导管组合物及其用途
发明背景
技术领域
本发明涉及到留置(indwelling)医疗器械领域，特别是导管，还涉及到冲洗(flush)、封闭(locking)、充盈(priming)和涂覆(coating)这些医疗器械的方法和组合物的领域。本发明也涉及到药物制剂，该制剂用于提高导管流量和防止在有纤维蛋白沉积可能的导管内或在已经有纤维蛋白结合型凝块(fibrin-bound clot)的导管内发生感染。
相关公开内容的描述
送递系统作为一种将液体物质介导至病人体内具体位置的手段在医药中得到广泛应用，所述液体物质可包括药剂、营养物、或其它活性因子。这类系统常涉及导管的使用，这类导管在许多应用中通过外科手术方式或静脉内方式被定位并被缝入一定位置，以便长期给药所需要的物质。典型的系统包括中心导管，如可用在例如短肠综合征(short bowel syndrome)(在生命持续期间内)中进行全肠外营养(total parenteral nutriation)(TPN)，但有脓毒症(sepsis)或心内膜炎的危险。这类系统也包括为那些晚期肾衰竭病人进行腹膜透析所涉及的导尿管和引流管，它们如果感染可能导致腹膜炎并有严重后果。
血管内导管是最常用的医疗器械。这类导管在许多操作中通常被置于病人的血管系统中并且经常长时期地留置。一种用于在数年中治疗人疾病的送递系统包含一个经皮下途径植入筋膜下的小体积池(reserveoir)或腔(chamber)，它可以通过导管直接进入心血管系统。这类系统被认为是接口(port)系统。因为接口和血管内导管是从外界环境到病人血流的直接路径，所以导管或接口的存在提供了将微生物引入病人血流的一种实质且连续的可能性。
现在通常认为在内科、外科、妇产科、泌尿科和其它科的病人中设置留置导管可导致泌尿生殖道的严重感染。从业人员已经开发了许多涉及到放置、使用、附着(attachment)和拆卸(detachment)流体操作器械的方案及与导管有关的其它方法。几乎所有这些方法的目的都是避免将微生物引入病人的血流中。
现已开发出了多种将抗感染因子掺入医疗器械中来降低感染风险的方法，但上述方法没有一种已经过临床证实完全满意。这类器械在整个使用期间原本希望提供有效的抗感染因子水平。但这种持续释放很难实现，因为它需要一种在长时间内分散抗感染因子的机制，而且掺入足量的抗感染因子可能对器械的表面特性带来不良影响。在提供有效的抗微生物保护中遇到的困难随着抗药病原体的发展而增加。
关于血管内导管的现行标准维护包括用抗凝剂(如肝素)冲洗导管内腔，以阻止导管尖端内部或周围血液凝结和阻塞液体流经导管。此外，肝素没有抗微生物活性，并且，除此之外，如果不小心控制，它可将抗凝过程带得太远，因此带来出血的危险。肝素也可导致抗体形成，引发肝素诱导血小板减少症(HIT)的严重自身免疫病，该症耗竭血小板并且进一步增加出血危险。因此，尽管预防性地采用肝素冲洗，感染和血栓栓塞仍然持续经常性地发生。中央静脉导管相关感染的发病机理和微生物学知识，对于为该问题提供有效防护是很必要的。
表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和金黄色葡萄球菌S.aureus)引起75％的中央静脉导管(CVC)-相关感染。假丝酵母(Candida)种引起另外10％到15％的这种感染。已发现使用抗葡萄球菌的抗生素来防止这些感染可减少CVC相关的细菌感染，但是只不过要以发生更高比例的真菌(假丝酵母)感染为代价。
现在可观测到血栓形成与感染之间也有一种相关性。基本上是，纤维蛋白鞘在后来覆盖了导管的内外表面，吞没(engulf)了留置的血管导管。该纤维蛋白鞘为诸如葡萄球菌和假丝酵母等生物提供了更强的粘附导管表面的能力。与这些具体微生物不同，革兰氏阴性芽孢杆菌(bacilli)并不能很好地粘附纤维蛋白和纤连蛋白。因此阻断纤维蛋白形成的组合物在防止葡萄球菌、假丝酵母等在留置导管部位定居时特别有用。
当药剂通过导管被引入病人时，从业人员通常在这个引入过程后接着引入可能包含抗凝剂(如肝素)的冲洗溶液。冲洗溶液的目的就是将药剂从导管移出，以便送递完整剂量，在导管中留下残余量，使病人血液不会倒流进入导管且不可能形成堵塞导管孔的凝块。因此，当后来再次需要导管时，经过正确冲洗的导管很可能是完全开放的，并且已为下一次使用做好准备。
Root等，Antimicrob.Agents Chemother.，32：1627-1631(1988)发表了一项研究，报道了在导管中乙二胺四乙酸二钠(EDTA)的影响，EDTA是一种在体内以其螯合性能著名并且在体外作为抗凝剂广泛使用的化合物。美国专利5,363,754公开了米诺环素(minocycline)和EDTA混合成的药物组合物可用于维持导管接口的开放性。美国专利5,091,442描述了管状制品，例如避孕套和导管，它们通过掺入少量可溶性非离子抗微生物剂如三氯生(triclosan)来有效抵抗微生物。抗微生物剂可分布于整个制品上，或者涂在其表面。美国专利5,362,754公开了用于维持导管开放性的药物制剂，它包含米诺环素和EDTA。美国专利5,362,754报道了米诺环素和EDTA的混合物(M-EDTA)在维持导管接口开放性方面的用途。
Purchase等，Nephron，58：119-20(1991)公开了包括柠檬酸盐在内的钙螯合剂为此目的的应用。Butuovic等，Artif.Organs.22：945-7(1998)公开了柠檬酸盐和聚明胶肽(polygeline，一种从牛骨制得的血浆替代品)在维持导管方面与肝素一样有效。在1997年11月2-5日于San Antonio，Tex.举办的美国肾脏学会第30届年会上的讨论中，Sodemann等报道了由于感染而引起的导管替换可通过常规应用浓缩的庆大霉素/柠檬酸盐混合物加以避免。
但是，导管透析所用的柠檬酸钙螯合剂TRICITRASOLTM有一些缺陷。一些病人报告在注射柠檬酸盐后立即发生短暂的味觉障碍(dysgensia)。最近FDA报道了一起在注射柠檬酸盐作为导管封闭物后立刻死亡的病例(Stas等，Nephrol Dial Transplant，16：1521-1522(2001)；FDA发布了对triCitrasol(商标)透析导管抗凝剂的警告。FDA Talk Paper T00-16，14 April 2000。
美国专利5,019,096公开了抗感染的医疗器械，包含银盐(如磺胺嘧啶银(silver sulfadiazine))与双氯苯双胍己烷(chlorhexidine)的协同组合。美国专利5,772,640报道了包含抗感染因子双氯苯双胍己烷和三氯生地聚合性医疗制品。美国专利5,362,754公开了通过涂覆EDTA和/或米诺环素来防止在导管上形成糖萼(glycolcalyx)，以及防止细菌和真菌感染。美国专利6,258,797公开了通过使用牛黄罗定(taurolidine)或啕卢坦(taurultan)的抗微生物封闭液来对抗导管和接口系统内的感染或脓毒症。
美国专利6,166,007公开了将医疗假体器械插入病人后，在该器械内部或附近防止感染和血液凝结的抗微生物封闭物，其包括牛黄酰胺衍生物(taurinamide)及其羧酸和/或盐。EP1,040,841描述了通过将递送系统的表面与含有抗凝因子，牛黄罗定和/或啕卢坦的血栓抑制液接触，防止在递送系统的液体接触表面形成血栓和/或有细菌生长。EP882,461公开了同时有生理和抗微生物活性的医疗器械，其包含一种基座(base)材料，一层在基座材料表面形成的交联涂覆膜，并且每一种生理活性物质和抗微生物物质都与涂覆膜结合。
Boorgu等，ASAIO J.，46(6)：767-770(Nov.2000)公开了在菌血症治疗中的一种辅助性抗生素/抗凝血封闭治疗(lock therapy)，其与皮下植入的血液透析通路仪(hemodialysis acess device)联合使用。与该仪器相连的两个导管被植入上腔静脉或右心房。抗生素/抗凝血封闭治疗需要将抗生素和抗凝血剂一同滴注入该仪器。也可见Schwartz等，Journal of Clinical Oncology.，8(9)：1591-1597(1990)and Kamal等，JAMA，265(18)：2364-2368(1991)。
Wiernikowski等，Am J.Pediatr Hematol Oncol.13(2)：137-140(1991)公开了与普通盐水相比抑菌盐水冲洗液可防止导管感染。Vercaigne等，Pharmacotherapy，20：394-9(2000)评价了肝素加抗生素作为封闭液来预防感染的效果。Patel等，Thromb Hemost，82：1205-6(1999)公开了在肝素诱导的血小板减少症病人中成功地运用低剂量的r-水蛭素治疗反复透析导管的血栓形成。Darouiche等，Nutrition，13(4)(suppl)：26S-29S(1997)报道了防止血管导管相关的感染可采用抗微生物因子而实现，包括应用表面消毒剂例如双氯苯双胍己烷，使用灌注银的皮下套囊(cuff)(对短期的CVCs而言)，用抗微生物和抗血栓因子的组合物冲洗导管，并且使用抗菌剂(双氯苯双胍己烷和磺胺嘧啶银)或者抗微生物因子(米诺环素和利福平(rifampin))涂覆导管。
抗菌封闭液已用于清洁导管。例如，美国专利6,174,537公开了一种导管冲洗液。也可见Sodermann等Blood Purif.，19：251-254(2001)的DIALOCKTM和CLS；TUBEXTM肝素封闭冲洗液(Wyeth-Ayerst)；以及Henrickson等，J.Clin Oncol.，18：1269-1278(2000)关于采用万古霉素/环丙沙星(ciprofloxacin)/肝素冲洗液防止CVC相关感染和血栓形成。
有软套囊的、可移植的CVCs如QUINTON PERMCATHTM CVC(QuintonInstrument Co.，Seattle，WA)在终末期肾病病人中作为永久通路的一种手段，使用量逐渐增多。它们主要的局限性，除了感染以外，是形成血栓和血流量不足。为了防止那些并发症，习惯上在透析期之间使用肝素充盈QUINTONPERMCATHTM CVC。Schenk等，Amer.J.Kidney Diseases，35：130-136(Jan.2000)显示出重组组织纤维蛋白溶酶原激活剂(rt-PA)在血液透析期之间充盈QUINTON PERMCATHTM CVC的效果优于肝素。但是，Schenk等使用了2mg阿替普酶(alteplase)以及不能防止细菌生长的SWFI(无菌注射用水，USP)。
由中央静脉通路器械(CVAD)导管内部或尖端形成血液凝块(血栓)而造成CVAD的闭塞或封闭是一个普遍的问题，可阻断对病人给与的治疗。评估表明25％的CVADs出现堵塞，而血栓的形成是最普遍的病因(Haire等，Thromb.Haemost，72：543-547(1994)；Rubin，J.Clin.Oncol.，1：572-573(1983)；Lokich等，J.Clin.Oncol.，3：710-717(1985))。1994年，Haire等，出处同上，进行了一项预见性随机双盲试验，其在经过放射性造影证明因血栓堵塞导致功能障碍的导管中测试了尿激酶和阿替普酶(t-PA)。导管经2mg阿替普酶或10,000U尿激酶处理，允许阿替普酶或尿激酶在器械中居留2小时。在最多两次处理后，阿替普酶相比于尿激酶而言使更多的导管恢复功能(89％对59％(p＝0.013))。
2001年9月4日，经过对抽血(withdraw blood)能力的评估，美国食品和药品监督管理局(FDA)批准溶栓因子CATHFLOTM ACTIVASE(阿替普酶)t-PA，用于恢复CVAD的功能。CATHFLOTM ACTIVASEt-PA有2mg装、供单个病人使用的小瓶，是可用于该适应征的唯一市售溶栓剂，它为医务人员提供了针对可妨碍病人健康的CVAD并发症的一种治疗选择。一瓶CATHFLOTM t-PA含有2.2mg阿替普酶、77mgL-精氨酸、0.2mgPOLYSORBATE 80TM乳化剂以及可将pH调节至大约7.3的磷酸。
T-PA已与除血管导管外的其它材料结合。见，例如，Zhou等，J.ControlRelease，55：281-295(1998)；Greco等，Ann Vasc.Surg，9：140-145(1995)andWoodhouse等，Biomaterials，17：75-77(1996)。
美国专利5,688,516公开了螯合因子、抗凝剂、或抗血栓形成因子与非糖肽抗微生物因子(如四环素抗生素)的精选组合物，在涂覆医疗器械以及抑制导管感染方面的应用。优选的组合物包括在可药用稀释剂中的米诺环素或另一种非糖肽抗微生物因子再加上EDTA、EGTA、DTPA、TTH、肝素和/或水蛭素。美国专利6,187,768同样地公开了采用一种抗微生物因子和一种抗凝剂、一种抗血栓形成因子，或一种螯合因子来维持留置医疗器械(如导管)的开放性，以及防止因导管内细菌生长引起的感染。
尽管本领域已有上述文献，但对于从导管(特别是留置医疗器械)中去除纤维蛋白结合型血凝块的非毒性方法一直存在需求。另外，还需要在这类器械中防止并去除纤维蛋白，尤其因为一些细菌具有喜好粘附纤维蛋白的结合位点。
发明简述
本发明公开了在满足上述需要的能力方面独一无二的溶液，该溶液不基于抗凝活性、抗血栓形成活性或螯合活性并且不包含抗生素的使用，而抗生素的使用可以在哺乳动物中引起抗药性。本发明通过联合使用纤维蛋白溶酶原激活剂和用作防腐剂的消毒剂(主要是具有该能力的有机醇类)，解决了这里提出的要求。所得组合物不仅具有溶解纤维蛋白的活性，而且防止病原体生长，特别是在有凝块的导管中防止病原体生长，并已通过USP标准。
本发明如权利要求所述。具体地，本发明一方面提供了可用于从导管中去除纤维蛋白结合型血凝块的组合物，它含有水、有效溶解纤维蛋白剂量的纤维蛋白溶酶原激活剂和有效防腐剂量的抑制细菌的有机醇类，其中该组合物不含螯合因子。
本发明另一方面提供了一种多隔室(multi-compartment package)包装，它包括多个隔室以及说明书，其中一个隔室含有纤维蛋白溶解有效量的纤维蛋白溶酶原激活剂，一个隔室含有防腐有效量的抑菌性有机醇-水溶液，且任一隔室都不含螯合剂，所述说明书用于指示将两个隔室的内容物混合以及指示用所得混合物从含有纤维蛋白结合型血凝块的导管中除掉此类血凝块。
本发明另一方面提供了一种多隔室包装，它包括多个隔室以及说明书，其中一个隔室含有约0.1～10mg/mL天然序列t-PA或替尼普酶(tenecteplase)，一个隔室含有水，所述水中含有约0.5～1.2％(v/v)苯甲醇、异丙醇或乙醇，且任一隔室都不含螯合剂，所述说明书用于指示将两个隔室的内容物混合以及指示用所得混合物从含有纤维蛋白结合型血凝块的导管中除掉此类血凝块。
苯甲醇是本文的优选的醇类，其优选剂量是大约0.8-1.1％。该范围以及大约0.5到1.2％的边界范围足以抑制微生物生长，却保留了纤维蛋白溶酶原激活剂的稳定性和功能。这些醇类的一个优点是不引起抗生素抗药性。
另一实施方案中，本发明提供了从含有纤维蛋白结合型血凝块的导管中去除这些血凝块的方法，包括将导管与上述组合物接触至少约5天。
另一实施方案中，本发明提供了用上述定义的组合物涂覆的导管。
图1显示了在玻璃小瓶中37℃贮存14天后重建的rt-PA(1mg/mL，含有BWFI、BNS和SWFI)的简化(reduced)SEC图谱。
定义
本文中“导管”是指一种以递送医学治疗和抽血为目的的医疗器械，通常由塑料聚合物，例如，聚氨基甲酸酯(polyurethane)、聚硅氧烷(silicone)、或其它这类聚合物构成。这样的导管代表了很多种留置式医疗器械例如尿道导管、血管导管如CVC或外周静脉导管、动脉导管、气管导管、斯-甘(Swan-Ganz)导管、血液透析导管、脐带导管、经皮非透过型(non-tunneled)聚硅氧烷导管、有套囊的透过型(tunneled)中央静脉导管、和皮下中央静脉接口等。
这里使用“血管导管”来描述与血管系统相关联的导管，包括外周导管和CVC、长期的有套囊的器械、短期的无套囊的器械、和可移植的接口。CVC与中央静脉通路仪(CVAD)一样，包括外周插入的中央导管(PICC线)，外部有套囊的器械，无套囊的导管、非透过的和皮下透过的导管、血液透析(HD)导管、以及接口。
这里优选的导管是留置导管如CVC(优选有套囊的透过型CVC)，外周静脉内导管、动脉导管、斯-甘导管、血液透析导管、脐带导管、经皮非透过型聚硅氧烷导管、或皮下中央静脉接口。也优选尿道导管或腹膜导管(peritoneal catheter)。还优选静脉内导管(由生物医学聚氨基甲酸酯或聚硅氧烷制成)，或血管导管。
本文中“制剂”或“组合物”是指由上述成分混合而成的组合物、溶液、配制剂等等。
本文中术语“接触”意思是通过例如涂覆、保温等任何手段暴露于试剂。
术语“涂覆”、“被涂覆的”等等，本文中是指用本文所述组合物浸(dipping)、泡(soaking)、处理(treating)、和/或灌注(impregmating)导管。
本文中“抑菌性有机醇类”是指用作防腐剂的有机醇类消毒剂，它不能归类为一种或一类抗生素。消毒剂是抑制或杀死微生物的化学制品，在Basicand Clinical Pharmacology，8th edition(2001)，Section VII.ChemotherapeuticDrugs.Chapter 50.Miscellaneous Antimicrobial Agents-Disinfectants，Antiseptics，and Sterilants.中有定义。防腐剂是用于防止微生物使制剂腐败(spoilage)的化学品。消毒剂都用作防腐剂来防止细菌和真菌在药物制剂中的过度生长。它们在防止可能污染它们的微生物生长方面必须有效，并且必须有足够的溶解性和稳定性来保持活性，参见Ellenhorn′s Medical Toxicology2nd Ed(1997)，Section IV.Chemicals.Chapter 57.Antiseptics andDisinfectants.。本文优选的此类有机醇防腐剂实例包括乙醇、异丙醇和苯甲醇，最优选苯甲醇。苯甲醇是疏水性的，可以破坏微生物的细胞壁和细胞膜、使蛋白质变性，以及使酶失活。
“抑菌性注射用水”或“BWFI”是指水和不同量苯甲醇的混合物，而且水中不含其它成分，见美国药典(USP)的定义。
本文中“无菌注射用水”或“SWFI”是不含任何其它成分的无菌水。
本文中“生理盐水”或“NS”是水与适量(如0.9％(w/v))氯化钠的混合物，不含其它成分。
本文中“抑菌性生理盐水”或“BNS”是指含有适量(如0.9％(w/v))氯化钠和适量(即具有防腐效果的量)抑菌性有机醇如苯甲醇的无菌水，不含任何其它成分。
本文中术语“纤维蛋白溶酶原激活剂”是指纤维蛋白溶解性的单或双链纤维蛋白溶酶原激活剂，包括天然或变异形式的尿原性纤维蛋白溶酶原激活剂、组织纤维蛋白溶酶原激活剂的天然形式如ACTIVASE阿替普酶(alteplase)t-PA或变异形式如r-PA(瑞替普酶(reteplase)；RETAVASE；Centocor，Inc.)和替尼普酶(tenecteplase)(t-PA变异体T103N，N117Q，K296A，H297A，R298A，R299，采用Genentech，Inc.的TNKASETM商标，可参见例如美国专利5,612,029)、以及尿激酶(例如ABBOKINASE；Abbott)，其可能是自然产生的天然分子或具有在血液中溶解凝块以及防止和除去纤维的纤维蛋白溶解功能的尿激酶变异体。优选该纤维蛋白溶酶原激活剂是天然序列t-PA、纤维蛋白溶解性t-PA变异体、天然序列尿激酶或纤维蛋白溶解性尿激酶变异体。更优选，该纤维蛋白溶酶原激活剂是天然序列t-PA、纤维蛋白溶解性t-PA变异体或天然序列尿激酶。还更优选，该纤维蛋白溶酶原激活剂是天然序列t-PA或纤维蛋白溶解性t-PA变异体。还更优选，该t-PA变异体是替尼普酶或瑞替普酶。最优选该纤维蛋白溶酶原激活剂是天然序列t-PA或替尼普酶。
本文中“螯合剂”是指用于螯合作用的试剂，诸如乙二胺四乙酸(ENTA)、DMSA、去铁胺(deferoxamine)、二巯丙醇(dimmercaprol)、柠檬酸锌、TRICITRASOLTM(一种柠檬酸钙螯合剂)、铋和柠檬酸盐的组合、青霉胺(penicillamine)、二巯琥珀酸(succimer)、或依替膦酸钠(etidronate)。乙二醇-二-(β-氨基乙醚)-N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA)和二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)及其盐类，是已知的其它螯合剂，此外还有依地酸钙二钠(edentate calciumdisodium)、三亚乙基四胺二氢氯化物，以及螯合二价金属阳离子如Ca、Mg、Mn、Fe和Zn的那些。
实施本发明的模式
本发明提供了一种组合物，用于从导液管中去除纤维蛋白结合型血凝块，它包含水，纤维蛋白溶解有效量的纤维蛋白溶酶原激活剂，以及防腐有效量的抑菌性有机醇。该组合物不包含螯合剂。
所述水优选包含抑菌性有机醇作为起始。通常有四种稀释剂用于稀释或重建药物：BWFI、SWFI、BNS和NS。本发明仅包括那些抑菌性的，即BWFI和BNS。含醇的水优选抑菌性注射用水或抑菌性生理盐水。
本文组合物的pH值必须适于生物学应用。通常，本发明的组合物或溶液为pH3～7，优选约3.5～6.5，最优选约4.5～6.5。组合物一般在生理pH值。如果必要，pH值可通过加入酸或碱来调整，诸如无机酸如盐酸，或优选不会造成酸中毒的那些，如乙酸、苹果酸或乳酸。也可以使用本领域熟知的其它方法来调节pH。
测试组合物中纤维蛋白溶酶原激活剂的量是否能有效溶解纤维蛋白时，可以采用例如体外凝块裂解试验，参见本文实施例所述。
醇的防腐有效量可以通过，例如，下文实施例中的抗微生物效力试验来确定。优选纤维蛋白溶酶原激活剂的量为约0.1～10mg/ml，有机醇的防腐有效量优选为约0.5～1.2％(v/v)。更优选能的纤维蛋白溶酶原激活剂的纤维蛋白溶解有效量是约0.3～5mg/ml，还更优选约0.5～4mg/ml，最优选约1～3mg/ml。更优选有机醇的量是约0.8～1.1％(v/v)。
本发明的组合物优选暴露于基本上使其中任何微生物都不能存活的条件下，并且包装在密封容器(如注射器、隔膜封闭瓶或安瓿瓶)中，也就是基本上能够防止微生物通过的容器。优选该密封容器含有一份足以完成一次导管冲洗程序的冲洗溶液。在具体应用中，优选大体积容器，其含有足够量的溶液，可以分配成多个等份来完成多次的导管冲洗程序。
一种冲洗静脉内导管的方法包括，提供一种如上面列出的混合溶液，并且将该导管与这种溶液接触至少两个小时。该方法包括用一份足以完成一次导管冲洗程序的溶液，充满一个液体操作装置，优选注射器。用于冲洗程序的优选量一般在约1～3毫升。然后医师将注射器与需要冲洗的目标静脉内导管相连，并将溶液注入导管，从而完成冲洗程序。
本文的方法可用于除去任何透过型或非透过型导管中已预先存在的血凝块。作为导管维护或冲洗方案的一部分，最优选用本文所述组合物冲洗导管，例如一星期一次、4天一次、2天一次、1天一次(约每24小时)、1天两次、4小时一次或根据病人需要，这些是熟练医师所熟知的。导管冲洗方案可以仅在每次更换导管的时候才制定(constitute)一次。在本方法的优选方面，导管将更频繁地以4小时的间隔用本文所述组合物冲洗。
本发明的方法可以用于将组合物引入已经放置到位的导管，但本领域技术人员还应明白，在体外用组合物接触或涂覆导管能够在移植该导管后防止纤维蛋白在其表面沉积，并减少便于细菌生长的位点。因此，导管(如血液透析导管)的表面可以用本文所述组合物进行预处理。可以先用组合物处理导管，然后插入导管，再对其重复多次周期性冲洗。
上文列出了可以用本发明组合物制备并涂覆的具体导管实例。在涂覆方法中，纤维蛋白溶酶原激活剂、水和醇是以一定量存在，以便使其组合在经过处理的制品中具有有效的纤维蛋白溶解活性和防腐活性。在一具体实施方案中，导管是聚氨基甲酸酯或聚硅氧烷导管(或由类似聚合物制作的导管)，其已用上述处理溶液处理过(即浸或泡)。然后将目的导管的表面暴露于组合物，所用的暴露时间足以在该装置的被暴露表面形成该组合物的膜或包衣。当组合物为液体时，可以使组合物在该装置的表面干燥，以便形成膜。
注射入导管的本发明组合物的量足以将导管填满。当这类装置是血液透析导管时，其内部容积通常约为0.1～10mL。当然，所述量将随该装置的管道长度和直径来变化，后者可以是单个病人个体大小的函数。
在将纤维蛋白结合型血凝块从导管中除去时，可以使导管与本文所述溶液接触至少约5天，优选约6～15天。
本发明还有一方面提供试剂盒或包装(package)。在一个实施方案中，该试剂盒或包装包括一个容器(如分隔式注射器)，它有至少两个相互分隔的隔室。一个隔室或容器含有纤维蛋白溶解有效量的纤维蛋白溶酶原激活剂(如t-PA)，第二个容器或隔室含有水，水中含有防腐有效量的抑菌性有机醇。任一含有组合物的隔室都不含有螯合剂。该包装还包括说明书，其用于指示将两个隔室的内容物混合，以及指示用所得混合物从含有纤维蛋白结合型血凝块(frbrin-bound blood clot)的导管中除掉此类血凝块。t-PA可以是冻干粉末，为干粉形式，与上述水混合后可以重建出适于使用的溶液。该试剂盒还可包括一个容器，也就是一个适于接收上述两个隔室的内容物的载体工具。本文所述包装可以是一个试剂盒，其中每一个隔室是一个独立的容器(诸如瓶或安瓿)，或者该包装也可以是多隔室注射器。
本发明的多种特性和方面在随后的实施例中进行了进一步的描述。这些实施例列在这里，是向本领域内技术人员展示如何在本发明范围内进行操作，而无意以任何方式对本发明的范围进行限定。所有这里引用的公开内容作为参考文献插入此文。
实施例1(对比)
概述
如下所述进行的试验，用来评估2mg/ml ACTIVASEt-PA溶解于SWFI后的抗微生物特性。该样品没有达到USP抗微生物效力试验的要求。
USP抗微生物效力试验
此试验常用于评估制剂中防腐剂的效力，或用于评估活性成分的内在抗微生物活性。该试验记录于USP 24“微生物试验/(51)抗微生物效力试验，1809-1811页”。
A.材料和主要设备
1.使用的受试微生物是大肠埃希氏菌(E.coli)ATCC 8739、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)ATCC 9027、金黄色葡萄球菌(S.aureus)ATCC 6538、白色假丝酵母(C.albicans)ATCC 10231以及黑曲霉(A.niger)ATCC 16404。
2.培养基、消耗品以及主要设备：
胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)
沙保氏葡萄糖琼脂(Sabouraud dextrose agar，SDA)
磷酸盐缓冲液(PBS)，无菌，pH7.2±0.2
无菌50ml锥形试管
无菌药签和血清吸液管
分光光度计
菌落计数器，Quebec或等同的
2-8℃、22.5±2.5℃以及32.5±2.5℃培养箱
B.步骤
1.接种物制备
将每一种生物悬液制备成能达到约1×108菌落形成单位(CFU)/ml的浓度。5支试管中各包含10ml样品，用0.05ml其相应攻击生物接种，使供试品起始浓度在1×105～1×106CFU/mL之间。每个供试品中活生物的起始数量是通过倒平板法，根据每个标准接种物中生物的浓度来计算的。本方法是用来计数供试样品中生物数的普通微生物方法。供试样品用无菌盐水稀释，然后吸出，转移到一个无菌Petri盘上。接着将融化的琼脂(营养培养基)倒入该Petri盘，与样品混合，在标准温度保温一段标准时间。本方法产生的菌落贯穿整个琼脂，而不仅位于表面。
将约10ml样品注入试管但不进行接种，作为阴性对照。在T＝7天、14天和28天时，通过倒平板法(一种经确认的平板计数方法)对每种生物在接种样品和阴性对照中的数量进行测定。倒平板法的接种条件显示于表1。
2.倒平板法的确认：
样品进行系列稀释以获得10-1和10-2稀释度。每份样品稀释液取1-mL加入5个Petri盘的一个盘中。对于每份样品稀释液，将含有约1×103CFU/mL攻击生物的0.1-mL等份试样加入相应Petri盘。平行地，将相同接种体积的每种生物等分至两个不含样品稀释液的平板中，进行计数确认。将维持在约45℃的融化琼脂取15-20ml加入每个平板，轻轻摇动以混匀内容物。使平板凝固并按照表1所示进行培养。
3.样品准备：
5个瓶中每瓶加入10ml样品。每瓶分别用“EC”、“PA”、“SA”、“CA”和“AN”来标记，因而一支瓶子的标记对应于一种将要进行检测的生物。10ml样品加入一支标记为阴性对照的管子。换言之，根据前面的传送和标记步骤，每支管中送入了20ml样品。
4.生物载量(Bioburden)确定：
利用阴性对照，样品的生物载量用倒平板法进行测定。使用的培养基和培养条件列于表1中。
5.样品的接种：
0.05ml每种生物的悬液以1×108CFU/mL的浓度，接种到相应的含有10ml样品的样品瓶中。使用的悬液接种物的体积为样品体积的0.5％。混合物进行充分涡旋震荡。供试品的终浓度大约为5.0×105CFU/mL。也就是说，如果在每个瓶中采用20ml样品体积，按照上述接种步骤，就携有了0.1ml每种受试菌悬液。
6.起始浓度计算确认：
每种标准接种物的平板计数通过倒平板法来确定(1.0×108CFU/mL)。使用的培养基和培养条件列于表1中。平板计数进行两次重复以获得每种标准接种物的平均平板计数。在供试品中每种攻击生物的起始浓度利用如下公式来计算：
Sx = I P ]]>
其中
S＝标准悬液的平均生物浓度(1.0×108CFU/mL)
I＝接种物体积(0.05mL)
P＝供试品体积(10mL)
7.样品保存和试验的间隔：
接种后的容器和阴性对照在22.5±2.5℃避光条件下培养。每个容器在表2中的特定时间点加样。接种的样品和阴性对照的平板计数通过倒平板法来完成。平板计数重复两次。按照表1中所列使用培养基和培养条件。
表1
倒平板法的接种条件 生物 适宜培养基 接种温度(℃) 接种时间(天)
大肠埃希氏菌ATCC 8739 TSA 32.5±2.5 3-5
铜绿假单胞菌ATCC 9027 TSA 32.5±2.5 3-5
金黄色葡萄球菌ATCC 6538 TSA 32.5±2.5 3-5
白色假丝酵母ATCC 10231 SDA 22.5±2.5 3-5
黑曲霉ATCC 16404 SDA 22.5±2.5 3-7
表2
用于非肠道的倒平板时间点 0hr 6hr 24hr 7d 14d 28d
USP(细菌、酵母和霉菌) NA NA NA R R R
EP(细菌) R R R R R R
NA＝没有可用数据
R＝必需的
C.接受标准
1.对于有效的激发研究来说，在每个供试品中攻击生物的浓度应在1×105～1×106CFU/mL之间。按照经确认的平板计数法，在所用样品中检测不到生物载量。
2.对于有效的平板计数法来说，每一稀释度水平回收接种物的平均数量一定要大于或等于相应对照平均数量的50％。如果某一稀释度回收接种物的平均数量少于50％，该稀释度的所有计数认为无效。
D.解释
1.USP
对于细菌，在7天计数时的数量比起始计算的应减少不少于1.0个log衰减单位，在14天时应比起始计数减少不少于3.0个log10衰减单位，而在28天时与14天计数相比无没有更多衰减。
对于酵母和霉菌，在7、14和28天计数，与起始时计算值相比应无增长。“无增长”定义为与前一测量值相比，增加量不超过0.5log10单位。
2.EP
评估母体制剂抗微生物活性的标准见表3，是根据对接种物所得的值来说，活微生物数目的log衰减来确定的。
表3
评价肠道外抗微生物活性的EP标准 Log衰减
标准* 6h 24h 7d 14d 28d
细菌 A 2 3 - - NR
细菌 B - 1 3 - NI
真菌 A - - 2 - NI
真菌 B - - - 1 NI
NR＝没有回收。
NI＝没有增加。“没有增加”定义为与前一测定值相比，增加量不超过0.3log10单位。
*A标准表示已达到推荐的功效。在那些经证明是合理的A标准不能达到的情况下，例如对那些因为不利反应风险增加的情况，则必须符合B标准。
用ACTIVASEt-PA和SWFI进行的试验
A.材料、设备和方法步骤
样品是一瓶中用不含苯甲醇的SWFI溶解的2mg/ml的ACTIVASE阿替普酶t-PA。
攻击生物和所有培养基、消耗品和主要设备就是在上述试验中所列的那些。使用的方法步骤与上述试验中描述的相同，而且培养条件是表1中的。接受标准和解释与上述试验相同。
结果
在每一供试品中计算出的起始攻击生物浓度在1×105～1×106CFU/mL之间(表4)。
使用倒平板法计数的样品中没有检测到生物载量(表5)。
利用倒平板法确认该平板计数法有效。在样品的10-1稀释度，接种物平均回收量大于或等于相应对照平均值的50％(表6)。
对于铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌，在7天计数时的数量比起始计算的值减少了不少于1.3个log10衰减单位，在14天时比起始计数减少了不到3.0个log10衰减单位，而在28天时与起始计数相比减少了不少于3.6个log10衰减单位(表7和8)。对于大肠埃希氏菌，在7天时与计算所得起始浓度相比，有不到1.0个log10衰减，而在14和28天有不到3.0个log10衰减(表7和8)。
对于酵母和霉菌，与计算所得起始浓度相比，在7天计数时的数量有不少于0.6个log10的衰减，在14天时有不少于1.0个log10衰减，而在28天时有不少于1.6个log10衰减(表7和8)。
表4
计算攻击生物的起始浓度 攻击生物 悬液浓度(CFU/mL) 计算出的起始浓度(CFU/mL)
铜绿假单胞菌 7.7×107 3.9×105
大肠埃希氏菌 1.2×108 6.0×105
金黄色葡萄球菌 3.9×107 2.0×105
白色假丝酵母 7.2×107 3.6×105
黑曲霉 1.2×108 6.0×105
表5
通过倒平板法所得样品生物载量 培养基 由样品10-1稀释度回收所得CFU 生物载量(CFU/mL)
TSA 0 ＜10
SDA 0 ＜10
表6
通过倒平板法计数的平均回收接种物 攻击生物接种的CFU平 均值 由10-1稀释度回收的平均 CFU 平均回收百分数(％)
铜绿假单胞菌 65 48 74
大肠埃希氏菌 93 110 118
金黄色葡萄球菌 43 55 129
白色假丝酵母 84 74 88
黑曲霉 59 46 79
表7
28天里的微生物数量 攻击生物起始时计算的数量 (CFU/mL) 7天 (CFU/mL) 14天 (CFU/mL) 28天 (CFU/mL)
铜绿假单胞菌 3.9×105 6.3×103 1.1×104 50
大肠埃希氏菌 6.0×105 1.2×105 1.3×106 7.2×105
金黄色葡萄球菌 2.0×105 9.1×103 7.4×102 55
白色假丝酵母 3.6×105 ＜100 ＜10 ＜10
黑曲霉 6.0×105 1.5×105 5.8×104 1.4×104
阴性对照 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10
表8
微生物数量在28天里Log衰减 攻击生物 Log衰减
7天 14天 28天
铜绿假单胞菌 1.8 1.5 3.9
大肠埃希氏菌 0.7 -0.3 -0.1
金黄色葡萄球菌 1.3 2.4 3.6
白色假丝酵母 ＞3.6 ＞4.6 ＞4.6
黑曲霉 0.6 1.0 1.6
讨论
在细菌的抗微生物效力试验中，本样品达不到USP的要求。对大肠埃希氏菌.，在7天时相对于起始时计算的浓度有＜1.0log10的衰减。在14天时，所有3种细菌的试验生物log衰减都＜3.0log10。对于酵母和霉菌，在7、14和28天时，与起始计算数据相比没有增加。
实施例2
概述
按照上面公布的有关抗微生物效力测试来进行试验，依照USP要求来评估0.8％苯甲醇在2mg/ml ACTIVASEt-PA中作为防腐剂的效力。该样品达到了USP抗微生物效力试验要求。
材料、设备和方法步骤
样品是在瓶中含有0.8％苯甲醇的ACTIVASEt-PA(2mg/mL)。明确地说，稀释液是加有适量苯甲醇使其终浓度为0.8％的无菌水。
攻击生物是那些在实施1中所描述过的。
培养基、消耗品以及主要设备与实施例1中所标明的相同。
使用的步骤和方法与实施例1中描述的相同，接种条件是表1中的。接受标准和解释与实施例1中的相同。
结果
对于每一个供试品中计算所得攻击生物的起始浓度(在1×105～1×106CFU/mL之间)以及利用倒平板法计数样品中的生物载量(没有可检测到的生物载量)，其结果与表4和表5中的相同。利用倒平板法进行平板计数被证明是有效的。在样品的10-1稀释度回收接种物的平均值大于等于相应对照平均值的50％(表9)。对于细菌，与计算得到的起始浓度相比，在7天时有＞3.3log10的衰减，在14和28天有＞4.3log10衰减(表10和11)。对于酵母和霉菌，与计算得到的起始浓度相比，在7天时有大于等于3.1log10的衰减，在14和28天有大于4.6log10的衰减(表10和11)。
表9
由倒平板法所得回收接种物的平均值 攻击生物接种的平均CFU 从10-1稀释度回收的平均 CFU 平均回收百 分数
铜绿假单胞菌 65 60 92
大肠埃希氏菌 93 99 106
金黄色葡萄球菌 43 55 129
白色假丝酵母 84 82 97
黑曲霉 59 50 85
表10
28天里的微生物数量 攻击生物 起始计算的数量 (CFU/mL) 7天(CFU/mL) 14天 (CFU/mL) 28天 (CFU/mL)
铜绿假单胞菌 3.9×105 ＜100 ＜10 ＜10
大肠埃希氏菌 6.0×105 ＜100 ＜10 ＜10
金黄色葡萄球菌 2.0×105 ＜100 ＜10 ＜10
白色假丝酵母 3.6×105 ＜100 ＜10 ＜10
黑曲霉 6.0×105 500 ＜10 ＜10
阴性对照 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10
表11
在28天里微生物数量的Log衰减 攻击生物 Log衰减
7天 14天 28天
铜绿假单胞菌 ＞3.6 ＞4.6 ＞4.6
大肠埃希氏菌 ＞3.8 ＞4.8 ＞4.8
金黄色葡萄球菌 ＞3.3 ＞4.3 ＞4.3
白色假丝酵母 ＞3.6 ＞4.6 ＞4.6
黑曲霉 3.1 ＞4.8 ＞4.8
结论
本样品符合USP抗微生物效力试验的要求。
实施例3
概述
按照上面公布的有关抗微生物效力测试来进行试验，依照USP要求来评估0.9％苯甲醇在2mg/ml ACTIVASEt-PA中作为防腐剂的效力。该样品达到了USP抗微生物效力试验要求。
材料、设备和方法步骤
样品是在瓶中含有0.9％苯甲醇的ACTIVASEt-PA(2mg/mL)。明确地说，稀释液是加有适量苯甲醇使其终浓度为0.9％的无菌水。
攻击生物是那些在实施例1中所描述过的。
培养基、消耗品以及主要设备与实施例1中所标明的相同。
使用的步骤和方法与实施例1中描述的相同，接种条件是表1中的。接受标准和解释与实施例1中的相同。
结果
对于每一个供试品中计算所得攻击生物的起始浓度(在1×105～1×106CFU/mL之间)以及利用倒平板法计数样品中的生物载量(没有可检测到的生物载量)，其结果与表4和表5中的相同。利用倒平板法进行平板计数被证明是有效的。在样品的10-1稀释度回收接种物的平均值大于等于相应对照平均值的50％(表12)。对于细菌，与计算得到的起始浓度相比，在7天时有＞3.3log10的衰减，在14和28天有＞4.3log10衰减(表13和14)。对于酵母和霉菌，与计算得到的起始浓度相比，在7天时有大于等于3.6log10的衰减，在14和28天有大于4.6log10的衰减(表13和14)。
表12
由倒平板法所得平均回收接种物量 攻击生物 接种的平均 CFU 从10-1稀释度回收的平均 CFU 平均回收百 分数
铜绿假单胞菌 65 58 89
大肠埃希氏菌 93 91 97
金黄色葡萄球菌 43 43 100
白色假丝酵母 84 76 90
黑曲霉 59 38 65
表13
在28天里微生物数量 攻击生物 起始时计算的量 (CFU/mL) 7天(CFU/mL) 14天 28天 CFU/mL)
铜绿假单胞菌 3.9×105 ＜100 ＜10 ＜10
大肠埃希氏菌 6.0×105 ＜100 ＜10 ＜10
金黄色葡萄球菌 2.0×105 ＜100 ＜10 ＜10
白色假丝酵母 3.6×105 ＜100 ＜10 ＜10
黑曲霉 6.0×105 ＜100 ＜10 ＜10
阴性对照 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10
表14
在28天里微生物数量的Log衰减
攻击生物 Log衰减
7天 14天 28天
铜绿假单胞菌 ＞3.6 ＞4.6 ＞4.6
大肠埃希氏菌 ＞3.8 ＞4.8 ＞4.8
金黄色葡萄球菌 ＞3.3 ＞4.3 ＞4.3
白色假丝酵母 ＞3.6 ＞4.6 ＞4.6
黑曲霉 ＞3.8 ＞4.8 ＞4.8
结论
本样品符合USP抗微生物效力试验的要求。
在一个推荐的充盈应用方案中，用含0.9％苯甲醇的无菌抑菌性注射用水2.2Ml溶解的2.2mg CATHFLOTM ACTIVASE(阿替普酶)冻干粉的溶液(1mg/Ml浓度)，可以与内腔导管充盈体积相同的体积注入一个血管导管中。接着可以从导管中吸出该溶液，并在将该导管进行医用之前弃去。
实施例4
概述
按照上面公布的有关抗微生物效力测试来进行试验，依照USP要求来评估1.0％苯甲醇在2mg/ml ACTIVASEt-PA中作为防腐剂的效力。该样品达到了USP抗微生物效力试验要求。
材料、设备和方法步骤
样品是在瓶中含有1.0％苯甲醇的ACTIVASEt-PA(2mg/mL)。明确地说，稀释液是加有适量苯甲醇使其终浓度为1.0％的无菌水。
攻击生物是那些在实施例1中所描述过的。
培养基、消耗品以及主要设备与实施例1中所标明的相同。
使用的步骤和方法与实施例1中描述的相同，接种条件是表1中的。接受标准和解释与实施例1中的相同。
结果
对于每一个供试品中计算所得攻击生物的起始浓度(在1×105～1×106CFU/mL之间)以及利用倒平板法计数样品中的生物载量(没有可检测到的生物载量)，其结果与表4和表5中的相同。利用倒平板法进行平板计数被证明是有效的。在样品的10-1稀释度回收接种物的平均值大于等于相应对照平均值的50％(表15)。对于细菌，与计算得到的起始浓度相比，在7天时有＞3.3log10的衰减，在14和28天有＞4.3log10衰减(表16和17)。对于酵母和霉菌，与计算得到的起始浓度相比，在7天时有大于等于4.1log10的衰减，在14和28天有大于4.6log10的衰减(表16和17)。
表15
由倒平板法所得平均回收接种物的量 攻击生物接种的平均CFU 从10-1稀释度回收的平均 CFU 平均回收百 分数
铜绿假单胞菌 65 64 98
大肠埃希氏菌 93 94 101
金黄色葡萄球菌 43 43 101
白色假丝酵母 84 79 94
黑曲霉 59 48 81
表16
在28天里的微生物数量 攻击生物 起始时计算的量 (CFU/mL) 7天 (CFU/mL) 14天 (CFU/mL) 28天 (CFU/mL)
铜绿假单胞菌 3.9×105 ＜100 ＜10 ＜10
大肠埃希氏菌 6.0×105 ＜100 ＜10 ＜10
金黄色葡萄球菌 2.0×105 ＜100 ＜10 ＜10
白色假丝酵母 3.6×105 ＜100 ＜10 ＜10
黑曲霉 6.0×105 50 ＜10 ＜10
阴性对照 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10
表17
在28天里微生物的Log衰减 攻击生物 Log衰减
7天 14天 28天
铜绿假单胞菌 ＞3.6 ＞4.6 ＞4.6
大肠埃希氏菌 ＞3.8 ＞4.8 ＞4.8
金黄色葡萄球菌 ＞3.3 ＞4.3 ＞4.3
白色假丝酵母 ＞3.6 ＞4.6 ＞4.6
黑曲霉 4.1 ＞4.8 ＞4.8
结论
本样品符合USP抗微生物效力试验的要求。
实施例5
概述
按照上面公布的有关抗微生物效力测试来进行试验，依照USP要求来评估1.1％苯甲醇在2mg/ml ACTIVASEt-PA中作为防腐剂的效力。该样品达到了USP抗微生物效力试验要求。
材料、设备和方法步骤
样品是在瓶中含有1.1％苯甲醇的ACTIVASEt-PA(2mg/mL)。明确地说，稀释液是加有适量苯甲醇使其终浓度为1.1％的无菌水。
攻击生物是那些在实施例1中所描述过的。
培养基、消耗品以及主要设备与实施例1中所标明的相同。
使用的步骤和方法与实施例1中描述的相同，接种条件是表1中的。接受标准和解释与实施例1中的相同。
结果
对于每一个供试品中计算所得攻击生物的起始浓度(在1×105～1×106CFU/mL之间)以及利用倒平板法计数样品中的生物载量(没有可检测到的生物载量)，其结果与表4和表5中的相同。利用倒平板法进行平板计数被证明是有效的。在样品的10-1稀释度回收接种物的平均值大于等于相应对照平均值的50％(表18)。对于细菌，与计算得到的起始浓度相比，在7天时有＞3.3log10的衰减，在14和28天有＞4.3log10衰减(表19和20)。对于酵母和霉菌，与计算得到的起始浓度相比，在7天时有大于等于3.6log10的衰减，在14和28天有大于4.6log10的衰减(表19和20)。
表18
由倒平板法所得平均回收接种物的量 攻击生物接种的平均CFU 从10-1稀释度回收的平均 CFU 平均回收百 分数
铜绿假单胞菌 65 61 94
大肠埃希氏菌 93 118 127
金黄色葡萄球菌 43 54 127
白色假丝酵母 84 77 91
黑曲霉 59 47 79
表19
在28天里的微生物数量
攻击生物 起始时计算的量 (CFU/mL) 7天 (CFU/mL) 14天 (CFU/mL) 28天 (CFU/mL)
铜绿假单胞菌 3.9×105 ＜100 ＜10 ＜10
大肠埃希氏菌 6.0×105 ＜100 ＜10 ＜10
金黄色葡萄球菌 2.0×105 ＜100 ＜10 ＜10
白色假丝酵母 3.6×105 ＜100 ＜10 ＜10
黑曲霉 6.0×105 ＜100 ＜10 ＜10
阴性对照 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10
表20
在28天里微生物的Log衰减 攻击生物 Log衰减
7days 14days 28days
铜绿假单胞菌 ＞3.6 ＞4.6 ＞4.6
大肠埃希氏菌 ＞3.8 ＞4.8 ＞4.8
金黄色葡萄球菌 ＞3.3 ＞4.3 ＞4.3
白色假丝酵母 ＞3.6 ＞4.6 ＞4.6
黑曲霉 ＞3.8 ＞4.8 ＞4.8
结论
本样品符合USP抗微生物效力试验的要求。
实施例6
概述
用BWFI、BNS和SWFI将阿替普酶(2mg/瓶rt-PA)溶解为1mg/mL。在37℃放置2周后，对该蛋白溶解在玻璃瓶中的稳定性进行检测。在在37℃保存14天后，所有溶解后的溶液外观均为无色澄明。该蛋白的浓度(1.1±0.02mg/mL)和pH(7.2±0.03)保持不变。通过非变性SEC法检测单体的百分数显示，在37℃放置1和2周后，分别有1-3％和4-5％的逐渐降低。在37℃放置1周后，观察到单链百分数和凝块溶解活性(在体外)的降低。然而，在37℃放置14天后，单链百分数和凝块溶解活性(在体外)迅速降低。在用SWFI溶解蛋白的溶液中观察到比用BWFI或BNS溶解的溶液更多该分子的蛋白水解碎片(clipping)或片段(fragment)。因此，阿替普酶(2mg/瓶rt-PA)用BWFI、BNS或SWFI溶解为1mg/Ml后，在37℃保存1周是相对稳定的。
材料和方法
A.材料
-阿替普酶(2-mg/瓶rt-PA)
-BWFI，USP，20mL(Abbott)
-抑菌性0.9％氯化钠(w/v)(BNS)注射液，USP，20mL(Abbott)
-SWFI，USP，20mL(Abbott)
B.方法
用BWFI、BNS和SWFI(重复两次)将阿替普酶(2mg/瓶rt-PA)溶解为1mg/mL。溶解后的蛋白溶液在37℃贮存。通过下面列出的测定方法对溶解后蛋白溶液在保存3小时、7天和14天后的稳定性进行评估。
为了用HIAC/ROYCO进行颗粒计数，进行了一个独立的试验。阿替普酶(2-mg rt-PA)用BWFI、BNS或SWFI(重复两次)溶解为1mg/mL。每个时间点每组有4瓶一起混合在一个瓶中(最初的5-mL玻璃瓶)。在37℃保存T＝0、3小时、7天和14天时，进行颗粒计数(按3×1mL取样，弃去第一次运行结果)。
C.测定
(1)颜色和澄清度
每个样品放在玻璃管中，在一个装备有黑白背景的灯箱中进行检查。该样品的颜色和澄清度由此可记录下来。
(2)HIAC/ROYCO
四瓶溶解后的蛋白溶液混合后用于此项检查。对小体积非肠道注射药物进行颗粒物质分析，所用方法有如下修改，即取体积为1mL的样品用1mL注射器来测试，而不是取体积为5mL的样品用10mL注射器来检测。将对大小范围在≥10以及≥25μm颗粒的计数记录下来。
(3)pH
所选等分溶液的是采用配备有一个混合pH电极的RADIOMETER PHM93TM pH计(Microelectrodes，Inc.)来测定的。该pH计用pH4.01和7.00标准缓冲液(Mallinckrodt，Inc.)来校准。20μL该等分溶液转入一个0.5-mLEppendorf管用于测试。
(4)UV测定浓度
蛋白浓度通过在280nm的UV吸收来测定。使用UV/VIS二极管阵列分光光度计，用光路长度1cm的石英比色杯进行测定。样品用制剂缓冲液稀释10～12.5倍。该测试采用合适的参比物进行空白校正，然后进行240～400nm的UV扫描。蛋白浓度如下进行计算：
Conc.，mg/mL＝(A280-A320)/1.9，其中1.9是rt-PA在280nm下的吸收率(mL/mg-cm)。
(5)通过非变性SEC法确定％单链
在配有二极管阵列检测器的HP1090TM液相色谱(LC)上使用TSK3000SWXLTM(ToSoHaas，300×7.5-mm i.d.，5-μm)柱。流动相是0.2M精氨酸、0.12M硫酸氨、10％异丙醇，pH7.3的溶液。流速为1mL/min。样品(50μg rt-PA等同物)单针(singlet)进样，在280nm检测收集色谱图。单体百分数以如下方式计算：
％单体＝(单体峰面积/总蛋白峰面积)×100
(6)通过还原性SEC法确定％单链
在配有二极管阵列检测器的HP1090TM LC上使用TSK 3000SWXLTM(ToSoHaas，300×7.5-mm i.d.，5-μm)柱。流动相是0.2M精氨酸、0.1％SDS、pH6.8的溶液。流速为1mL/min。样品(12.5μg rt-PA等同物)与20mM DTT(终浓度)在37℃温浴3～5分钟，然后单针(singlicate)进样。在检测波长214nm下监测色谱图。单链(SC)百分数如下计算：
％SC＝(第一个主峰面积/第一和第二个主峰的峰面积之和)×100。
(7)rt-PA对纯化后的凝块溶解活性
该蛋白的效力通过如下实施例7中所描述的纯化凝块溶解测试来评估。样品用稀释液稀释为检测范围内(200-1000ng/mL)的两个浓度。稀释在测试的前一天完成，稀释后的样品保存在2～8℃直到第二天分析。rt-PA对照品原料以同样方式稀释作为内部参考品。
结果
本研究结果展示在表21和22中。在37℃保存14天后，所有溶解的溶液外观都是无色澄明的。蛋白浓度(1.1±0.02mg/mL)和pH(7.2±0.03)保持不变。表21展示阿替普酶(2mg/瓶rt-PA，n＝1)用BWFI、BNSH和SWFI溶解为1mg/mL，在37℃保存后用HIAC/ROYCO所做的颗粒计数。该表显示所有溶解后的蛋白溶液与稀释液自身相比，其颗粒数(≥10和25μm)都有增加。不过，所有的结果都很好地处于USP对小体积注射液规定的限度之内(SVI，见表23)。看起来溶解后的药物产品在37℃保存时间过长后颗粒数会减少。颗粒计数结果还显示，用BWFI和BNS溶解的蛋白溶液比SWFI溶解的有较少的颗粒数。
所有经溶解的溶液在37℃放14天(表22)后，剩余有94～95％的单体。％单链和凝块溶解活性(在体外)检验表明37℃一周以后都有降低。用SWFI或BNS溶解的蛋白溶液中％单链高于用SWFI溶解的蛋白溶液中的％单链。这不能归于任何一种理论，可能是防腐剂抑制蛋白水解活性的结果。在37℃两周后，用SWFI溶解的蛋白溶液中单链百分数减少至等于或小于50％，这个值低于关于rt-PA中单链稳定性的标准规定(≥55％)。
除了一条链向两条链的转化，在37℃两周后对溶解后蛋白溶液的还原性SEC色谱显示了该分子的剪切碎片或片段，提示在随时间提高温度时蛋白水解切割作用增加(见图1)。图1清楚地显示除了剪切碎片或片段以外，在37℃保存14天后，在用SWEI溶解的rt-PA中能观察到比用BWFI或BNS溶解更多的一条链向两条链rt-PA转化的情况。
凝块-溶解活性(在体外)表明所有溶解后的阿替普酶溶液(1mg/mL)在37℃放3小时后，都能保持超过或等于100％的效力(表23)。所有样品是无色或澄明的。在37℃保存1周后活性开始降低，但仍有约90％的活性(相对于起始来说，T＝0)保留下来。在37℃两周后，活性明显降低，只剩下44～65％的活性。
表21
溶解后的阿替普酶(1mg/mL，2mg/瓶rt-PA)在37℃保存
3小时、7天和14天后，用HIAC/ROYCO进行的颗粒计数 HIAC/ROYCO
≥10μm/mL≥10μm/瓶 ≥25μm/mL ≥25μm/瓶
T＝0：BWFIrt-PA/BWFI 89 725.5 196 1596 5.5 7 12 15
T＝0：BNSrt-PA/BNS 50 474.5 110 1044 7 8.5 15 19
T＝3h，37℃BWFIrt-PA/BWFI 1 474 2 948 0 3.5 0 8
T＝3h，37℃BNSrt-PA/BNS 10.5 200 23 440 0 1 0 2
T＝0：SWFIrt-PA/SWFI 10.5 603 23 1327 0 10.5 0 23
T＝0：BWFIrt-PA/BWFI 2.5 877.5 6 1931 0 18.5 0 41
T＝0：BNSrt-PA/BNS 2 225 4 495 0 2.5 0 6
T＝7d，37℃：SWFIrt-PA/SWFI 13.5 302.5 30 666 0 0 0 0
T＝7d，37℃BWFIrt-PA/BWFI 302.5 2 132.5 4 292 0 1 0 2
T＝7d，37℃BNSrt-PA/BNS 2 32.5 4 72 0 0.5 0 1
T＝0：SWFIrt-PA/SWFI 6.5 796.5 14 1752 0 6 0 13
T＝0：BWFIrt-PA/BWFI 4.5 564 10 1241 0 13.5 0 30
T＝0：BNSrt-PA/BNS 1 587 2 1291 0 4 0 9
T＝14d，37℃：SWFIrt-PA/SWFI 4.5 491 10 1080 0 2.5 0 6
T＝14d，37℃：BWFIrt-PA/BWFI 1.3 56.3 3 124 0 3 0 7
T＝14d，37℃：BNSrt-PA/BNS 0.5 55 1 121 0 0 0 0
表22
阿替普酶(2mg/瓶rt-PA)在玻璃瓶中
用BWFI、BNS和SWFI溶解为1mg/mL后在37℃的稳定性 pH 浓度(通 过SEC) mg/mL 非还原 SEC(％ 单体) 还原 SEC (％SC) 凝块溶解
(mg/mL) (×103 IU/mg) 相对 ％活 性*
T＝0：rtPA/BWFI A B 7.23 7.24 1.11 1.11 98.7 98.6 85.5 85.5 0.97±0.02 1.00±0.01 5.07 5.23 100 100
T＝0：rtPA/BNS A B 7.18 7.19 1.11 1.09 98.4 98.3 85.5 85.5 1.03±0.02 0.99±0.05 5.38 5.27 100 100
T＝0：rtPA/SWFI A B 7.26 7.25 1.10 1.10 98.3 98.2 85.5 85.4 1.07±0.02 1.04±0.04 5.64 5.48 100 100
T＝3h，37℃：rtPA/BWFI A B 7.24 7.25 1.12 1.08 98.3 98.2 85.2 98.3 1.08±0.005 1.01±0.035 5.59 5.42 110 104
T＝3h，37℃：rtPA/BNS A B 7.18 7.20 1.11 1.10 98.0 97.9 85.3 85.3 1.07±0.01 1.04±0.015 5.59 5.48 104 104
T＝3h，37℃：rtPA/SWFI A B 7.25 7.25 1.11 1.10 98.2 98.1 85.2 85.2 1.04±0.04 1.11±0.035 5.43 5.85 96 107
T＝7d，37℃：rtPA/BWFI A B 7.25 7.26 1.12 1.11 95.9 96.2 72.8 73.0 0.86±0.03 0.92±0.025 4.45 4.81 88 92
T＝7d，37℃：rtPA/BNS A B 7.20 7.20 1.10 1.07 96.9 97.0 75.1 74.9 0.91±0.045 0.89±0.005 4.80 4.82 89 91
T＝7d，37℃：rtPA/SWFI A B 7.28 7.27 1.11 1.12 97.5 97.2 68.7 67.6 1.00±0.03 0.94±0.01 5.23 4.87 93 89
T＝14d 37℃：rtPA/BWFI A B 7.26 7.27 1.10 1.09 94.5 93.8 58.0 58.4 0.56±0.02 0.57±0.03 2.95 3.03 58 58
T＝14d 37℃：rtPA/BNS A B 7.22 7.22 1.11 1.10 94.0 93.9 62.2 62.1 0.62±0.015 0.62±0 3.24 3.27 60 62
T＝14d 37℃：rtPA/SWFI A B 7.31 7.29 1.16 1.16 94.0 93.9 49.2 49.0 0.73±0 0.48±0.01 3.65 2.40 65 44
*％活性(IU/mg)相对于起始时的(T＝0)。
表23
注射剂的颗粒物限度 小体积注射剂SVI(基于每个容器)： ＞10μm＞25μm
光阻法 6000 600
显微法 25 3
结论
阿替普酶(2mg/瓶rt-PA)在玻璃瓶中用BWFI、BNS或SWFI溶解为1mg/mL后，在37℃一周是相对稳定的。相信BNS溶液应该是抗微生物的，因为该活性成分是苯甲醇。用BNS所进行的稳定性试验是肯定的，也就是说阿替普酶是稳定并有功能的。
实施例7
概述
T-PA用生理盐水稀释至0.01mg/mL后，在凝块溶解效力检验中发现其仍有溶解活性。此检验中，凝血酶和纤维蛋白原混在一起以生成纤维蛋白；纤维蛋白溶酶原和rt-PA混在一起以产生纤溶酶；与纤维蛋白放在一起然后纤溶酶溶解凝块。该试验测试t-PA与纤维蛋白溶酶原一起作用形成纤溶酶然后溶解凝块的效力。
材料和方法
A.材料：
用含有0.9％NaCl(生理盐水，NS)的静脉注射(IV)袋(Baxter和/或Abbott，250mL)将阿替普酶(2mg/瓶rt-PA)稀释至蛋白终浓度为0.01、0.025、0.05和0.1mg/mL浓度系列。具体地，rt-PA，蛋白原液，用经过过滤的MILLI-QTM水稀释为1mg/mL(50-mg瓶配制剂等效物，0.004％TWEEN 80TM表面活性剂)，或是通过使用60-cc BD注射器和18G针直接插入瓶子上位于药饼块中央的橡胶隔膜注入液体的方法，将100-mg/瓶rt-PA用无菌注射用水USP(SWFI)溶解为1mg/mL(0.008～0.011％TWEEN 80TM表面活性剂)的溶液。瓶子通过颠倒或滚动而轻柔混匀，直到药饼完全溶解。撤去静脉注射稀释液(0.9％NaCl，NS)并替代以同样量经如下方式溶解或稀释至1mg/mL的rt-PA溶液：
终浓度(mg/mL)从250-mL IV袋*中移出的体积(mL)
(接着用同体积的1mg/mL rt-PA替换)
0.05 12.5(30-cc BD注射器和18G针头)
0.024 6(10-cc BD注射器和22G针头)
0.01 2.5(3-或5-cc BD注射器和22G针头)
·溢出袋子外的终体积不计在内。
在稀释液进入袋子之后(每个浓度n＝2)，通过颠倒方式(约20～24分钟)轻轻将袋混匀。用10-cc BD注射器和22G针头从IV袋子的入口吸去10mL等分溶液。取一等分(t＝0)直接分入一个20-cc I型清澈透明玻璃瓶中用于目测观察。同样地，对在0.025和0.05mg/mL浓度下的同等安慰剂也进行物理检查。
B.检验：
1.目测观察
每一等分在配有黑白背景的灯箱下进行检查。各等分与作为对照的，在一个大小相同的玻璃瓶中等体积的SWFI或经过过滤的MILLI-QTM水进行比较。相应地记下各等分溶液的颜色和澄清度。
2.纯化凝块溶解试验(微量离心分析仪(试验1)以及读板机(试验2))：
阿替普酶t-PA蛋白的效力通过下述纯化凝块溶解试验来评估。样品用稀释液稀释为在测试范围内(200-1000ng/mL)的3或2个浓度。稀释在测试前一天完成，稀释后的样品保存在2～8℃直到第二天分析。Rt-PA参考品原料以同样方式稀释作为内部对照品。
a.设备：
使用了型号为no.761TM的IL MONARCH微量离心分析仪，包括一个具有荧光和光散射性能的分析仪、配制在一起的(built in)电脑和一个载样装置。
b.试剂：
-1％(v/v)POLYSORBATE 80TM乳化剂(JT Baker).
-检测缓冲液：0.06M磷酸钠(0.0114 F NaH2PO4.H2O，0.0486 F Na2HPO4)，其中含有0.02％(w/v)NaN3和0.01％(v/v)POLYSORBATE 80TM乳化剂，pH7.4±0.1。
-人凝血酶(30-40单位/mL)(Calbiochem)直到准备使用之前，一直要在封口瓶中于-60℃或-60℃以下冷冻保存。
-纤维蛋白溶酶原在用前一直冷冻保存于-60℃或-60℃以下。
-按如下要求准备生物细胞纤维蛋白原：纤维蛋白原和凝块溶解缓冲液放置平衡至室温。总体积7Ml凝块溶解缓冲液加入瓶中。去掉瓶帽并用封口膜封口。将瓶子以其侧面放置盘中或绑在轨道混合器上。速度设置在4～5之间。瓶子可摇动多至1小时，同时随时对其进行检查看药饼溶解得如何。待药饼完全溶解后，将该溶液转移至一个50-mL Falcon试管中。瓶子用凝块溶解缓冲液清洗至少3次，然后清洗液转入一个Falcon试管以捕获任何残留的小球或颗粒。利用管子上的刻度标记将该溶液的终体积调至30mL。将管子用封口膜封口后放置振荡器上摇动15～30分钟。在震荡后所有蛋白都溶解。该溶液在冰上放置至少2～3小时并进行周期性地轻微摇动。使用WHATMANTM No.1滤纸，通过将溶液从沉淀倾倒出来的方式过滤该溶液。过滤后的溶液继续放置在冰上。
-对照品原料(标准的ACTIVASER t-PA)。所有含有t-PA的溶液都要保存在聚苯乙烯或聚丙烯容器中。
c.标准品制备：
从对照品原料开始，制备出10-μg/mL的标准品贮存溶液。稀释过程记录于测试数据表上。剩余标准品按照下面的稀释表进行制备。所有标准品都保持在冰上，标准曲线的终止点为准备时间点的12个小时以后。
标准品 rt-PA来源 测试缓冲液
200ng/mL 200μL标准品贮液 9.8mL
400ng/mL 400μL标准品贮液 9.6mL
600ng/mL 600μL标准品贮液 9.4mL
800ng/mL 800μL标准品贮液 9.2mL
1000ng/mL 1000μL标准品贮液 9.0mL
重复进行标准品贮液和剩余标准品的制备，以制备两条标准曲线。
d.样品的制备：
i.初始制备
如果样品是最终的一瓶冻干原料，就用一定体积的注射用水(WFI)将之溶解为1mg/mL。如果样品是无菌原液原料，就用WFI把它稀释为1mg/mL。
ii.样品贮液的制备
利用微量取液器将1.0-mg/mL rt-PA的样品100μL吸入15-mL聚苯乙烯试管。用一个10-mL的具刻度聚苯乙烯移液管或容量吸液管加微量取液器将总共9.90mL的测试缓冲液加入该试管。此溶液被称为样品贮存液。
iii.工作样品的制备
用微量取液器将600μL样品贮液吸入15-mL的聚苯乙烯试管。用10-mL的具刻度聚苯乙烯移液管或容量移液管加微量取液器将9.40mL测试缓冲液加入该试管。这就是奖装入样品杯的样品溶液。稀释后的样品保持在冰上。
iv.重复样品贮液制备和工作样品的制备步骤来制备两个样品稀释。
v.阳性测试对照的制备
这个对照的制备是通过将样品溶解成为1mg/mL的溶液、吸取0.5-mL等分进入Eppendorf管然后冷冻保存于-60℃来完成的。在该测试运行的每天融化一支新的管。用100μL样品，以与样品同样的方式稀释该对照。稀释后的对照样品保持在冰上。
e.MONARCH 2000TM分析仪的使用程序(测试1)：
测试以如下方式工作：试剂是那些加入另一种将参加化学反应的物质溶液中的物质。在此情况中，船(boat)1的内容将与船2的内容反应以形成标准的凝块。凝血酶(船2)与纤维蛋白溶酶原和纤维蛋白原(船1)混合后，引起纤维蛋白原向纤维蛋白的转化并形成由纤维蛋白溶酶原和纤维蛋白组成的标准体外凝块。然后将t-PA的供试样品与该凝块放在一起。T-PA造成纤维蛋白溶酶原向纤溶酶转化，然后纤溶酶打断纤维蛋白链。由于凝块断裂，在(光)吸收特性上就发生了改变。该吸收值对时间做图。
分析仪的吸液管头要经检查以确保它们正确排列，而且贮水池也要检查以确保是满的。如果必要注射器需除泡，而且要进行冲洗循环。
该分析仪参数如表24中所示。
表24
分析仪参数 鉴别参数
测试码 24
测试名称 普通吸收
测试记忆 GNABS
光学模式 吸光值
装载参数
装载类型 装载温浴分析(Load(Crit.)incubate analyze)
试剂空白 打开
参考品类型 稀释液
样品体积 20μL
样品稀释液 0μL
试剂稀释液 0μL
1st试剂 200μL
2nd试剂 20μL
1st试剂条码 T1
2nd试剂条码 T2
数据获得参数
分析类型 混合 运行
温度 37℃
温浴时间 5min.
延迟时间 280sec*
间隔时间 5sec*
数据点编号 90*
滤光器1 340nm
滤光器2 340nm
单色光镜1 340nm
单色光镜2 340nm
*这些项目应根据确保获得完整数据的要求来调整。
试剂船1是通过将200μL溶解后的纤维蛋白溶酶原加入10.0mL经过滤的纤维蛋白原中来制备的。是轻微混匀然后加入试剂船1的。试剂船1放入分析仪试剂表的第一个位置。
试剂船2是通过将上面所述的33单位/mL凝血酶溶液加入试剂船2来制备的。试剂船2放在分析仪的2位置里。
0.25-mL样品杯放置在样品环中。使用可丢弃转移吸液管或PIPETMANTM吸液管，将样品杯用标准品、对照以及如指示出装载方案的表25中所显示的那些样品充满。如果运行的样品不到两个，装样如显示的那样进行，但要将测试缓冲液或水用吸液管加入所有插入的空样品杯中。
表25
指示的装样方案 样品ID 杯No. 比色杯No.
200ng/mL标准品(I) 1 3
400ng/mL标准品(I) 2 4
600ng/mL标准品(I) 3 5
800ng/mL标准品(I) 4 6
1000ng/mL标准品(I) 5 7
测试对照rep1 6 8
200ng/mL标准品(II) 7 9
样品1 dil 1 rep1 8 10
样品1 dil 2 rep1 9 11
样品2 dil 1 rep1 10 12
样品2 dil 2 rep1 11 13
测试对照rep2 12 14
400ng/mL标准品(II) 13 15
样品1 dil 1 rep2 14 16
样品1 dil 2 rep2 15 17
样品2 dil 1 rep2 16 18
样品2 dil 2 rep2 17 19
测试对照rep3 18 20
600ng/mL标准品(II) 19 21
样品1 dil 1 rep3 20 22
样品1 dil 2 rep3 21 23
样品2 dil 1 rep3 22 24
样品2 dil 2 rep3 23 25
测试对照rep4 24 26
800ng/mL标准品(II) 25 27
样品1 dil 1 rep4 26 28
样品1 dil 2 rep4 27 29
样品2 dil 1 rep4 28 30
样品2 dil 2 rep4 29 31
测试对照rep5 30 32
1000ng/mL标准品(II) 31 33
样品1 dil 1 rep5 32 34
样品1 dil 2 rep5 33 35
样品2 dil 1 rep5 34 36
样品2 dil 2 rep5 35 37
按下MONARCHTM分析仪上的“特殊要求”按钮。输入样品杯信息。按两次“接受”按钮。在MONARCHTM分析仪完成取样后，试剂船被移走并放置在冰上。移走样品环并放在2-8℃的冰箱中。
i.终点确定：
终点(裂解时间)可以通过电脑程序或手动来确定。对于由电脑进行的自动计算，终点是裂解凝块所需要的时间，可以自动确定。对于手动终点确定来说，终点被限定为，在变化小于0.003吸收单位时低于0.03吸收单位的第一时间点。明确地说，对于手动确定来说，终点是由吸收时间数据来确定的。第一个小于0.0300的吸收点被定位。如果在当前和下一个吸收之间的变化小于0.0030，终点就是第一个小于0.0300的吸收值出现的时间。如果δ吸收大于0.0030，则移动到另一个吸收读数并确定该δ吸收。终点是δ吸收小于0.0030的一对(起始和随后的吸收值)中的第一个吸收值。
ii.计算：
对每一个标准曲线点的平均裂解时间进行计算。标准品浓度(ng/mL)和平均终点时间(以秒表示的)被转化成log值。log浓度(x-轴)对log时间(y-轴)的标准曲线制备出来。
利用从线性回归分析中所得的斜率和截距值，从log裂解时间(终点)计算出每一个样品的log浓度。取所得对数(log)浓度的反对数(antilog)然后乘以稀释因子(例如1667)以得到单位/mL。
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X(样品稀释度)X(1单位/mg)。
利用系统适用性试验来评估出标准曲线的系统适用性。要在此试验中确定为有效，标准品的相关系数必须在-0.997～-1.000，而对照必须在其可接受值的±10％之内。如果系统适用性达不到要求，标准曲线可以通过利用不少于4个连续点(即第一个或最后一个标准品可忽略)的线性回归分析进行重新定义。
结果按要求报告为单位/瓶、单位/mg、单位/mL、IU/瓶、IU/mg或IU/mL。对于对照，要对所有5个重复进行平均。系统适用性按上述进行评估。对于终产品样品瓶，要对每个样品稀释度的所有5个重复进行平均。报告来自两个样品稀释度的平均结果。报告为单位/瓶的形式，其中单位/瓶＝平均单位/mL×mL/瓶。对于原液样品，要对每个样品稀释度的所有5个重复进行平均。报告来自两个样品稀释度的平均结果。以单位/mg来报告，其中：
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(单位/mg)
*单位/mL或单位/mg可以通过乘以适当的国际单位转换因子来转化为国际单位(IU)/mL或IU/mg。
至于COA和稳定性试验，三天中每一天使用一个转子来重复样品的测试。报告三天的样品平均值结果。该测试可根据内控对照结果和/或根据确定或不确定误差来重复。最终结果可以汇报为多次试验的平均值。
f.读板机测试2的程序方法：
打开读板机将自动调温器温度设置为25℃。灯可以至少预热半小时。每个孔中加入20μL凝血酶。凝血酶可用多通道移液器从试剂池或过渡板中移出加入。以20μL每孔将稀释后的标准品(两个重复)加入B2-B6孔和C2-C6孔中。以20μL每孔将对照加入D2-G2孔，将样品以20μL每孔，以四个重复按垂直方式加入剩余孔中，最大可达每块板9个样品。不含标准品、对照或样品的第B-G行的孔中应含有20μl检测稀释液。rt-PA样品可以用单道移液器一个一个加入，或用多通道移液器从过渡板取出。
指示性的板分布图|
200ng Std 400ng Std 600ng Std 800ng Std 1000ng Std测试Dil测试Dil测试Dil测试Dil测试Dil
200ng Std 400ng Std 600ng Std 800ng Std 1000ng Std测试Dil测试Dil测试Dil测试Dil测试Dil
对照 样品-1 样品-2 样品3 样品4样品5样品 6样品7样品8样品9
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在加入纤维蛋白溶酶原之前，使得纤维蛋白原溶液达到室温。以尽可能快的速度以200μL每孔将纤维蛋白原-纤维蛋白溶酶原加满整板。
加入纤维蛋白原-纤维蛋白溶酶原之后，立即将板放入读板机并开始进行数据采集。第一次读数在加入纤维蛋白原-纤维蛋白溶酶原的两分钟时间内得到，以便记录下凝块的最大吸收值。
采集该板在340nm处的吸收值，以适当的时间间隔(一般为30秒)读数，直到达到所有孔的基线吸收(一般1小时)。
i.计算：
按如下方式进行终点确定(半数最大裂解时间)：裂解时间计算为吸收达到最大吸收一半的时间。最大吸收相对应于该孔所记录的凝块最不透明时。背景吸收相对应于完全裂解后凝块的最小吸收。对每一个标准品、对照和样品重复的原始数据点(以秒表示的裂解时间)进行平均。计算该平均值的log。
通过输入裂解时间(log秒-y轴)对标准曲线蛋白浓度(log ng/mL-x轴)的数据绘制标准曲线。
利用从线性回归分析中获得的斜率和截距值，从log裂解时间计算每个样品的log浓度。取得所得log浓度的反对数值，然后乘以稀释因子(例如1667)以获得单位/mL。
![]()
X(样品稀释度)X(1单位/mg)。
对于终产品样品瓶，单位报告为单位/瓶的形式，其中：
单位/瓶＝平均单位/mL×mL/瓶。
如果无菌原液样品要求有特异活性，要以单位/mg汇报所有5个重复的平均值，其中：
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(单位/mg)
*单位/mL或单位/mg可通过乘以适当的国际单位转换因子转换为国际单位(IU)/mL或IU/mg。
确定系统适用性。确定为有效的系统适用性，标准品的相关系数必须在-0.995～-1.000，而对照必须在其可接受值的±10％之内。如果系统适用性达不到要求，标准曲线可以通过利用不少于4个连续点(即第一个或最后一个标准品可忽略)来再次运行计算程序，进行重新定义。
rt-PA的活性按测试数据表的要求报告为单位/瓶、单位/mg、单位/mL、IU/瓶、IU/mg或IU/mL。该测试可根据内控对照结果和/或根据确定或不确定误差来重复。最终结果可以汇报为多次试验的平均值。
结果
阿替普酶t-PA用NS稀释至0.01、0.025和0.05mg/mL，室温下刚刚灌注和24小时后(没有过滤)，目测观察外观是无色、澄明至轻微乳白色的溶液。在NS中为0.1mg/mL时，在刚刚稀释后阿替普酶t-PA看起来为轻微地云状溶液，并且在整个灌注过程中保持此状。
在大多数情况下，通过凝块裂解活性测试来评估，在24小时过程中对所有浓度的所有分部收集物都表现出高于90％的特异活性。
结论
保存在环境条件下24小时后，在0.9％NaCl IV袋子(500mL)中稀释至0.01、0.02和0.05％mg/mL的t-PA(5mg/mL)经回收后仍有裂解活性。
实施例8
概述
替尼普酶在生理盐水中稀释至0.01mg/mL后，在凝块裂解效力测试中发现仍有裂解活性。在此测试中，凝血酶和纤维蛋白原混合在一起以产生纤维蛋白；纤维蛋白溶酶原和替尼普酶混合在一起以产生纤溶酶；纤维蛋白和纤溶酶在一起则溶解凝块。该试验测试替尼普酶与纤维蛋白溶酶原作用以形成纤溶酶从而裂解凝块的效力。
材料和方法
A.材料和化学试剂
*Teneteplase，TNKASETM，50mg瓶
*0.9％NaCl注射液，USP，500mL(Baxter)
*10mL SWFI，USP(Abbott)
*3-cc，5-cc和10-cc BD注射器
*22G 1.5针头
*5-cc WHEATONTM Type I透明玻璃瓶
*20-mm灰色丁基橡胶封液塞
B.方法
由Genentech，Inc.(例如美国专利5,612,029)获得的替尼普酶(TNKASETM，t-PA的变体)(50mg/瓶)用10mL的SWFI溶解为5mg/mL。用3和5cc注射器和22G针头，分别以两个重复从分离的IV袋(500mL NS，Baxter)中移出1、2和5mL生理盐水。替换以同样体积的溶解药品，使得替尼普酶在袋子中终浓度为0.01、0.02和0.05mg/mL。这些袋子随后通过颠倒轻柔混匀。用10-cc注射器经IV口取出10-mL等分经稀释的替尼普酶溶液样品，然后分装进2个5-cc干净透明的玻璃瓶(一个瓶中装6mL，剩余的入另一个瓶子)。含有稀释后的替尼普酶的IV袋子放在一个长椅顶端，环境条件下在正常荧光灯下放置24小时。在贮存8和24小时后从这些IV袋子中对其它等分(每个10mL)取样。
C.测试
利用RADIOMETER PHM 93TM Ph计和微电极(MI-410TM，Microelectrode，Inc.)进行pH测定。pH计用在测量前放置为环境条件的pH4.01和7.00缓冲液标准进行校正。
所有替尼普酶的等分都参与如上所描述的凝块裂解试验，以便确定替尼普酶在这些等分中的体外生物活性。样品用稀释液稀释至位于检测范围(200～500ng/mL)内的2或3个不同浓度。替尼普酶用作内部对照品。所有获得的值均以替尼普酶对照物质值来规范。离心前后的生物活性用凝块裂解试验来测试。
结果
结果的概述显示在表26。观察到的较高浓度替尼普酶(0.05mg/mL in NS)的pH(7.1-7.2)微微高于较低浓度替尼普酶的pH(pH6.7-6.8和6.8-6.9，分别在0.01和0.02mg/mL)。这是由于大量经缓冲过的替尼普酶(5mg/mL，pH7.3)加入IV袋中直接用于初始稀释。但在环境条件下保存24小时后，所有的pH值均保持不便。
在每一个样品等分离心前后，进行凝块裂解活性和蛋白浓度(通过RP-HPLC确定)测定。这是为了确保在检验前除去所有肉眼不可见的沉淀，从而能对结果进行更精确的解释。在所有情况下，离心后的结果在活性和浓度上都略低于离心前的，说明有少量沉淀产生。表26显示离心前后浓度百分数的变化，说明蛋白刚稀释后起始浓度为0.01和0.02mg/mL时，蛋白损失要高于浓度较高(0.5mg/mL)的情况。在低浓度(0.01mg/mL)下百分数变化也随保存时间而增加。在0.01mg/mL时，在刚稀释后浓度的百分数变化是57％，在24小时后增加至71％。在0.02和0.05mg/mL下没有观察到明显的变化。在不受任何理论约束的前提下，这种结果可以解释为低浓度下蛋白吸附更显著，这种现象通常会马上发生且随时间饱和。
表27显示，相对于目标浓度在0.01、0.02和0.05mg/mL的蛋白回收百分数分别为40-50％、65％和86-92％。回收百分数低于估计是因为IV袋内的溢出体积没有计算在内，蛋白回收将至少低于预期目标浓度10％(假设在IV袋内有10％溢出)。
在环境条件下保存24小时，回收蛋白的凝块裂解活性(离心后)没有明显变化。在0.01、0.02和0.05mg/mL下，回收蛋白的总体特异活性百分数分别为≥100％、≥92％和≥80％(表27)。
表26
稀释在0.9％NaCl IV袋(500mL)内的替尼普酶稳定性概述 时间 目标浓度* (mg/mL) pH 凝块裂解 (-cent) (mg/mL) 凝块裂解 (+cent) (mg/mL) 浓度** (-cent) (mg/mL) 浓度** (+cent) (mg/mL) ％浓度 变化 (±cent)
T＝0 0.01 6.70 0.006 0.004 0.007 0.004 57
T＝0 0.01 6.73 0.006 0.004 0.007 0.004 57
T＝0 0.02 6.83 0.015 0.012 0.017 0.013 76
T＝0 0.02 6.93 0.015 0.012 0.017 0.013 76
T＝0 0.05 7.12 0.040 0.037 0.048 0.045 94
T＝0 0.05 7.15 0.041 0.036 0.047 0.046 98
T＝8小时 环境条件 0.01 - 0.007 0.005 0.007 0.004 57
T＝8小时 环境条件 0.01 - 0.008 0.006 0.008 0.005 63
T＝8小时 环境条件 0.02 - 0.015 0.012 0.016 0.013 81
T＝8小时 环境条件 0.02 - 0.013 0.012 0.016 0.013 81
T＝8小时 环境条件 0.05 - 0.039 0.034 0.047 0.045 96
T＝8小时 环境条件 0.05 - 0.039 0.037 0.047 0.045 96
T＝24小时 环境条件 0.01 6.77 0.007 0.005 0.007 0.005 71
T＝24小时 环境条件 0.01 6.71 0.007 0.006 0.007 0.005 71
T＝24小时 环境条件 0.02 6.86 0.015 0.013 0.016 0.013 81
T＝24小时 环境条件 0.02 6.90 0.016 0.012 0.016 0.013 81
T＝24小时 环境条件 0.05 7.10 0.043 0.040 0.0480 0.043 90
T＝24小时 0.05 7.07 0.043 0.040 0.0460 0.044 96
*目标浓度，IV袋溢出的没有计算在内。
**RP-HPLC的浓度。
-cent＝离心前
+cent＝离心后
表27
稀释后的替尼普酶在贮存中生物活性、蛋白回收％以及特异活性％ 时间 浓度* (mg/mL) 浓度**(+cent) (mg/mL) 蛋白回收％(目标浓度的) 凝块裂解(+cent)(mg/mL) 特异性 活性％
T＝0 0.01 0.004 40 0.004 100
T＝0 0.01 0.004 40 0.004 100
T＝0 0.02 0.013 65 0.012 92
T＝0 0.02 0.013 65 0.012 92
T＝0 0.05 0.045 90 0.037 82
T＝0 0.05 0.046 92 0.036 78
T＝8小时环境条件 0.01 0.004 40 0.005 125
T＝8小时环境条件 0.01 0.005 50 0.006 120
T＝8小时环境条件 0.02 0.013 65 0.012 92
T＝8小时环境条件 0.02 0.013 65 0.012 92
T＝8小时环境条件 0.05 0.045 90 0.034 76
T＝8小时环境条件 0.05 0.045 90 0.037 82
T＝24小时环境条件 0.01 0.005 50 0.005 100
T＝24小时环境条件 0.01 0.005 50 0.006 120
T＝24小时环境条件 0.02 0.013 65 0.013 100
T＝24小时环境条件 0.02 0.013 65 0.012 92
T＝24小时环境条件 0.05 0.043 86 0.040 93
T＝24小时环境条件 0.05 0.044 88 0.040 91
*目标浓度，IV袋溢出的不计在内。
**RP-HPLC浓度
+cent＝离心后
％蛋白回收＝[浓度(+cent)，mg/mL/目标浓度，mg/mL]×100％
％特异性活性＝[凝块裂解(+cent)，mg/mL/浓度(+cent)，mg/mL]×100％
结论
如同上面提到的t-PA，在0.9％NaCl IV袋(500mL)中稀释至0.01、0.02和0.05％mg/mL的替尼普酶(5mg/mL)，在环境条件下保存24小时后回收仍有裂解活性。
前述组合物和制剂预期在防止导管表面被感染性生物如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和真菌的附着和定植方面，将会有效。