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促进神经再生的中药复方
技术领域：
本发明涉及促进神经再生的中药复方。
背景技术：
在现代创伤外科中，周围神经损伤因其致残率高，损伤后修复及再生较为困难。尽管目前周围神经修复技术已经有了长远的进步，但即使新鲜，清洁的周围神经断裂伤，能及时运用显微外科技术进行修复，也往往不能完全再生，造成许多神经伤患者的残废。因此，如何促进周围神经损伤后的再生，恢复其功能已日益成为研究的重点。
在促进周围神经再生因子的研究中，报告最早、唯一阐明分子结构的神经细胞调节因子是神经生长因子(NGF)。研究证实了其受体及生物效应途径，观察到其促进神经轴突再生，髓鞘化及神经元的保护作用。同时，研究较为集中的还有神经节苷脂，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，分别被证明有不同程度的促神经生长作用。但上述因子疗效不确定，且目前以单因子的研究和应用为主，价格昂贵，难以在临床推广应用。
周围神经损伤后的修复与再生是多因子，多因素参与的生理过程(Berger-A，Uierner-R；Rokde-H，shen-EL，Diagnosis and Treatment of Opertpheral Nerve Injury，the integrated therapyconcept.Unfallcaitrurg.1999：102(1)：59-68)。周围神经再生所需的微环境应是一个多因素共同参与的生物网络，被称之为多因素共济环。因此，补充单一因子对神经再生的作用非常有限。国外目前在临床上研究与应用的神经生长因子及神经管养因子的替代物与诱生剂等进展缓慢，至今没有一种可靠的促进神经再生的药物。
祖国医学的中药复方是多因素复合，相辅相成的药剂。探求与开发中草药中单方与复方制剂，有可能提供更多，比例更接近神经生理需求与生长活性因子的环境，可能在神经再生的过程中的雪旺氏细胞活化、再生轴索生长、变性物质吸收及促进局部血液循环、增强免疫力等方面均起到作用。
周围神经损伤修复的传统方剂包括：
1.补阳还五汤，该方原载于清代王清任的《医林改错》。全方由黄芪，当归、赤芍、川芎、红花、桃仁、地龙组成(许济群主编.方剂学上海科学技术出版社，1990：150)。具有补气活血通经的功效。
研究人员对补阳还五汤作用机制和对周围神经损伤修复与再生进行了大量的的实验研究和临床研究。如认为补阳还五汤有在神经损伤后促进轴浆运输的作用(石关桐等，补阳还五汤对钳夹大鼠坐骨神经轴浆运输的影响.中国骨伤.1996.9(1)：3-4。并能够早期改善微循环，促进局部炎性水肿消退(石关桐等，补阳还五汤对周围神经损伤后腓肠肌及血粘度影响的实验研究.中国中医骨伤科杂志.1996.4(2)：4-7)。证实补阳还五汤对神经纤维再生、雪旺氏细胞活跃增殖，髓鞘形成及结构完整有明显促进作用，对失神经肌肉萎缩有改善作用(赵翠萍、王健智等加味补阳还五汤对周围神经再生的形态学实验研究.中医正骨.1993.5(2)：6-8)。现代药理研究发现，该方具有强心，增加脑血流量，改善循环的作用，并能促进吞噬细胞的吞噬能力(许青媛，补阳还五汤对动物脑循环与血流变学影响的实验研究.中成药：1990，3：25)，还可以促进再生神经中血管的生长，改善血供，促进神经元修复与再生(刘美玉等补阳还五汤对小鼠额叶皮质后神经元胞体形态影响的主要研究.昆明医学院学报.1995.16(2)：43)。
2、黄芪桂枝五物汤，该方系张仲景首创，由黄芪、白芍、桂枝、生姜、大枣组成，该方具有益气和营，温阳行痹的功效，是治疗气血阻滞，营卫失和，筋脉失养的血痹症主方。
目前认为神经损伤后，肢体感觉和运动功能障碍以及因神经损伤后造成的神经营养不良性改变多属外伤后气血阻滞，营卫失和，与血痹的病机十分相似，该方可使血脉通，气血充，营卫和，活血强筋(聂小圃周围神经损伤从血痹论治湖北中医杂志.1997.19(6)：37)。以该方治疗周围神经损伤，获痊愈或功能得到明显改善(隋秀芝中医治愈周围神经损伤5例.山东医药2001.41(16)：72；张天健  加味黄芪桂枝五物汤治疗挠神经损伤98例报告中医正骨1994 6(2)：18)。
尽管有上述促进周围神经再生的中药研究，但这些研究及结果总体上有以下几个特点和缺点：
1.各种复方的主要成分均为黄芪，说明比较公认的对周围神经损伤有肯定疗效的中药是黄芪。
2.按中医的理论，促进周围神经再生主要原理是补血补气、活血化淤、生肌通络。并没有具体描述对周围神经损伤的治疗效果。
3.研究手段尚不够科学。虽然研究中涉及组织学、电生理学及神经功能学评价方法，但很多是间接的观察。没有以确有促进神经再生的物质，如NGF(神经生长因子)等作为对照。因此，较难充分证明各中药复方的有效性。
4.以口服剂型为主，且配方中药物种类较多；因为口服剂型是全身用药，用量大、作用范围广，难免有副作用。
红芪(Radix Hedysari)是豆科岩黄芪属植物，与黄芪同科不同属，主产于我国甘肃。目前已知的红芪药理作用主要有：1)增强机体的免疫功能；2)促进生长抗衰老；3)强心降压；4)耐缺氧；5)抗菌抗病毒；6)生肌促进伤口愈合。但尚未见到促进周围神经再生的复方中药制剂的临床应用。
发明内容：
本发明的目的是开发一种以中药为活性成分的促进神经再生的药物。
本研究与周围神经研究基础相结合，从组织学、免疫组织化学及电生理学诸方面考察了红芪及与其配伍的中药复方的作用，为进一步的临床应用及成药开发提供科学的实验依据，并进一步验证神经再生的多因素共济环假说。
本发明进行了以下研究：
1.筛选出对周围神经修复合理有效的复方；
2.研究复方制剂最优的给药方式或途径，包括全身给药，局部给药；
3.在复方对促进周围神经再生理论方面进行更深入的研究，阐明复方的免疫调节机制。
本发明开发的促进周围神经修复的中药复方由如下重量份的原料药制成：红芪6-16份、淫羊藿4-10份、地龙2-6份。
上述原料药的优选配比是：红芪8-14份、淫羊藿5-9份、地龙3-5份。
最佳配比是：红芪9-13份、淫羊藿6-8份份、地龙3-4份。
上述复方中君药不变，还可以加入其它药物，组合成多种组方，发挥不同程度的功效。
如上述复方中可另加入当归1-6份。
在有红芪、淫羊藿、地龙和当归地复方中，还可以再加川芎1-6份和/或赤芍1-6份；
或者，有红芪、淫羊藿、地龙和当归的复方中，再加红花1-4份和/或桃仁1-4份。
还可以在红芪、淫羊藿、地龙三种基本成份的基础上，不用当归，另加下列药物中的一种或几种：川芎1-6份、红花1-4份、桃仁1-4份、赤芍1-6份。
或者，仅用红芪一味药的提取物。
本发明药物可以采用中药制剂的常规方法制备成任何常规的制剂，例如将原料药物进行水煎，或用醇或醇水混合物提取，然后浓缩水煎液或提取液，精制成为中药提取物。将提取物与药物可接受的各种载体、辅剂配伍，用本领域技术人员常规的制药方法，制备成各种制剂。
本发明药物的剂型可以是各种口服剂，如传统的水煎剂、浓缩口服液、粉剂、颗粒剂、胶囊、片剂、冲剂等，也可以制成注射剂，如用于损伤局部注射或腹腔注射等。
从中医理论讲，红芪具有益气活血、托毒生肌之功；从西医理论讲，红芪含红芪多糖，能显著促进巨噬细胞活性，提高免疫功能，明显降低血浆过氧化脂质的含量，提升白球蛋自比值，促进RNA合成，此外，红芪尚能改善肺的摄氧功能。本发明人对单药红芪的提取物进行了体外细胞培养实验，证实其对雪旺氏细胞有较好的促生长作用。说明仅用红芪一味单药也有周围神经损伤后的修复与再生作用。
本发明配方的另几种药中，当归补血活血，赤勺清热祛瘀，地龙通络，川芎活血行气，红花、桃仁活血祛瘀，淫羊藿补肾壮阳。综合起来，该复方制剂具有益气、活血、通络、补肾的功效。赤勺具有抑制血小板聚集，激活纤溶，抗血栓形成的作用；当归的有效成分之一阿魏酸能促进吞噬细胞功能，抑制血栓形成，其另一有效成分免疫活性多糖能增强机体造血机能，显著提高单核巨噬细胞的活性；地龙提取物降血压，地龙还含血栓溶解素，能直接催化纤溶蛋白酶类，抑制血栓形成；川芎亦含阿魏酸，具有改善微循环，降压扩血管，抑制血小板聚集的功能；桃仁和红花能扩张血管，且能抑制血栓形成；淫羊藿能扩张血管，抑制血小板聚集，促进核酸、蛋白质合成代谢，提高钠泵活性，改善能量代谢。
在该方剂组成中，红芪与红花、桃仁、赤芍、当归、川芎具有相似的功效，都有补血活血，祛瘀止痛作用。因此，本发明以红芪为主几味药物的不同组合，如红芪、淫羊藿、地龙三味药的组方等，均可以通过扩张损伤神经外周及内部的血管、抑制损伤后的局部血管血栓形成来改善损伤神经的微循环，提高微动脉的血流量，增加损伤神经血供；同时可以增强免疫功能，提高巨噬细胞活性，加快损伤神经的变性坏死物质的清除；以利于损伤神经再生。
本发明采用坐骨神经功能指数、神经传导速度、有髓神经纤维计数作为药效学实验观察指标，神经传导速度综合反映神经干内的感觉传导速度和运动传导速度的复合动作电位，在检测神经干外伤性损伤时，简单快捷可行。有髓神经纤维计数能直观地反映神经损伤后再生的有髓神经纤维数，准确地反映神经再生情况。坐骨神经功能指数是检测大鼠坐骨神经损伤后大体功能恢复的指标，它能反映坐骨神经损伤后神经功能恢复的程度，相比前两项指标，它更具临床意义。本实验采用此三项指标，从微观到宏观，比较全面地反映了各组大鼠坐骨神经再生情况及其功能恢复程度，且具可比性，能较准确地描述治疗组和治疗组、治疗组和对照组结果之间的差异及其大小。实验结果显示，本发明药物的各项指标均优于空白对照组。且光镜下观察组织切片，用药组大鼠在神经钳夹后2周、4周和6周时，溃变髓鞘均明显少于空白对照组。
本发明对以上所述的各种配方组合还进行了其它药理实验，包括：细胞毒性试验、结合神经再生室进行中药作用机制的研究、诱导人及动物骨髓造血组织干细胞定向分化为神经组织细胞。优化已经研制出的海洋生物套管，使之具有良好神经组织相容性，适当的降解吸收周期。将定向诱导分化的神经组织细胞、本发明的中药复方的有效组份与海洋生物套管共同构建成神经再生室。通过动物实验验证其对周围神经损伤的修复作用。
以上实验除包括本发明的各种配方组、单味红芪提取液组，还另设有阳性药物对照NGF组，以及不用药物的空白对照组。
药理研究发现：
1.局部给予本发明的中药复方和NGF的电生理功能的恢复均明显好于对照组，且SFI运动功能指数的恢复方面，本发明的中药复方组显示了优于NGF组的效果，说明这组复方制剂促进周围神经再生的作用。
2.本发明的中药复方提取液全身给药对脊髓神经元具有保护作用。
3.本发明的中药复方具有促进雪旺氏细胞的增殖、分化的功能，而且证明分化的细胞是药物作用后新增生的细胞。
因此，可以认为本发明的中药复方提取液对周围神经的修复起着肯定的作用。其作用机制可能为在周围神经损伤后，充分发挥其扩张神经外周及内部血管、改善损伤神经的微循环、提高微动脉的血流量，并能增强免疫功能，提高巨噬细胞的活性，促进核酸、蛋白质合成代谢，加快损伤神经变性坏死物质的清除，增加对神经再生物质的供给，促进轴浆流的恢复，进而防止神经元的变性坏死及促进其早期恢复。
因为红芪多糖是红芪的主要成份，本发明采用改进的苯酚-浓硫酸法测定了本发明药物提取液中红芪多糖的含量。
具体实施方式
实施例1  多组复方的配比
用红芪单味药，或以红芪、淫羊藿、地龙作为复方中的君药，另加入当归、川芎、红花、桃仁、赤芍中的一种或几种，组方见表1。
                            表1  各组复方原料药成份配比

    配方                            原料药名称及用量(重量份)    红芪  淫羊藿    地龙    当归    桃仁    赤芍    川芎    红花    1    1  -    -    -    -    -    -    -    2    6  4    2    -    -    -    -    -    3    9  2    3    -    -    -    -    -    4    12  6    4    -    -    -    -    -    5    16  8    6    -    -    -    -    -    6    12  6    4    1    -    -    -    -    7    13  10    4    4    -    -    1    -    8    11  6    3    6    3    -    -    -    9    8  6    4    4    -    4    -    -
    10    8    4    4    3    -    -    -    3    11    2    7    2    4    -    6    6    -    12    14    4    4    -    4    -    -    1    13    12    6    5    -    1    1    -    4    14    11    5    2    -    -    4    4    -
实施例2  原料药水煎提取
设备：旋转蒸发仪(含真空泵)，电热煎药器，冷凝管，茄形瓶等玻璃仪器。
红芪购自原产地甘肃，其余药材购于北京同仁堂药店。
步骤：
1.按配方称取每种药物，其中，将红芪切铡成约2cm的小段，碾压后称量。
2.将各配方组药物置于圆底烧瓶内，每组药物各煎三遍，各以药量的10倍，8倍，6倍水加入，第一遍煎煮两小时，后两遍各煎一小时，每遍煎出液过滤至容器内，将煎出液通过旋蒸仪除水，然后以蒸馏水融为含生药量2g/ml的液体，转至无菌瓶内冷冻保存。
实施例3  原料药的乙醇提取
将各药材用75％乙醇提取三次，然后通过旋蒸回收醇，所得液体以多糖为主，浓缩。
实施例4  中药复方提取细胞毒性试验
将提纯的本发明的中药复方提取液0.22μm滤网过滤，用含15％胎牛血清的PRMI1640培养(Gibco BRL，美国)倍比稀释，分置24孔板中。对数生长期的SP2/0细胞，调整细胞浓度为10⁶/ml，在含倍比稀释的红芪培养液的24孔板中分别加入10ul，37℃培养。每天观察细胞生长状况。
观察3天后结果显示复方红芪提取液在1∶16000，1∶32000时(即NGF有效地作用剂量)均对雪旺氏细胞有促进增生及分化的作用。说明可促进雪旺氏细胞的增生。用药安全。
实施例5  各组药物提取液和NGF对SD大鼠坐骨神经培养对比
各组配方提取液NGF按1∶16000稀释，作为阳性参照，正常培养液作阴性对照。分别放入新鲜切取的SD大鼠坐骨神经。37℃培养。平行样3个。分别于培养后第48h、72h和96h取出坐骨神经，-20℃冰箱保存。酪氨酸蛋白激酶测试系统：美国Gibco公司产品(NO：13154-018)。含底物液和不含RR-SRC的对照液。用前按100uCi/ml加[γ-³²P]ATP(＞5000Ci/mmol)(北京亚辉生物医学工程公司)、按试剂系统推荐配方配制抽提液。检测前样品制备参照试剂盒说明，每根神经加抽提液200ul，玻璃匀浆品匀浆，冰上放置20min，12000g离心2min，考马斯亮兰法测蛋白浓度^[7]。按蛋白浓度取样，用抽提液稀释至0.5mg/ml。分别加入底物液或对照液10ul，冰上孵育10min后12000g离心10min(4℃)。吸取反应液上清20ul，滴于已标记的磷酸纤维素纸上，1％(v/v)乙酸与自来水各洗两次，每次5min。加入液闪杯中检测。样本检测采用Wallac 1410液体闪烁计数器(芬兰)计数，每样计数1min。
结果分析：①每pmol磷的cpm按下公式计算：10ul含³²p底物(a)及对照(b)的cpm值/1200；②参入磷的肽pmol数按下公式计算：样品cpm值×2/①_a-对照cpm值×2/①_b；③激酶活性按下公式计算：②/30。不同浓度及不同时间的样品结果用多样本比较的秩和检验进行统计学处理。方差分析第48h各组方剂、NGF及对照间均值的差异。
实施例6  动物体内药效学实验
模型及分组：取SD雄性大鼠随机分为两组，一组以钳夹法造成双侧坐骨神经损伤，随机分为服药组与对照组，将体外筛选后的疗效较好的方剂已低，中，高三种剂量随机择鼠灌服，对照组采用生理盐水，另一组将大鼠双侧坐骨神经切断后断端留取两毫米间隙，采用我们自制的海洋生物套管套接缝合，用药组局部给予方剂，对照组局部应用NGF+神经节苷脂。
观察时间：3d，1W，2w，3w，6w，9w。
早期观察项目：
1.SC增值形态，数量
2.再生新芽发出时间，走行
3.纤维通过套管的时间
4.髓鞘形成时间及层数(光镜与电镜)
5.各组神经损伤处巨噬细胞聚集数量的变化
6.细胞内亚微结构的变化(DIC)。
晚期观察项目：
1.观察神经纤维再生数量
2.神经传导速度和活动电位
3.测量肌张力和肌肉干湿重量。
组织学染色方法：固兰髓鞘染色和HE染；SY-38生长圆锥染色；S-100雪旺氏细胞染色；SMI-31轴索染。
实施例7  复方药物作用机制的研究
在进行大鼠体内实验过程中，分别在局部或全身给药前和给药一段时间之后，取材或取血，检测巨噬细胞数量和功能的变化，体内MHC抗原的变化，来检测中药红芪对大鼠免疫状态的影响。
实施例8  对药物诱导人及鼠造血组织干细胞向神经组织细胞定向分化的观察实验
1.实验目的
研究本发明复方对神经干细胞生长的影响，为开展人工神经的研究作基础。
2.方法
用不同方法分离及纯化造血组织干细胞：将不同方法分选的造血组织干细胞及骨髓基质细胞进行定向诱导分化：在促神经生长因子(EGF、FGF-2、PDGF)作用下，将以上细胞诱导分化成神经组织细胞；利用单克隆抗体进行鉴定，所用抗体包括：抗神经上皮干细胞蛋白(nestin)鉴别神经干细胞，抗神经元特异性烯醇化酶鉴别神经元细胞，抗S100鉴别雪旺氏细胞；对诱导出的神经组织细胞进行神经电位测定。
3.结果
证明该复方可有效促进神经干细胞的增殖与分化，将有利于人工神经的研究与应用。
实施例9  中药复方的有效成份与海洋生物套管共同构建成神经再生室研究
1.人工海洋生物管桥制备和性能优化：
材料的生物性能(动物体内吸收时相及组织相容性)研究；材料与雪旺氏细胞相容性及抑制成纤维细胞生长特性的研究：具体如下，无菌手术取出坐骨神经，剪碎，用培养液在培养皿中进行体外雪旺氏细胞培养，培养皿中垫放生物材料膜，并设置对照，分不同时期以倒置显微镜、光镜切片、组织学及免疫组织化学染色、扫描电镜等手段观察雪旺氏细胞及成纤维细胞的形态、活性和密度，进行单位面积计数，并观察雪旺氏细胞的内部结构及功能活性。
2.将诱导分化出的神经组织细胞悬液或干细胞和本发明的中药复方有效成分接种在本课题研制出的海洋生物材料支架上，然后将二者一同加入转壁式生物反应器中，使细胞与材料均匀的结合，构建神经再生室，进行大鼠坐骨神经修复试验。
①实验动物随机分成两大组，第一组进一步分为A组：取大鼠左腿坐骨神经行外膜原位缝合；B组：取大鼠右腿坐骨神经行套管小间隙原位套接。第二组进一步分为C组：取大鼠左腿坐骨神经行外膜旋转180度缝合；D组：取大鼠右腿坐骨神经行套管小间隙远侧断端旋转180度套接。另取一小组大鼠作为正常神经对照。②实验方法：SD大鼠用2.5％戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉后，由股外侧肌间隙进入暴露双侧坐骨神经，在坐骨结节下方1.0cm处锐性切断坐骨神经，然后依据各组进行相应处理。③实验各组动物预先行骨髓穿刺，分离骨髓基质细胞及造血组织干细胞并定向培养成神经组织细胞，实验组个体的神经组织细胞用于生物组织管桥制备，其余各组神经组织细胞用于体外活性实验观察；④分别在术后第一、二、三、四周，每次从第一组和第二组随机取大鼠，取材后行手术显微镜下观察，光镜下有髓神经纤维计数，锇酸染色组织学切片观察，电生理学检查及功能检查(坐骨神经功能指数)。
以上实施例1～9的实验结果显示：
1.局部给予本发明的中药复方和NGF的电生理功能的恢复均明显好于对照组，且SFI运动功能指数的恢复方面，本发明的中药复方组显示了优于NGF组的效果，充分说明了这组复方制剂促进周围神经再生的作用。
2.本发明的中药复方提取液全身给药对脊髓神经元具有保护作用。在该制剂作用机制的研究方面证实：其具有促进神经再生过程中发挥重要作用的雪旺氏细胞的增殖、分化的功能。同时证明分化的细胞是药物作用后新增生的细胞。因此，可以认为本发明的中药复方提取液对周围神经的修复起着肯定的作用。其作用机制可能为在周围神经损伤后，充分发挥其扩张神经外周及内部血管、改善损伤神经的微循环、提高微动脉的血流量，并能增强免疫功能，提高巨噬细胞的活性，促进核酸、蛋白质合成代谢，加快损伤神经变性坏死物质的清除，增加对神经再生物质的供给，促进轴浆流的恢复，进而防止神经元的变性坏死及促进其早期恢复。
实施例10  本发明的中药复方提取液对周围神经再生促进作用观察(一)
本实验用钳夹大鼠的坐骨神经的方法作成周围神经损伤的模型，以本发明的中药复方提取液作为治疗药物与神经生长因子及空白组作为对照，通过对坐骨神经功能指数(SFI)，神经传导速度，再生髓鞘计数的测量来探明本发明的中药复方提取液是否对周围神经再生有促进作用。
1.实验方法
实验动物与分组：实验采用40只成年健康的SD雄性大鼠，由北京医科大学动物实验部提供，体重250g左右，随机分成4组，每组10只大鼠。各组编号为N、Q、S、B。
2.实验药物：
1)含红芪50份、当归10份、赤芍8份、地龙5份、川芎5份、红花5份、桃仁5份、淫羊藿15份，浓缩为1.125g/ml。
2)含红芪、淫羊藿、地龙，浓缩为0.774g/ml。
3)补阳还五汤成分：含黄芪、当归、赤芍、川芎、桃仁、红花、地龙，浓缩为2.6g/ml。
3.实验方法及观察指标：
SD大鼠用2.5％戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉后，由股外侧肌间隙进入暴露双侧坐骨神经，在坐骨结节下方1.0cm处以无齿钳钳夹坐骨神经(3齿30秒种)造成宽2mm损伤区，此种方法经组织学证实能够使神经外膜完整情况下，轴索全部断裂。然后关闭切口。Q组：实验药物1)提取液灌药剂量为2ml/只/天，S组：实验药物2)灌药剂量2ml/只/天；B组：实验药物3)补阳还五汤，灌药剂量2ml/只/天；N组：生理盐水灌药剂量2ml/只/天；每天一次。术中麻醉死亡3只(S组1只，Q组2只)。每组中，5只于2周时(灌药为每天一次，共14天)，5只于4周时(每天灌药一次，共28天)，取出双侧坐骨神经行组织学观察，每组大鼠术前与2、4周取材前行坐骨神经功能指数测定，每组大鼠2周与4周取材前取双侧坐骨神经行神经传导速度测定。
观察指标：坐骨神经功能指数(SFI)、神经传导速度、组织形态学及有髓神经纤维计数。
SFI测定：自制大鼠足印行走箱，高15cm，宽15cm，长50cm，通道远端放置一长20cm，宽15cm，高15cm单侧开门的鼠箱。行走箱底放置与行走箱等长、等宽的白纸。在培养皿内放入少许棉花，倒入适量碳素墨水使棉花浸湿，将大鼠后足在培养皿内蘸一下，放入行走箱的一端，其自行走向箱的另一端，在此过程中，标记纸上留下大鼠双侧后足印各4-5个。各组10只大鼠钳夹术前于标记纸上留下后足印，钳夹术后2、4周再于标记纸上留下后足印，均取双侧足印，前者为正常组(N)，后者为实验组(E)。各测量3个变量，测量精确到毫米。
足印长度(print length factor，PLF)：足印的最长距离，即从足跟到足尖，每次选用最长的PLF值。
足距宽度(toe spread factor，TSF)：第1-5趾连线距离，每次选用最长的TSF值。
中间足趾距离(intermediary toe spread，ITF)：第2-4趾连线距离，每次选用最长的TSF值。
将上述3个变量代入Bain公式便可计算出SFI.
SFI＝-38.3(EPL-NPL/NPL)+109.5(ETS-NTS/NTS)+13.3(EIT-NIT/NIT)-8.8
EPL：实验组足印长度；NPL：正常组足印长度；ETS：实验组足距宽度；NTS：正常组足距宽度；EIT：实验组中间足趾距离；NIT：正常组中间足趾距离。
           SFI以±10为正常值，-100为神经完全离断的指标。
神经传导速度(NCV)：行SFI检测后，按原径路暴露双侧坐骨神经，在钳夹损伤处两侧约1.5cm处放置电极，中枢端为刺激电极，外周端为引导电极，用Oxford肌电图仪测量神经传导速度。公式：速度＝两电极间距离/动作电位潜时的差值
组织学检查：
取材及染色：各组大鼠分别于钳夹术2周，4周后原手术径路暴露坐骨神经，取出钳夹处以远0.5cm的神经节段，置入10％福尔马林，固定24小时后，行锇酸染色。
锇酸染色：
1％锇酸后固定及染色72小时
流水冲洗10分钟后，蒸馏水浸泡10分钟共3次
脱水：酒精50％→70％→75％→80％→85％→90％→95％→100％(1次)，→100％(2次)各15分钟→二甲苯(1次)→二甲苯(2次)各15分钟
浸蜡：60分钟→30分钟→30分钟→15分钟
包埋
切片：3-5微米的神经横断切片
烤片：38℃12-24小时
二甲苯5分钟2次
封片
镜检：每个标本选1-2张切片，锇酸染色的切片在观察各组切片髓鞘的染色及形态数量差异的基础上，作腓总神经有髓神经纤维计数研究。
有髓神经纤维计数：实验各组及对照组共75张切片，在光学显微镜放大400倍(10*40)的视野下，每张切片测量腓总神经各个视区的有髓神经纤维数，取均值。行统计学分析。
4.实验结果
1)坐骨神经功能指数(SFI)：X+SD
组别                术后2周                  术后4周
空白对照组          -50.3405±20.5918        -22.1106±10.3532
S组                 -32.9944±20.0971        -11.9985±5.4533
Q组                 -27.4385±13.5411        -16.8660±8.6201
B组                 -58.3396±12.3949        -21.1303±7.0933
其中2周时N组3只5侧，Q组3只5侧，B组2只3侧因不同程度的足趾溃疡及挛缩未测出。补阳还五汤组和实验药物2)组与对照组无显著差异(分别为P＝0.086＞0.05；P＝0.530＞0.05)；但补阳还五汤组和实验药物2)组有显著差异，且实验药物2)组优于补阳还五汤组，(P＝0.01＜0.05)，实验药物1)组与对照组比差异有显著性意义，且优于对照组(P＝0.046＞0.05)，实验药物1)组也优于补阳还五汤组，且差异有显著性(P＝0.002＜0.010)。4周时N组1只1侧，S组2只2侧，B组1只2侧因不同程度的足趾溃疡及挛缩未测出，实验药物1)组和补阳还五汤组与对照组差别无意义(分别为P＝0.827＞0.05，P＝0.246＞0.05)，实验药物2)组与对照组差别有显著意义，且优于对照组(P＝0.048＜0.05)，同时优于实验药物1)组，且差别有意义(P＝0.023＜0.05)，但与补阳还五汤组差别无意义。
2)神经传导速度(NCV)(m/s)X+SD
                      术后时间
组别       2周                     4周
N组        17.0000±14.4855        26.2900±11.3439
S组        20.5100±8.1175         40.7857±14.4462
B组        22.5700±16.2037        39.1516±10.1192
Q组        27.7540±3.9825         40.4375±13.9800
2周时Q组有四只四侧，B组有2只2侧，N组3只5侧，未能测出，实验药物1)组、实验药物2)组、补阳还五汤组与对照组比均优于对照组，但差异无统计学意义。4周时S组1只1侧，B组1只1侧，Q组1只2侧未能测出，其中实验药物1)组、实验药物2)组、补阳还五汤组与对照组比均优于对照组，且差异具有显著意义(分别为P＝0.005＜0.01，P＝0.02＜0.05，P＝0.003＜0.05)，而三组用药组间差别无显著意义。
组织学观察
光镜下形态学观察：锇酸染色切片，2周时，已开始出现再生有髓神经纤维，较细，壁薄，用药各组再生有髓神经纤维明显多于对照组，且部分变性髓鞘已崩解吸收，空白组仍有较多变性髓鞘，再生有髓神经纤维较少。4周时，再生有髓神经纤维明显增多，用药各组再生有髓神经纤维明显多于空白组，且变性髓鞘已基本崩解消失，而空白组仍有较多变性髓鞘。
3)单位视野有髓神经纤维计数(条)X+SD
组别       术后2周           术后4周
N组        11.3±1.06        19.0±2.50
S组        17.3±1.99        29.0±3.67
B组        17.6±2.85        23.5±2.31
Q组        17.6±3.87        22.9±2.94
2周时用药各组均明显好于对照组，(p＝0.001＜0.01)，但各用药组间差异无意义，4周时用药各组均明显好于对照组(p＜0.05)，且实验药物2)组明显好于全方组及补阳还五汤组(p＝0.002＜0.01，p＝0.004＜0.01)。而全方组与补阳还五汤组间差异无意义。
实施例11本发明的中药复方提取液对周围神经再生促进作用观察(二)
1.实验动物与分组：实验采用30只成年健康的SD雄性大鼠，由北京医科大学动物实验部提供，体重250g左右，随机分成3组，每组10只大鼠。
2.实验药物：
1)实施例1中配方红芪60份、淫羊藿20份、地龙6份，当归15份，赤芍10份，每剂提取液浓缩为0.963g/mL。(请改写)
2)含红芪70份、淫羊藿25份、地龙5份(写出配比关系)。每剂浓缩为浓缩为0.774g/mL。
3.实验方法及观察指标：
SD大鼠用2.5％戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉后，由股外侧肌间隙进入暴露双侧坐骨神经，于双侧股后作小切口暴露坐骨神经直至远端胫神经和腓总神经分叉上5mm处，用头部为2mm宽的无齿钳子钳夹神经，钳夹强度统一咬合3齿，持续时间为1分钟。术后第二日起S组与Q组分别按每次5ml/kg每日灌药一次，对照组每日灌服生理盐水5ml/kg。术后3组在同一条件下分笼饲养6周。
全部于6周时(每天灌药一次，共灌药42天)取出双侧坐骨神经行组织学观察，每组大鼠术前与6周取材前行坐骨神经功能指数测定。
观察指标：坐骨神经功能指数(SFI)、组织形态学及有髓神经纤维计数。
一般状态：包括食欲、精神状态、攻击性、局部感染率及死亡率。
SFI测定：自制大鼠足印行走箱，高15cm，宽15cm，长50cm，通道远端放置一长20cm，宽15cm，高15cm单侧开门的鼠箱。行走箱底放置与行走箱等长、等宽的白纸。在培养皿内放入少许棉花，倒入适量碳素墨水使棉花浸湿，将大鼠后足在培养皿内蘸一下，放入行走箱的一端，其自行走向箱的另一端，在此过程中，标记纸上留下大鼠双侧后足印各4-5个。各组10只大鼠钳夹术前于标记纸上留下后足印，钳夹术后6周再于标记纸上留下后足印，均取双侧足印，前者为正常组(N)，后者为实验组(E)。各测量3个变量，测量精确到毫米。
足印长度(print length factor，PLF)：足印的最长距离，即从足跟到足尖，每次选用最长的PLF值。
足距宽度(toe spread factor，TSF)：第1-5趾连线距离，每次选用最长的TSF值。
中间足趾距离(intermediary toe spread，ITF)：第2-4趾连线距离，每次选用最长的TSF值。将上述3个变量代入Bain公式便可计算出SFI。
SFI＝-38.3(EPL-NPL/NPL)+109.5(ETS-NTS/NTS)+13.3(EIT-NIT/NIT)-8.8
EPL：实验组足印长度；NPL：正常组足印长度；ETS：实验组足距宽度；NTS：正常组足距宽度；EIT：实验组中间足趾距离；NIT：正常组中间足趾距离。
           SFI以±10为正常值，-100为神经完全离断的指标。
组织学检查：
取材及染色：各组大鼠分别于钳夹术6周后原手术径路暴露坐骨神经，取出钳夹处以远0.5cm的神经节段，置入10％福尔马林，固定24小时后，行锇酸染色。
锇酸染色：
1％锇酸后固定及染色72小时
流水冲洗10分钟后，蒸馏水浸泡10分钟共3次
脱水：酒精50％→70％→75％→80％→85％→90％→95％→100％(1次)，→100％(2次)各15分钟→二甲苯(1次)→二甲苯(2次)各15分钟
浸蜡：60分钟→30分钟→30分钟→15分钟
包埋
切片：3-5微米的神经横断切片
烤片：38℃12-24小时
二甲苯5分钟2次
封片
镜检：每个标本选1-2张切片，锇酸染色的切片在观察各组切片髓鞘的染色及形态数量差异的基础上，作腓总神经有髓神经纤维计数研究。
有髓神经纤维计数：实验各组及对照组共75张切片，在光学显微镜放大400倍(10*40)的视野下，如图所示，每张切片测量腓总神经各个视区的有髓神经纤维数，取均值。行统计学分析。
4.实验结果
1)一般状态除术中麻醉死亡6只(Q组3只，S组2只，N组1只)外，术后各组大鼠均无明显异常行为。术后24 h起睡眠及食欲无明显变化，无1例出现伤口感染或死亡。给药组大鼠的双侧坐骨神经表面普遍比对照组光滑，容易从组织中分离和显露，外膜血管丰富。
2)坐骨神经功能指数(SFI)：+SD    组别    术后时间(6周)    N    -25.1729±15.3830    Q    -30.2700±10.8001    S    -19.1105±9.1048
结果显示实验药物1)组和实验药物2)组与对照组无显著差异(分别为P＝0.262，＞0.05；P＝0.479＞0.05)。而实验药物1)组与实验药物2)组比差异有显著性意义，且实验药物2)组优于实验药物1)组(P＝0.03，＜0.05)。
3)组织学观察
光镜下形态学观察：
锇酸染色切片，6周时，再生有髓神经纤维明显增多，中药组及NGF组再生有髓神经纤维多于空白组，中药组变性髓鞘已基本崩解消失，空白组仍有较多变性髓鞘。提示，本发明的中药复方提取液能够促进有髓神经纤维的再生和变性髓鞘的分解吸收。
4)单位视野有髓神经纤维计数(条)+SD    组别    术后时间(6周)    N    75.77±14.36    Q    112.33±17.99    S    109.26±15.73
本发明的中药复方组平均单位视野有髓神经纤维数为112.33±17.99优于对照组75.77±14.36且统计学有明显差异(P＝0.000，＜0.01)。实验药物2)组109.26±15.73明显优于对照组(P＝000，＜0.01)，而实验药物1)组与实验药物2)组间无显著性差异。
实施例10～11结果：
(1)坐骨神经功能指数(SFI)：2周时，补阳还五汤组和实验药物2)组与对照组无显著差异，但补阳还五汤组和实验药物2)组有显著差异，且实验药物2)组优于补阳还五汤组，实验药物1)组与对照组比差异有显著性意义，且优于对照组，实验药物1)组也优于补阳还五汤组，且差异有显著性。4周时实验药物1)组和补阳还五汤组与对照组差别无意义，实验药物2)组与对照组差别有显著意义，且优于对照组，同时优于实验药物1)组，且差别有意义，但与补阳还五汤组差别无意义。6周时实验药物1)组和实验药物2)组与对照组无显著差异；而实验药物1)组与实验药物2)组比差异有显著性意义，且实验药物2)组优于实验药物1)组。
(2)神经传导速度(NCV)：2周时实验药物1)组、实验药物2)组、补阳还五汤组与对照组比均优于对照组，但差异无统计学意义。4周时其中实验药物1)组、实验药物2)组、补阳还五汤组与对照组比均优于对照组，且差异具有显著意义，而三组用药组间差别无显著意义。
(3)组织学观察：2周时用药各组均明显好于对照组，但各用药组间差异无意义，4周时用药各组均明显好于对照组，且实验药物2)组明显好于全方组及补阳还五汤组，而全方组与补阳还五汤组间差异无意义。6周时本发明的中药复方组优于对照组且统计学有明显差异。实验药物2)组明显优于对照组而实验药物1)组与实验药物2)组间无显著性差异。
实施例12本发明的中药复方提取液中红芪多糖含量测定
在含红芪70份、淫羊藿25份、地龙5份的提取液配方可以有效促进大鼠损伤坐骨神经再生的基础上，对该方中主要物质成分红芪多糖采用苯酚-浓硫酸法作含量测定。
材料和方法
1.1材料：苯酚(分析纯)，重蒸后配成50g/l水溶液；浓硫酸(分析纯，d＝1.84g/cm^-3)；吸光度用721型分光光度计测定，使用光径10mm石英比色皿，用Optifix定量加液器吸加50g/l苯酚及浓硫酸。葡萄糖纯品。已提纯本发明的中药复方减方提取液(浓度86mg/ml)
1.2方法：标准溶液的配制：精确称取已经干燥的葡萄糖纯品10mg，溶于100ml水中，然后分别稀释为浓度为2，4，8，10，20ug/ml，本发明的中药复方减方提取液稀释为4.3ug/ml.。先取已稀释各标准葡萄糖溶液各0.4ml，置于10ml试管中，加入50g/l苯酚溶液0.8ml混合后，迅速加入4ml浓硫酸，混合均匀后，室温放置30min，在波长490nm测定吸光度，空白对照以蒸馏水代替糖溶液。待测出标准曲线后，取已稀释的本发明的中药复方减方提取液0.4ml，置于10ml试管中，加入50g/l苯酚溶液0.8ml混合后，迅速加入4ml浓硫酸，混合均匀后，室温放置30min，在波长490nm测定吸光度，将此吸光度代入标准曲线方程求出含有的红芪多糖量，从而得出方剂中红芪多糖含量。
2.结果与讨论
2.1由下表所示的样品吸光值得到标准曲线，求得直线方程为Y＝14.73X-0.0343Chi-Square：0.00091
其中Y为所含糖量，X为490nm处吸光度
稀释的本发明的中药复方减方提取液测得吸光度为0.076，代入方程求得所含糖量为1.0908ug，稀释液含方剂1.72ug，从而求得方剂中所含红芪多糖占总量的63.41％。
    样本编号    所含标准葡萄糖量(ug)    490nm吸光值    1    0.8    0.051    2    1.6    0.110    3    3.2    0.225    4    4.0    0.280    5    8.0    0.541
在减方方剂中，因为方中淫羊藿与地龙几乎不含糖类，所以测得的糖可以认为即是红芪多糖。测得结果为方剂总量的63.41％
实施例13单药红芪的药效学实验
1.实验目的：观察红芪单药对促进周围神经损伤后的再生作用
2.实验方法
红芪单药提取液与NGF按1∶16000稀释，作为阳性参照，正常培养液作阴性对照。分别放入新鲜切取的SD大鼠坐骨神经。37℃培养。平行样3个。分别于培养后第48h、72h和96h取出坐骨神经，-20℃冰箱保存。酪氨酸蛋白激酶测试系统：美国Gibco公司产品(NO：13154-018)。含底物液和不含RR-SRC的对照液。用前按100uCi/ml加[γ-³²P]ATP(＞5000Ci/mmol)(北京亚辉生物医学工程公司)、按试剂系统推荐配方配制抽提液。检测前样品制备参照试剂盒说明，每根神经加抽提液200ul，玻璃匀浆品匀浆，冰上放置20min，12000g离心2min，考马斯亮兰法测蛋白浓度^[7]。按蛋白浓度取样，用抽提液稀释至0.5mg/ml。分别加入底物液或对照液10ul，冰上孵育10min后12000g离心10min(4℃)。吸取反应液上清20ul，滴于已标记的磷酸纤维素纸上，1％(v/v)乙酸与自来水各洗两次，每次5min。加入液闪杯中检测。样本检测采用Wallac 1410液体闪烁计数器(芬兰)计数，每样计数1min。
3.结果分析：
①每pmol磷的cpm按下公式计算：10ul含³²P底物(a)及对照(b)的cpm值/1200；②参入磷的肽pmol数按下公式计算：样品cpm值×2/①_a-对照cpm值×2/①_b；③激酶活性按下公式计算：②/30。不同浓度及不同时间的样品结果用多样本比较的秩和检验进行统计学处理。方差分析第48h红芪单药、NGF及对照间均值的差异。
4.结论：红芪单药有促进雪旺氏细胞增殖及分化的作用，效果与NGF相似。说明单味红芪也有促进周围神经损伤后的再生的作用。
实施例14注射剂的制备
制备注射剂：将方剂的水煎剂先用旋蒸仪提纯，然后在真空机中将含有的水分提出，再通过水浴锅将其干燥为粉状，使用时按所需用量精确称量，用注射用水稀释后对大鼠局部注射应用。
实施例15口服剂的制备
将方剂的水煎剂先用旋蒸仪提纯，浓缩为所需用量，对大鼠进行灌服实验。