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用于使哺乳动物组织中的脂质水平正常化的组合物和方法
参照相关申请
本申请享有于2001年11月26日申请的美国在先专利申请60/333,422的权益，该专利申请在此引入作为参考。
发明领域
本发明提供用于在细胞或组织中调节脂质水平的以及确定可用于调节脂质水平的试剂的方法和组合物。本发明可用于生物学和医学领域。
技术背景
脂质代谢紊乱在各种疾病和病理状态中起重要作用。例如，确凿证据说明骨骼肌中脂质蓄积是重要的代谢异常，表示不仅在肌肉本身而且在肝脏、脂质中产生胰岛素抵抗。McGarry等，如果Minkowski已经失去味觉将会怎样？另一角度看糖尿病(What if Minkowski had been ageusic？An alternative angle ondiabetes)科学，1992年10月30日；258(5083)：766-70；Ellis等，长链酰基辅酶A酯作为大鼠和人的肌肉中的脂质代谢和胰岛素敏感性的指示剂(Long-chain acyl-CoA esters as indicators of lipid metabolism and insulinsensitivity in rat and human muscle.)，美国生理学内分泌代谢杂志，2000年9月；279(3)E554-60；Furler等，高脂质膳食影响大鼠中的胰岛素刺激的转运后肌肉葡萄糖代谢(A high-fat diet influences insulin-stimulatedposttransport muscle glucose metabolism in rats)，代谢，1997年9月；46(9)：1101-6；Dobbins等，肌肉肉毒碱棕榈酰基转移酶-1的延长抑制促进大鼠肌细胞内脂质蓄积和胰岛素抵抗(Prolonged inhibition of muscle carnitinepalmitoyltransferase-1 promotes intramyo cellular lipid accumulation andinsulin resistance in rats)，糖尿病，2001年1月；50(1)：123-30；Kraegen等，肝脏胰岛素抵抗后，在高脂质饲喂的大鼠中产生肌肉胰岛素抵抗(Developmentof muscle insulin resistance after liver insulin resistance in high-fat-fedrats)，糖尿病，1991年11月；40(11)：1397-403；Unger等，肥胖症中非脂质组织的脂质毒性病(Lipotoxic)(Lipotoxic diseases of nonadipose tissuesin obesity)，国际肥胖相关的代谢异常杂志(Int J Obes Relat Metab Disord.)2000年11月；24附录4：S28-32；Kelley等，与胰岛素抵抗、肥胖和体重下降相关的骨骼肌脂肪酸代谢，美国生理学杂志，1999年12月；277(6Pt1)：E1130-41)；Simoneau等，能够在人骨骼肌中利用脂肪酸的标记：与胰岛素抵抗和肥胖及体重下降结果相关(Markers of capacity to utilize fatty acids in humam skeletalmuscle：relation to insulin resistance and obesity and effect of weightloss)，FASEB杂志，1999年11月；13(14)：2051-60；Manco等，胰岛素抵抗与骨骼肌甘油三酯中饱和脂肪酸增加直接相关(Insulin resistance directlycorrelates with increased saturated fatty acids in skeletal muscletriglycerides)，代谢，2000年2月；49(2)：220-4。
胰岛素抵抗是许多人类主要代谢疾病的最初发病过程，这些疾病具有称作为“代谢综合症”或“X综合征复合体”的常见基本病理机制。一般归为X综合征复合体的疾病包括2-型糖尿病、高血压、肥胖、血脂异常(dyslipidaemia)，如Zierath等，2000，糖尿病学(diabetologia)43：821-35；Bergman等，2001，消化代谢杂志49：119-26；Olefsky等，1995，美国临床营养学杂志(Am J ClinNutr.)61(4附录)：980S-986S；Ginsberg等，2000，临床研究杂志106：453-8；Groop等，1999，糖尿病肥胖代谢，1附录1：S1-7；Fujimoto等，2000，美国医学杂志17；108附录6a：9S-14S；Ferrannini等，1986，N Engl J Med.，1986，317：350-7；Landsberg等，1999，Clin Exp Hypertens；21：885-894；Ferrannini等，1995，代谢，44(9附录3)：15-7；Kahn等，2000，临床研究杂志106：473-81；Ginsberg等，2000，心血管危险杂志(J Cardiovasc Risk)7：325-31；Howard等，1999，美国心脏病学杂志(Am J Cardiol)8；84(1A)：28J-32J；Grundy等，1999，美国心脏病学杂志(Am J Cardiol)13；83(9B)：25F-29F；Misra等，心血管危险杂志7(3)：215-29)。
期望开发使组织中的脂质含量正常化的药物和治疗策略。例如，这种药物和治疗策略可以用于治疗胰岛素抵抗。
发明概述
在一个方面，本发明提供一种通过将哺乳动物组织(如骨骼肌或肝脏)与一定量高亲和性CGRP受体激动剂接触在该组织刺激脂质分解的方法，相对于代谢支链淀粉受体，该激动剂的量有效地优选刺激高亲和性CGRP受体活性(如刺激高亲和性CGRP受体的活性，而不能够刺激代谢支链淀粉受体的活性)。在一个实施方案中，激动剂为CGRP-1。在一个实施方案中，组织与约10^-15M到10^-10M之间的CGRP-1接触。在一个实施方案中，CGRP-1的量少于300pM。在一个实施方案中，该组织是离体的。在另一方面，该方法包括检测组织中对脂质分解的刺激的步骤。
在一方面，本发明提供通过将哺乳动物细胞如骨骼肌细胞与CGRP多肽或其生物学上的功能性变体接触，在该细胞中刺激脂质分解的方法。在一个实施方案中，CGRP多肽具有天然CGRP多肽如人CGRP的序列。在一个实施方案中，CGRP多肽是人CGRP-1多肽，或者其生物学上的功能性变体。在一个实施方案中，该多肽或变体优选地刺激高亲和性CGRP受体。
在一方面，本发明提供一种通过将骨骼肌或肝脏与CGRP-1或由代谢受体刺激的其变体接触，在哺乳动物骨骼肌或肝脏中刺激脂质分解的方法。该方法还包括监控哺乳动物组织中脂质分解水平的变化(例如通过测定哺乳动物肌肉、肝脏、血液或其他组织中的游离脂肪酸含量)。
在一方面，本发明提供一种治疗方案，包括(i)给患有或易感特征为骨骼肌中脂质蓄积的症状的哺乳动物施用CGRP-1多肽、其生物学上的功能性变体或者由代谢受体刺激的其变体，和(ii)监控哺乳动物中的脂质分解。
在一方面，本发明提供通过施用高亲和性CGRP受体激动剂在需要这种治疗的哺乳动物中降低骨骼肌脂质水平的方法，在此条件下，代谢支链淀粉受体不被该激动剂刺激或者优选地刺激高亲和性受体，其中该哺乳动物具有特征为组织中脂质蓄积的症状或疾病。在一个实施方案中，该哺乳动物为胰岛素抵抗。在一个实施方案中，该方法还包括检测哺乳动物组织(例如骨骼肌、肝脏或血液)中游离脂肪酸的变化。在一个实施方案中，该方法还包括监控该症状或疾病的过程。在一个实施方案中，激动剂的施用不会导致在哺乳动物中血糖水平升高。
一个相关方面，本发明提供一种通过将组织(例如骨骼肌或肝脏)与CGRP多肽或其生物学上的功能性变体接触来降低组织中的脂质水平的方法。在一个实施方案中，CGRP多肽或变体以有效降低组织脂质水平的量被施用给哺乳动物。在一个实施方案中，该哺乳动物为胰岛素抵抗，多肽或变体以有效降低哺乳动物中胰岛素抵抗的量被施用。在一个实施方案中，该多肽或变体优选刺激高亲和性CGRP受体。
在一个方面，本发明提供CGRP多肽，如CGRP-1或其生物学上的功能性变体在制备用于降低哺乳动物骨骼肌中脂质水平的药剂或在制备用于治疗胰岛素抵抗的药剂中的用途。
在一方面，本发明提供一种通过将表达高亲和性CGRP受体的细胞与高亲和性CGRP受体激动剂接触来刺激该细胞中的脂质分解的方法。在一个实施方案中，相对于代谢支链淀粉受体，该激动剂优选激活高亲和性CGRP受体。
在相关方面，本发明提供一种通过给哺乳动物施用高亲和性CGRP受体激动剂来刺激哺乳动物中的脂质分解的方法。在一个实施方案中，相对于代谢支链淀粉受体，该激动剂优选激活高亲和性CGRP受体。在一个实施方案中，该激动剂是多肽，如CGRP多肽或者其生物上的功能性变体。在各种实施方案中，该方法包括测定哺乳动物组织(骨骼肌、肝脏、血清，血浆或血液)中游离脂肪酸含量，或监控给哺乳动物施用CGRP对哺乳动物胰岛素抵抗的影响。在一个实施方案中，激动剂以有效刺激脂质分解而不引起血管舒张的量被施用。在相关方面，本发明提供一种通过施用一定量高亲和性CGRP受体激动剂来刺激需要这种治疗地哺乳动物组织(例如骨骼肌或肝脏)中脂质分解的方法，相对于代谢支链淀粉受体，激动剂的含量足以优选激活高亲和性CGRP受体的量。
在各种实施方案中，被施用激动剂的哺乳动物在骨骼肌中(例如胰岛素抵抗、X综合征、2一型糖尿病)或肝脏中(例如肝脂质变性或“脂质肝”)具有特征为脂质蓄积的疾病或症状。
在本发明的一个实施方案中，激动剂与药学上可接受的载体一起被施用。本发明还提供高亲和性CGRP受体激动剂(如CGRP-1多肽)在制备用于治疗特征为在哺乳动物组织(例如骨骼肌或肝脏)中脂质蓄积的症状或疾病(如胰岛素抵抗或X综合征)的药剂的用途。在相关方面，本发明提供CGRP-1在制备用于治疗患有或易感特征为组织(例如骨骼肌或肝脏)中脂质蓄积的症状的哺乳动物的药剂中的用途，其中当被施用给哺乳动物时药剂在血液中产生低于300pM的激动剂水平或者当施用给哺乳动物时在血液中产生在约10^-15M到10^-10M之间的较低的激动剂水平。在一个方面，本发明提供CGRP-1在制备用于治疗患有或易感特征为组织(例如骨骼肌或肝脏)中脂质蓄积的症状的哺乳动物的药剂中的用途，其中当被施用给哺乳动物时药剂在血液中产生在约10^-15M到10^-10M之间的激动剂水平。在一个实施方案中，该症状是糖尿病、胰岛素抵抗或X综合征。
本发明还提供通过确定一种试剂是否为CGRP受体如高亲和性CGRP受体的激动剂来确定该试剂是否可用于刺激哺乳动物中脂质分解的方法。在一个实施方案中，该方法还包括确定，相对于代谢支链淀粉受体该试剂优选激活高亲和性CGRP受体。在一个实施方案中，该方法还包括比较影响由代谢支链淀粉受体介导的反应(如对碳水化合物代谢的作用)的试剂的EC₅₀与该试剂影响由高亲和性CGRP受体介导的反应(如骨骼肌组织或骨骼肌细胞中游离脂肪酸增加)的EC₅₀。在一个实施方案中，用离体骨骼肌体外测定EC₅₀值。在一个实施方案中，有效的碳水化合物代谢影响是组织或血糖和/或乳酸水平和/或组织糖原水平的变化。
本发明还提供通过确定一种化合物是否可用作一种治疗剂的方法，通过确定试剂是否在表达高亲和性CGRP受体和代谢支链淀粉受体的哺乳动物组织中刺激脂质分解；和确定脂质分解刺激试剂是否相对于代谢支链淀粉受体优选刺激高亲和性CGRP受体，其中优选刺激高亲和性CGRP受体的试剂被确定为可用作治疗剂。本发明的这种或其他方法可用于筛选用作治疗药物的化合物。在一个实施方案中，药物筛选包括用至少25中不同试剂(例如同时地或顺序地)实施前述方法。
在一个实施方案中，本发明提供一种筛选方法，包括(i)确定大量结合高亲和性CGRP受体的试剂；和(ii)从(i)中筛选一种相对于代谢支链淀粉受体优选刺激高亲和性CGRP受体的试剂。在一个实施方案中，该方法包括(i)确定大量结合高亲和性CGRP受体的试剂；和(ii)从(i)中选择一种试剂，其影响由代谢支链淀粉受体介导的反应的EC₅₀比该试剂影响由高亲和性CGRP受体介导的反应的EC₅₀更高。在一个实施方案中，用离体骨骼肌(如来自大鼠)体外测定EC₅₀值。在一个实施方案中，影响由代谢支链淀粉受体介导的反应的EC₅₀比该试剂影响由高亲和性CGRP受体介导的反应的EC₅₀至少高10倍。由高亲和性CGRP受体介导的反应可以是骨骼肌组织或骨骼肌细胞中游离脂肪酸增加，由代谢支链淀粉受体介导的反应是对碳水化合物代谢的影响。
在相关实施方案中，本发明提供确定一种试剂是否可以用于刺激哺乳动物中脂质分解的方法，通过(i)确定大量在表达高亲和性CGRP受体的组织中刺激脂质分解的试剂；和(ii)从(i)中筛选一种相对于代谢支链淀粉受体优选刺激高亲和性CGRP受体的试剂。在一个实施方案中，该组织是骨骼肌(如来自大鼠)。在一个实施方案中，被筛选的文库具有超过约100种不同的检测试剂。
本发明还提供确定一种试剂是否用于在哺乳动物中刺激脂质分解的方法，包括比较该试剂的脂质分解活性和CGRP的脂质分解活性。
本发明还提供通过施用一定量CGRP受体激动剂来治疗哺乳动物中胰岛素抵抗的方法，该激动剂的量有效激活哺乳动物组织中高亲和性CGRP受体而不激活代谢支链淀粉受体，其中该激动剂是上述筛选方法确定的一种试剂。在一个实施方案中，该治疗方法包括测定哺乳动物组织中游离脂肪酸的量或在哺乳动物中监控胰岛素抵抗的额外步骤。
在一个方面，本发明提供测定高亲和性CGRP受体激动剂的剂量或配方的方法，该剂量或配方在哺乳动物组织(如骨骼肌或肝脏)中刺激脂质分解而且最小化哺乳动物中不期望的副作用(例如哺乳动物中血糖水平升高或刺激血管舒张)，通过(i)(a)给试验哺乳动物施用各种不同剂量或配方的CGRP受体激动剂；和(b)测定各种剂量和配方对试验哺乳动物的组织中的脂质分解的影响和测定各种剂量对副作用的影响，进行剂量-反应分析，从而建立脂质分解和副作用的剂量-反应数据；和(ii)从剂量-反应数据中确定能够提高脂质分解而不导致副作用或者显著提高脂质分解而最小限度增加副作用的CGRP受体激动剂配方的剂量。在一个实施方案中，通过测定哺乳动物组织中游离脂肪酸水平来确定各种剂量或配方对脂质分解的影响。
本发明还提供含有治疗有效量的试剂和药学上可接受的赋形剂的组合物，该试剂相对于代谢支链淀粉受体优选刺激高亲和性CGRP受体。在一个实施方案中，当被施用于哺乳动物时，该组合物刺激在哺乳动物中的高亲和性CGRP受体而不刺激代谢支链淀粉受体。在一个实施方案中，该组合物刺激脂质分解而最小限度地刺激血管舒张。
在一个方面，本发明提供一种施用给哺乳动物的单位剂量形式的药物组合物，所述单位剂量包括一定量的高亲和性CGRP受体激动剂和药学上可接受的赋形剂，激动剂的含量有效在血液中产生相对于代谢支链淀粉优选刺激高亲和性CGRP受体的激动剂水平(例如刺激高亲和性CGRP受体活性而不能够刺激代谢支链淀粉受体活性。在一个实施方案中激动剂是CGRP-1)。在一个实施方案中，该激动剂是CGRP-1和其生物学上的功能性变体。在一个实施方案中，该激动剂是CGRP-1和血液中激动剂水平少于300pM。在一个实施方案中，该激动剂是CGRP-1和血液中激动剂水平在约10^-15M到约10^-10M之间。
本发明还提供高亲和性CGRP-1受体在制备用于治疗患有或易感特征为组织(如骨骼肌或肝脏)脂质蓄积的症状的哺乳动物的药剂中的用途，当被施用给哺乳动物时，该药剂在哺乳动物中产生一定水平的激动剂，足以相对于代谢支链淀粉优选刺激高亲和性CGRP受体(例如刺激高亲和性CGRP受体活性而不能够刺激代谢支链淀粉受体活性。在一个实施方案中激动剂是CGRP-1)。
在另一方面，本发明提供通过给哺乳动物施用有效抑制脂质分解的量的代谢支链淀粉受体和/或高亲和性CGRP代谢支链淀粉受体(如^8，37支链淀粉或^8，37CGRP)的拮抗剂来抑制哺乳动物中脂质分解的方法。
在另一个方面，本发明提供通过将哺乳动物组织(如骨骼肌)与代谢支链淀粉受体的激动剂(如CGRP)来刺激组织中脂质分解的方法。
附图简介
附图1表示试验中所用肽的氨基酸序列。所用肽为大鼠支链淀粉、大鼠CGRP-1(CGRP)、大鼠支链淀粉-(8-37)和人CGRP-(8-37)。所用肽在第2个和第7个Cys残基之间具有分子内二硫键。羧基末端的“NH₂”表示该激素酰胺化。
附图2A表示支链淀粉、CGRP、去甲肾上腺素和胰岛素对肌肉游离脂肪酸含量的影响。比目鱼肌在KHB缓冲液(对照)、100nM支链淀粉或CGRP-1、4.4μM去甲肾上腺素或23.7nM胰岛素中培养1h。数值为平均数±S.E.M(各组n＝8)。*与对照组相比差异显著(p＜0.05)。**与对照组相比差异显著(p＜0.01)。
附图2B表示支链淀粉、CGRP和去甲肾上腺素对肌肉甘油含量的影响。比目鱼肌在KHB缓冲液(对照)、100nM支链淀粉或CGRP-1、4.4μM去甲肾上腺素中培养1h。数值为平均数±S.E.M(各组n＝8)。*与对照组相比差异显著(p＜0.05)。**与对照组相比差异显著(p＜0.01)。
附图2C表示支链淀粉、CGRP和去甲肾上腺素对肌肉甘油三酯含量无影响的试验。比目鱼肌在KHB缓冲液(对照)、100nM支链淀粉或CGRP-1或4.4μM去甲肾上腺素中培养1h。数值为平均数±S.E.M(各组n＝8)。
附图3A表示支链淀粉-(8-37)、CGRP-(8-37)和胰岛素对支链淀粉增加肌肉内游离脂肪酸作用的影响。比目鱼肌在KHB缓冲液(对照)、100nM支链淀粉、具有10μM支链淀粉-(8-37)(A/A)或人CGRP-(8-37)(A/C)、10μM支链淀粉-(8-37)(A-8-37)的100nM支链淀粉或者100nM支链淀粉+23.7nM胰岛素(A+I)中培养1h。数值为平均数±S.E.M(各点n＝7)。**与对照组相比差异显著(p＜0.01)。
附图3B表示支链淀粉-(8-37)、CGRP-(8-37)和胰岛素对CGRP-1增加肌肉内游离脂肪酸作用的影响。比目鱼肌在KHB缓冲液(对照)、100nM CGRP、具有10μM人CGRP-(8-37)(C/C)或支链淀粉-(8-37)(C/A)、10μM人CGRP-(8-37)(C-8-37)的100nM CGRP或者100nM CGRP+23.7nM胰岛素(C+I)中培养1h。数值为平均数±S.E.M(各点n＝7)。**与对照组相比差异显著(p＜0.01)。
附图3C表示支链淀粉-(8-37)和CGRP-(8-37)对CGRP-1增加肌肉内游离脂肪酸作用的影响。比目鱼肌在KHB缓冲液(对照)、1pM CGRP、1pM CGRP+100pM CGRP-(8-37)或1pM CGRP+100pM支链淀粉-(8-37)中培养1h。数值为平均数±S.E.M(各点n＝7)。**与对照组相比差异显著(p＜0.01)。
附图4A和4B表示CGRP-1对刺激被培养的比目鱼肌中的游离脂肪酸含量的剂量依赖的影响。附图4C表示CGRP-2对刺激被培养的大鼠比目鱼肌中的游离脂肪酸含量的影响。比目鱼肌在KHB缓冲液(对照)或一定范围CGRP浓度中培养。数值为平均数±S.E.M(各点n＝7)。
附图5A表示支链淀粉对刺激被培养的大鼠比目鱼肌中的游离脂肪酸含量的剂量依赖的影响。比目鱼肌在KHB缓冲液(对照)或一定范围支链淀粉浓度中培养。数值为平均数±S.E.M(各点n＝7)。
附图5B表示存在100pM CGRP时，支链淀粉对刺激游离脂肪酸含量的剂量依赖的影响。比目鱼肌在KHB缓冲液(对照)或一定范围支链淀粉浓度+100pM CGRP中培养。数值为平均数±S.E.M(各点n＝7)。
附图6A、6B和6C表示支链淀粉、CGRP和去甲肾上腺素对饲喂高脂质食物的大鼠的比目鱼肌中甘油三酯含量的影响。给大鼠饲喂由40％猪油(6A)、玉米油(6B)或橄榄油(6C)组成的食物。比目鱼肌在KHB缓冲液(对照)、100nM支链淀粉或CGRP-1或4.4μM去甲肾上腺素中培养1h。数值为平均数±S.E.M(各点n＝7)。*与对照组相比差异显著(p＜0.05)。**与对照组相比差异显著(p＜0.01)。
附图7A、7B和7C表示支链淀粉、CGRP和去甲肾上腺素对饲喂高脂质食物的大鼠的比目鱼肌中游离脂肪酸含量的影响。给大鼠饲喂由40％猪油(7A)、玉米油(7B)或橄榄油(7C)组成的食物。比目鱼肌在KHB缓冲液(对照)、100nM支链淀粉或CGRP-1或4.4μM去甲肾上腺素中培养1h。数值为平均数±S.E.M(各点n＝7)。*与对照组相比差异显著(p＜0.05)。**与对照组相比差异显著(p＜0.01)。
附图8表示[³H]大鼠支链淀粉或[³H]鲑鱼降钙素(sCT)与被培养的L6成肌细胞的总的和非特异性结合，该成肌细胞用含有所述插入物的载体瞬时转染。成肌细胞如下被转染：A，仅为载体；B，含有鼠科ramp1的载体；C，含有大鼠降钙素受体1的反向插入同种型(isoform)C1_ins-的载体；D，分别用含有鼠科ramp1和鼠科C1_ins-的载体共转染。如所示，在缺乏(总(T))和存在(非特异性(NS))1μM相应的未标记肽时，与浓度为10nM的各种放射性配体进行结合。在各种情况下，可以通过从相应总结合中减去非特异性结合而得到特异性结合。每一栏表示来自重复至少两次的试验中的三次独立的成肌细胞转染的结合的平均数(±S.E.M)。*，p＜0.05；***，p＜0.001；用不成对(unpaired)t-检验确定总的和相应非特异性结合之间的差异显著性。
附图9表示从用含有鼠科ramp1和反向插入的大鼠降钙素受体同种型1(C1_ins-)的载体共转染的L6成肌细胞置换结合的[³H]大鼠支链淀粉；在存在指定浓度未标记配体时，鼠科ramp1和C1_ins-共转染的成肌细胞用[³H]支链淀粉(20nM)在21℃下培养3h。然后洗涤细胞，并通过脂质闪烁计数确定结合放射性。A，用大鼠CGRP-1(◆)；大鼠支链淀粉(○)；鲑鱼降钙素(*)；大鼠降钙素(8)；或人肾上腺髓质素(adrenomedullin)置换[³H]支链淀粉(：)B，用^8，37CGRP(△)；或^8，37支链淀粉(6)置换[³H]支链淀粉。每个点表示来自重复至少两次的试验的3个独立成肌细胞的转染的平均数±SEM。
附图10表示平端肽拮抗剂^8，37大鼠CGRP-1和^8，37大鼠支链淀粉对用鼠科受体活性改进蛋白1、ramp1和反向插入的鼠科降钙素受体同种型1，C1_ins-的瞬时共转染并用大鼠CGRP-1或大鼠支链淀粉培养的L6成肌细胞中的cAMP浓度的影响。被转染的成肌细胞用指定浓度的A，CGRP或B支链淀粉培养15min。A(◆)CGRP；(△)CGRP+^8，37CGRP(5μM)。B：(○)支链淀粉；(6)支链淀粉+^8，37支链淀粉(5μM)培养。洗涤细胞，测定肌肉cAMP浓度。各个点表示来自重复至少两次的试验的3个独立转染的平均数(±SEM)。
附图11表示与用所示的载体构建体瞬时转染的Cos-7细胞的特异性结合，用A，[³H]大鼠CGRP-1、CGRP B，；[³H]大鼠支链淀粉，支链淀粉；和C，[³H]-sCT，的总结合的比例表示。特异性结合得自在缺少或存在相应的未标记配体(1μM)时各个放射性配体(各个情况下为20nM)总结合之间的差别。各个点表示来自重复至少两次的试验的3个独立转染的平均数±SEM。**，p＜0.01对于与仅用载体转染的细胞比较的结合。
附图12显示在用起始载体构建体瞬时转染的Cos-7细胞中对应于鼠科受体活性改进蛋白1、ramp 1或鼠科ramp 3的RNA表达的Northern印迹(上边组)：从仅用载体，载体；或含有对应于鼠科ramp 1或ramp 3的插入物的载体转染的COS-7细胞中提取的RNA的Northern杂交，然后用对应于ramp 1(左边组)或ramp 3(右边组)的标记cDNAs探测。(下边组)：用于Northern分析的cos-7细胞的总RNA，表示18S和28S rNA条带，说明在各个凝胶泳道中是等量加载。
附图13表示CGRP和支链淀粉对大鼠骨骼肌中的cAMP的浓度依赖性作用。用所示浓度的大鼠CGRP-1(13A)或大鼠支链淀粉(13B、13C)体外培养比目鱼肌条。在缺少或存在人胰岛素(23.7nM)时进行培养。通过单因素(one-way)ANOVA进行统计显著性检测，接着用Dunnett多重比较检验进行post-hoc分析，A，*p＜0.05，**p＜0.01，与对照比较；和B，*p＜0.05，**p＜0.01，与对照比较。与对照比较，A和B中用1μM异丙去甲肾上腺素处理的比目鱼肌中测定的cAMP含量分别为3.5±0.2pmol/mg(p＜0.05)和3.8±0.2pmol/mg(p＜0.01)。
附图14表示肽拮抗剂对体外大鼠比目鱼肌中的胰岛素刺激的葡萄糖转移的支链淀粉介导抑制的影响。分离大鼠比目鱼肌并剥离，用支链淀粉(10nM)和胰岛素(23.7nM)，以及用指定浓度的A，^8，37大鼠支链淀粉或B，^8，37大鼠CGRP-1培养，以2-脱氧-D-葡萄糖的增加(2-DOG；nmol/g-干重/min)确定葡萄糖转移。各点表示得自n＝4的独立试验的平均数(±S.E.M)。通过单因素ANOVA进行统计显著性检测，接着用Dunnett多重比较检验进行post-hoc分析；A，*p＜0.05，**p＜0.01，与对应于[胰岛素(23.7nM)+支链淀粉(10nM)](无拮抗剂)的对照值单独比较。
附图15表示CGRP和相关肽对大鼠骨骼肌中基线的和体外胰岛素刺激的代谢的作用。得到：在指定浓度的大鼠支链淀粉、支链淀粉(○)；大鼠CGRP-1，CGRP(σ)；或鲑鱼降钙素，sCT(E)中培养的离体大鼠比目鱼肌条中的(A，B)，总糖原含量；和(C，D)D[¹⁴C(U)]葡萄糖转化为糖原的比例的剂量-反应曲线。在缺乏(A，C)或存在(B，D)最大有效量的人胰岛素(23.7nM)时进行培养。各个点表示来自n＝4-5个独立试验(总糖原)和来自n＝3-6(D[¹⁴C(U)]葡萄糖转化)的平均数(±S.E.M)，并且除了基线值分别得自n＝15或12独立试验，每个测定重复3次。
附图16表示饲喂高脂质食物的大鼠比目鱼肌中的胰岛素剂量-反应曲线。胰岛素剂量-反应曲线是从饲喂正常食物(■)或高脂质食物()51天的大鼠比目鱼肌中测定的。胰岛素反应是在用各种浓度胰岛素培养2h后，通过D[¹⁴C(U)]葡萄糖转化为肌糖原测定的。然后提取掉肌糖原并通过液体闪烁分光光度计分析D[¹⁴C(U)]葡萄糖含量。剂量-反应曲线与S形剂量-反应算法拟合。结果以平均数±SEM(各点n＝12-18)表示。平方总和分析说明两条曲线之间的显著差异(p＜10^-5)。
附图17A和17B表示CGRP-1对高脂质饲喂的动物中的肌肉和甘油三酯含量的影响。
附图18表示CGRP受体拮抗剂对CGRP-1作用于高脂质饲喂大鼠的肌肉脂质的影响。所示结果的统计学显著性用单因素ANOVA进行检测，用Tukey检验进行post-hoc分析，***p＜0.001，*p＜0.05与基线比较；^###p＜0.001与100nM CGRP比较；^！！！p＜0.001与1pM CGRP比较。
附图19表示CGRP-1对正常饲喂和高脂质饲喂动物的比目鱼肌中的cAMP含量的影响。
附图20表示灌注CGRP 1(100pmol/kg/min)或生理盐水1h，Wistar大鼠中平均动脉压下降。平均动脉压用固态血压传感器持续测定，并用PowerLab/16s数据采集模块监控。校准信号显示在屏幕上，并以各个变量的2S平均数保存在光盘上。*P＜0.05。
附图21表示灌注CGRP-1或CGRP-1活性拮抗剂对血液葡萄糖水平的影响。血液葡萄糖水平每间隔5分钟用Advantage仪器测定，被灌注90min的动物的尾部血液样本作为指示。
发明祥述
I.定义
本文所用“脂质分解”是指脂质或脂质存储化合物如甘油三酯的酶促水解，导致游离脂肪酸释放。术语“游离脂肪酸(FFA)”和“去酯化脂肪酸(NEFA)”在此可互换使用。
本文所用“治疗有效量”是指计算用于消除组织、系统、动物或人类的生物学的或医学上的反应的试剂的预先确定量，是研究人员、兽医、内科医师或其他临床医生寻求的，如足以刺激脂质分解或降低脂质水平和/或改善疾病状态或综合征的量，或预防、阻止、减缓或反转疾病或其他不期望的综合征的进展以达到期望治疗效果的量。
本文所用“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”是指一种在施用后不会引起不利的机体反应并且治疗剂在其中充分溶解以释放治疗有效量的载体。赋形剂的例子包括缓冲液、生理盐水、PBS、右旋糖溶液、Hank液和惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳酸、磷酸钙或磷酸氢钠。
本文所用“哺乳动物”具有其通常意义，包括灵长类动物(例如人类和非人类的灵长类动物)、试验动物(例如啮齿类如小鼠和大鼠)、家畜(例如奶牛、公猪、绵羊和马)和家养动物(例如狗和猫)。
本文所用术语，对哺乳动物的症状或疾病的“治疗”是指(i)症状或疾病的预防，也就是消除疾病的任何临床症状；(ii)抑制症状或疾病，也就是抑制临床症状的发展或进展；和/或(iii)减轻症状或疾病，也就是使临床症状消退。
本文所用“EC₅₀”具有本领域的常规意义，是指产生特异性生物作用的最大促进作用的50％的化合物浓度，例如当通过配体(如CGRP)结合到受体(如高亲和性CGRP受体)介导的生物作用为其最大值的一半时的浓度。例如，由CGRP和高亲和性CGRP受体刺激的骨骼肌脂质分解的EC₅₀是引起相对于基线水平的最大促进骨骼肌脂质分解的50％的CGRP浓度。钙配体可以是也可以不是天然的。
本文所用受体“激动剂”是能够促进至少一种通常与受体的天然配体结合到受体相关的生物反应的试剂(化合物或组合物)。例如，存在于骨骼肌细胞中的高亲和性CGRP受体的激动剂是与高亲和性受体相互作用(如结合)并且以剂量依赖方式提高肌细胞中的脂质分解的试剂(如CGRP)。激动剂与CGRP受体间的结合作用可以通过激动剂与CGRP(如放射标记的CGRP)竞争结合受体的能力和/或采用其他竞争分析来确定。
本文所用受体被“刺激”或同等地、被“激活”或、同等地被该组合物或试剂“激动”，当该组合物或试剂结合到受体(如结合到配体结合位点)引起表达该受体的细胞的代谢状态变化。通常地，对于配体(如天然配体或其他激动剂)结合，受体给细胞内传递一信号。当将受体与特定化合物接触，产生细胞特征为天然配体(即天然内源性的)结合的反应，这表明该组合物能够刺激或激活该受体。字面上的同等物(如激活、刺激等)具有相同意思。
本文所用“保守取代”，当描述蛋白质时，是指该蛋白质的氨基酸组成的变化，其中残基由结构相似替代物取代，而不会实质性地改变该蛋白质的活性。因此，特定氨基酸序列的“保守性取代变体”是指那些对于蛋白质活性不关键的氨基酸的氨基酸替代物，或者用其他具有相似特性的氨基酸(如酸性、碱性、正电荷或负电荷、极性或非极性等)的氨基酸替代，使得即使关键氨基酸的取代也不会实质性地改变其活性。提供功能性相似的氨基酸的保守取代表是本领域熟知的。如下六组，每组含有相互保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰氨酸(N)谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)(参见，Creighton(1984)蛋白质，W.H.Freeman and Company)。本领域技术人员可以预期上述提及的取代不是唯一可能的保守取代。例如可以将无论是正电荷或负电荷的所有带电的氨基酸视为相互间的保守取代。此外，在一条编码序列上改变、增加或删除单个氨基酸或小比例氨基酸的个别取代、缺失或添加也可以是“保守取代的变体”。
术语“肽”是指长度小于50个残基的多肽。术语“蛋白质”和“多肽”包括“肽”和较长的氨基酸聚合物。
术语“接触”具有其产生相似性的通常意义。将化合物与由细胞或组织表达的受体接触的方法包括而不限于在机体外(如体外)将细胞或组织与化合物在该化合物能结合受体的条件下培养，和将化合物施用给动物使化合物通过动物的循环或其他系统呈递给细胞或组织。在一些情况下，被施用的试剂通过动物或组织的代谢活性转化为激动剂(如被施用的试剂的代谢物为一种激动剂)。
本文所用术语“肽的类似物”或“拟肽”(Fauchere，1986，Adv.DrugRes.15：29；Veber和Freidinger，1985，TINS，392；和Evans等，1987，J.Med.Chem30：1229)具有其在本领域通常的意义，指作为具有与模板肽相似特性的非肽药物用于制药工业的肽的类似物。肽类似物通常借助计算分子建模开发。结构与治疗上有用的肽相似的肽的类似物可用于产生同等的治疗或预防效果。一般地，肽类似物与范例多肽(即具有生物学的或药学活性的多肽)结构相似，例如天然CGRP多肽，具有一个或多个肽连接优选被选自：-CH₂NH-、-CH₂S-、-CH₂-CH₂-、-CH.dbd.CH-(顺式和反式)、-COCH₂-、-CH(OH)CH₂-和-CH₂SO-的连接取代，通过本领域熟知的和在如下文献中进一步描述的方法：Spatola，A.F.在“氨基酸、肽和蛋白质化学和生物化学”，B.Weinstein编辑，Marcel Dekker，纽约，267(1983)；Spatola，1983，Vega Data 1：3，“肽骨架修饰”；Morley，1980，药物科学趋势(TrendsPharm Sci)，463-468；Hudson，D.等，1979，Int J Pept Prot Res 4：177-185(-CH₂NH-、-CH₂-CH₂-)；Spatola等，1986，生命科学(Life Sci)38：1243-1249(-CH₂-S)；Hann，M.M.，J Chem Soc Perkin Trans I(1982)307-314(-CH-CH-，顺式和反式)；Almquist，R.G.等，医学化学杂志(J Med Chem)(1980)23：1392-1398(-OCH₂-)；Jennings-White等，Tetrahedron Lett(1982)23：2533(-OCH₂-)；Szelke等，European App.EP45665(1982)CA：97：39405(1982)(-CH(OH)CH₂-)；Holladay，M.W.等，TetrahedronLett(1983)24：4401-4404(-C(OH)CH₂-)；和Hruby，V.J.，生命科学(1982)31：189-199(-CH₂-S-)。这些肽的类似物具有比多肽实例更显著的优点，包括，如：生产更经济、化学稳定性更高、药学特性(半衰期、吸收性、效价和功效等)更好、特异性(如广谱的生物活性)改变、抗原性降低等。肽类似物的化合物还包括氨基酸的生物学同等物，如氨基酸的磺酰和硼化类似物。
当用于骨骼肌中的脂质含量方面，本文所用术语“正常化”是指降低肌肉甘油三酯水平异常高的个体的肌肉中的脂质含量，例如，从肌肉甘油三酯的降低中得益的个体。
本文所用术语“最小化”，当涉及化合物对哺乳动物、组织或细胞的代谢反应(如血糖和乳酸水平上升)的作用时，是指化合物通过刺激高亲和性受体来介导增强脂质分解而不显著地增加由支链淀粉代谢受体刺激的代谢反应的作用。例如，在一个实施方案中，术语“最小化地刺激血管舒张”、“最小化地刺激副作用”或“最小化地增加血液乳酸”等等，是指一种或一些试剂，其[脂质分解增加]/[血糖增加/血液乳酸升高/血管舒张增强/副作用增加等]比例大于由代谢支链淀粉受体饱和量的CGRP-1(如200nM)刺激产生的比例。通常该比例至少约高2倍、通常至少约高4倍、有时至少约高10倍)。这些术语还包括未检测到血管舒张和/或血液乳酸和/或其他副作用的显著增加的试剂或剂量(即测定值接近于零)。
II.描述
引言
降钙素基因相关肽(CGRP)是肽激素的降钙素家族的37个氨基酸的成员。CGRP存在于支配骨骼肌的运动终板的含有乙酰胆碱的传出神经元中，其在刺激神经后被释放到突触间隙中。CGRP在人类中至少以两种主要形式被发现，称为CGRP-1和CGRP-2(表1)。
表1
人和大鼠的CGRP-1和CGRP-2氨的基酸序列
hCGRP-1 Ala Cys Asp Thr Ala Thr Cys Val Thr His
        Arg Leu Ala Gly Leu Leu Ser Arg Ser Gly
        Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr
        Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe
hCGRP-2 Ala Cys Asn Thr Ala Thr Cys Val Thr His
        Arg Leu Ala Gly Leu Leu Ser Arg Ser Gly
        Gly Met Val Lys Ser Asn Phe Val Pro Thr
        Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe
rCGRP-1 Ser Cys Asn Thr Ala Thr Cys Val Thr His
        Arg Leu Ala Gly Leu Leu Ser Arg Ser Gly
        Gly Val Val Lys Asp Asn Phe Val Pro Thr
        Asn Val Gly Ser Glu Ala Phe
rCGRP-1 Ser Cys Asn Thr Ala Thr Cys Val Thr His
        Arg Leu Ala Gly Leu Leu Ser Arg Ser Gly
        Gly Val Val Lys Asp Asn Phe Val Pro Thr
        Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe
CGRP与蛋白质支链淀粉具有约50％序列相似性(Cooper等，1987，美国国家科学院汇编(Proc Natl Acad Sci USA)84：8628-32；Cooper等，1994，内分泌研究(Endocr Res.)15：163-201)，并且这两种蛋白质的生物活性重叠但是不同(见，如Muff等，1985，欧洲内分泌学杂志(Eur.J.Endocrinol.)。在其活性中，CGRP具有显著的心血管作用，包括血管舒张和正向的变时和变力作用(Nuki等，1993，生物化学生物物理学研究通讯(Biochem Biophys Res Commun)196：245-51；Muff等，同上；Cooper等，1994，内分泌研究(Endocr Res.)15：163-201；Gardiner，1991，糖尿病(Diabetes)40：948-951；和Takenaga，1999，欧洲药学杂志(Euro.J.Pharma.)367：239-245)。此外，当以高浓度被施用时，CCRP被报道会导致胰岛素抵抗(见如Leighton和Cooper，1988，自然335：632-35)。已经提出胰岛素抵抗应当通过抑制CGRP释放或活性来治疗(见如美国专利6,004,961；美国专利5,641,744)。血浆支链淀粉和CGRP水平升高，在大鼠中与胰岛素抵抗相关，在人类中与肥胖和2型糖尿病相关。在肌肉中，支链淀粉和CGRP已经被报道会通过抑制糖原合成并促进糖原分解而抑制葡萄糖升高，与作为非竞争的功能性拮抗剂的胰岛素的作用相反。糖原分解产生的高浓度的周边乳糖作为肝脏糖原异生的底物，导致过量肝糖原生成。
本发明部分地涉及CGRP-1刺激骨骼肌和肝脏中的脂质分解(即导致三酰甘油(甘油三酯)减少)和鼠CGRP-2被证实刺激骨骼肌中的脂质分解的发现。可从脂肪酸的增加来检测这种降低。如在下文的实施例所示，将骨骼肌暴露在各种含量大鼠CGRP-1的剂量-反应分析表明肌肉游离脂肪酸水平的两阶段增加，第一阶段在皮摩浓度的CGRP-1时观察到，第二阶段在毫微摩尔浓度CGRP-1和2时观察到。无需结合特定机理，该数据表明CGRP-1对肌肉脂质的潜在脂质分解的影响是通过高亲和性CGRP受体起作用(EC₅₀约2.6×10^-13M[如在10^-11M到10^-13M的范围内])。因此，表达高亲和性受体的细胞特征为对应于毫微摩尔浓度的CGRP-1。该浓度大大低于在离体肌肉制备物中消除胰岛素抵抗和抑制糖原合成的浓度(Leighton等，1988，自然335：632-635；Leighton等，1989，FEBS Lett 249：357-361)。脂质分解的第二阶段发生在较高浓度的CGRP-1和2时(EC₅₀约4.5×10^-8M[如在10^-9M到10^-8M的范围内])，并且由代谢支链淀粉受体介导，即能够在骨骼肌中通过CGRP和支链淀粉转导信号的单个受体，其可以作为这两种肽的受体(即CGRP/支链淀粉受体)。
如在下文更加详细地描述，高亲和性CGRP受体激动剂的特征为剂量依赖地刺激骨骼肌中的脂质分解，其中刺激受体介导而CGRP-1以毫微摩尔EC₅₀与该受体作用。代谢支链淀粉受体激动剂特征为通过受体介导的刺激骨骼肌中的脂质分解，CGRP-1或2以毫微摩尔EC₅₀与受体作用，并且支链淀粉通过受体引起脂质分解。
具有代谢支链淀粉受体特征的受体通过将降钙素受体(反向插入形式)[C1_ins-]与ramp-1共转染到L6成肌细胞或cos-7细胞来构建(见实施例，下文)。这种受体建立了强烈的与CGRP、支链淀粉和sCT的特异性结合，和CGRP和支链淀粉地信号传导。肌肉和肝脏细胞中的CGRP-1的高亲和性结合位点已经被描述。Galeazza等，1991，肽12：585-91描述大鼠骨骼肌膜制备物中的两个CGRP-1结合位点，具有约37pM和6nM的导出Kd值。Galeazza等还描述了大鼠肝脏膜上的两个CGRP特异性结合位点，具有约44pM和27nM的导出Kd值。放射标记的CGRP-1与肝脏非实质细胞(如内皮细胞、脂质存储细胞和平滑肌细胞)的膜碎片的结合，而不与肝细胞结合，已经被Stephens等，1991，糖尿病，40：395-400报道。还可参见Poyner等，2002，药理学研究54：233-46。
脂质分解可以通过高亲和性CGRP受体介导的发现，以及其他在此详述的发现提供了新的用于刺激脂质分解和降低细胞和组织中的脂质蓄积的方法和试剂。特别地，本发明提供用于示骨骼肌和肝脏中的脂质降低，和用于治疗特征为细胞和组织中脂质蓄积的疾病的方法和试剂。骨骼肌中的脂质蓄积是表明产生胰岛素抵抗的关键的代谢异常。例如，在肥胖相关的胰岛素抵抗中，骨骼肌的代谢能力似乎被调整为脂质酯化作用而不是氧化，饮食引起的体重下降不能改正这种沉积(Simoneau等，1999，FASEB J.13：2051-60)。还有证据表明肌肉脂质正常化伴随着胰岛素敏感性提高(见如，McGarry等，1992，科学258：766-70；Ellis等，2000，美国生理学内分泌代谢(AmJ Physiol Endocrinol Metab)279：E554-60；Oakes等，1997，糖尿病46：1768-74；Furler等，1997，代谢46：1101-6；Kraegen等，1991，糖尿病40：1397-403；Dobbins等，2001，糖尿病50：123-30；Unger等，2000，国际肥胖相关的代谢异常杂志(Int J Obs Relat Metab Disord)24附录4：S28-32；Manco等，2000，代谢49：220-4；Kelley等，1999，生理学277(6Pt1)：E1130-41)。
特征为骨骼肌中脂质蓄积的疾病和症状包括胰岛素抵抗及相关症状，如X综合征的症状(如2型糖尿病、高血压、肥胖症、血脂异常、动脉硬化症和血栓症)和多囊性卵巢综合症(PCOS)。特征为肝脏中脂质蓄积的疾病和症状包括脂质肝(肝脂质变性)。肝脂质变性在溶剂损伤(如由四氯化碳引起)或长期过量食用酒精的患者、肥胖患者中产生，和作为服用药物如糖皮质激素和合成雌激素的结果。在一方面，本发明提供用于治疗这些或其他症状的方法和试剂。
本发明还提供确定和开发用于在肌肉或其他组织中刺激脂质分解的药物组合物的方法。
另外，已经观察到在小鼠中敲除CGRP-1基因不影响血管舒张的调控(Lu等，1999，分子细胞神经科学(Mol.Cell.Neuroscience)14：99-120)。因此，一方面，本发明提供用通常被CGRP-1结合的高亲和性CGRP受体的激动剂治疗胰岛素抵抗的方法，而最小化或避免通常伴随服用大剂量CGRP的副作用(如血管舒张；急性心血管)。还可以实现脂质分解的有益效果，同时最小化周边乳酸的增加(如产生自糖原降解)和血液葡萄糖升高(如产生自由乳酸刺激的肝脏葡萄糖生成)。
B.组织脂质含量降低和对将得益于脂质水平降低(如在骨骼肌和/或肝脏中)的患者的治疗
在一方面，本发明提供通过将组织或细胞(如骨骼肌或肝脏)与高亲和性CGRP受体或代谢支链淀粉受体激动剂接触来降低该组织或细胞中的脂质含量的方法。在优选方面，本发明提供通过将组织或细胞与高亲和性CGRP受体激动剂接触来降低骨骼肌或肝脏或骨骼肌细胞或肝脏细胞中的脂质含量的方法。如上指出，这种降低伴随着各种有益效果。在一个实施方案中，通过降激动剂施用于动物一般为哺乳动物，来使组织或细胞与该激动剂接触。
本发明提供通过施用高亲和性CGRP受体激动剂来治疗需要降低脂质含量(如骨骼肌或肝脏的)的哺乳动物的方法，改善与肌肉脂质蓄积相关的症状的综合征或减少发生的可能性，该症状特别包括胰岛素抵抗和“X综合征”复合物(如2-型糖尿病、高血压、肥胖症、血脂异常、动脉硬化症和血栓症)、多囊性卵巢综合症和肝脏脂质变性。在一个实施方案中，激动剂为人CGRP，如人CGRP-1。在一个实施方案中，高亲和性CGRP的激动剂不能实质性地刺激代谢支链淀粉受体。在本发明的这种或其他方法的实施方案中，哺乳动物可以是人类、灵长类或非灵长类，或非人类动物。
在相关方面，本发明提供治疗需要降低脂质含量(如骨骼肌或肝脏的)的来改善与肌肉脂质蓄积相关的症状的综合征或减少发生的可能性的哺乳动物如人的方法，通过(1)确定具有与脂质蓄积相关的症状(如胰岛素抵抗、2-型糖尿病、高血压、肥胖症、血脂异常、动脉硬化症、血栓症、多囊性卵巢综合症或肝脏脂质变性)的动物，(2)施用高亲和性CGRP受体激动剂，和(3)监控动物中的脂质分解。在一个实施方案中，该症状为胰岛素抵抗。在一个实施方案中，该症状为2型糖尿病。在一个实施方案中，该哺乳动物是胰岛素抵抗的，但不具有2-型糖尿病。在一个实施方案中，该哺乳动物不用胰岛素治疗。采用本领域熟知的诊断方法(包括在下文中描述的方法)容易实现对患有上述症状的哺乳动物的确定，也可以用任何将来知晓或开发的确定方法(如基因表达图谱)来实现。典型的高亲和性CGRP受体激动剂为人CGRP-1和其生物学上的功能性变体。在一个实施方案中，施用激动剂不会实质性地刺激代谢支链淀粉受体。
在一个方面，本发明提供高亲和性CGRP受体激动剂在加工或配制用于降低患者中的脂质水平的药剂中的用途，该患者得益于这种降低。在一方面，本发明提供高亲和性CGRP受体激动剂在加工或配制用于治疗患有X综合征syndrome、胰岛素抵抗、2型糖尿病、高血压、肥胖症、血脂异常、动脉硬化症和血栓症的患者的药剂中的用途。
在相关方面，本发明提供含有本文描述的高亲和性受体激动剂的单位剂量形式的药物组合物。例如，在一个实施方案中，当被施用于哺乳动物如人类时，该单位剂量产生血液或血浆水平的激动剂，该水平低于代谢支链淀粉受体的激活剂的EC₅₀。通常，血液或血浆水平的该试剂的激动剂以约10^-15M到约1^-10M存在。对于CGRP-1，其血浆水平可能低于300pM(见实施例，下文)
适合的受体激动剂(如高亲和性的CGRP受体激动剂)可以是下文详细描述的各种试剂中的任何一种，包括天然CGRP多肽(如人CGRP-1多肽)、CGRP多肽变体(如生物学上的功能性变体)或非肽试剂。
将CGRP受体激动剂施用给患者(即体内接触)或在机体外将组织或细胞与激动剂接触，会导致可检测脂质含量的降低并伴随游离脂肪酸增加。一般认为，脂质含量降低是刺激细胞如骨骼肌细胞中脂质分解的结果。见如下文实施例17。但是，本申请人不旨在受任何特定机理的约束。因此，本文有时采用表述“脂质分解的刺激”是方便起见，其包括组织中脂质水平下降和游离脂肪酸增加，而不考虑上升和下降的机制。CGRP受体激动剂刺激脂质分解可以从组织(如骨骼肌或肝脏或血液或血浆)中游离脂肪酸的含量和组成的变化中检测。通常，刺激脂质分解的水平为组织或血液的游离脂肪酸增加至少为基线(缺乏激动剂时的水平)的2倍，通常至少4倍和有时至少6倍或更高。检测游离脂肪酸水平变化的方法是熟知的。例如，如在下文实施例2中描述，可进行肌肉组织(如得自活体解剖或组织培养)的气相色谱分析。其他方法包括用于制备结构和代谢分析的特定脂肪酸的标准分离物的HPLC操作。这种方法可用于挥发性物质，如短链脂肪酸，用于研究同位素标记的脂肪酸，或用于分离位置和构象异构体。衍生脂肪酸通常用UV分光光度计或通过荧光计(Rao等，1995，色谱科学杂志(J Chromatogr Sci)33：9-21)监控。可以通过基于乙酰辅酶A的比色测定方法确定非酯化的游离脂肪酸的血浆浓度(Wako Pure Chemical Industries，大阪，日本)。可以用比色测定测量血浆甘油三酯(Triglyceride Produre 336，Sigma Diagnostics)。可以通过从组织中溶剂提取长链辅酶A、相位分离和通过反向高效液相色谱来测定组织长链辅酶A。
在一方面，本发明提供高亲和性CGRP受体激动剂在加工或配制用于降低患者的脂质水平的药剂中的用途，该患者将得益于该降低。在一方面，本发明提供高亲和性CGRP受体激动剂在加工或配制用于治疗患有X综合征、胰岛素抵抗、2型糖尿病、高血压、肥胖症、血脂异常、动脉硬化症和血栓症的患者的药剂中的用途。
尽管激活(agonize)高亲和性受体的试剂具有特别意义，在另一方面，本发明提供治疗需要降低脂质含量的哺乳动物的方法，包括施用代谢支链淀粉受体而非高亲和性受体的激动剂刺激哺乳动物中的脂质分解，通过施用这种代谢受体激动剂和含有这种激动剂的药物组合物来实现该结果，以治疗由于脂质分解下降而需要这种治疗的哺乳动物的方法。在一个实施方案中，激动剂为大鼠CGRP-2。在一个实施方案中，激动剂是CGRP的受体刺激变体。在一个实施方案中，激动剂不是支链淀粉。在另一个实施方案中，激动剂为支链淀粉。这种激动剂的施用方法和方式与本文描述的用于高亲和性受体激动剂施用的方法和方式相似，在剂量上有变化，这对于技术人员来说是显然的。
C.高亲和性CGRP受体激动剂
在本发明实践中所用的高亲和性CGRP受体激动剂包括各种类型化合物，包括肽、肽的类似物和非肽化合物。适宜的激动剂在下文中描述和/或可以用本文描述的方法(和/或通过由于本发明公开教导对普通技术人员来说是显然的方法)确定。高亲和性CGRP受体激动剂刺激骨骼肌中的脂质分解。优选的激动剂和/或剂量导致相对于代谢支链淀粉受体优选地刺激高亲和性CGRP受体。
优选刺激
如本文指出，某些组织(如骨骼肌)表达高亲和性受体和代谢支链淀粉受体，而某些化合物如大鼠CGRP-1为高亲和性受体和代谢支链淀粉受体的激动剂。如上指出，脂质分解可被这两种受体介导。但是，如本文公开，通常期望优选刺激高亲和性受体。“优选刺激”具有该术语常规意义，可以各种方式被描述(或检测)。当高亲和性受体激动剂具有该高亲和性受体的EC₅₀时发生“优选刺激”，该EC₅₀低于代谢支链淀粉的EC₅₀，该激动剂的剂量和浓度低于代谢支链淀粉受体的EC₅₀，但是等于或高于高亲和性受体的EC₅₀。在一个实施方案中，当高亲和性受体激动剂不引起任何可检测的对代谢支链淀粉受体的刺激时，实现“优选刺激”(例如在任何剂量，任何低于10μM或任何低于10mM)。
因此，在本发明的一个实施方案中，高亲和性CGRP受体激动剂以产生相对于代谢支链淀粉受体优选刺激高亲和性CGRP受体的量被施用。这种优选刺激可以被实现，例如通过调整激动剂的剂量或配方，或者根据激动剂的特性。
在一个优选实施方案中，相对代谢支链淀粉受体，对高亲和性CGRP受体的优选刺激通过将细胞与会引起该高亲和性CGRP受体的优选刺激的试剂接触来实现。在一个实施方案中，该试剂是高亲和性CGRP受体的激动剂，而不会实质性地刺激代谢支链淀粉受体。在一个实施方案中，该试剂具有一个通过代谢支链淀粉受体影响脂质分解刺激的EC₅₀，其显著大于通过高亲和性CGRP受体影响脂质分获刺激的EC₅₀。在一个实施方案中，将骨骼肌与该试剂接触导致较多FFA的生成(如通过组织或血浆中FFA的状态(appearance)测定)，这是由于高亲和性受体的脂质分解刺激作用大于代谢支链淀粉受体的脂质分解刺激作用。可以预期确定一种试剂的效果是否是刺激高亲和性CGRP的结果的方法是通过比较该试剂的效果和支链淀粉的效果(具有与CGRP相似的剂量反应曲线)，已知支链淀粉是通过代谢受体起作用。
在一些实施方案中，该试剂通过代谢支链淀粉受体影响脂质分解刺激的EC₅₀显著大于该试剂通过高亲和性CGRP受体影响脂质分解刺激的EC₅₀，其对于高亲和性受体的EC₅₀比用于代谢支链淀粉受体的EC₅₀至少低10倍，更通常低至少约100倍，至少约低500倍，至少约低1000倍，至少约低5000倍，至少约低10000倍。但是，更通常，高亲和性CGRP受体的EC₅₀至少约低10⁵倍，至少约低10⁶倍，至少约低10⁷倍，至少约低10⁸倍。被描述作为低亲合性受体的EC₅₀(“EC_{50-支链淀粉-R}”)与高亲和性受体的EC₅₀(“EC_50-CGRP-R”)比例，即EC_{50-支链淀粉-R}/EC5_0-CGRP-R，对于具有通过高亲和性受体刺激的显著地较高的EC₅₀的试剂，该比例通常至少约10，通常至少约大于10²，大于5×10²，大于10³，大于5×10³，大于10⁴，大于10⁵，大于10⁶，大于10⁷，或大于10⁸。用于测定化合物的EC₅₀的方法是公知的，在下文中描述。
在一些实施方案中，当被施用时或与细胞或组织接触时，高亲和性CGRP受体激动剂对代谢支链淀粉受体不具有任何显著或任何可检测的刺激活性。对代谢支链淀粉受体的显著刺激活性的检测是将激动剂灌注给动物(如大鼠)时，产生相对于灌注生理盐水或其他非活性成分的对照动物血液乳酸或血液葡萄糖的显著增加。显著性是通过常规方法如测定值中内在的平均数和标准方差确定。对照与处理方法之间的显著差异可用标准分析方法如t-检验来显著性地检验。通常，采用n＞1进行分析，如至少为7用于较大的统计力。对乳酸生成增加和骨骼肌中通过代谢支链淀粉受体拮抗胰岛素刺激的葡萄糖升高的分析是本领域熟知的(见如Cooper，1994，内分泌学回顾(Endocr Rev)15：163-201；Young等，1993，FEBSLett.334(3)317-321；和Young等，支链淀粉活性检测，US6,048,514)。
可以用人细胞和组织、来自其他哺乳动物(如小鼠和大鼠)的细胞和组织、细胞系和重组细胞进行其他检测。检测包括细胞检测、机体外的检测(如离体大鼠比目鱼肌)和对动物整体研究。例如，可以用下文实施例中描述的基于细胞的重组受体进行细胞分析。
在一种分析中，使用离体大鼠比目鱼肌。大鼠比目鱼肌含有高亲和性CGRP受体和代谢支链淀粉受体，离体大鼠比目鱼肌特别适用于区别对不同受体的不同作用。比目鱼肌可以得自饲喂高脂质或常规食物的动物，制作化合物的剂量-反应曲线，其中生成(i)通过高亲和性CGRP受体和代谢支链淀粉受体发生的过程的分析反射(reflective)(如肌肉游离脂肪酸和甘油三酯含量的测定)，和(ii)通过代谢支链淀粉受体发生的过程的反射(如肌肉糖原含量和存在最强刺激胰岛素时[¹⁴C]-葡萄糖转化为糖原的测定)。已经表明支链淀粉和CGRP对糖原代谢具有相似的作用，特别地，对胰岛素刺激的葡萄糖转化为糖原的非竞争抑制(作为实例分析，见如Muff等，同上；Copper等，1994，内分泌学回顾15：163-201；Gardiner，1991，糖尿病40：948-951；Takenaga，1999，欧洲药学杂志(Euro.J，Pharma.)367：239-245；Leighton等，1988，自然335：632-5；Cooper等，1988，美国国家科学院汇编85：7763-6)。一种试剂、剂量或配方产生表示刺激了高亲和性CGRP受体而不产生对代谢支链淀粉受体特异性刺激的指示的结果，则被认为是不会实质性的激活代谢支链淀粉受体的高亲和性CGRP受体的激动剂。在一个实施方案中，对高亲和性的和代谢的受体的作用通过高亲和性的和/或代谢的受体的选择性拮抗剂来区分。相对于对照组织、细胞或动物(如不暴露于激动剂中)，不引起代谢支链淀粉受体活性显著变化的试剂或处理(如受体介导的脂质分解增强)被认为没有实质性地刺激代谢支链淀粉受体的活性。本文还提供确定高亲和性受体的优选刺激的其他检测(如见实施例)。
如上文指出，在本发明的一个实施方案中，高亲和性受体的激动剂以足以刺激宿主的骨骼肌的高亲和性CGRP受体而不实质性地刺激低亲合性骨骼肌代谢支链淀粉受体的剂量被施用于哺乳动物(或与离体组织接触)。因此，一种试剂在高浓度时刺激高亲和性受体和代谢支链淀粉受体，可以通过调整施用的剂量(如，调整配方使得仅有被检测量的活性化合物被释放和能与受体作用)来调节该试剂的作用相对于代谢支链淀粉受体的任何刺激最大化。本文所用“被施用的剂量”旨在包括组织与试剂在机体外接触。
高亲和性受体激动剂被施用给哺乳动物(如人类)的优选剂量范围为在骨骼肌或肝脏中导致脂质下降至少约15％的最小剂量，优选至少约25％，更优选至少约30％，更优选至少约50％，或更高，如约75％(如通过游离脂肪酸或甘油三酯水平的变化来测定)。
高亲和性受体激动剂被施用给哺乳动物(如人类)的另一个优选剂量范围是在哺乳动物骨骼肌产生对脂质分解的刺激的含量，而不刺激或最小限度地刺激血管舒张。该含量可以通过许多方法测定，如通过(i)施用大量不同剂量的CGRP受体激动剂配方给试验动物(如通过I.V.，I.P.口服或其他途径)来进行剂量-反应分析；(ii)检测各个剂量对试验动物肌肉中的脂质分解的影响和检测各个剂量对试验动物血管舒张的影响，从而建立脂质分解和血管舒张的剂量反应数据；和(iii)从剂量反应数据中确定CGRP受体激动剂配方的剂量，其在哺乳动物中提高脂质分解而不显著地增加血管舒张，或仅仅最小限度地增加血管舒张。血管舒张可以用各种检测方法中任何一种测定(见如Nuki等，1993，生物化学生物物理学研究通讯(Biochem Biophys Res Commun)196：245-51)。在人类中，血管舒张可以通过测定收缩压和平均动脉血压来监控。
高亲和性受体激动剂被施用给哺乳动物(如人类)的另一个优选剂量范围是在哺乳动物骨骼肌产生对脂质分解的刺激，而不刺激或最小限度地刺激血液中葡萄糖和/或乳酸水平升高(即相对基线水平的统计学上显著地升高)的含量。该含量可以通过许多方法测定，如通过(i)施用大量不同剂量的CGRP受体激动剂配方给试验动物(如通过I.V.，I.P.口服或其他途径)来进行剂量-反应分析；(ii)检测各个剂量对试验动物肌肉中的脂质分解的影响和检测各个剂量对试验动物葡萄糖和/或乳酸水平的影响，从而建立脂质分解和葡萄糖/乳酸水平的剂量反应数据；和(iii)从剂量反应数据中确定CGRP受体激动剂配方的剂量，其在哺乳动物中增强脂质分解而不提高或最小限度地提高葡萄糖和/或乳酸水平。血液葡萄糖和乳酸可以用常规方法测定，如通过存在于标准葡萄糖分析仪中的固定酶化学(葡萄糖氧化酶、L-乳酸氧化酶，分析仪型号2300-STAT，Yellow SpringsInstruments，Yellow Springs，俄亥俄州)。简而言之，当底物进入酶层时被氧化，生成过氧化氢，过氧化氢透过乙酸纤维素到铂电极并被氧化。产生的电流与底物浓度成比例。还可参见如Ye等，2001，糖尿病(Diabetes)，50：411-417；Ellis等，2000，美国生理学杂志(Am.J.Phys.)279：E544-E560。
当为天然CGRP-1多肽(如人CGRP-1)时，产生在高亲和性CGRP受体的EC₅₀范围内(如从10^-11M到10^-13M范围)而低于代谢支链淀粉受体的EC₅₀(如从10^-9M到10^-8M范围)的血液或血清浓度CGRP-1的药物配方是特别有用的。对于CGRP-1及其功能性变体，典型剂量产生血浆或血清水平在约10^-15M到约10^-10M之间，在约10^-15M到约10^-11M之间，或在约10^-15M到约10^-12M之间。有用的血浆或血清水平通常＜10^-10M。这些范围应当被理解为举例而不是用于限制。化合物(包括非肽化合物)的血浆和血清水平可以通过常规方法测定，如ELISA、RIA、分光光度法、酶促分析或其他方法)。
可以理解，通过本文的教导指引，各种方法可被用于确定相对于代谢支链淀粉受体优选激活或刺激高亲和性CGRP受体的化合物、组合物、剂量和配方。显然这些方法可被用于筛选用于治疗胰岛素抵抗和其他症状的试剂。
采用重组受体的竞争结合检测可以产生关于化合物与代谢支链淀粉受体的内在结合亲合性(如K_i值)的信息，并证实目标化合物是否通过受体介导机制起作用。例如，如果目标化合物能通过支链淀粉或CGRP在代谢支链淀粉受体处阻断第二信使生成，那么这便表明该化合物是一种拮抗剂。如果缺乏支链淀粉或CGRP时，化合物本身能够引起第二信使反应，那么这表明被研究的化合物是一种激动剂。关于化合物相对功效的信息，如通过EC₅₀参数测定，在足以饱和该受体的化合物浓度下从第二信使(如cAMP)反应中获得。可以根据化合物的内在结合亲合性确定适宜的浓度。
示例激动剂
各种化合物可以激活高亲和性CGRP受体，包括多肽和拟肽，和非肽化合物如小的有机分子(如分子量＜1000)。
在一个实施方案中，高亲和性CGRP受体激动剂为多肽。在一个实施方案中，该多肽具有与天然CGRP-1多肽(如人CGRP-1多肽或得自大鼠、猪、奶牛、兔子、鸡、鲑鱼或其他物种的同系物)相同的序列或极其相似的序列；见Cooper等，1994，内分泌学回顾15：163-201)。在本文中，一种特定多肽具有与天然CGRP-1多肽极其相似的序列，当按优选匹配排列，该特定多肽含有对应于的天然CGRP-1多肽(如人类)至少约75％，有时至少约80％和有时至少约90％的残基的氨基酸序列。在一个实施方案中，受体激动剂的序列仅仅通过保守取代区别于CGRP-1(如人CGRP-1)。
在相关实施方案中，高亲和性CGRP受体激动剂是CGRP-1多肽的生物学上的功能性变体，如多肽或肽的类似物(如肽类似物)。多肽为CGRP-1多肽的生物学上的功能性变体(包括具有显著的序列同一性的多肽和保守取代变体)，通过如下特性被表征：(i)在骨骼肌中刺激脂质分解，(ii)其通过代谢支链淀粉受体影响脂质分解的刺激的EC₅₀显著大于其通过高亲和性CGRP受体影响脂质分解的刺激的EC₅₀，即其优选刺激高亲和性CGRP受体)，和通常(iii)当按优选匹配排列，含有相当于天然CGRP-1(如人CGRP-1)变体的序列长度的至少约60％，有时至少约75％，有时至少约80％和有时至少约90％的残基的氨基酸序列(即极其相似)。
由本发明公开的教导，可以设计和检测变体的激活活性。传统的突变方法(如本文描述或本领域知晓的方法定点突变、丙氨酸扫描和分析)可被用于确定CGRP-1的生物学上的功能性变体。在一个方面，本发明提供生产可用于制备治疗剂的高亲和性CGRP受体的非天然的激动剂的方法，通过(i)获得天然CGRP多肽(如人CGRP-1)序列；(ii)通过取代或删除修饰至少一个氨基酸残基来生成CGRP变体；(iii)检测变体刺激由高亲和性CGRP受体介导的一种或多种活性的能力(如骨骼肌中的脂质分解刺激活性)；和(iv)确定相对于代谢支链淀粉受体优选激活高亲和性CGRP受体的变体作为用于制备治疗组合物的高亲和性CGRP受体的非天然的激动剂。
在设计和筛选高亲和性CGRP受体激动剂中，通过本公开教导的那些技术还可以理解，至少天然CGRP的氨基末端的环状结构部分对于活性是必须的(即缺少环状结构的平端CGRP肽是某些CGRP活性的拮抗剂)，包括高亲和性受体激动剂活性。²Cys-⁷Cys二硫键(形成含有6个氨基酸的“环状”结构)和C-末端胺被报道是完整生物学活性所必须的(Cooper等，1988，美国国家科学院汇编，85：7763-66)。因此，在一个实施方案中，作为高亲和性CGRP-1受体激动剂的CGRP-1的生物学上的功能性变体包含这种氨基酸环状结构，或同等物(如非肽结构同系物)，和/或酰胺化。在一个实施方案中，该激动剂是具有被报道的CGRP家族一致序列的通式的多肽：Xxx Cys Xxx Thr Ala Thr Cys Val Thr His Arg Leu Ala Xxx XxxLeu Xxx Arg Ser Gly Gly Xxx Xxx Xxx Xxx Asn Phe Val Pro Thr Xxx Val GlyXxx Xxx Ala Phe，其中Xxx为任何氨基酸，见Cooper等，内分泌学回顾1994，15：163-201。
在一些实施方案中，该激动剂是或对应于CGRP多肽的片段(如至少6个残基，更经常为20、25、30或35个残基)。在本发明的一个实施方案中，该试剂具有嵌合CGRP多肽的序列，其中一种物种的天然序列中一个或多个氨基酸被不同氨基酸取代，得到一种或多种不同的物种(如大鼠)的CGRP-1的相应序列。
CGRP肽(如包括生物学上的功能性变体)可以用这些蛋白质的已知序列通过常规合成和重组方法制备。用于本发明实践的重组技术和其他方法是本领域已知的并且已经被描述，如Sambrook和Russel(2001)分子克隆：实验室手册(第三版)冷泉巷实验室出版社；Ausubel等(1987)分子生物学中的当前方法(在2001年中附加)John Wiley&Sons，纽约。从头化学合成多肽是熟知的并可用于制备CGRP多肽(见如Caruthers等，1980，Nucleic Acid Res.Symp.Ser.，215-223；和Horn等，1980，Nucleic Acid Res.Symp.Ser.，225-232)。例如，肽合成可用各种固相技术进行(Roberge等，1995，科学269：202)，包括自动合成(如用Perkin ElmerABI 431A肽合成仪，按照生产商推荐进行)。新合成的肽可被完全地纯化，如通过用于制备的高效液相层析(如Creighton，蛋白质、结构和分子机理WH Freeman andCo，纽约[1983])。CGRP多肽的氨基酸序列或其任何部分在直接合成中可被改变和/或被用化学方法与其他蛋白质的序列(特别是一些和其他动物物种的同源CGRP的序列)组合来生产本发明的变异的多肽。此外，CGRP多肽可以从天然原料中分离。
CGRP的多核苷酸(基因组和cDNA)的核酸和氨基酸序列以及多肽是已知的，采用搜索词“CGRP”和“降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide)”可以在科技文献以及GenBank中找到(如http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/databse/index.html)。在表2中提供CGRP多肽的GenBank登录号。
表2
CGRP蛋白的GenBank登录号和基因

    物种    GI登录家鼠属(Rattus rattus)   115，281020；203227小家鼠(Mus musculus)   12744898，13241720原鸡属(Gallus gallus)   115539；2134304；222802；1334708绵羊(Sheep)   399233；109012；256539双色叶片水母(Phyllomedusabicolor)   7387567类人(Homo sapiens)   115482；2144644；179828；296638；9945304；1476   2355；155487；86999；9929240；14250056；180466；147   68186；2134847；1340176；179799；457134；223948普通牛(Bos taurus)   227702欧洲兔(Oryctolagus cuniculus)   10281574；227771；10281572；湖蛙(Rana ridibunda)   399232；388464犬属(Canis familiaris)   9367718马属家马(Equus caballus)   7804969；7804971猪(Pig)   399231鱼类(Oncorhynchus species)   231851；1730319
可以预期在本发明的方法和各种组合物的一个实施方案中，激动剂和被测试的化合物和试剂(如用于筛选)是CGRP外的化合物。例如本发明提供通过检测一种试剂是否为高亲和性CGRP受体激动剂来确定该试剂是否可用于在哺乳动物中刺激脂质分解的方法。在这种方法的一个可预期的实施方案中，该试剂不是CGRP。
在一个实施方案中，该激动剂不是CGRP相关多肽。例如，该激动剂是无关序列的多肽或，此外，非多肽分子。示例的非多肽激动剂可以是化合物如碳水化合物如寡糖和多聚糖；多核苷酸；脂质和磷脂；脂肪酸；类固醇；二肽、氨基类似物和有机分子，如小分子。在某些实施方案中，激动剂不是人CGRP-1或不是哺乳动物的CGRP-1多肽。
在一个实施方案中，多肽或非多肽激动剂用推导药物设计方法(如采用完整一套方法学，包括目标分子的结构分析、合成化学和先进的计算工具)来制备。见如Kim等，2000，联合化学高通量筛选(Comb Chem High Throughput Screen)3：167-83和Coldren，1997，美国国家科学院汇编(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)94：6635-40)。
在一个实施方案中，激动剂是按照下文描述的筛选方法确定的化合物。
在一方面，本发明提供制备药物组合物的方法，通过制备上述激动剂，并将该激动剂与药学上可接受的赋形剂结合。在一些实施方案中，该药物组合物在无菌和等渗条件下配制，完全遵照美国食品药品管理局的优质生产规范(GMP)的所有规定。
在不同方面，基于CGRP-1结合到代谢支链淀粉受体会刺激脂质分解的发现，本发明提供通过用CGRP-1或由代谢支链淀粉受体刺激的CGRP-1的变体多肽刺激高亲和性CGRP受体或代谢支链淀粉受体或者它们两者，来刺激脂质分解的方法。通常，还有监控哺乳动物组织(如通过测定哺乳动物的肌肉、肝脏、血液或其他组织中的游离脂肪酸的量)或离体组织中的脂质分解水平的变化的步骤。代谢受体刺激CGRP-1变体被如下特性表征：(i)刺激骨骼肌中的脂质分解，和(ii)当按最佳匹配排列时，它们含有对应于天然CGRP-1变体的序列如人CGRP-1序列的长度的至少约60％，有时至少约75％，有时至少约80％和有时至少约90％的残基的氨基酸序列。在一个方面，本发明提供通过将哺乳动物的骨骼肌或肝脏与CGRP-1或由代谢受体刺激的其变体接触，来刺激骨骼肌或肝脏中的脂质分解的方法。
在一方面，本发明提供一种治疗方案，包括(i)给患有或易感特征为骨骼肌中脂质蓄积的症状的哺乳动物施用CGRP-1多肽、其生物学上的功能性变体或由代谢支链淀粉刺激的其变体，和(ii)监控哺乳动物中的脂质分解。
D.激动剂的施用和剂量形式
按照本发明，在一个方面，治疗有效量的高亲和性CGRP受体激动剂(如CGRP-1多肽)被施用给患者(如病人或动物)，该患者将得益于组织脂质含量(如骨骼肌脂质含量)降低。如下文讨论，脂质含量的这种降低对具有各种症状的患者是有益的，这些症状如胰岛素抵抗、2型糖尿病、高血压、肥胖症、血脂异常、动脉硬化症和血栓症。施用本发明试剂的剂量范围是足以产生期望效果的范围(如脂质含量下降或改善综合症或症状发展)。
在相关方面，本发明提供用于施用给患者的单位剂量形式的高亲和性CGRP受体的激动剂。本文所用“单位剂量形式”是指用于单次施用来治疗患有疾病或症状的患者的组合物。每个单位剂量形式一般包括各种本发明的活性成分加上药学上可接受的赋形剂。单位剂量形式的例子为单独片剂、单独胶囊、批量粉剂、水溶液、栓剂、乳剂或悬浮液。疾病或症状的治疗需要定期施用单位剂量形式，例如，每天2次或2次以上单位剂量形式，每餐一次，每四个小时或其他间隔施用一次，或每天仅一次。表述“口服的单位剂量形式”表示被设计成通过口腔服用的单位剂量形式。用于注射的配方也可以以单位剂量形式提供，如在安瓿或多次剂量容器中。
本发明的单位剂量形式含有治疗有效量的受体激动剂。在一个实施方案中，施用单位剂量形式在哺乳动物中产生一定水平激动剂，优选地刺激高亲和性受体(相对于代谢支链淀粉受体)。因此，在本发明的一个实施方案中，高亲和性受体的激动剂(如CGRP-1蛋白或其生物学上的功能性变体)以不会使与代谢支链淀粉受体的结合饱和的浓度被施用(如监控已知通过代谢支链淀粉受体发生的作用，如血液或血浆乳酸和葡萄糖水平增加)。在一个实施方案中，该剂量仅仅导致血液或血浆乳酸和葡萄糖水平或血管舒张的最小限度的增加(如果有)。
虽然特定剂量将依赖于特定激动剂的分子结构和化学特性，药学领域的技术人员将能够从本文的公开中理解采用常规技术能够确定适宜的剂量。例如，高亲和性CGRP受体激动剂的剂量或配方可以通过各种方式确定，该激动剂刺激哺乳动物骨骼肌中的脂质分解，而不或最小限度地在哺乳动物中引起不期望的副作用(如，增加哺乳动物的血液葡萄糖、血液乳酸或血管舒张)。如在本文中使用，“升高的水平”是指相对于预先确定水平的增加(如副作用的指定阈值水平)。进行这种确定的方法包括(i)通过(a)施用大量不同剂量(或配方)的CGRP受体激动剂给试验哺乳动物；和(b)测定各种剂量或配方对试验哺乳动物组织中的脂质分解的影响和测定对副作用的影响，进行剂量反应分析，从而建立脂质分解和副作用的剂量反应数据；和(ii)从剂量反应数据确定能够增加脂质分解而不会引起副作用的CGRP受体激动剂配方的剂量。在一个实施方案中，各种剂量或配方对脂质分解的影响通过测定动物组织中的游离脂肪酸水平来确定。可以采用离体组织替代整个动物进行类似方法。而且，基于本文的教导，普通技术人员能够采用任何各种方法来确定期望的剂量。
通常，非肽化合物激动剂的剂量将在从10^-16M到10^-5M的浓度内(如在一个或多个肌肉、血液、血清或血浆中测定)。如上指出，当为CGRP-1多肽(如人CGRP-1)时，使CGRP-1的血浆或血清浓度在高亲和性CGRP受体的EC₅₀范围内(10^-10M到10^-13M)，但是低于代谢支链淀粉受体的EC₅₀(10^-9M到10^-8M)的剂量是特别有用的。对于CGRP-1及其生物学上的功能性变体，示例剂量产生在约10^-15M到约10^-10M之间的血清或血浆水平。在一个实施例中，血清水平低于300pM。
试剂被施用给动物来产生期望水平或浓度的的试剂量依赖于技术人员熟知的许多因素，如化合物半衰期(如血清半衰期)和施用的频率和方式。用于说明而不是限制，CGRP-1多肽的剂量以20皮克到1克的范围被施用，更通常为每天在3毫微克到50微克。在各种实施方案中，单位剂量(有时为日剂量)低于约10微克，小于约1微克，小于约100毫微克，小于约10毫微克，小于约1毫微克，小于约100皮克和小于约10皮克。
根据上述的得自原始剂量反应曲线的数据和通过常规方法获得的其他数据，多肽和非肽化合物的其他范围对于有经验的从业人员来说是显然的。
本发明还提供含有与药学上可接受的赋形剂结合的高亲和性CGRP受体激动剂的组合物。在一个实施例中，该试剂和赋形剂被配制成选择性地激活高亲和性CGRP受体而不激活代谢支链淀粉受体。在另一个实施例中，该试剂和赋形剂被配制成选择性地刺激脂质分解，而不或者最小限度地刺激不利的副作用，如血管舒张，或血液葡萄糖或乳酸水平升高。
CGRP多肽或其他激动剂可以与其他活性试剂一起被配制或被共同施用(如试剂单独地或与CGRP组合，降低脂质、游离脂肪酸和/或长链辅酶A水平)。在一个实施例中，本发明的激动剂不与胰岛素共同施用。在一个方面，高亲和性受体激动剂与抑制激活代谢支链淀粉受体而不抑制高亲和性受体的试剂(如抗受体抗体)一起施用。
在本发明实践中使用的激动剂(或拮抗剂)可以直接施用于被处理的宿主。施用可选择地在无菌条件下进行。但是，虽然活性成分可以被单独施用，但是优选以药物配方被提供。配方典型地含有至少一种活性成分以及一种或多种其可接受的载体。考虑到与其他成分的相容性和不对患者造成伤害，各种载体应当是药学上和生理学上可接受的。可以通过任何药学领域熟知的方法制备治疗配方，见如Gilman等(编辑)(1990)GOODMAN AND GILMAN’S：治疗学家的药学基础(ThePharmacological Bases of therapeutics)(第8版)Pergamon出版社，和(1990)Remington，实践和药剂学科学(the science of practice and pharmacy)，第20版，Mack Publish Co.，Eston，P.A.；Avis等(编辑)(1993)药物制剂形式：Dekker胃肠外药物(Parenteral Medications Dekker)，纽约；Lieberman等(编辑)(1990)药物制剂形式：Dekker片剂(Tablets Dekker)，纽约；Lieberman等(编辑)(1990)药物制剂形式：Dekker分散体系(Disperse Systems Dekker)，纽约。
本发明的化合物可以通过口服、胃肠外(如肌肉内、腹膜内、静脉内、ICV、脑池那注射或灌注、皮下注射、或埋植)、吸入喷雾、鼻腔、阴道、直肠、舌下或体表的施用路径被施用，可以适合于各种施用路径而单独或一起配制在含有传统的无毒性的药学上可接受的载体、佐剂和赋形剂的适宜剂量单位的配方中。当激动剂为多肽时，常常通过胃肠外施用(如静脉内)。
如果需要(如维持特定血浆浓度)，激动剂可以控制释放的配方形式被施用给患者。各种适合控制释放系统是已知的，包括适合于口服、胃肠外和其他施用路径的形式。见如Bogner等，1997 U.S.Pharmacist1997；22(附录)：3-12；和工业手册：缓释口服制剂形式：体内外相关性的开发、评价和应用。Rockville，MD：食品药品管理局，药物评价和研究中心，1997。可在标准参考文献中找到控制药物配方的例子(例如，见：Sweetman，S.C.(编辑)Martindale，完全药物参考(Thecomplete Drug Reference)(第33版)，Pharmaceutical Press，芝加哥，2002，2483；还可参见：Aulton，M.E.(编辑)制药学，药剂形式设计科学(The Scienceof Dosage FormDesign)，Churchill Livingstone，Edinburgh，2002，734；还可以参见Ansel，H.C.，Allen，L.V.和Popovich，N.G.，药物制剂形式和药物释放系统，第7版，Lippincott 1999，676)。在药物释放系统中采用的赋形剂在各种公开物中被介绍，是本领域技术人员知晓的(如见：Kibbe，E.H.药物赋形剂手册，第3版，美国制药协会，华盛顿，2000，655)。USP提供许多改进释放的口服剂型的例子(如见美国药典23/国家处方18(the United States Pharnacopeia 23/National Formulary 18)，The United States PharmacopeialConvention，Inc.，Rockville MD，1995)。本公开物中还提供总章节和特定试验来测定缓释和延迟释放的片剂和胶囊的药物释放能力。在本发明的一个方面，该激动剂与锻炼项目协同施用，来增强患者通过锻炼降低甘油三酯效果。
药物组合物可以是可注射的无菌水溶液或油性悬浮液。这种悬浮液可按照已知的现有技术，用那些适宜的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。这些可注射的无菌制备物还可以是溶解在胃肠外可接受的非毒性稀释剂或溶剂中的可注射的无菌溶液或悬浮液。可被使用的可接受的赋形剂和溶剂是水、Ringer’s溶液和等渗的氯化钠溶液。但是，应当理解用于任何特定患者的特定剂量水平和给药频率是不同的，这依赖于各种因素，包括所用的特定化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用长度、年龄、体重、健康症状、性别、饮食、施用的方式和时间、排泄率、药物组合和特定症状的严重程度。在一些实施例中，每天或每周施用激动剂是可行的。
E.监控脂质含量、血液葡萄糖水平、血液乳酸水平、血管舒张、胰岛素抵抗和其他症状
在本发明的一些实施例中，CGRP受体激动剂被施用给哺乳动物，监控该哺乳动物或其组织(哺乳动物骨骼肌)中对脂质分解的刺激或脂质含量的降低。通常通过检测目标组织(如骨骼肌、血液、血浆)中游离脂肪酸含量或组成的变化来监控脂质分解。检测游离脂肪酸水平变化的方法是熟知的。例如，如下文实施例1中描述，可以进行肌肉组织(得自活体解剖或组织培养)的气相色谱分析。其他方法包括通过基于乙酰辅酶A氧化酶的比色分析(Wako Pure ChemicalIndustries，大阪，日本)来测定血浆非酯化的脂肪酸(NEFA)。采用比色分析(Triglyceride Procedure 336，Sigma Diagnostics)测定血浆甘油三酯。最近的数据还表明长链乙酰辅酶A酯可以作为大鼠和人的肌肉中脂质代谢和胰岛素敏感性的标记(见Bronwyn等，2000，美国生理学杂志279：E544-E560)。可以通过从组织中溶剂提取长链辅酶A、相位分离和通过反相高效液体色谱纯化来测定组织长链辅酶A(如得自肌肉解剖)(见如Bronwyn等，2000，美国生理学杂志279：E544-E560)。此外，还可以采用用于测定肌肉内甘油三酯含量的新方法。这些方法包括非侵入的方法，如计算X线断层摄影术和核共振光谱学(见如Kelley等，1991，临床营养杂志(J.Clin.Nutr.)54：509-515；Krssak等，1999，糖尿病专家42：113-116；Jacob等，1999，糖尿病48：1113-1119)。
在本发明的一些实施例中，CGRP受体激动剂被施用给哺乳动物，测定该哺乳动物中的血管舒张。CGRP-1和CGRP-2是有效的血管舒张物(见如Muff等，1995，欧洲内分泌学杂志133：17-20；Nuki等，同上)。但是，假定CGRP-1(和高亲和性CGRP受体的其他激动剂)对骨骼肌脂质分解刺激的影响至少可以部分地与其对血管舒张作用区分开，如通过施用一种类型、配方或剂量的试剂激活高亲和性受体而不激活(或最小限度地激活)代谢支链淀粉受体。在本发明的一个实施例中，该试剂被施用给哺乳动物，测定该动物的血管舒张。可以采用任何适宜的分析来检测血管舒张(见如Nuki等，1993，生物化学生物物理学研究通讯196：245-51)。在人类中，可以通过测定收缩压和平均动脉血压来监控血管舒张。
在本发明的一些实施例中，CGRP受体激动剂被施用给哺乳动物，测定血液葡萄糖生成和/或乳酸水平。如上指出，可以实现高亲和性受体介导的脂质分解，而不会产生由代谢支链淀粉受体介导的不期望作用(如血液葡萄糖水平升高)。
在本发明的一些实施例中，CGRP受体激动剂被施用给哺乳动物，监控哺乳动物中与肌肉脂质蓄积相关的疾病的症状的减缓。在本发明的一些实施例中，监控疾病进程足够长时间以确定该症状的严重程度、征兆或发展是否降低。在本发明的一些实施例中，CGRP受体激动剂被施用给哺乳动物(如需要刺激脂质分解的哺乳动物)，监控该动物的一种或多种疾病或生理状态。例如，在本发明的一些实施例中，CGRP受体激动剂被施用给哺乳动物，监控该哺乳动物中激动剂的施用对胰岛素抵抗的影响。可以通过本领域已知的任何各种方法来评定动物中的胰岛素抵抗。例如，在人类中，可以采用口服葡萄糖耐受测试或OGTT(见如Bergman等，1985，内分泌学回顾6：45-86)来监控胰岛素抵抗。总之，75克进行2小时，OGTT水平大于140mg/dl的个体被认为是胰岛素抵抗，而低于120mg/dl水平的个体被认为是正常的。还可以采用稳定态的血液葡萄糖测定(见如Reaven等，1979，糖尿病专家16：17-24)来监控胰岛素抵抗。SSPG平均值大于180mg/dl的个体通常被认为是胰岛素抵抗；而SSPG平均值小于150mg/dl的个体被认为是正常的。其他方法包括测定HbAlc和以C-肽作为胰岛素抵抗的标记(del Prato，1999，药物58：附录1：3-6；Ferranini等，1998，高血压16：895-906)。
任何上述监控工作可以合并进行；因此，如在一个实施例中，在施用了激动剂的哺乳动物中同时监控血管舒张和胰岛素抵抗。在一个实施例中，监控症状(如胰岛素敏感性/抗性)或施用激动剂的结果(如脂质分解)，在施用试剂之前(如生成基线)和/或在施用后的一个或多个时间点(或当是多次施用时，在一次或多次施用后)进行测定。
在本发明的一个实施例中，激动剂被施用给诊断为胰岛素抵抗的个体。在一个实施例中，该个体被诊断为患有胰岛素抵抗，但是不被诊断为糖尿病(如患有2型糖尿病)。
如本文教导，如公开CGRP(或其他CGRP受体激动剂)的脂质分解和血管舒张的活性至少可以部分地被区分开，对有经验的从业人员来说，显然可以通过监控血管舒张和期望的结果(脂质分解增强、胰岛素敏感性升高等)，给哺乳动物施用一定量CGRP或其他激动剂，足以刺激脂质分解(和从而降低肌肉脂质蓄积)而不引起和仅仅最小限度地增强血管舒张。
F.筛选方法
在一个方面，本发明提供一种方法，通过确定一种试剂是否是CGRP受体激动剂来确定该试剂是否可用于在哺乳动物或哺乳动物细胞(如骨骼肌细胞)中刺激脂质分解。在一个实施例中，确定优选激活高亲和性受体(相对于代谢支链淀粉受体)的试剂。如上指出，这种试剂可用于制备药物组合物和用于疾病和症状的治疗。如下文描述，可以通过各种方式确定对高亲和性受体的优选刺激，包括比较试剂影响由代谢支链淀粉受体介导的反应的EC₅₀(如对碳水化合物代谢的影响)与试剂影响由高亲和性CGRP受体介导的反应的EC₅₀(骨骼肌组织或骨骼肌细胞中游离脂肪酸增加)。
应当可以理解，本文描述的确定和筛选方法可被用于筛选具有治疗有用活性的单个化合物或大量化合物。该群体至少为3种试剂，更通常为至少25种，更通常为至少50种，通常至少100种和包括筛选非常多试剂(＞1000)。筛选是高通量的和/或包括顺序或同时进行的分析(包括在开始后，但是在完成该分析进行其他试剂之前，起始一种试剂的分析)。
任何适宜的分析可以被用于确定优选激活，包括(但不限于)根据试剂通过高亲和性受体刺激脂质分解的EC₅₀(如通过组织甘油三酯降低或游离脂肪酸升高测定)与该试剂通过代谢支链淀粉受体刺激脂质分解的EC₅₀比较来确定或用本文描述的其他分析来确定(见如II(B)和实施例)。可以认识到，这些分析可被用于筛选多种试剂，如，化合物文库，如通过高通量方式。可以预期，通过本文存在的高亲和性CGRP受体以及不同作用的教导，不同的方法可被用于确定相对于代谢支链淀粉受体优选激动或刺激高亲和性CGRP受体的化合物、组合物、剂量和配方。显然这些方法还可以用于筛选用于治疗胰岛素抵抗和其他症状的试剂。
本发明的筛选分析可以采用，不限于，动物、体外组织或器官培养物(如分离的骨骼肌)、细胞或细胞系进行，如，来确定该化合物是否可用于降低动物、细胞或组织中的脂质含量。此外，该激动剂被施用于离体细胞系。见如，下文的实施例。
在一个实施例中，本发明提供确定一种试剂是否可以用于在哺乳动物中刺激脂质分解的方法，通过(i)确定至少一种和通常为大量试剂，其与高亲和性CGRP受体结合(如采用CGRP-1置换分析)；和(ii)选择相对于代谢支链淀粉受体优选刺激高亲和性CGRP受体的试剂。在相关实施例中，本发明提供确定一种试剂是否用于在哺乳动物中刺激脂质分解的方法，通过(i)确定至少一种和通常大量试剂，其在表达高亲和性CGRP受体的组织中刺激脂质分解；和(ii)从(i)中选择相对于代谢支链淀粉受体优选刺激高亲和性CGRP受体的试剂。在一个实施例中，该方法包括(i)至少一种和通常大量试剂，其与高亲和性CGRP受体结合；和(ii)从(i)中选择相对于代谢支链淀粉受体优选刺激高亲和性受体的试剂。在一个实施例中，该组织是骨骼肌(如得自大鼠)，在一个实施例中，该方法包括(i)至少一种和通常大量试剂，其与高亲和性CGRP受体结合；和(ii)从(i)中选择一种试剂，其影响由代谢支链淀粉受体介导的反应的EC₅₀高于该试剂影响由高亲和性CGRP受体介导的反应的EC₅₀。在一个实施例中，该组织是骨骼肌(如得自大鼠)。
在另一个实施例中，本发明提供根据一种试剂影响由代谢支链淀粉受体和高亲和性CGRP受体介导的反应的EC₅₀，该反应如上文描述通常为脂质分解，来确定该试剂是否可用于在哺乳动物中刺激脂质分解的方法。在一个实施例中，该试剂影响由代谢支链淀粉受体介导的反应的EC₅₀比该试剂影响由高亲和性受体介导的反应的EC₅₀高约10倍、至少约100倍、至少约1000倍和优选至少约10,000倍、至少约100,000倍或至少约1,000,000倍。
在一个实施例中，比目鱼肌(如离体比目鱼肌)被用于确定化合物的脂质分解活性。(在本文中使用的脂质分解活性是指一种试剂在细胞或组织中刺激脂质分解的能力)。比目鱼肌可来自饲喂高脂质食物或正常食物的动物，制备化合物的剂量-反应曲线，其中生成(i)通过高亲和性CGRP受体和代谢支链淀粉受体发生的过程的分析反射(如测定肌肉游离脂肪酸和甘油三酯含量)，和(ii)通过代谢支链淀粉受体发生的过程反射(如存在最大刺激胰岛素时对肌肉糖原含量和[¹⁴C]葡萄糖转化为糖原的测定)。从剂量-反应曲线中确定EC₅₀值(如相对EC₅₀值)。可以从(i)和(ii)的结果中选择化合物的剂量。特别有意义的是在(i)中而不在(ii)中产生代谢影响的化合物的浓度。在不同化合物的比较中，该浓度将是化合物相对功效的测定值。例如，根据其EC₅₀值，如果一种化合物在较低相对浓度下在(i)而不在(ii)中产生作用，该化合物将被认为具有高于其他化合物的相对功效。
在一个相关方面，确定优选激活高亲和性CGRP受体(相对于代谢支链淀粉受体)的试剂，包括检测对高亲和性CGRP受体(如骨骼肌CGRP受体)和代谢支链淀粉受体(如骨骼肌代谢支链淀粉受体)的不同结合的步骤。采用不同的多种方法通过放射配体结合试验便利地进行结合研究。例如，检测试剂用适当的放射探针(如¹²⁵I和³H)进行放射标记，在存在和缺乏过量未标记的配体时，与含有高亲和性CGRP受体的制备物(如骨骼肌膜)一起培养。然后构建饱和曲线，获得用于特异结合的结合参数K_d(半饱和所需的检测试剂的浓度)。在另一个实施例中，检测试剂对高亲和性CGRP受体的特异结合的参数可以通过放射标记的CGRP配体的竞争性取代来确定。在这种情况下，存在含量升高的未标记检测试剂，放射标记的CGRP与含有高亲和性CGRP受体的制备物(如骨骼肌膜)一起培养。绘制被结合的CGRP配体与未被标记的检测试剂的浓度的图形，将得到S形曲线，从中获得检测试剂的抑制常数K_i。进行结合分析的方法以及分析反应和数据的方法是本领域熟知的。见如www.graphpad.com/prism/，和《RBI受体分类和信号传导手册》，K.J.Watling，J.W.Kebebian，J.L.Neumeyer编辑，Research BiochemicalsInternational，Natick，Mass.，1995，及其参考文献。分析的方法可以在T.Kenakin的《药物受体作用的药理分析》，第2版，Raven Press，纽约，1993及其参考文献中找到。
在本发明的一个方面，高亲和性CGRP受体激动剂(或可能是激动剂的测试化合物)被施用给动物，在筛选分析中确定该化合物是否可用于降低动物(如动物组织)中的脂质含量。例如，该激动剂可被施用给非人类的动物，该动物作为与肌肉脂质蓄积相关的人类疾病或症状的模型。这种试验模型的例子包括作为胰岛素抵抗的动物模型，如ob/ob(Kreutter，1991，糖尿病40(附录1)：159A(摘要)；Bretherton，内分泌学129(附录1)：91A(摘要))，db/db(Kreutter，糖尿病40(附录1)：159A(摘要))；和小鼠中肥胖-糖尿病的能存活的黄色种属(obere-diabetic viable yellow)(Gill，1991生命科学48：703-710)，和LA/N-cp(Huang，1992高血压19(附录1)：101-109(图14)，SHR/N-cp(Dunning，1991糖尿病40(附录1))，肥胖Zucker(Kotanyi L 1992糖尿病41：685-680)，和大鼠的肥胖-糖尿病Zucker种属(Geduolin，1991生物化学生物物理学研究通讯180：782-789)，以及通过施用糖皮质激素(Jamal H，1990，内分泌学126：425-429)，金黄硫代葡萄糖(gold thioglucose)(Tokuyama，1991内分泌学128：2739-2744)，或腹正中视丘下部损伤(Tokuyama，1992糖尿病研究临床实践(Diabetes Res Clin Pract)15：23-29)引起胰岛素抵抗的动物；Tokuyama，1991内分泌学128：2739-2744)除了脂质含量(FFA的表现)，可以评价其他效果如血液葡萄糖和乳酸水平、血管舒张程度来确定不会引起不期望结果的化合物。可以预期，来自组织和细胞分析的信息可被用于确定化合物的浓度，其对于进行机体外的剂量反应研究最有用。整个动物筛选研究也可以用于评价化合物或剂量。实例操作与Ji-Ming等2000，美国生理学内分泌代谢杂志280：E562-569中描述用于支链淀粉的方法相似。可以理解，在本文描述的一些分析实施例中，试验动物在试验过程中或之后被处死。
当要确定试剂(或测试试剂的混合物，如在一些高通量筛选方式中)对于高亲和性CGRP受体和/或代谢支链淀粉受体的EC₅₀时，可以采用各种分析方法。例如，对于特定的化合物、受体和作用的EC₅₀，可以通过分析各种浓度配体对CGRP-1结合高亲和性受体的影响和生成试剂浓度对于脂肪酸释放的剂量反应曲线来确定。在一个实施例中，当为高亲和性CGRP受体，各种浓度测试试剂与离体比目鱼肌肉条在保持组织存活的条件下一起培养。在特定的培养阶段后，提取甘油三酯和游离脂肪酸，量化，相对于检测试剂的浓度的对数值绘制图形。用S形曲线与数据拟合，从最大刺激的50％所需的检测试剂浓度得到EC₅₀值。实例分析及获得的剂量反应数据在下文的实施例中描述，见实施例4。总之，一定范围浓度的CGRP被加到含有大量受体的样本中(如骨骼肌)。通过绘制CGRP浓度对于CGRP结合效果(如游离脂肪酸浓度升高)指示物的图形，CGRP结合的EC₅₀可以被确定为引起被检测的效果(如游离脂肪酸生成)的最大刺激的一半的CGRP浓度。
在一个实施例中，分析一种试剂(或大量试剂，例如，收集(in pools)或如下文描述的高通量筛选方式)(a)分析确定该试剂通过高亲和性CGRP受体(如骨骼肌CGRP受体)刺激脂质分解的EC₅₀，即“EC_50-CGRP-R”和(b)分析确定刺激脂质分解的EC₅₀，即“EC_{50-支链淀粉-R}”。比较这两种EC₅₀，具有大于约10的EC_{50-支链淀粉-R}/EC_{50 -CGRP-R}比的试剂被认为具有比支链淀粉受体显著更低的高亲和性受体的EC₅₀。优选的EC_{50-支链淀粉-R}/EC_50-CGRP-R比为至少约10，通常至少约大于约10²，大于5×10²，大于约10³，大于5×10³，大于约10⁴，大于约10⁵，大于约10⁶，大于约10⁷，或大于约10⁸。
可以用各种类型化合物和组合物进行筛选。适宜的测试试剂包括天然的和合成的化合物或组合物。适宜的检测试剂包括多肽(包括蛋白和短肽，如本文描述的CGRP相关肽)、碳水化合物如寡糖和多聚糖；多核苷酸；脂质和磷脂；脂肪酸；类固醇；二肽、氨基酸类似物、有机分子，如小分子(如分子量小于1000)。检测的化合物可以是各种化学形式，包括但不限于杂环的化合物、碳环化合物、内酰胺、福代锌。在一个实施例中，试剂通过筛选化合物文库来确定。合成分子文库的建立和筛选可以采用组合化学中熟知的技术进行，例如见van Breemen，1997分析化学69：2159-64；Lam，1997，抗癌药物研究12：145-67；Gold，1995，生物化学杂志270：13581-84)。此外，可以在从作为原材料的自然产品的提取物中筛选大量可能有用的活性改进的化合物。这种提取物的来源可以来自许多物种，如真菌、放线菌、藻类、昆虫、原生动物、植物和细菌。然后分析这些具有活性的提取物来分离活性分子。见如，Turner，1996，民族药学(Ethnopharmacol)51：3943；Suh，1995，抗癌研究(Anticancer Res)15：233-39。许多其他的测试试剂和文库是本领域知晓的。在一些实施例中，测试试剂文库含有至少100种不同的测试化合物和试剂。
在一个方面，本发明提供通过比较一种试剂的脂质分解活性与CGRP的脂质分解活性来确定该试剂是否可用于在哺乳动物中刺激脂质分解的方法。根据这种分析方法，在细胞或组织中(如骨骼肌或肝脏中)与CGRP相同或更好地刺激脂质分解(在相同摩尔数基础上比较)的试剂被认为可用于在哺乳动物中刺激脂质分解，是动物和人类治疗的候选化合物。可以在平行分析中(同时进行)进行比较步骤。另外，脂质分解活性(如在特定条件下每摩尔试剂单位时间内生成的FFA)与先前记录(如在计算机可读介质中等)的标准值比较。也可以间接比较：例如，化合物A与CGRP比较脂质分解活性，而测试试剂的脂质分解活性与化合物A的脂质分解活性比较(从而间接地与CGRP比较)。在一个方面，由高亲和性受体介导的CGRP的脂质分解活性作为比较的基础。例如，在一个实施例中，在低于300pM浓度下进行CGRP脂质分解活性活性的比较。例如，在一个实施例中，在不会实质性地刺激代谢支链淀粉受体的脂质分解的浓度下进行进行CGRP脂质分解活性的比较。在另一方面，由高亲和性受体和代谢支链淀粉受体或由代谢支链淀粉受体单独介导的CGRP的脂质分解活性作为比较的基础。在一个实施例中，在骨骼肌中刺激脂质分解的任何形式CGRP都可以使用；在相关的实施例中(根据前述内容是显然的)，CGRP形式是通过高亲和性受体刺激脂质分解。CGRP的典型形式是但不限于大鼠和人的CGRP-1。
G.抑制脂质分解的方法
在另一个方面，本发明提供通过施用高亲和性和/或代谢受体的拮抗剂来在骨骼肌中抑制脂质分解的方法。在试验和临床条件下，在组织中抑制脂质分解是有用的。例如，长期施用拮抗剂可能会在肌肉和肝脏中引起补偿代谢过程，引起脂质利用增强(如上调β-氧化)和导致期望的肌肉脂质减少。抑制脂质分解的试剂也可用于药物筛选分析(如确定脂质分解调节器的正向和反向调控)。拮抗剂可以是抑制由一种试剂如CGRP和支链淀粉刺激的脂质分解的任何化合物。拮抗剂可能抑制结合或竞争对高亲和性CGRP受体或低亲合性代谢支链淀粉受体的结合(见如下文实施例4)。拮抗剂可以是天然化合物，如一种蛋白质、肽、多核苷酸或小的效应分子或通过合成制备。在一个实施例中，拮抗剂是^8，37支链淀粉或^8，37CGRP。^8，37CGRP和^8，37支链淀粉分别指CGRP和支链淀粉的变体，其中C-末端的前7个氨基酸已经被去除。(见Cooper，2001，生理学手册中的“内分泌胰腺和对代谢的调控”II(7)：内分泌系统，Jefferson，L.S.，Cherrington，A.D.编辑，牛津大学出版社)。还可以使用非肽CGRP拮抗剂。包括BIBN4096BS(见Wu等，2002，BichemSoc.Trans.30：468-73)、“化合物-1”和“化合物-2”(见Mallee等，2002，生物化学杂志277：4294-98)。
该拮抗剂以治疗有效量被施用给需要抑制脂质分解的哺乳动物中。该受体拮抗剂可以与药学上可接受的赋形剂结合并被施用给动物。施用的方式与上文描述的受体激动剂的施用相似。
实施例1
材料与方法
本实施例描述在实施例2-7所述试验中使用的材料与方法。
材料除非另外指出，所有化学药品是分析级或更高级的。戊巴比妥钠(nembutal)购自Virbac Laboratories Ltd。大鼠支链淀粉、大鼠支链淀粉-(8-37)、大鼠CGRP1和人CGRP1-(8-37)(见附图1)购自Bachem，瑞士。NaHCO₃、CaCl₂、D-葡萄糖、NaCl、KH₂PO₄、氯仿、甲醇、HCl、NH₄OH、乙醇和Triton X-100购自BDH；MgSO₄·7H₂O购自Sigma；和KCl购自Riedel-de Haen。聚四氟乙烯柱(16ml)、聚四氟乙烯玻璃料(teflon frits)和真空洗提仪(Vac Elutapparatus)购自Alltech。氨丙醇结合的硅40μ(键洗提(Bond Elut))柱填充物购自Phenomenex；己烷和二乙醚购自Labscan。庚烷购自Water Associates Inc和三氟化硼-甲醇复合物(BF3溶解在甲醇中)购自Aldrich Chemical CompanyInc。丁醇改性羟甲苯和所有脂肪酸甲基酯标准物购自Sigma。GLC柱DB225(30m×25mm I.D.)得自J&W Scientific。三-N-辛基胺购自Acros Organics；三氯乙酸购自Ajax Chemicals Ltd；和甘油购自Scharlau。游离脂肪酸、Half-microtest购自Boehringer Mannheim。用于甘油检测和甘油三酯检测的脂质酶释放剂粉末购自Pointe Scientific Inc。
动物模型正常饲喂大鼠所有操作得到奥克兰大学动物伦理委员会认可。雄性Wistar大鼠(年龄＝50天)重200-250g处于持续的12h/12h的光照/黑暗循环中，并随意采食标准大鼠料(Diet 86，NRM，奥克兰)和水。标准食物含有5％脂质(w/w)，主要含有牛脂。分析该食物的代表性样本的甘油三酯、总的和游离的脂肪酸含量，示于表3中。腹膜内注射戊巴比妥钠来麻醉大鼠(45mg/kg体重)，然后脱颈处死。
表3
标准大鼠料的脂肪酸成分
游离脂肪酸和总脂质样品采用气相色谱分析，个体脂肪酸鉴定的确认是通过质谱仪分析，以确定标准大鼠料的游离脂肪酸和总脂肪酸组合物，值是平均标准差(对每一点n＝7)。
脂肪酸                                  游离脂肪酸          脂肪酸
                                        (μmol/g)           (μmol/g)
十四烷酸                 C14:0          10.52±2.44         12.54±3.26
十五烷酸                 C15:0          7.93±1.44          8.90±0.324
十六烷酸                 C16:0          508±97.8           610±21.8
十六碳烯酸(n＝9)         C16:1          7.10±1.30          8.91±0.469
十六碳烯酸(n＝7)         C16:1          33.0±6.14          39.1±1.48
十七烷酸                 C17:0          9.57±2.12          11.6±0.385
十八烷酸                 C18:0          173±40.2           196±4.74
油酸(n＝9)               C18:1          22.8±3.43          1293±70.4
十八碳烯酸(n＝7)         C18:1          1.99±0.424         37.7±0.892
十八碳二烯酸             C18:2          642±62.8           1081±41.4
十八碳三烯酸             C18:3          96.9±17.9          166±6.46
二十烷酸                 C20:0          10.9±2.08          12.2±0.439
二十碳四烯酸             C20:4          2.13±0.311         7.28±0.288
二十碳五烯酸             C20:5          25.7±4.57          46.6±1.47
二十二碳四烯酸           C22:4          1.41±0.312         1.69±0.0711
二十二碳六烯酸           C22:6          4.12±0.708         9.61±0.354
高脂质饲喂的大鼠 数组雄性Wistar大鼠(n＝21/食物)自由采食，在从断奶(n＝21d)直到处死(n＝50d)内饲喂含有标准大鼠料的高脂质食物，其中加入40％(w/w)猪油、玉米油和橄榄油。猪油中的三酰甘油主要含有饱和脂肪酸；玉米油中的三酰甘油主要为单不饱和脂肪酸；而橄榄油中的三酰甘油主要为多不饱和脂肪酸，见表4。
表4
用于制备高脂质食物的脂质中的游离脂肪酸成分
猪油、玉米油和橄榄油的游离脂肪酸成分。数值为总量的％。
脂肪酸              猪油              玉米油              橄榄油
C16:00              26.9              5.0                 15.2
C16:1               3.5               --                  1.7
C18:0               51.8              1.7                 2.7
C18:1(n-9)          3.5               10.7                66.7
C18:1(n-7)          --                3.9                 3.0
C18:2               14.3              57.2                10.5
C18:3               --                21.1                --
比目鱼肌组织的分离及培养 浸泡和培养的溶液为Krebs-Henseleit(KHB)，含有118.5mM NaCl、4.75mM KCl、1.18mM MgSO₄.7H₂O和KH₂PO₄、24.8mM NaHCO₃、2.54mM CaCl₂和10mM D-葡萄糖。往该溶液中持续通人95％O₂/5％CO₂。用单独的KHB或者适宜地含有各种浓度的CGRP、支链淀粉、去甲肾上腺素、胰岛素或CGRP和支链淀粉的拮抗剂进行培养。切除双腿的比目鱼肌，浸泡在KHB中；将肌肉分成两个等量部分，转移到培养瓶中。培养结束后，迅速将肌肉冷冻在液氮中，然后去除结缔组织和所有可见的脂质。肌肉条在-80℃下保存直到分析。
脂肪酸的液体提取和色谱分离 采用改进的Bligh和Dyer的方法(Gorski等，1998，分子和细胞生物化学178：113-118；1.Bligh等，1959，加拿大生物化学生理学杂志37：911-917)从肌肉条中提取总脂质。肌肉在0.4ml去离子水中匀化(Soniprep 150)。如所述(Bligh和Dyer，同上)，所有的溶剂体积根据肌肉中的水分含量(肌肉重量)而变化。将两体积含有0.005％丁醇改性羟甲苯的甲醇和1体积氯仿加入肌肉悬浮液中。以最大速度搅动匀浆2分钟，以2,500g离心4分钟。去除上清液，用2体积甲醇、1体积氯仿和0.8体积0.2N HCl再提取沉淀物。搅动残余物2分钟，然后以3,500g离心3分钟。离心后，混合的上清液用两体积milli Q水和氯仿稀释，通过以3,500g离心4分钟进行相位分离。取出较低的氯仿相，滴加0.2N甲醇化NH₄OH来中和，在液氮蒸汽中蒸发干燥。样本在-80℃下保存备用。
将氨丙醇相(250mg)加入上层填充聚四氟乙烯玻璃料和底部填充键合相的16ml聚四氟乙烯柱中。将柱放入真空洗提仪中，用2ml己烷洗脱两次(Prasad等，1988，色谱杂志(J Chromato)428：221-228；Kaluzny等，1985，脂质研究杂志(J LipidRes)26：135-140)。干的脂质样本溶解在0.150ml氯仿中，并在常压下加入柱中。在吸收后，用4ml氯仿-2-丙醇(2∶1，v/v)洗脱中性脂质，用4ml混合在二乙醚中的2％乙酸洗脱游离脂肪酸。含有游离脂肪酸的溶剂在N₂蒸汽中干燥。
气液色谱分析 用三氟化硼-甲醇方法处理干燥的脂肪酸残余物来衍生甲基酯(Prasad，上文)。将1ml溶解在甲醇中的三氟化硼(BF3)加入各个样本中，样本瓶在70℃下加热5分钟，剧烈摇晃，再加热10分钟。一旦样本恢复到室温，加入0.5ml milliQ水，摇晃样本瓶，加入0.1ml庚烷，再摇晃样本瓶。取出0.05ml上部的庚烷层用于GLC分析。装有DB-225柱的型号为HP5890 GC Plus Series(Hewlett-Packard)的气相色谱仪用于分离脂肪酸甲基酯，装有型号为HP5973 MS(Hewlette-Packard)的型号为HP5890 GC的GC/MS用于证实对各种游离脂肪酸的确定。升温程序为以3℃/min从起始温度80℃线形地升高到最终温度210℃，接着在最后温度下停留10分钟。组织脂肪酸量化依赖于脂肪酸甲基酯标准物的保持时间和相关理论的反应因素。根据标准物和GC/MS色谱确定游离脂肪酸。
通过酶促分析确定组织中的游离脂肪酸和三酰甘油浓度 从总脂质中分离游离脂肪酸，在N₂蒸汽中蒸发干燥，并保存在-80℃下直到用于分析。样本溶解在50μl热乙醇中(35-40℃)，当乙醇恢复到室温时，加入Triton X-100溶液(6％w/v)。搅拌溶液30min，加入Triton溶液到0.825ml。用棕榈酸标准物通过被调整为适合微量分析的商业方法(Cobal Mira，Roche Diagnostics)来量化游离脂肪酸。用甘油标准物在总脂质馏分(Pointe Scientific)中量化三酰甘油水平。
酶促分析组织中的甘油 冷冻的肌肉组织被磨碎，并称重到2ml离心管中。在各个样本中加入0.5ml10％(w/v)三氯乙酸，然后在冰块中匀化4分钟。离心和摇晃匀浆多次，在冰块上放置2分钟后，以10,000rpm离心5min。0.4ml上清液被转移到新的试管中，加入0.5ml三-N-辛基胺/Freon 113(1∶2.03v/v)。混合溶液，并在冰块上放置5分钟。测定上层水层的pH，样本被混合和离心直到获得中性的pH。取出0.2ml上层并分析甘油含量。
统计分析 所有结果表示为平均数±S.E.M.。为了平均激素对脂质代谢的影响，进行变量单因素分析(ANOVA)。Dunnett post hoc检验用于分析处理组与相应对照值之间的差异。所有统计分析用Power PC版本的Macintosh Graph Pad Prism程序进行。P＜0.05的数值认为具有统计显著性。
实施例2
支链淀粉、CGRP、去甲肾上腺素和胰岛素对得自正常饲喂的大鼠的骨骼肌中脂质代谢的影响。
本实施例描述由各种试剂引起的对离体大鼠比目鱼肌组织中的脂质代谢水平的刺激。肌肉组织用支链淀粉、CGRP、去甲肾上腺素或胰岛素处理，游离脂肪酸、甘油和甘油三酯的水平与对照水平进行比较。
支链淀粉、CGRP、胰岛素和去甲肾上腺素对离体比目鱼肌中的游离脂肪酸含量的影响显示在附图2A中。用支链淀粉、CGRP和去甲肾上腺素处理的比目鱼肌中的游离脂肪酸含量与对照肌肉的游离脂肪酸含量相比具有显著差异。与去甲肾上腺素(295±27nmol/g比78±21，P＜0.01)和支链淀粉(216±22nmol/g比78±21，P＜0.01)相比，用CGRP培养引起肌肉内游离脂肪酸的最大增加(325±56nmol/g比78±21，P＜0.01)。与对照组织相比，用最大刺激胰岛素来培养比目鱼肌不会改变肌肉内游离脂肪酸的浓度(67±9nmol/g比78±21)。
如附图2B所示，支链淀粉、CGRP和去甲肾上腺素引起肌肉内甘油含量下降。用支链淀粉、CGRP和去甲肾上腺素培养1h后，甘油含量分别为(0.03±0.004nmol/g比0.07±0.007，P＜0.01)、(0.04±0.008nmol/g比0.07±0.007，P＜0.01)和(0.04±0.005nmol/g比0.07±0.007，P＜0.01)。
附图2C表示在培养60min后比目鱼肌中的三酰甘油含量。用去甲肾上腺素处理降低三酰甘油含量(0.81±0.09nmol/g比1.17±0.15)。用支链淀粉和CGRP处理，肌肉三酰甘油的还有升高的趋势(1.7±0.26nmol/g(支链淀粉)、1.9±0.23nmol/g(CGRP)比1.17±0.15(对照))。但是这些结果与对照值之间都不具有显著差别。
来自三种激素处理的培养介质用相同的酶基底方法检测(每个处理n＝7)。没有检测到释放到介质中底游离脂肪酸或甘油(结果未显示)。
实施例3
激素对骨骼肌中的各种游离脂肪酸含量的影响
本实施例描述对响应CGRP、支链淀粉或去甲肾上腺素处理的骨骼肌中释放的各种游离脂肪酸的量化。所有程序采用气相色谱来量化各种游离脂肪酸，通过质谱分析(GC-MS)确定鉴定。表5表示在静止(resting)比目鱼肌的所有脂质馏分中脂肪酸水平，通过分析总脂质样本确定。总的基线脂质样本通过气相色谱分析，来确定比目鱼肌中的静止脂肪酸成分，用质谱分析来确定对各种脂肪酸的鉴别。数值为平均数±S.E.M.(各点n＝8)。
表5
比目鱼肌的脂肪酸成分
脂肪酸                                     FA浓度(nmol/g wwt)
十四烷酸                    C14:0          0.78±0.45
十五烷酸                    C15:0          0.1±0.033
十六烷酸                    C16:0          8.05±2.65
十六碳烯酸(n＝9)            C16:1          0.11±0.05
十六碳烯酸(n＝7)            C16:1          0.1±0.05
十七烷酸                    C17:0          0.133±0.033
十八烷酸                    C18:0          4.25±0.733
油酸(n＝9)                  C18:1          4.9±1.95
十八碳烯酸(n＝7)            C18:1          1.25±0.316
十八碳二烯酸                C18:2          5.5±1.55
十八碳三烯酸                C18:3          0.25±0.1
二十烷酸                    C20:0          0.183±0.13
二十碳四烯酸                C20:4          1.56±0.316
二十碳五烯酸                C20:5          0.28±0.083
二十二碳四烯酸              C22:4          0.083±0.016
二十二碳六烯酸              C22:6          0.816±0.166
表6表示激素引起的各种游离脂肪酸的释放。表明C16:0是比目鱼肌中存在的最大量的游离脂肪酸，但是，存在激素时进行培养不会引起浓度升高。用支链淀粉(0.013±0.0011nmol/g比0.008±0.0013，P＜0.05)、CGRP(0.013±0.0011nmol/g比0.008±0.0006，P＜0.01)和去甲肾上腺素(0.013±0.0011nmol/g比0.007±0.0007，P＜0.01)处理降低肌肉内C16:1(n＝9)的浓度。
通过激素处理，一些长链的、多聚不饱和脂肪酸的浓度升高。用支链淀粉(0.005±0.001nmol/g比0.016±0.002，P＜0.01)、CGRP(0.005±0.001nmol/g比0.018±0.002，P＜0.01)和去甲肾上腺素(0.005±0.001nmol/g比0.015±0.0007，P＜0.01)处理提高了肌肉内的二十碳四烯酸(C20:4)浓度。用这三种激素处理也提高了二十二碳六烯酸浓度：支链淀粉(0.01±0.0008nmol/g比0.03±0.004，P＜0.01)、CGRP(0.01±0.0008nmol/g比0.022±0.002，P＜0.01)和去甲肾上腺素(0.01±0.0008nmol/g比0.022±0.0015，P＜0.05)。
表6
激素引起的各种游离脂肪酸的释放
用气相色谱仪分析比目鱼肌中由激素引起的超过1h的各种游离脂肪酸的释放，通过质谱分析来确定对各种游离脂肪酸的鉴定。数值为nmol/g wwt，并表示为平均数±S.E.M.。(各个点n＝16)。*与对照比较的显著差别(P＜0.05)。**与对照比较的显著差别(P＜0.01)。
游离脂肪    对照                      支链淀粉          CGRP              去甲肾上腺素
酸
十四烷酸    C14:0    0.025±0.002     0.026±0.0028     0.028±0.001      0.023±0.001
十五烷酸    C15:0    0.01±0.00005    0.013±0.002      0.01±0.01        0.01±0.0012
十六烷酸    C16:0    0.17±0.74       0.21±0.0188      0.23±0.01*       0.175±0.011
十六碳烯    C16:1    0.013±0.0011    0.008±0.0013*    0.008±0.0006*    0.007±
酸(n＝9)                                                                  0.0007**
十六碳烯    C16:1    0.013±0.002     0.015±0.0025     0.022±0.002*     0.015±0.002
酸(n＝7)
十七烷酸    C17:0    0.008±0.0006    0.013±0.0022*    0.015±0.0015*    0.01±0.0007
十八烷酸    C18:0    0.09±0.0035     0.0125±0.0058**  0.15±0.01**      0.1±0.006
油酸(n＝9)  C18:1    0.06±0.0051     0.076±0.0082     0.09±0.0075**    0.07±0.0056
十八碳烯    C18:1    0.008±0.0007    0.015±0.0015**   0.017±                        0.015±
酸(n＝7)                                                0.0015**          0.0008**
十八碳二    C18:2    0.035±0.0045    0.058±0.006**    0.057±0.006*     0.043±0.003
烯酸
十八碳三    C18:3    0.001±0.0007    0.01±0.002*      0.005±0.0013     0.007±0.0025
烯酸
二十烷酸    C20:0    0.007±0.001     0.008±0.002      0.007±0.0008     0.003±0.001
二十碳四    C20:4    0.005±0.001     0.016±0.002**    0.018±0.002**    0.015±
烯酸                                                                      0.0007**
二十碳五    C20:5    0.002±0.0007    0.005±0.0007**   0.003±0.0005     0.002±0.0005
烯酸
二十二碳    C22:4    0.002±0.001     0.008±0.003*     0.007±0.002      0.007±0.001
四烯酸
二十二碳    C22:6    0.01±0.0008     0.03±0.004**     0.022±0.002**    0.022±
六烯酸                                                                    0.0015*
表7表示肌肉内游离脂肪酸相对于总脂肪酸水平的百分比。该表格还表明了在激素处理后可获得的游离脂肪酸的百分比的变化。
表7
激素引起的游离脂肪酸的释放
在比目鱼肌中由激素引起的超过1h的游离脂肪酸的释放与总的静止脂肪酸比较。数值表示由激素处理引起释放的游离脂肪酸相对于总的静止脂肪酸水平的比例。
脂肪酸            对照        支链淀粉        CGRP        去甲肾上腺素
C14:0             3.2         3.4             3.6         3.1
C15:0             12.9        15.4            12.9        10.9
C16:0             2.2         2.6             2.9         2.2
C16:1(n-9)        10.6        7.2             7.5         6.0
C16:1(n-7)        12.6        15.8            21.6        14.3
C17:0             6.3         10.7            10.7        7.2
C18:0             2.1         2.9             3.6         2.4
C18:1(n-9)        1.2         1.6             1.8         1.4
C18:1(n-7)        0.6         1.3             1.4         1.2
C18:2             0.6         1.1             1.0         0.8
C18:3             0.8         3.7             2.1         2.5
C20:0             3.7         4.5             3.6         2.0
C20:4             0.3         1.0             1.1         0.9
C20:5             0.5         1.4             1.0         0.4
C22:4             1.2         9.1             8.1         7.5
C22:6             1.3         3.3             2.7         2.5
前面的表3表示标准大鼠料中的游离脂肪酸水平和总脂肪酸含量。
实施例4
支链淀粉、CGRP和去甲肾上腺素对饲喂高脂质食物的大鼠的比目鱼肌三酰甘油含量的影响
高脂质饲喂的大鼠是胰岛素抵抗的模型，是2型糖尿病研究中特别有用的模型(与正常饲喂的动物相比)。上面的表4表示用于制备高脂质食物的脂质成分。表8、9和10表示饲喂这三种高脂质食物之一的大鼠的比目鱼肌中的各种游离脂肪酸含量。附图16表明饲喂高脂质食物的大鼠是胰岛素抵抗的，从比目鱼肌的胰岛素反应确定。在饲喂正常食物(■)或高脂质食物()51天的大鼠比目鱼肌中测定胰岛素的剂量反应曲线。在用各种浓度胰岛素培养2h后，通过D[¹⁴C(U)]葡萄糖转化为肌糖原来测定胰岛素反应。然后提取肌糖原并通过液体闪烁分光光度计分析D[¹⁴C(U)]葡萄糖浓度。剂量-反应曲线与S形剂量反应算法拟合。结果表示为平均数±SEM(各个点n＝12-18肌肉条)。平方总和分析表明这两种曲线之间差异极其显著(P＜10^-5)。
附图6表示三种激素对饲喂三种高脂质食物之一的大鼠比目鱼肌中的甘油三酯含量的影响。与相应的对照比较，在饲喂含有40％加入的猪油(附图6A)的食物的组中，所有三种激素引起比目鱼肌中甘油三酯含量的显著下降(在各种情况下，为0.75±0.08(CGRP)、0.71±0.07(支链淀粉)和0.69±0.09(去甲肾上腺素)μmol/g比1.14±0.16μmol/g，p＜0.05)。在饲喂40％玉米油(附图6B)的组中(在各种情况下0.48±0.06(CGRP)和0.49±0.07(支链淀粉)μmol/g比0.89±0.06μmol/g，P＜0.05)或40％橄榄油(附图6C)(在各种情况下0.52±0.08(CGRP)和0.44±0.4(支链淀粉)μmol/g比0.83±0.1μmol/g，P＜0.05)，与对照比较仅支链淀粉和CGRP引起显著降低。
附图7表示三种激素对饲喂三种高脂质食物之一的大鼠比目鱼肌中的游离脂肪酸含量的影响。在饲喂含有40％加入的猪油(附图7A)的食物的组中，与相应的对照比较，支链淀粉和去甲肾上腺素引起比目鱼肌中游离脂肪酸含量的显著升高(102±12(支链淀粉，P＜0.01)、75±7(去甲肾上腺素，P＜0.05)nmol/g比43±8)。CGRP具有引起游离脂肪酸含量升高的趋势，与对照值之间无显著差别(64±7nmol/g比43±8)。在饲喂40％玉米油(附图7B)(75±9(支链淀粉，P＜0.05)和99±17(CGRP，P＜0.01)nmol/g比35±4nmol/g)或40％橄榄油(附图7C)(85±12(支链淀粉，P＜0.01)和55±14(CGRP，P＜0.05)nmol/g比15±3nmol/g)的组中，CGRP和支链淀粉都引起比目鱼肌游离脂肪酸含量的显著增加。
施用CGRP-1给高脂质饲喂的动物对甘油三酯和游离脂肪酸的作用通过高亲和性CGRP1位点发生，这被相似的EC₅₀剂量-反应值证明。附图17A表示CGRP-1引起肌肉NEFA含量的剂量依赖升高，具有与正常饲喂动物的肌肉中观察到的高亲和性位点相似的EC₅₀(0.7pM±0.4到1.0；平均数±95％C.I.)。附图17B表示与NEFA浓度增加相关的是总肌肉内甘油三酯含量的剂量依赖性下降，这是在正常饲喂动物的比目鱼肌中没有观察到的结果。肌肉内甘油三酯降低的EC₅₀(0.25pM±0.03到1.96；平均数±95％C.I.)是在NEFA含量升高中所观察的EC₅₀的试验误差内确定。相对于正常饲喂动物的肌肉，高脂质饲喂动物的肌肉中的基线甘油三酯含量显著升高。在本试验中，动物从断奶开始饲喂含大量饱和脂质(猪油)的食物30天。
表8
在饲喂高玉米油含量的食物的大鼠比目鱼肌中激素引起的各种游离脂肪酸释放
在饲喂高玉米油含量的食物大鼠比目鱼肌中由激素引起的超过1h的各种游离脂肪酸的释放用气相色谱仪分析，通过质谱分析确定对各种脂肪酸的鉴定。数值为nmol/g wwt，并表示为平均数±S.E.M.。(各个点n＝16)。*与对照比较的显著差别(P＜0.05)。**与对照比较的显著差别(P＜0.01)。
游离脂肪             对照             支链淀粉         CGRP             去甲肾上腺素
酸
十四烷酸    C14:0    0.02±0.001      0.04±0.006**    0.03±0.02**     0.02±0.002
十五烷酸    C15:0    0.01±0.001      0.05±0.007**    0.04±0.03**     0.04±0.005**
十六烷酸    C16:0    0.07±0.006      0.12±0.01       0.16±0.03**     0.09±0.01
十六碳烯    C16:1    0.12±0.007      0.19±0.008**    0.20±0.008**    0.15±0.01
酸(n＝9)
十六碳烯    C16:1    0.005±0.0005    0.01±0.0008**   0.01±0.0008**   0.007±0.0005
酸(n＝7)
十七烷酸    C17:0    0.03±0.006      0.02±0.0009     0.02±0.003      0.04±0.006
十八烷酸    C18:0    0.09±0.004      0.14±0.008      0.39±0.02       0.11±0.008
油酸        C18:1    0.08±0.008      0.13±0.01*      0.16±0.01       0.12±0.02
十八碳烯    C18:1    0.02±0.002      0.02±0.002      0.02±0.004      0.02±0.001
酸
十八碳二    C18:2    0.08±0.005      0.18±0.02**     0.18±0.008**    0.14±0.02*
烯酸
十八碳三    C18:3    0.07±0.005      0.16±0.02**     0.17±0.01**     0.13±0.01**
烯酸
二十烷酸    C20:0    0.03±0.003      0.04±0.002      0.03±0.005      0.03±0.002
二十碳四    C20:4    0.02±0.002      0.04±0.002      0.02±0.002      0.08±0.009**
烯酸
二十碳五    C20:5    0.02±0.002      0.05±0.007**    0.04±0.001**    0.05±0.005**
烯酸
二十二碳    C22:4    0.02±0.002      0.03±0.003      0.04±0.002**    0.05±0.004**
四烯酸
二十二碳    C22:6    0.01±0.0007     0.03±0.002**    0.03±0.003**    0.04±0.003**
六烯酸
表9
在饲喂高橄榄油含量的食物的大鼠比目鱼肌中激素引起的各种游离脂肪酸释放
在饲喂高橄榄油含量的食物大鼠比目鱼肌中由激素引起的超过1h的各种游离脂肪酸的释放用气相色谱仪分析，通过质谱分析确定对各种脂肪酸的鉴定。数值为nmol/g wwt，并表示为平均数±S.E.M.。(各个点n＝16)。*与对照比较的显著差别(P＜0.05)。**与对照比较的显著差别(P＜0.01)。
游离脂肪酸             对照             支链淀粉         CGRP             去甲肾上腺素
十四烷酸      C14:0    0.004±0.0003    0.01±0.001**    0.015±0.0009**  0.005±0.0002
十五烷酸      C15:0    0.009±0.0020    0.04±0.005**    0.08±0.002**    0.01±0.0004
十六烷酸      C16:0    0.07±0.02       0.18±0.01       0.20±0.006**    0.19±0.002*
十六碳烯酸    C16:1    0.16±0.03       0.29±0.03**     0.27±0.013*     0.23±0.01
(n＝9)
十六碳烯酸    C16:1    0.01±0.0006     0.02±0.001      0.02±0.002      0.03±0.009*
(n＝7)
十七烷酸      C17:0    0.009±0.002     0.02±0.003      0.03±0.012      0.01±0.001
十八烷酸      C18:0    0.09±0.01       0.18±0.02**     0.12±0.004      0.16±0.006**
油酸          C18:1    0.10±0.01       0.34±0.04**     0.34±0.01**     0.28±0.03**
十八碳烯酸    C18:1    0.06±0.01       0.13±0.02**     0.17±0.008**    0.2±0.003
十八碳二烯    C18:2    0.007±0.0006    0.02±0.004      0.06±0.01**     0.04±0.009*
酸
十八碳三烯    C18:3    0.009±0.001     0.01±0.002      0.03±0.0009     0.04±0.01**
酸
二十烷酸      C20:0    0.01±0.0009     0.04±0.005**    0.04±0.001**    0.009±0.0004
二十碳四烯    C20:4    0.01±0.002      0.03±0.007**    0.02±0.007      0.03±0.0008
酸
二十碳五烯    C20:5    0.009±0.002     0.02±0.003      0.01±0.001      0.04±0.004**
酸
二十二碳四    C22:4    0.01±0.002      0.05±0.008**    0.03±0.006*     0.02±0.0007
烯酸
二十二碳六    C22:6    0.02±0.003      0.08±0.02       0.11±0.03*      0.12±0.03*
烯酸
表10
在饲喂高猪油含量的食物的大鼠比目鱼肌中激素引起的各种游离脂肪酸释放
在饲喂高猪油含量的食物大鼠比目鱼肌中由激素引起的超过1h的各种游离脂肪酸的释放用气相色谱仪分析，通过质谱分析确定对各种脂肪酸的鉴定。数值为nmol/g wwt，并表示为平均数±S.E.M.。(各个点n＝16)。*与对照比较的显著差别(P＜0.05)。**与对照比较的显著差别(P＜0.01)。
游离脂肪酸             对照             支链淀粉         CGRP             去甲肾上腺素
十四烷酸      C14:0    0.004±                      0.05±0.01**     0.03±0.007*     0.04±0.007**
                       0.0007
十五烷酸      C15:0    0.04±0.01       0.12±0.03*      0.14±0.01**     0.13±0.02*
十六烷酸      C16:0    0.1±0.009       0.24±0.01**     0.24±0.01**     0.23±0.02**
十六碳烯酸    C16:1    0.02±0.001      0.02±0.003      0.03±0.003*     0.01±0.001
(n＝9)
十六碳烯酸    C16:1    0.03±0.005      0.02±0.0009     0.02±0.005      0.02±0.0008
(n＝7)
十七烷酸      C17:0    0.03±0.005      0.08±0.01**     0.09±0.01**     0.08±0.008**
十八烷酸      C18:0    0.2±0.03        0.35±0.04*      0.35±0.06*      0.22±0.01
油酸          C18:1    0.17±0.02       0.2±0.01        0.25±0.02*      0.21±0.01
十八碳烯酸    C18:1    0.01±0.002      0.02±0.002      0.03±0.006*     0.07±0.003**
十八碳二烯    C18:2    0.12±0.009      0.29±0.004**    0.23±0.005*     0.09±0.003
酸
二十烷酸      C20:0    0.02±0.001      0.06±0.007**    0.07±0.004**    0.03±0.004
二十碳四烯    C20:4    0.01±0.003      0.01±0.0005     0.02±0.001      0.012±0.003
酸
二十碳五烯    C20:5    0.01±0.002      0.02±0.002      0.02±0.002      0.02±0.004
酸
二十二碳四    C22:4    0.02±0.003      0.03±0.005*     0.04±0.005*     0.02±0.003
烯酸
二十二碳六    C22:6    0.01±0.002      0.02±0.002      0.015±0.002     0.01±0.001
烯酸
实施例5
支链淀粉-(8-37)和CGRP-(8-37)在正常饲喂和高脂质饲喂大鼠的骨骼肌中对脂质代谢的激素介导的调节的影响
A.支链淀粉-(8-37)和CGRP-(8-37)在正常饲喂大鼠的骨骼肌中对脂质代谢的激素介导的调节的影响
离体比目鱼肌条中的基于酶促分析的体外研究证明，与单独用100nM支链淀粉培养相比，10μM支链淀粉-(8-37)或10μMCGRP-(8-37)与100nM支链淀粉协同施用时极大地降低肌肉内游离脂肪酸含量，分别为(18.5±6nmol/g对216±26，P＜0.01)和(65±8nmol/g对216±26，P＜0.01)，见附图3A。这两种线性的具有拮抗活性的肽都缺少前7个氨基酸，以及一致的NH₂末端的cys2-cys7二硫键环状结构，该环状结构是获得这些肽的全长肽所共有的。这两种肽都反转大量由CGRP和支链淀粉引起的生物作用，并以不同的效力在各种不同的组织中与相应的放射标记的类似物竞争。(Wang等。1991，FEBS Lett291：195-198；Chantry等，1991，生物化学杂志277：139-143；Beaumont等，1998，美国生理学杂志274：F51-62；Aiyar等1995，神经化学杂志65：1131-1138；Bhogal等1994，肽15：1383-1390；Perry等，1997，内分泌学138：3486-3496；Zimmermann等，1997，内分泌学杂志155：423-431)。相对于仅用100nM CGRP培养，支链淀粉(8-37)抑制CGRP-100nM增加比目鱼肌中的游离脂肪酸含量的能力(34±5nmol/g比334±52，P＜0.01)，见附图3B。CGRP拮抗剂CGRP-(8-37)也抑制由100nM CGRP引起的游离脂肪酸的升高(90±7nmol/g对334±52，P＜0.01)。最大刺激的胰岛素的加入抑制了100nM支链淀粉(216±26nmol/g比100±52，P＜0.01)或CGRP(334±52nmol/g比107±17，P＜0.01)促进比目鱼肌中游离脂肪酸含量的增加的能力。因此，胰岛素拮抗这两种激素的作用，引起骨骼肌中游离脂肪酸的释放。
当CGRP浓度为1pM时，100pM CGRP-(8-37)和支链淀粉-(8-37)能显著降低比目鱼肌中的游离脂肪酸浓度，分别为(68±8nmol/g比166±18，P＜0.01)和(86±20nmol/g比166±18，P＜0.01)，见附图3C。
本研究提供直接证据，^8，37支链淀粉和^8，37CGRP能够抑制由支链淀粉和CGRP引起的肌肉内游离脂肪酸升高，即作为组成型CGRP/支链淀粉受体的竞争性拮抗剂。由支链淀粉衍生的拮抗剂^8，37支链淀粉的组成型受体的K_i显著高于相应的CGRP衍生的拮抗剂^8，37CGRP。大约20倍的结合亲和性的差异，这在数量上与^8，37CGRP更有效地阻断支链淀粉对葡萄糖升高的作相一致。已经证实1μM和10nM^8，37CGRP反转由10nM支链淀粉介导的对胰岛素刺激的葡萄糖升高的抑制，与观察到的这些肽对组成型C1_ins-/ramp 1受体的结合亲和性一致。因此，测定的拮抗剂^8，37CGRP和^8，37支链淀粉对L6成肌细胞中的C1_ins-/ramp 1受体的结合亲和性与其在离体比目鱼肌中的相对功效一致。相似地，^8，37CGRP的交叉反应活性与该拮抗剂竞争性地反转支链淀粉对胰岛素刺激糖原合成抑制和支链淀粉导致血液葡萄糖和乳酸升高的能力相一致(Wang等，1991，FEBS Lett 291：195-198)。拮抗剂的功效的顺序即拮抗剂顺序与CGRP和支链淀粉通过与内在C1_ins-/ramp 1受体结合而引起对骨骼肌葡萄糖代谢的作用的假设一致。
B.CGRP受体拮抗剂反转CGRP-1对高脂质饲喂的大鼠肌肉脂质的影响
Wistar大鼠从断奶时期(21天)开始饲喂高脂质食物(40％猪油)30天(直到51天)，在缺少或存在CGRP拮抗剂、支链淀粉-(8-37)或CGRP-(8-37)时，用CGRP1体外培养离体的大鼠比目鱼肌1h。提取并量化总脂质。结果表示为附图18A的NEFA和18B的甘油三酯。
在正常饲喂的大鼠中，CGRP受体拮抗剂反转CGRP的效果。由1pM或100nM CGRP1引起的甘油三酯含量的降低被10倍摩尔过量的任何一种拮抗剂抑制。对于高亲和性位点，100pM拮抗剂足以改善1pM CGRP对比目鱼肌中的甘油三酯和游离脂肪酸含量的影响。
实施例6
支链淀粉对刺激培养的大鼠比目鱼肌中游离脂肪酸含量的剂量-依赖的作用
CGRP对刺激培养的大鼠比目鱼肌中游离脂肪酸含量的剂量-依赖的作用CGRP-1剂量反应研究的数据示于附图4A和4B。这些研究表明存在两种浓度范围，其中CGRP导致培养的大鼠比目鱼肌中的游离脂肪酸含量降低。第一阶段的EC₅₀值为0.25pM±(13-0.5pM[95％的置信范围]，相应的r²值为0.84。第二阶段的EC₅₀值为45nM±(8.5-95)，相应的r²值为0.51。来自CGRP-2研究的数据示于附图4C。该研究证明CGRP-2具有不同于其类似物的作用机制，实际上与支链淀粉相似。EC₅₀值为5.2nM±(2.3-11.5；平均数±95％C.I.)，相应的r²值为0.78。
支链淀粉对刺激培养的大鼠比目鱼肌中游离脂肪酸含量的剂量-依赖的作用支链淀粉对刺激培养的大鼠比目鱼肌中游离脂肪酸含量的剂量-依赖作用在附图5A中说明。培养液中支链淀粉浓度的逐步增加提高了大鼠比目鱼肌中的游离脂肪酸的含量。这种作用的EC₅₀为7.8nM±(4.1-14.7，平均数±95％C.I.)，相应的r²值为0.87。
存在CGRP(100pM)时，支链淀粉对刺激培养的大鼠比目鱼肌中游离脂肪酸含量的剂量-依赖的作用
附图5B表示存在100pM CGRP时得到的支链淀粉剂量反应曲线。EC₅₀值为11.6nM±(4.8-27，平均数±95％C.I.)，相应的r²值为0.79。
从骨骼肌中激素处理后的游离脂肪酸计算得到代谢能量表11表示从用支链淀粉、CGRP和去甲肾上腺素处理比目鱼肌60min后释放的游离脂肪酸获得的代谢能量。总水平得自GC数据。各种游离脂肪酸的潜在能量的数量根据完全线粒体脂肪酸β氧化的可能ATP产量来计算(Mathews等，2000，生物化学，第3版，BenjaminCummings Pub.Co.，加利福尼亚)。这些计算假定理想的100％的能量转化。支链淀粉和CGRP引起肌肉内游离脂肪酸含量增加，相对于对照可以获得更多的潜在能量(2.73±0.28μmol/g对1.97±0.31，P＜0.01)，(2.96±0.22μmol/g对1.97±0.31，P＜0.01)。在用去甲肾上腺素处理后，从游离脂肪酸得到的潜在代谢能量与对照(2.24±0.17)之间无显著差别。
表11
从激素处理后的游离脂肪酸获得的代谢潜能
通过气相色谱测定比目鱼肌中由激素引起的游离脂肪酸的总释放，通过质谱分析确定对各种游离脂肪酸的鉴定。各种游离脂肪酸被用于计算由游离脂肪酸通过线粒体脂肪酸β氧化完全转化得到的理论代谢能量。这些计算值假定100％的能量转化效率。数值为平均数±S.E.M(各个点n＝16)。所有激素浓度为100nM。**与对照相比显著差别(p＜0.01)。
               对照           支链淀粉         CGRP             去甲肾上腺素
总游离脂肪酸   0.467±0.03    0.636±0.05**    0.691±0.04**    0.527±0.03
(nmol/g wwt)
获得能量(μ          63.56±5.2     88.2±9.08       95.55±7.28      72.58±5.58
mol ATP/g/hr)
(kJ/g/hr)      1.97±0.31     2.73±0.28**     2.96±0.22**     2.24±0.17
实施例7
材料与方法
本实施例描述在实施例8-14中描述的试验中所有的材料与方法，包括制备表达重组受体的细胞。
肽、放射化学药品及其他的分析试剂 大鼠支链淀粉的序列与鼠科支链淀粉的序列(Cooper等，1994，内分泌学研究15：163-201，1994)相同，在下文称为“支链淀粉”(目录号0538912)；大鼠CGRP-1(‘CGRP’；目录号501460)；大鼠降钙素(目录号ZJ375)；鲑鱼降钙素(‘sCT’；目录号ZM423)；^8，37大鼠CGRP-1(目录号501395)购自Bachem(瑞士)。人adrenomedullin根据先前的描述合成(Heller等，2000，分析化学285：100-104)。通过质谱分析确定所有肽制备物完整性和纯度(基质辅助激光吸收电离时间飞行质谱，MALDI-TOF；Hewlett-Packard G2025A；4-羟基-苯乙烯酸基质)。可溶的人胰岛素全都用作为胰岛素激动剂(‘胰岛素’；Actrapid 100U，Novo Nordisk)。批量合成的肽以干粉状在-80℃下储存在氩中直到使用。溶解在18MΩ的双重去离子水中，得到母液，按照需要，将母液加入反应液中获得指定的最终浓度。[2-³H]2-脱氧-D-葡萄糖([³H]2-DOG；目录号2711-158，30.6Ci/mmol)和D[¹⁴C(U)]葡萄糖(目录号2643-317，10.6mCi/mmol)购自New England Nuclear；D[¹⁴C(U)]山梨糖醇购自美国放射标记化学药品公司(American Radiolabeled  Chemicals Inc)(目录号950314，320mCi/mmol)；和[α-³²P]dCTP购自Amersham(目录号A025694；3000mCi/mmol)。除非另外指出，所有其他的试剂是分析级的。
放射标记的激素类似物的合成和分析 CGRP、支链淀粉和sCT通过还原性甲基化用[³H]NaBH₄进行放射标记，然后如先前所述纯化(Cornish等，1997，Am.J.Phys.36：E1113-E1120)。通过凝胶过滤，接着RP-HPLC纯化³H标记的肽，用MALDITOF-MS来确定[³H]甲基标记的插入。测定的[³H]放射配体的特定活性为：CGRP，26.2GBq/mmol；支链淀粉，24.0GBq/mmol；和sCT，23.2GBq/mmol。当干燥地在氩气、-80℃下储存，放射配体能够稳定超过12个月。
鼠科ramp 1、鼠科ramp 3和鼠科降钙素的反向插入形式(C1_ins-)的克隆分子生物学方法已被描述(Sambrook J，1989，分子克隆：试验室手册，冷泉巷试验室出版社)。Ramp 1和Ramp3(genbank登录号分别为AA544629和AF146524)从提取自鼠科比目鱼肌的总RNA(1μg)中经RT-PCR克隆。在65℃下加热10min，并用随机六碱基序列(hexamer)起始(Primed)。用Expand^TM-RT在30℃下反转录10min，接着在42℃下45min。反应条件为：tri-HCl(50mM)；KCl(40mM)；MgCl₂(5mM)；Tween-20(0.5％)；二硫苏糖醇(10mM)；RNA酶抑制剂(20U)；Expand^TM反转录酶(50U)(Boehringer Mannheim)；dNTP’s(1mM)；pH 8.3。Ramp1和Ramp3的寡核苷酸引物分别为
5-TTAGGATCCGTTGCCATGGCCCGGCTGCGGCTCCCG-3(正向)
/5-CGAGAATTCCTCATCACCCGGATACCTA-3(反向)
和5-ATAGGATCCTGCATCTTAGTTGGCCATGA-3(正向)
/5-ATAGAATTCATCCAGCAGATCCTCAAGC-3(反向)。下划线的核苷酸分别表示被引入方便克隆的BamH I和EcoR I的限制性位点。PCR扩增在Eppendorf MastercyclerR梯度热循环仪进行，94℃(1min)、55℃(2min)和72℃(3min)循环40次。反应条件为：Tri/HCl(10mM)；KCl(50mM)；MgCl₂(1.1mM)；寡核苷酸(0.5μM)、凝胶(0.01％w/v)、dNTP’s(200μM)、U REDTaq^TM DNA聚合酶(Sigma，Saint Louis)、cDNA模板(10ng)，pH 8.3。分离PCR产物，通过BamH I和EcoR I的限制性位点亚克隆到pcDNA3.1+(Invitrogen)中。序列分析证实Ramp 1和Ramp3序列的忠实性(fidelity)。
通过RT-PCR从鼠大脑总RNA中克隆反向插入形式的降钙素受体C1_ins-(Genbank登录号U18542)，所用寡核苷酸引物为5-CCATCCCTGCCTGCAGATGC-3(正向)和5-CTCTATTTCTAGACTGACTCCC-3(反向)；下划线的碱基被引入以方便克隆的BamH I和EcoR I的限制性位点，而黑体碱基表示引入限制性位点的点突变。用Elongase^TM进行RT-PCR。在94℃(30s)、56℃(30s)、68℃(2min)循环5次，然后在94℃(30s)、60℃(30s)和68℃(2min)下循环30次进行扩增。将对应于降钙素受体C1_ins-的1.9kbp的PCR产物亚克隆到pGEM-T(Promega)，然后再用EcoR I和Xba I酶切。通过EcoR I和Xba I位点经双重克隆步骤将从C1_ins-得到的两个片段被亚克隆到pCDNA3.1上。鼠科C1_ins-序列的忠实性通过序列分析确定。还对克隆产物的序列进行RT-PCR克隆来表明，对应于C1_ins-的RNA在大鼠比目鱼肌中表达，该RNA是比目鱼肌中相应被检测的钙的主要RNA种类。(结果未显示)。
L6成肌细胞和cos-7细胞的转染和放射配体结合的检测 L6成肌细胞和cos-7细胞得自ATCC。在5％CO₂/95％空气和37℃下，两种细胞系在Dulbecco改进的Eagle培养液(DMEM；Gibco/BRL，高葡萄糖)中培养，培养液中添加了10％胎牛血清(Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)、L-谷氨酰胺(2mM)、青霉素(100U/ml，Sigma)、链霉素(100U/ml，Sigma)、生理盐水(0.85％)。转染前一天，细胞用胰蛋白酶消化，然后以2.9×10⁵细胞/孔植入六孔培养板的相同的培养液中。转染时，细胞与含有1μg各种Qiagen纯化(Qiafen，Valencia，CA)的含有C1_ins-与ramp 1或ramp 3的质粒和Fugene试剂(6μl；Boehringer Mannheim)的Opti-Mem I溶液(Gibco/BRL)混合物一起培养。复合体与血清一起加入细胞中，再培养48h。
对于结合试验，试验前放射性配体(单独地或与指定最终浓度的非放射性标记的配体一起)溶解在含有0.1％BSA的DMEM中(结合缓冲液)1h。结合条件根据先前的时程试验(数据未显示)选择。细胞用这种缓冲液洗涤两次，然后与加入放射性配体的相同缓冲液在室温(21℃)下培养4h。接着，细胞用冰冷的结合缓冲液洗涤两次，在用0.5M氢氧化钠对细胞进行两次洗涤转移后，通过液体闪烁分光光度计计数被结合细胞的放射性。
Northern印迹杂交分析 用Trizol^TM试剂(Life Technologies)按照生产商的推荐分离总RNA。在甲醛/琼脂糖凝胶(1％w/v)上对总RNA(5μg/泳道)进行电泳，转移到Nylon Hybond^TM膜上(Amersham Pharmacia Biotech)，然后与Stratalinker 2400(Stratagene，La Jolla，CA)交联。小鼠ramp 1和ramp 3 cDNA杂交探针用[α-³²P]dCTP随机起始。过滤器在Church-Gilbert溶液(0.25M磷酸氢二钠、7％SDS、1mM EDTA)中65℃下预杂交2h，然后在含有25ng/ml标记的探针的相同缓冲液中65℃下杂交过夜。过滤器在65℃下、在2×SSC中洗涤30min两次，接着在1×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.5％SDS中洗涤30min两次。Northern印迹通过磷光图像仪可视化。
比目鱼肌的制备 所有试验按照公共动物伦理委员会(Institutional AnimalEthics Committee)认可的方法进行。5-6周龄的雄性Wistar大鼠(160g)处于12∶12光照/黑暗循环中，自由采食和饮水。大鼠用50mg/kg耐波他(戊巴比妥钠)麻醉，然后通过脱颈处死。在氧化KHB(118mM NaCl、4.75mM KCl、1.2mM MgSO₄、24.8mM NaHCO₃、1.2mM KH₂PO₄、2.54mM CaCl₂、10mM葡萄糖，pH7.4)中解剖比目鱼肌，并撕成对半，然后如下培养。
确定培养细胞和比目鱼肌条中的cAMP 测定如所述被植入六孔培养板并被转染的细胞中的cAMP浓度。通入气体后，细胞在存在指定浓度配体的结合缓冲液中室温下培养15min。加入异丁基甲基黄嘌呤(Sigma)到0.5mM的最终浓度以及指定浓度的肽，然后通入气体来结束反应。细胞用冰冷的TE缓冲液(10mMTris/HCl，1mM EDTA，pH7.6)洗涤，并迅速转移到离心管的1ml相同缓冲液中，加热5min。在4℃下以12,000g离心5min后，在冰上冷却，完全相同的50μl等分试样采用基于竞争结合的分析系统(Amersham Pharmacia)，按照生产商的推荐进行cAMP分析。
对于测定肌肉中的cAMP，离体比目鱼肌条用指定浓度的肽培养，然后冻干和脱蛋白。每个肌肉条放在400μl含有5mM EDTA的HClO₄中(磷酸二酯酶抑制剂)并以20s的脉冲超声波处理3次。试管在沸水中加热3-5min来凝固蛋白，然后离心(12,000g，，4℃，2min)。取上清液(300μl)，用75μl 2M NH₄OH调节pH为7.0。冷冻(4℃，2h)样本来沉淀蛋白，然后在与上述相同条件下离心，并取50μl用于cAMP测定。
被培养的比目鱼肌条中葡萄糖转运速率的测定在每个含有10ml DMEM的培养瓶中加入4-5个肌肉条。用指定的激素在摇晃水浴中30℃下预培养30min，此后，加入5μl 2[³H]DOG(0.5μCi/ml)和5μl D[¹⁴C(U)]山梨糖醇(0.5μCi/ml)，然后再培养30min；加入RIA级的BSA到0.9％(w/v)来阻止胰岛素非特异地结合到培养瓶上。培养后，将肌肉条转移到冰冷的KHB中5-10min来去除过量的[³H]DOG和[¹⁴C]山梨糖醇。然后印迹、冷冻、切除肌腱，再冻干48h。然后称重肌肉，转移到闪烁管中，用0.5ml 1M NaOH在60℃下消化1h。在每个管中加入闪烁液(4ml)，样本在Beckman液体闪烁分光光度计中计数，设置为同时计数¹⁴C和³H信号。确定存在于样本中的各种同位素的量，用于计算细胞外和细胞内的[³H]DOG浓度。肌肉葡萄糖升高的测定值是细胞内[³H]DOG的积累，通过从相应的总肌肉[³H]DOG中减去细胞外的[³H]DOG的浓度来计算；细胞外的[³H]DOG通过测定肌肉中[¹⁴C]山梨糖醇的浓度来量化。
测定培养的离体比目鱼肌中的糖原代谢 对于D[¹⁴C(U)]葡萄糖转化为肌肉糖原的测定，肌肉条在DMEM中预培养30min，接着在缺乏或存在23.7nM胰岛素时，用0.5μCi D[¹⁴C(U)]葡萄糖和支链淀粉、CGRP和sCT以指定浓度培养2h。迅速冷冻、冻干、称重肌肉条，然后在60％(w/v)氢氧化钾中70℃下消化45min(5mg干燥肌肉条/0.4ml 10.7M氢氧化钾)，并不定期混合。糖原用96％乙醇(1.2ml)在-20℃下沉淀过夜，然后以8,000g离心(15min，4℃)。用等量乙醇洗涤沉淀物两次，然后溶解在水中(0.6ml)。等分试样(0.3ml)通过液体闪烁分光光度计分析D[¹⁴C(U)]葡萄糖含量。
通过冷冻干燥肌肉条，接着用0.2M乙酸钠/乙酸缓冲液pH7.4中的20U/100ml的淀粉葡糖苷酶(Sigma)水解糖原为D-葡萄糖来测定总糖原含量，表示为μmol‘葡糖基’单位/g肌肉干重。用D-葡萄糖氧化酶固定的酶化学药品在葡萄糖/乳酸分析仪(YSI 2300 STAT，Yellow Springs Corporation)中测定上清液中的游离葡萄糖。
数据分析适宜地采用单因素ANOVA、Dunnett多重比较检验和不成对t-检验计算差异的统计学显著性。剂量-反应曲线与S形剂量反应算法拟合，如下：对于2-DOG升高，；和对于总糖原和[¹⁴C]葡萄糖转化采用四参数对数模型， / ( 1 + 10 log 50 ( EC - X ) hill - Coefficient ) ; ]]>用Prism v2.0(Graph Pad软件，San Diego，CA)行计算来获得半数最大有效浓度(EC₅₀)。按照一个位点竞争方式用Prism v2.0计算在转染细胞中不带放射性标记的配体与结合的放射性配体竞争的置换曲线。
实施例8
结合到用鼠科ramD 1和C1_ins-共转染的L6成肌细胞的放射性配体
已经被报道，当反向插入形式的降钙素受体与人ramp 1或ramp 3同种型(isoform)共表达时，发生对支链淀粉的受体响应(Muff等，1999，内分泌学140：2924-2927；Christopoulos等，1999，分子药学(Mol.Pharmacol)56：235-242)。本文，本发明人测定相应的鼠科受体同种型的性质，当鼠科ramp 1和鼠科C1_ins-共转染L6(鼠科)成肌细胞时(附图8)形成该同种型。单独用载体(附图8A)、ramp 1(附图8B)或C1_ins-(附图8C)转染的细胞中没有检测到显著的支链淀粉的特异结合，而在单独用ramp 1转染的细胞中，sCT表现出较低的但是显著的特异结合(附图8C)，相反，当用ramp 1和C1_ins-构建物共转染时，发生支链淀粉和sCT的特异结合的显著增加(附图8D)。时程试验确定[³H]支链淀粉结合达到平衡所需的培养时期(结果未显示)。
实施例9
从转染的L6成肌细胞中结合的[³H]支链淀粉的置换
在C1_ins-和ramp 1共转染的L6成肌细胞中，用CGRP-1和支链淀粉置换特异结合的[³H]支链淀粉，具有相似K_i值和EC₅₀值(附图9A)。该发现与两种肽竞争对细胞表面上的单个分子位点结合相一致。相反，sCT具有较高的亲和性与较低的K_I，与其较高的结合比例相一致(表12；附图8C和D)。大鼠降钙素和人adreomedullin，该肽家族中的第五个成员代表，仅仅非常微弱地与支链淀粉竞争结合共转染的细胞(附图9A)。与全长肽的相似结合的特性不同，作为拮抗剂的线性的平端肽^8，37支链淀粉和^8，37CGRP之间出现结合亲和性的显著差别(表12；附图9B)。^8，37CGRP与这些细胞结合的K_i比^8，37支链淀粉低约20倍(附图9B)。测定的IC₅₀和得到的K_i值总结在表12中。本试验得到的大鼠支链淀粉的K_i值(表12)与从饱和试验中得到的[³H]支链淀粉的K_d值(9.2±0.2nM，平均数±S.E.M；B_max＝1.5
表12
在共转染的L6成肌细胞中，由降钙素家族肽/拮抗剂和鼠科ramp 1/C1_ins-受体得到的结合参数
                       R²           IC₅₀(nM)           K_i(nM)
鲑鱼                   0.96          1.9(0.9-2.5)        0.5(0.3-8)
降钙素CGRP             0.96          63(43-93)           20(13-29)
支链淀粉               0.92          23(13-44)           7.4(4-14)
^8，37CGRP               0.92          62(35-108)          19.5(11-34)
^8，37支链淀粉           0.87          1270(661-           399(208-763)
                                     2420)
用22nM的放射性配体浓度和独立地从饱和曲线得到的K_d值9.2，通过Cheng和Prusof(Cheng等，1973，生物化学药物学(Biochem.Pharmacol.)22：3099-3108)的方法计算K_i值。包括95％的置信区间(nM)。
实施例10
肽拮抗剂对被转染的L6成肌细胞中的CGRP和支链淀粉引起的cAMP产量的影响
为了探讨作为由肽引起的信号传导的拮抗剂的作用，对于组成的ramp 1/C1_ins-受体表型，研究^8，37CGRP和^8，37支链淀粉对由CGRP和支链淀粉引起的cAMP生成的影响(附图10)。CGRP和支链淀粉都引起共转染的成肌细胞中cAMP生成的剂量依赖增加，虽然在所有被试验浓度下，这种反应的大小显著小于支链淀粉。
在所有被试验浓度下(10pM到100nM；附图10A)，5μM^8，37CGRP消除由CGRP引起的cAMP升高。该浓度足以饱和受体，比测定的CGRP和支链淀粉的K_i值约大250倍。与CGRP和^8，37CGRP之间的K_i值的相似性一致，所用的最高浓度CGRP(100nM)被50倍过量的^8，37CGRP(5μM)有效地竞争。相反，5μM^8，37支链淀粉作为支链淀粉拮抗剂的效率显著较低，仅仅引起cAMP产量的适度降低。
实施例11
在用ramp 3和C1_ins-转染后的结合细胞的放射性配体
用鼠科ramp 3和C1_ins-共转染成肌细胞，不会产生显著的与任何所用放射性配体的特异结合(数据未显示)。已经被报道，cos-7细胞的共转染会产生[¹²⁵I]-大鼠支链淀粉或[¹²⁵I]人支链淀粉与C1_ins-/ramp 1和C1_ins-/ramp 3受体同种型的结合(Muff等，1999，内分泌学140：2924-2927；Christopoulos等，1999，分子药学56：235-242)。因此，本发明人在这种细胞中用相应的鼠科同种型进行比较试验。本发明的C1_ins-/ramp 1的共转染与公开的结果类似(附图11A-C)。但是，与在L6中的结果一致，用鼠科C1_ins-/ramp 3转染不能获得特异性结合。通过Northern分析确定cos细胞中ramp 3的转录(附图12，右边组)，相对于ramp1(附图12，左边组)ramp 3的转录较少。但是，在该系统中在一定浓度范围内，没有观察到由ramp 3质粒转录的效率的变化(数据未显示)。未转染的cos-7细胞具有较小但是显著的对所有三种[³H]肽的内在的特异结合，表明它们表达低水平的公共受体。实际上，RT-PCR表明L6和cos-7细胞都表达C1_ins-(数据未显示)，说明所观察到的结合亲和性的差别可能是由于ramp1和ramp 3内在表达的改变。
实施例12
CGRP和支链淀粉对比目鱼肌中cAMP含量的影响
骨骼肌中CGRP/支链淀粉信号与cAMP代谢之间的关系颇受争议，部分是由于不同的公开试验之间不一致。早期的研究表明支链淀粉不会影响骨骼肌中cAMP的含量，与存在与cAMP无关的信号机制相一致(Deem等，1991，生物化学生物物理学研究通讯174：716-720；Kreutter等，1993，美国生理学杂志264：E606-613)。这些发现与其他关于支链淀粉对骨骼肌中cAMP和腺苷酰环化酶活性的潜在刺激报道(Pittner等，1995，Biochimical Biophys.Acta1267：75-82)相反。
a)毫微摩浓度的CGRP和支链淀粉通过代谢支链淀粉受体引起cAMP生成
在本试验中，测定CGRP(附图13A)和支链淀粉(附图13B)对比目鱼肌中cAMP生成的体外作用，并与他们对用C1_ins-/ramp 1共转染的细胞中cAMP生成的影响(附图10A和B)比较。表明支链淀粉对比目鱼肌中cAMP含量的影响在施用支链淀粉后5min达到最大(增加2倍，p＜0.01，数据未给出)，这与先前报道的在灌注离体心脏中对异丙去甲肾上腺素(β-肾上腺素激动剂)的反应的时程具有可比性。在缺少和存在胰岛素(23.7nM)时，5nM和10nM的CGRP都引起肌肉cAMP浓度的显著升高(附图13A)。当以10nM和100nM施用时，支链淀粉引起cAMP含量的最大增加，约2倍(附图13B)；这种作用的大小在缺少和存在胰岛素时(23.7nM)没有差异。皮摩尔浓度的支链淀粉对肌肉cAMP水平没有影响，说明了支链淀粉和CGRP-1之间活性的差别(附图13C)。
CGRP和支链淀粉的这种生物学作用与它们刺激由C1_ins-/ramp 1共转染的L6成肌细胞中的cAMP含量的作用一致(附图10)。而且，竞争性拮抗剂^8，37支链淀粉对支链淀粉介导的cAMP刺激的抑制(附图9B和11B)与支链淀粉在生理性肌肉中通过C1_ins-/ramp 1受体引起的这种作用的现象相一致。
b)皮摩尔浓度的CGRP1通过高亲和性受体引起cAMP生成
在正常饲喂的动物的比目鱼肌中，100nM CGRP(6.9±0.8对3.9±0.2pmol/mg，P＜0.01)和肾上腺素(9.6±0.7对3.9±0.2pmol/mg，P＜0.01)引起cAMP含量的显著增加。10倍摩尔过量的CGRP(8-37)(4.8±0.2对6.9±0.8pmol/mg，P＜0.01)或支链淀粉-(8-37)(2.9±0.1对6.9±0.8pmol/mg，P＜0.01)抑制这种增加。在用1pM CGRP培养1h后，没有观察到cAMP的显著增加。从饲喂高脂质的动物中分离比目鱼肌，100nM CGRP 1(9.3±1比5.7±0.2pmol/mg，P＜0.001)也引起cAMP含量的显著增加，这可以通过10倍摩尔过量的支链淀粉-(8-37)(4.3±0.8pmol/mg；P＜0.001)或CGRP-(8-37)(5.4±0.4；P＜0.001)来抑制。但是，与得自正常饲喂的动物的比目鱼肌相反，用1pM CGRP培养显著增加cAMP含量(8.6±0.4比5.7±0.2pmol/mg，P＜0.001)。10摩尔过量的支链淀粉-(8-37)或CGRP-(8-37)分别将cAMP含量从8.6±0.4pmol/mg降低到4.4±0.4pmol/mg(P＜0.001)和4.7±0.5pmol/mg(P＜0.001)，见附图19B。
在正常和饲喂高脂质食物的动物之间，静止比目鱼肌的基线cAMP含量差别显著(5.7±0.2对3.9±0.2pmol/mg，P＜0.01)。
实施例13
竞争性拮抗剂对支链淀粉介导抑制葡萄糖转运的作用
培养30min后，以2-DOG测定支链淀粉对比目鱼肌中的基线的和胰岛素介导的葡萄糖转运的作用，报道在表13中。单独用支链淀粉处理不会显著地引起葡萄糖的升高，而胰岛素刺激葡萄糖升高3.2倍(P＜0.01)。相反，支链淀粉(10nM)使胰岛素刺激的葡萄糖降低31％，达到与基线差别不显著的数值。
^8，37支链淀粉和^8，37CGRP在各种组织中都抑制CGRP和支链淀粉的作用(参见Cooper，2001，生理学手册，第7章：内分泌系统。第II卷内分泌胰腺和代谢调控(Jefferson，LS Cherrington，AD编辑)，牛津大学出版社)。在本文中，比目鱼肌条在体外用支链淀粉(10nM)和胰岛素(23.7nM)加上指定最终浓度的^8，37支链淀粉和^8，37CGRP进行预培养(附图14)。1μM和10μM的^8，37CGRP有效地拮抗支链淀粉对胰岛素刺激地葡萄糖升高地抑制作用(附图14A)，由19.5±3.6nmpl/g干重肌肉/min(n＝5)升高到30.4±3.0(n＝4，p＜0.05)。相反，即使为10μM，^8，37支链淀粉对由支链淀粉介导的对葡萄糖升高没有显著作用(附图14B)。
表13
在用激素培养的离体比目鱼肌肉条中，大鼠支链淀粉对基线(无胰岛素)或最大量(23.7nM)刺激的葡萄糖升高比例，通过2-脱氧-D-葡萄糖测定。
                            2-DOG升高
                            (nmol/g肌肉干重/min)        显著性水平
基线                        8.8±0.9(n＝3)              -
支链淀粉(10nM)              13.4±2.4(n＝5)             p＞0.05
胰岛素(23.7nM)           28.4±6.4(n＝3)        **P＜0.001
支链淀粉(10nM)+胰岛素    19.5±3.6(n＝5)        p＞0.05
(23.7nM)
用单因素ANOVA进行统计分析，接着用Dunnett多重比较检验进行post hoc分析。显著性水平是指激素处理的肌肉的比例与基线条件的比例之间的比较。n＝独立试验的数量。
实施例14
CGRP和支链淀粉对比目鱼肌中糖原代谢的作用的比较
预期试验表明在离体比目鱼肌肉中，胰岛素浓度为23.7nM时总糖原生成和D[¹⁴C(U)]葡萄糖转化为糖原最高(数据未显示)。因此，缺乏或存在该浓度胰岛素时，在培养2h后测定提高CGRP、支链淀粉和sCT浓度对糖原含量的作用(附图15)。糖原含量的浓度-反应曲线表明，10nM支链淀粉引起总糖原含量的大量消耗(附图15A)，从90.8±3.7μmol/g肌肉干重/h(n＝15)的基线比例到65.6±9.1(n＝4；p＜0.05)。10nM CGRP也见到糖原含量的类似降低，为71.4±7.7μmol/g肌肉干重/h，尽管这种差别还未能达到统计显著性(n＝4，p＝N.S.)。存在胰岛素时，这两种肽的抑制作用均更为显著(附图15B)。用10nM支链淀粉处理，总糖原含量从138±4.8μmol/g肌肉干重/h(n＝12)降低到86.7μmol/g肌肉干重/h(n＝4，p＜0.01)。相反，用10nM CGRP培养仅仅使糖原含量降低到113±6.9μmol/g肌肉干重/h(p＝N.S.)。因此，支链淀粉对肌肉糖原含量的最大作用显著大于CGRP的作用。SCT对糖原含量的作用与CGRP的作用不具有显著差异(附图15A和B)。
D[¹⁴C(U)]葡萄糖转化为糖原的比例为骨骼肌中体外糖原合成的测定值。因此，将D[¹⁴C(U)]葡萄糖和肽一起加到培养液中，培养2h后，在肌肉条中测定转化为糖原的比例。缺乏支链淀粉时，用10nM支链淀粉处理降低葡萄糖的转化比例，从4.8±0.3μmol/g肌肉干重/h(n＝16)到2.7±0.8(n＝5，p＜0.01；附图15C)。类似地，10nMCGRP使葡萄糖转化降低到2.8±0.3(n＝7，p＜0.01)。存在最大浓度胰岛素时，10nM支链淀粉降低放射标记的葡萄糖的转化(附图15D)，从27.6±1.4(n＝11)到16.0±2.5(n＝4，p＜0.05)，其中相同浓度CGRP抑制葡萄糖转化，为13.7±0.7μmol/g肌肉干重/h(n＝，p＜0.01)。缺乏胰岛素时，对sCT的反应比对CGRP或对支链淀粉的反应显著地更加有效(附图15C)，其中存在胰岛素时，sCT的反应与CGRP的反应相同(附图15D)。当肌肉糖原含量下降时，发生由所有三种肽引起在葡萄糖转化中测定的消耗，从而表示糖原合成比例降低。
从这些浓度-反应曲线中得出EC₅₀值和95％CI(置信区间)(表14)。存在胰岛素时，支链淀粉功效显著低于其他两种肽。观察到肽之间关于糖原合成的最大抑制的显著差别。这些结果表明在受体亚型之间存在一定程度不均匀性，该三种肽通过这些受体亚型生理骨骼肌中引起糖原合成的最大抑制。
表14
计算总糖原含量的EC₅₀值和95％置信区间(CI)和体外培养的离体大鼠比目鱼肌中¹⁴C-葡萄糖转化为糖原的比例
                 总糖原含量                      ¹⁴C-葡萄糖转化为糖原
                 (μmol/g肌肉干重/h)              (μmol/g肌肉干重/h)
               -胰岛素            +胰岛素         -胰岛素           +胰岛素
           EC₅₀       95％CI    EC₅   95％    EC₅₀   95％CI    EC₅₀   95％CI
                                 0      CI
支链淀     8.0         1.9-33.0  8.     3.5-1   9.4     0.2-476   9.2     4.0-21.0
粉                               1      8.3
CGRP-      3.2         0.4-27.2  4.     1.2-1   3.1     0.3-27.8  0.7     0.3-2.1
1                                3      4.6
sCT        1.7         0.01-48.  0.     0.3-1   0.1     0.1-52    0.9     0.3-2.8
                       2         6      .3
EC₅₀的    P＝N.S..    p＝N.S                           P＝N.S.           p＜0.01
差异
最大抑     p＜0.0001   p＜0.0001                        p＜0.0001         p＜0.0001
制的差
异
缺乏和存在最大有效浓度的人胰岛素(23.7nM)时，大鼠比目鱼肌条与支链淀粉、CGRP和sCT一起培养，如附图15所示。通过双向ANOVA确定显著性。
这些试验表明具有代谢支链淀粉受体特征的受体通过将降钙素受体(反向插入形式)[C1_ins-]和ramp 1共转染到L6成肌细胞或cos-7细胞中来构建。这些受体建立与CGRP、支链淀粉和sCT的强烈特异性结合，以及通过CGRP和支链淀粉的信号传导。相反，大鼠降钙素和人adrenomedullin，以及CGRP/支链淀粉肽家族的代表对该受体结合亲和性较低。如在下文的实施例中所示，这些肽在重组受体中作为配体的生物学作用与其在离体大鼠比目鱼肌中的作用比较，比目鱼肌是这些肽的已知的药学上的靶向组织。所测定的肽配体对C1_ins-/ramp 1受体的结合亲和性具有与其在完整骨骼肌中对糖原合成抑制的代表性EC₅₀值相同的相对数量顺序。激动剂顺序为sCT＞CGRP≈支链淀粉＞＞大鼠降钙素、人adrenomedullin。CGRP和支链淀粉对该受体的类似的亲和性与这些肽刺激cAMP得到的类似EC₅₀值一致。组织分布研究表明在大鼠骨骼肌中，C1_ins-是从calcr转录得到的主要分子。这些结果与CGRP和支链淀粉在骨骼肌中作为C1_ins-/ramp 1受体激动剂产生对糖原合成抑制相一致。其他的CGRP受体亚型在分子水平上被表征，通过用ramp构建物和或相关的G偶联受体、降钙素受体样受体、CRLR共转染构建。见，McLatchie等，1998，自然393：333-339；和Buhlmann等，1999，内分泌学140：2883-2890)。大鼠CGRP-1和支链淀粉作为胰岛素活性拮抗剂的作用还在从高脂质饲喂的大鼠离体比目鱼肌中进行。这些试验表明在高脂质饲喂的肌肉中，CGRP作为非竞争性胰岛素活性拮抗剂的功效没有变化，说明对高脂质饲喂的肌肉中脂质含量的作用区别于拮抗剂对胰岛素刺激的葡萄糖转化为糖原的不期望的效果。
实施例15
正常饲喂的大鼠中快速CGRP灌注(1h)后对组织脂质和代谢的影响
手术试验在雄性Wistar大鼠身上进行。如下所述随机地将大鼠分入试验组中。通过3-5％氟烷和2L氧气来诱导和维持手术麻醉。从尾动脉采取起始血液样本来测定基线水平的血液葡萄糖和乳酸、电解质、酸碱和氧水平、血液水平的游离脂肪酸、甘油三酯和胆固醇。在此之后，立即插入导管，以60-70呼吸/min给大鼠通入添加了O₂的空气。调节呼吸频率和尽端潮汐压(end-tidal pressure)(10-15cmH₂O)来维持尽端潮汐CO₂在35-40mmHg。在整个手术和试验过程中，通过加热平台使体温保持在37℃。颈动脉和颈静脉分别插入固相血压传感器和添装生理盐水的PE50尿管。对于拮抗剂灌注试验，手术与上述类似，区别之处在于颈动脉和颈静脉都插入添装生理盐水的PE50尿管。液体(生理盐水和溶解在生理盐水中的激素)用连接这两条管的Y形连接器输送到颈静脉中。颈动脉的管与血压传感器连接。在零时(基线数据)、30min和每20min直到试验结束的第90min，通过该管获取血液样本。
灌注在手术和至少15min的稳定期后，以1ml.h^-1的速度给动物灌注生理盐水(对照)或CGRP(100pmol.kg^-1.min^-1，Bachem)60min。该灌注附加以3.3ml/kg/h的速度静脉内注射154mmol/L NaCl溶液来替代已经造成的液体损失。在整个试验期间，以5min间隔从尾部毛细管血管中(tail capillary)获取血液葡萄糖测定值。灌注结束后，通过心脏穿刺来获得终端血液样本，并作为每个基线样本分析，以及分析各种代谢产物和激素。血清和血浆样本在-80℃下保存直到进一步分析。脱颈处死大鼠，收集组织(大脑、肝脏、肾脏、骨骼肌、伸肌digitorum longus肌、左心室、腹膜后的和附睾的脂质块)，快速地在N₂中冷冻并在-80℃下保存直到进一步分析。对于拮抗剂试验，方法与上述相同，具有如下改变：联合灌注拮抗剂、CGRP和生理盐水。动物在前30min以1ml/kg/h接受拮抗剂或生理盐水，然后再以1ml/kg/h启动适当地含有CGRP或生理盐水的第二条管。
在整个试验过程中，用PowerLab/16s数据采集模块持续地监控平均动脉压(MAP)、心率(HR，从MAP波形中获得)、氧饱和度(Nonin 8600V脉冲血氧计和core body温度。在屏幕上显示校准信号并以各个变量的2s平均值保存到光盘上。
结果
灌注CGRP产生对血浆、肝脏和比目鱼肌中的脂质含量的特异作用  与灌注生理盐水的对照动物相比，给被麻醉的动物灌注剂量为100pmol/kg/h的CGRP导致血浆CGRP增加(6.3±0.8对照比325±75p；p＜0.01)(表15)。而胰岛素、支链淀粉、肾上腺素和去甲肾上腺素的浓度没有显著变化。
表15
CGRP灌注后的血清激素浓度
通过心脏穿刺采集全血，用放射免疫分析或HPLC量化激素。数值为平均数±SEM(每个值为n＝10只动物)。通过t-检验分析统计显著性。**相对于对照显著差异，P＜0.01。
血清激素浓度(pM)                对照                    CGRP
胰岛素                          810±103                631±142
支链淀粉                        30±5                   25±5
CGRP                            6.3±0.8                325±75**
肾上腺素                        6776±509               8321±491
去甲肾上腺素                    2194±80                2734±134
与灌注生理盐水相比，灌注CGRP出现血浆游离脂肪酸浓度显著升高(-0.1mmol/L对照比0.4mmol/L，P＜0.01)(表16)。相反，CGRP拮抗剂、(CGRP-(8-37)以10nmol/kg/h的剂量灌注引起游离脂肪酸水平的显著下降(-0.1mmol/L对照比-0.3，P＜0.05)，表明该拮抗剂能够阻断内源性CGRP肽的活性。在灌注的时间过程中，CGRP引起血浆甘油三酯降低(0.2mmol/L对照比-0.7mmol/L，P0.01)，而该拮抗剂表现出相反的作用，在90min的灌注过程中甘油三酯的水平升高到显著水平(0.2mmol/L对照比0.9mmol/L，P＜0.01)。两种肽组合(CGRP-(8-37)90min+CGRP 60min)没有引起血浆游离脂肪酸或甘油三酯含量相对于对照水平的变化。
表16
CGRP灌注后的血液代谢水平
通过心脏穿刺采集全血，以3,000rpm在10℃下离心15min，取出血清并在-80℃下保存直到进一步分析。用基于酶的方法量化游离脂肪酸和甘油三酯的浓度。用动脉血气分析仪测定heparnised的全血中的乳酸。所示数据为代谢浓度变化，用灌注阶段结束后的代谢浓度除以灌注开始时的代谢浓度的比例来表示(各个点为n＝7只动物)。通过t-检验分析统计显著性。相对于对照显著差异，**P＜0.01；*P＜0.05。
                          [血清]变化(mmol/L)
              对照        CGRP        CGRP-(8-37)        CGRP-(8-37)+
                                                         CGRP
甘油三        0.2         -0.7**      0.9**              0.4
酯
FFA           -0.1        0.4**       -0.3*              -0.1
乳酸          0.3         1.7**       0.02               0.4
血清激素浓度(pM)        生理盐水灌        CGRP灌注
                        注
胰岛素                  810±103          631±142
支链淀粉                30±5             25±5
CGRP                    6.3±0.8          325±75**
肾上腺素                6776±509         8321±491
去甲肾上腺素            2194±80          2734±134
缺乏或存在拮抗剂CGRP-(8-37)时，在灌注CGRP后对组织的脂质进行分析，表明在骨骼肌和肝脏中有特异性作用(表17)。在心脏、附睾脂质(epidydmaladipose)或肾脏中的甘油三酯和游离脂肪酸含量没有发生显著变化。CGRP灌注导致骨骼肌和肝脏中的游离脂肪酸显著升高和甘油三酯含量下降。相反，仅灌注拮抗剂对这些脂质产生相反作用，表明其阻断了内源性的CGRP的作用。共同灌注CGRP和拮抗剂后，脂质含量不具有显著变化(表17)。
表17
在骨骼肌和肝脏中，CGRP产生对游离脂肪酸和甘油三酯的组织特异性作用
在适当地用CGRP(100pmol/kg/min 1h)、CGRP-(8-37)(10nmol/kg/min 90min)、它们结合或生理盐水灌注90min后，各种器官和组织中的FFA(A)和甘油三酯(B)的含量。切除器官并采用基于酶的方法确定总脂质含量。数值表示为平均数±SEM(每个点n＝只动物)。通过单因素ANOVA分析统计学显著性，然后用Dunnet多重比较检验进行post-hoc分析。相对于对照显著差异，*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。
A
(μmol/g)      对照      CGRP         CGRP-(8-37)      CGRP-(8-37)+CGRP
心脏           0.8+0.2   0.9+0.1      0.9+0.2          0.7+0.2
肝脏           0.1+      0.7+0.1**    0.06+0.04        0.1+0.01
               0.01
附睾脂质       2.1+0.5   2.7+0.7      2.2+0.6          2.0+0.3
比目鱼肌       0.2+      0.6+0.07**   0.1+0.02         0.2+0.04
               0.02
肾脏           0.8+0.1   0.9+0.2      0.8+0.1          0.7+0.2
B
心脏           2.9+0.4   2.6+0.4      3.1+0.4          3.7+0.5
肝脏           4.3+0.3   2.2+0.5**    5.8+0.4*         3.7+0.3
附睾脂质       5.1+1.2   5.0+0.9      4.9+1            5.2+1.3
比目鱼肌       3.7+0.4   1.5+0.2**    4.3+0.4*         3.6+0.5
肾脏           2.8+0.5   2.4+0.4      2.5+0.4          2.3+0.5
实施例16
100pmol/kg/h的CGRP灌注剂量对碳水化合物代谢和血管舒张产生作用
在如实施例15所述的60min的CGRP灌注中，平均动脉血压降低，在最后10min中显著下降(附图20)。类似地，CGRP灌注导致血液葡萄糖浓度显著升高(附图21)。与对照动物相比，CGRP与其拮抗剂CGRP-(8-37)结合也导致血液葡萄糖升高。在CGRP灌注中，乳酸水平相对于对照水平升高(0.3mmol/L对1.7mmol/L，P＜0.01)，并且该拮抗剂对其激动剂具有相反作用，稍微下将(0.3mmol/L对照比0.02，P＜0.05)。拮抗剂能够阻断由CGRP引起的葡萄糖浓度的增加，乳酸水平没有相应变化(0.3mmol/L生理盐水比0.4mmol/L，P＝NS)。
实施例15和16中的试验表明，实现以100pmol/kg/h灌注的CGRP剂量足以产生对乳酸和葡萄糖生成、脂质代谢和血管舒张的作用。在以100pmol/kg/h灌注的动物中出现300pM的CGRP-1血清浓度，表示在数小时的灌注阶段内的稳定浓度。(假定体外CGRP-1的清除半衰期为10min，该浓度在2-3个半衰期或20-30min后达到)。使血清浓度低于此的剂量对于激活低亲和性受体而不作用于代谢支链淀粉受体是有用的。
实施例17
脂质加氧酶抑制剂Masoprocol反转比目鱼肌中由CGRP1引起的对肌肉脂质的作用
Masoprocol(去甲二氢愈创木酸)是一种脂质加氧酶抑制剂，被确定是石炭酸灌木提取物的活性成分。口服这种化合物能够在果糖诱导的hypertriglyceridemia的大鼠中降低血清NEFA和甘油三酯浓度(Gowri等2000，美国生理学杂志279：E593-E600)，和降低脂质饲喂/链脲霉素大鼠模型中血液葡萄糖和甘油三酯浓度(Reed等，1999，糖尿病专家42：102-106)。由于已经表明Masoprocol通过抑制激素敏感性脂质酶在脂质细胞中起抗脂质分解作用(Gowri等2000，美国生理学杂志279：E593-E600)，研究了其在高脂质饲喂大鼠的比目鱼肌中对CGRP-1作用于NEFA和甘油三酯含量的影响。单独用50μM masoprocol培养比目鱼肌肉条，对NEFA(74±30nmol/g基线对55.77±21.08mmol/g)(A)或甘油三酯(3.9±0.8nmol/g基线比4.5±0.9mmol/g)(B)含量没有显著作用。但是，masoprocol完全反转由100nM CGRP 1(533±114nmol/g；P＜0.001)和1pMCGRP 1(482±99nmol/g；P＜0.05)nmol/g引起的NEFA升高。类似地，masoprocol完全反转由100nM CGRP 1(1.2mmol/g±0.3nmol/g；P＜0.05)和1pM CGRP 1(1.2mmol/g±0.1nmol/g；P＜0.05)引起比目鱼肌中甘油三酯含量的下降。
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