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用于诊断和治疗肿瘤的微生物和细胞
本发明涉及包含一种微生物或细胞的诊断和药物组合物，所述的微生物或细胞含有一种编码一种可检测的蛋白质或一种能够诱导可检测信号的蛋白质的DNA序列，所述的能够诱导可检测信号的蛋白质例如为一种发光蛋白(luminescent protein)或荧光蛋白，且在特定的实施方案中，所述的微生物或细胞还含有另外的DNA序列，其编码适合用于肿瘤的治疗和/或清除转移的肿瘤的蛋白质，例如一种细胞毒蛋白或细胞生长抑制蛋白。
50年前即有关于肿瘤部位中存在细菌的报道。一些出版物证实了这些早期的临床观察结果，即在自患者体内切除的瘤块中出乎意料地发现了大量的细菌。研究人员认为慢性感染会使得细胞倾向于发生恶性生长。已经发现多种衣原体(Chlamydia)的慢性感染与肺癌和子宫颈癌以及恶性淋巴瘤相关。特定的细菌感染与癌症发生存在关联的另一种常见的情况涉及胃溃疡患者的幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)感染。已经发现，十二指肠溃疡和胃腺癌患者体内的幽门螺旋杆菌相关性抗体水平升高。这些发现证实了在肿瘤部位同时有细菌的存在；不过，尚不清楚究竟是微生物是导致肿瘤产生的原因抑或是肿瘤组织更容易发生细菌定殖(bacterial colonization)。给小鼠静脉注入严格厌氧菌巴氏梭菌(Clostridiumpasteurianum)，其选择性地在瘤体内复制，这说明在肿瘤的坏死中心部位存在组织缺氧的微环境。给小鼠静脉注射减毒的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)突变株后，经组织学和细菌血分析发现，与其他器官相比，肿瘤组织内的细菌滴度是升高的。
与此类似，早在1965年即有文献报道在切除的人类乳腺肿瘤中发现病毒颗粒。近来，依据聚合酶链反应(PCR)得到的结果，认为人类乳头状瘤病毒(human papillomavirus)与肛门与生殖器肿瘤和食道癌、乳腺癌、以及更为常见地与子宫颈癌相关。此外，已经报道了在人类肝细胞肝癌中存在丙型肝炎病毒、在Kirnura病(Kirnura′s disease)的鳞状细胞癌中存在Epstein-Barr病毒、在人类乳腺癌中存在小鼠乳腺肿瘤病毒样颗粒(mouse mammary tumor virus-like paiticles(MMTV))、在恒河猴星细胞瘤中(macaque astrocytoma)存在SV40病毒、以及在海龟纤维乳头状瘤(fibropapilloma)中存在疱疹病毒(herpesvirus)。令人惊异的是，在不同患者之间，肿瘤中的病毒颗粒的浓度是不同的。0～72％(10-15)的食道鳞状细胞癌中存在人类乳头状瘤病毒。与肿瘤组织不同，在同一个患者的无瘤区域的食道上皮中未发现病毒颗粒，这提示病毒颗粒仅定位于肿瘤组织中。
不过，迄今为止尚不能明确究竟是以上讨论的微生物是导致疾病如肿瘤发生的原因(乳头状瘤病毒除外)还是例如肿瘤能够吸引和/或保护病毒或细菌。因此，以往没有依据提示可将此类微生物用于肿瘤的诊断或治疗。传统的肿瘤诊断方法(例如磁共振成像术(MRI))缺乏敏感性和特异性，而治疗方法(例如外科手术)具有创伤性且不是很敏感。
因此，本发明的目的在于提供一种有效可靠的肿瘤诊断以及肿瘤治疗的手段，其克服了当前使用的诊断和治疗方法的不足之处。
根据本发明，这一目的可通过由本权利要求书所定义的主题而实现。如果将携带发光融合基因构建体rVV-ruc-gfp的痘苗病毒(Vacciniavirus)(LIVP株)静脉注射于裸鼠，通过测定光发射的消失情况发现病毒颗粒在4天之内可自所有的内脏器官中被清除。与此相反，如果接受该病毒注射的是带有由皮下植入的C6大鼠神经胶质瘤细胞生长而来的肿瘤的裸鼠，以同样的方式对所注射的痘苗病毒进行追踪，发现随着时间的推移，肿瘤组织中持续存在病毒颗粒，导致持久的光发射。通过用立体显微镜观察GFP荧光以及用弱光视频成像照相机(low-lightvideo-imaging camera)收集萤光素酶催化的光发射的方法，在活体动物内监测到了同一种肿瘤中有该病毒编码的融合蛋白的存在和扩增。在携带大小为25～2500mm³的皮下C6神经胶质瘤植入体的裸鼠中，在注射病毒4天后检测到了肿瘤特异性的光发射。该信号于注射后第4天开始增强，并持续30至45天，说明存在持续地病毒复制。在携带自植入的PC-3人类前列腺细胞进展而来的皮下肿瘤的裸鼠中以及在具有同位(orthotopically)移植的MCF-7人类乳腺肿瘤的小鼠中，同样发现了rVV-ruc-gfp病毒颗粒在肿瘤中的聚集。此外，痘苗病毒还定向于具有免疫活性的大鼠的颅内C6大鼠神经胶质瘤细胞植入体，并定向于C57小鼠体内的MB-49小鼠膀胱肿瘤细胞植入体。C6神经胶质瘤的横切片显示快速分裂细胞所处的肿瘤的外围区域具有成簇、成片的光发射。与此不同，乳腺肿瘤的横切片显示分布于肿瘤中的荧光“岛”。除了原发的乳腺肿瘤，在对侧乳腺部位以及在暴露的肺表面的结节中也自外观上检测到了小的转移肿瘤，提示肿瘤转移至对侧乳腺和肺。总之，发光细胞或微生物(例如痘苗病毒)可用于对原发和转移的肿瘤进行诊断和治疗。
将发光细菌(沙门氏菌(Salmonella)、弧菌(Vibrio)、利斯特氏菌(Listera)、大肠杆菌)静脉注射于小鼠，可通过弱光成像仪在动物的整体上对这些发光细菌进行即时观察，由此也得到了与以上相似的结果。注射细菌36小时后，在无胸腺(nu/nu)小鼠和具有免疫活性的C57小鼠中均未观察到光发射，这是由于细菌已经被免疫系统清除。在一只接受注射的动物的皮肤创伤部位观察到细菌光发射的增强并直至注射后6天仍能检测到。在携带由植入的C6神经胶质瘤细胞进展而来的肿瘤的裸鼠，注射细菌后36小时，光发射自动物中完全消失，这与无肿瘤的动物相似。但出乎意料的是，在注射后48小时观察到了仅自肿瘤部位产生的、强烈而迅速增强的光发射。这说明在肿瘤组织中存在持续性的细菌复制。光发射的程度取决于所用的细菌菌株。在携带前列腺、膀胱和乳腺肿瘤的裸鼠中也证实了这一“归巢(homing-in)”过程以及持续的光发射。除了原发的肿瘤以外，转移的肿瘤也可以被观察到，如在乳腺肿瘤模型中所示。在携带膀胱肿瘤的具有免疫活性的C57小鼠以及携带脑神经胶质瘤植入体的Lewis大鼠中也观察到肿瘤特异性的光发射。一旦进入肿瘤部位，发光细菌便不再释放至循环中以及再次定殖(re-colonize)于随后植入同一动物体内的肿瘤中。此外，将表达Ruc-gfp融合蛋白的哺乳动物细胞注射到血流中，也观察到其回归到神经胶质瘤瘤体中并在其中增殖。
这些发现具有以下两方面的应用前景：(a)设计多功能病毒载体，其可基于如光发射等信号而用来对肿瘤进行检测和/或以光消失作为信号用于抑制肿瘤的进展和/或血管形成(angiogenesis)，以及(b)开发基于细菌和哺乳动物细胞的肿瘤定向系统，与治疗性基因构建体相结合，用于癌症的治疗。这些系统具有以下优点：(a)其特异性地定向于肿瘤而不影响正常组织；(b)治疗基因构建体的表达和分泌优选地受控于诱导型启动子，使得分泌能够被打开或关闭；以及(c)在激活基因表达和蛋白输送之前能够对输送系统在肿瘤中的定位进行直接观察验证。
因此，本发明涉及一种诊断和/或药物组合物，其包含一种微生物或细胞，所述的微生物或细胞含有编码一种可检测的蛋白质或一种能够诱导可检测信号的蛋白质的DNA序列。
在一个优选的实施方案中，所述的诊断和/或药物组合物的微生物或细胞进一步含有编码适合用于肿瘤的治疗和/或清除转移的肿瘤的蛋白质，例如一种细胞毒蛋白、细胞生长抑制蛋白、抑制血管形成的蛋白或促凋亡蛋白。此类蛋白是本领域人员熟知的，更多的合适的蛋白质的例子将在下文给出。
任何微生物或细胞均可用于本发明的组合物，条件是其能够在有机体中复制，对有机体不具有致病性(如是减毒的)，并且可被有机体的免疫系统识别等等。可用于本发明的微生物例如是细菌和病毒。术语“细菌”在此指的是其本身不是定向于肿瘤的细菌(即其不能区分癌细胞或组织与对应的非癌细胞或组织)，这是因为导致本发明的实验结果显示出细菌等在肿瘤部位聚集的原因在于，在该环境中，其未暴露于宿主的免疫系统的攻击之下。下文的表1给出了可能适合用于本发明的、且可能不是定向于肿瘤的细菌的列表。本领域人员能够通过常规的方法轻易鉴别此类不是定向于肿瘤的细菌，例如采用WO 96/40238中6.1节所述的方法。优选地，所述的细菌是细胞间细菌，例如大肠杆菌、粪肠球菌(E.faecalis)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、Vibrio fischeri、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)、乳酸菌属(Lactobacillus spp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)。在本发明的方法中，优选病毒和细胞、特别是哺乳动物的细胞，其不定向于肿瘤。特别优选细胞质病毒。
在一个特别优选的实施方案中，该诊断和/或药物组合物包含一种编码一种发光蛋白和/或荧光蛋白的DNA序列的微生物或细胞。
在此，术语“编码一种发光蛋白和/或荧光蛋白的DNA序列”也包含编码一种作为融合蛋白的发光蛋白和荧光蛋白的DNA序列。
在所述的诊断和/或药物组合物的另一个优选的实施方案中，由所述的DNA序列编码的蛋白质是一种能够结合一种配体的细胞受体，所述的配体可以是一种诊断性或治疗性配体。配体可以是蛋白质(包括大的或小的多肽、抗体等等)、合成的化合物(如合成的类固醇类似物)等等。因此，可以通过例如SPECT或PET对标记的配体在活体动物体内或病人体内的定位进行观察。几乎任何已知的用于标记肿瘤的蛋白质配体-受体对均可用于本发明的方法。优选地，为增加特异性，可以对突变的蛋白配体(如果是化合物则为类似物)或突变的配体受体进行遗传工程化或化学工程化改变，以使其不与任何内源性分子结合。除了增加特异性，还要将这些突变体/类似物的不良反应限制于宿主的正常的生理学水平。
在本发明的诊断和/或药物组合物的一个更加优选的实施方案中，该配体是一种放射性核素标记的配体。所述的配体，可用于例如通过单光子发射计算机断层成像术(single-photon emission computed tomography，SPECT)或正电子发射断层成像术(positron-emission tomography，PET)对肿瘤进行观察，这是由于在静脉注入例如工程化的携带特异性表达于肿瘤细胞表面的受体蛋白的基因构建体的细菌、病毒或哺乳动物细胞后，放射性核素标记的配体与该特异性表达于肿瘤细胞表面的受体相结合的结果。放射性核素可用于常规的肿瘤闪烁扫描法、PET，且有可能用于肿瘤的体内放射治疗。可用于本发明的放射性核素例子为(a)β⁺-发射体，例如¹¹C、¹³N、¹⁵O或⁶⁴Cu或(b)γ-发射体，例如¹²³I。其他例如可用作PET的示踪剂的放射性核素包括⁵⁵Co、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁶⁰Cu(II)、⁶⁷Cu(II)、⁵⁷Ni、⁵⁵Co、⁵²Fe、¹⁸F等等。
SPECT和PET是可用于本发明的肿瘤显像的敏感技术。SPECT和PET均能检测到来自放射性核素的β⁺和γ发射。PET较SPECT更为敏感。如果使用的是小的实验动物，可采用微型PET设备进行肿瘤成像，该设备例如可自Concorde Microsystems(Knoxville，TN)购得。
适用的放射性核素标记的制剂的例子是⁶⁴Cu-标记的工程化的抗体片段(Wu等，PNAS USA 97(2002)，8495-8500)、⁶⁴Cu-标记的生长抑素(Lewis等，J.Med.Chem.42(1999)，1341-1347)、⁶⁴Cu-丙酮醛-双(N4-甲硫基缩氨基脲)(⁶⁴Cu-PTSM)(Adonai等，PNAS USA 99(2002)，3030-3035)、⁵²Fe-柠檬酸(Leenders等，J.Neural Transm.Suppl.43(1994)，123-132)、⁵²Fe/^52mMn-柠檬酸(Calonder等，J.Neurochem.73(1999)，2047-2055)和⁵²Fe-标记的氢氧化铁(III)-蔗糖复合物(Beshara等，Br.J.Haematol.104(1999)，288-295，296-302)。
为将放射性核素标记的配体用于肿瘤的检测，通过静脉注射本发明的细菌、病毒或哺乳动物细胞而输送编码该受体与之相结合的受体蛋白的基因。由于某些静脉注射的细菌、病毒和哺乳动物细胞可特异性地在肿瘤中复制(如以下实施例中所示)，因此该受体蛋白在肿瘤中的表达将标示出该放射性核素标记的配体所定向的肿瘤。
例如，对于痘苗病毒，为了能够对肿瘤进行有效检测，该病毒可被用来携带编码与配体特异性结合的受体蛋白基因构建体。可通过静脉注射重组的痘苗病毒输送受体基因并使得肿瘤组织表面表达该受体蛋白。然后，将放射性核素标记的配体静脉注射给宿主。放射性核素标记的配体与其表达于肿瘤细胞表面的受体之间发生特异性结合，由此，可以基于仅来自于肿瘤的β⁺或γ发射而对肿瘤进行检测。以放射性核素标记肿瘤可简单地对肿瘤组织与正常组织进行区分。因此，可设计附加于外科手术刀架上的手持式β⁺或γ探测器。基于β⁺或γ发射信号，可将标记的肿瘤彻底切除，而正常组织的切除被减少到最低。
为实现本发明的目的，特别优选镓-67。镓-67(⁶⁷Ga)可用于PET、SPECT或闪烁扫描法的诊断成像术中。已知其能够聚集在炎症病变和肿瘤、特别是淋巴瘤等部位，但也可聚集在其他多种类型的肿瘤中，例如胰腺肿瘤、肺部肿瘤等等。目前认为，⁶⁷Ga摄取的机制存在转铁蛋白依赖途径和转铁蛋白非依赖途径。对于转铁蛋白依赖途径，已经发现，转铁蛋白受体的过表达显著增强了肿瘤细胞对⁶⁷Ga的摄取。此外，抗转铁蛋白受体抗体可显著阻断肿瘤细胞对⁶⁷Ga的摄取。在小肿瘤成像方面，需要很高的⁶⁷Ga浓度以克服背景信号。因此，在这种情况下，优选地使用携带一种转铁蛋白受体基因构建体的重组痘苗病毒，以便在静脉注射病毒后，活体动物或病人体内的肿瘤细胞表面能够特异性过表达转铁蛋白受体。⁶⁷Ga也通过静脉注射输送。借助于过表达的转铁蛋白受体，⁶⁷Ga在肿瘤细胞中高水平的聚集有助于显著提高对活体动物和病人的肿瘤的检测能力。
在另一个优选的实施方案中，本发明的诊断和/或药物组合物包含一种微生物或细胞，所述的微生物或细胞含有一种编码一种能够诱导MRI可检测信号的蛋白质(例如金属结合蛋白质)的DNA序列。此外，该蛋白质能够与进行组织显像所需的对比剂(contrast agent)、发色团、配体或化合物相结合。优选地，所述的蛋白质是一种能够结合顺磁性或超顺磁性(superparamagnetic)金属标记的配体的细胞受体。在例如通过静脉注射携带特异性表达于肿瘤细胞表面的受体蛋白基因构建体的本发明的遗传工程化的细菌、病毒或哺乳动物的细胞后，该顺磁性或超顺磁性金属标记的配体与其特异性表达于肿瘤细胞表面的上述受体相结合，通过MRI对肿瘤进行成像观察，这具有若干优点。这些金属在肿瘤中高水平的聚集有助于对肿瘤的检测。实际上任何顺磁性或超顺磁性金属均可用于此目的。优选地，鉴于“裸露的”重金属具有系统性毒性，因此仔细选择顺磁性或超顺磁性金属以将不良反应降至最低。在大多数现有的对比剂中，金属颗粒或是与螯合剂相连，或是被聚合物包被，这较使用裸露的颗粒而言更为安全。因此，优选地使用以螯合的金属或是聚合物包被的金属进行标记的配体。
本领域人员熟知产生与蛋白连接的对比剂的方法，例如，首先以化学方法将蛋白质配体(或其他化学化合物配体)附着于螯合剂(例如为二乙撑三胺五乙酸(diethylene triamine pentaacetic acid，DTPA))，然后将该螯合剂-蛋白质复合体标记上金属。已经用相似的标记方法，以DTPA-双(硬脂酰胺)产生了镓-标记的生长抑素(somatostatin)类似物和铟-111-标记的低密度脂蛋白。用螯合剂对蛋白进行修饰用于对比剂已经被详细描述。例如，使用双功能螯合剂2-(4-异硫氰基苄基-6-甲基)二乙撑三胺五乙酸(MX-DTPA))(Mirzadeh等，Bioconjug.Chem.1(1990)，59-65)对蛋白进行修饰以及用环化二乙撑三胺五乙酸酐(cyclic anhydride ofdiethylenetriamine-pentaacetic acid，cDTPAA)(Duncan和Welch，J.Nucl.Med.34(1993)，1728-1738)对蛋白进行修饰。
或者，可通过以下方法进行MRI：
(a)改良的酶/蛋白输送引起的钆激活
该方法基于基因定向的酶前体药物治疗(Gene-Directed EnzymeProdrug Therapy(GDEPT))，其中酶/蛋白将一种全身输送的非毒性前体药物激活为一种活性毒性药物。通过肿瘤中的酶/蛋白将处于弱相对状态(weak relaxivity state)的MRI对比剂特异性激活为强相对状态(strongrelaxivity state)，可对肿瘤进行检测。通过静脉注射经遗传工程化而携带编码β-半乳糖苷酶(或其他相关的酶)的细菌、病毒和哺乳动物细胞可将酶/蛋白输送至肿瘤部位。该β-半乳糖苷酶可以是细胞外分泌形式的或表达于细菌或哺乳动物细胞的表面。能够被β-半乳糖苷酶裂解并用于肿瘤检测的MRI成像的MRI制剂的例子为(4，7，10-三(乙酸-1-(2-β-吡喃半乳糖乙氧基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷)钆((4，7，10-tri(aceticacid)-1-(2-β-galactopyranosylethoxy)-1，4，7，10-tetraazacyclododecane)gadolinium，Egad)(Moats等，1997)。该化合物中，一个吡喃半乳糖残基位于Gd³⁺离子的第9配位位置。由于此封阻作用，水质子无法与Gd³⁺离子相互作用，因此降低了其对T1驰豫时间的影响。存在β-半乳糖苷酶时，该酶将吡喃半乳糖自螯合物裂解，释放了该配位位点，因此使得该对比剂自弱相对状态不可逆地转变为强相对状态。由于基于细菌、病毒或哺乳动物细胞的酶表达仅出现于肿瘤部位，因此酶介导的相对状态转变也将仅出现于肿瘤部位。因此，可用酶介导的MRI对比剂的激活来检测肿瘤。
除了上述MRI对比剂，也可开发相似的新型对比剂，其中可将其他类型的残基附着于螯合物。这些残基可被相应的酶去除(类似于用半乳糖苷酶去除吡喃半乳糖)(例如α-甘露糖苷酶、α-和β-葡糖苷酶、β-葡糖苷酸酶)以释放Gd³⁺离子的第9位配位位点并改变肿瘤检测的T1驰豫时间。编码这些酶的基因均可用本发明的遗传工程化的细菌、病毒或哺乳动物细胞而输送。此外，可开发使用除钆以外的其他金属的新型的对比剂以用于酶激活的MRI肿瘤成像。
如下文所示，该方法可与治疗方法相结合。
(b)用于通过同一种组成型表达的酶(例如β-半乳糖苷酶)首先激活对比剂(例如修饰的钆)并随后激活注射的前体药物的输送载体系统的遗传工程化—基于一种基因产物的检测和治疗系统(OGPBDTS)
例如，如上所述，可通过一种酶(例如β-半乳糖苷酶)激活基于钆的对比剂，其可用于肿瘤的检测。随后，静脉输送的前体药物如CBI、TMI、PCI(见美国专利5,646,298)可被肿瘤内的同一种β-半乳糖苷酶裂解，产生用于治疗癌症的具有抗肿瘤活性的细胞毒药物。
(c)具有基于两种基因产物的检测和治疗系统(TGPBDTS)的输送载体系统的遗传工程化
将基因1连接于一种组成型启动子并产生用于检测(sensing)对比剂(例如金属结合蛋白、修饰的钆或其他制剂)的酶/蛋白，而基因2连接于一种外源性可激活的启动子，该启动子在无活化剂药物时是沉默的，而仅在MRI发现检测载体系统呈阳性时才启动。通过注射或口服活化剂药物可激活该基于载体的启动子基因构建体。通过重复注射对比剂可在治疗过程中对肿瘤的大小和转移灶的位置进行实时监测。
优选地，用于转染细胞的编码如上所述的(诊断性或治疗性)蛋白(例如一种发光蛋白和/或荧光蛋白)的DNA序列存在于一种载体或表达载体中。本领域人员熟悉其例子。DNA序列也可以由含有适当的表达盒的重组病毒携带。可用于本发明的诊断或药物组合物的合适的病毒包括杆状病毒、牛痘、新培斯病毒、仙台病毒、腺病毒、AAV病毒或细小病毒，例如MVM或H-1。载体还可以是逆转录病毒，例如MoMULV、MoMuLV、HaMuSV、MuMTV、RSV或GaLV。如果在哺乳动物中表达，合适的启动子例如是人巨细胞病毒“立即早期启动子(immediate early promotor)(pCMV)”。此外，组织和/或器官特异性启动子也是有用的。优选地，将编码例如一种发光蛋白和/或荧光蛋白的DNA序列可操纵地连接于一种启动子以实现高表达。此类启动子，例如诱导型启动子是本领域人员所熟知的。优选地，通过稳定整合将上述构建体插入细菌基因组。如果此类构建体是以哺乳动物载体在哺乳动物细胞中构建的，可产生携带单拷贝插入体的转化的细胞系以达到在肿瘤细胞中长期表达的目的。
可采用本领域已知的常规方法以产生上述的DNA序列并构建含有所述DNA所表达载体或病毒。这些方法包括例如体外重组技术、合成方法、以及体内重组方法，例如见Sambrook等(Molecular Cloning，ALaboratory Manual，2^nd edition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)所述。用上述载体进行细胞转染、转染子的表型选择以及DNA序列表达的方法是本领域已知的。
本领域人员了解编码例如发光蛋白或荧光蛋白等可用于本发明诊断和/或药物组合物的蛋白质的DNA序列。在过去的10年中，已经鉴定并分离了多种编码光发射蛋白的结构基因，这些光发射蛋白包括来自哈氏弧菌(Belas等，Science 218(1982)，791-793)和Vibrio fischerii(Foran和Brown，Nucleic acids Res.16(1988)，177)的细菌萤光素酶、萤火虫萤光素酶(de Wet等，Mol.Cell.Biol.7(1987)，725-737)、来自Aequoreavictoria的发光蛋白质(Prasher等，Biochem.26(1987)，1326-1332)、来自Renilla renformis的Renilla萤光素酶(Lorenz等，PNAS USA 88(1991)，4438-4442)以及来自Aequorea victoria的绿色荧光蛋白(Prasher等，Gene111(1987)，229-233)，这使得能够基于光发射对细菌、病毒或哺乳动物细胞进行追踪。经这些基因转化并表达这些基因的细菌可用来通过弱光imaging camera检测菌落或在荧光显微镜下检测单个的细菌(Engebrecht等，Science 227(1985)，1345-1347；Legocki等，PNAS 83(1986)，9080-9084；Chalfie等，Science 263(1994)，802-805)。
萤光素酶基因表达于多种生物体。使用融合于固氮酶启动子的luxAB，通过弱光成像，在根瘤菌属(Rhizobia)中证实了基于光发射的启动子的激活存在于感染的根瘤的细胞的细胞质中(Legocki等，PNAS 83(1986)，9080-9084；O′Kane等，J.Plant Mol.Biol.10(1988)，387-399)。lux A和lux B基因的融合产生了具有完整功能的萤光素酶蛋白(Escher等，PNAS 86(1989)，6528-6532)。将该融合基因(Fab2)引入脆弱芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium)中置于木糖启动子控制下，然后放入昆虫的幼虫中并注射入虫体的血淋巴。使用弱光摄像机进行光发射成像。使用弱光成像仪，通过对假单胞菌属或欧文氏菌属感染进行定位，证实了致病细菌在携带病原体激活的PAL启动子-细菌萤光素酶融合基因构建体的转基因拟南芥属(arabidopsis)植株中的运动和定位，在番茄植株以及马铃薯块茎(stacks of potatoes)也是如此(Giacomin和Szalay，PlantSci.116(1996)，59-72)。
所有表达于细菌的萤光素酶均需要外源性添加的底物(如癸醛(decanal)或腔肠荧光素(coelenterazine))以产生光发射。与此不同的是，尽管产生GFP荧光不需要底物，但却需要激发光源。近来，已经从发光致病杆菌(Xenorhabdus luminescens)(Meighen和Szittner，J.Bacteriol.174(1992)，5371-5381)和鳆发光杆菌(Photobacterium leiognathi)(Lee等，Eur.J.Biochem.201(1991)，161-167)中分离出了包括luxCDABE的、编码细菌萤光素酶以及能够在细胞内提供癸醛的蛋白的基因簇(gene cluster)，并将其转移至细菌内，由此产生不依赖于外源性添加的底物的持续的光发射(Fernandez-Pinas和Wolk，Gene 150(1994)，169-174)。将含有完整的lux操纵子序列的细菌通过腹腔内、肌肉或静脉注射的方式施用于小鼠，可使得在活体小鼠内对细菌进行显像并定位，说明这种萤光素酶光发射能够穿透组织并可在外部进行检测(Contag等，Mol.Microbiol.18(1995)，593-603)。
优选地，本发明的微生物是一种非定向于肿瘤的细菌，例如一种减毒的细菌。表1列出了可能会用于本发明(即BMPT(细菌介导的蛋白治疗)和肿瘤成像)且可能不是定向于肿瘤的候选细菌菌株。通过现有的常规方法，例如WO 96/40238的6.1节所述的方法，本领域人员可轻易鉴定出此类非定向于肿瘤的细菌。
为了安全地直接应用于人类，优选地采用那些自然情况下即被绝大多数个体摄入、且当直接注射于实体瘤内时具有内在的抗肿瘤活性的细菌细胞系，例如为乳和干酪相关的微生物。此类细菌也包括天然条件下分离自人类肿瘤中的细菌，后者与多种类型的肿瘤或一种特定类型的肿瘤建立了一种共存关系(共生现象)。这些治疗性蛋白质被细菌分泌到细胞外的过程是由信号肽或内源性蛋白分泌途径介导的。为进一步提供BMPT的安全性，可以使用细菌的诱导型启动子例如IPTG-诱导的lac启动子来对细菌的肿瘤性蛋白的生产进行调节。已经有大量文献报道了在细菌中以IPTG调节哺乳动物蛋白的表达的方法。也发现IPTG在动物中也具有启动子激活的作用。除了lac启动子，其他的能够在细菌中调节基因表达的启动子的例子包括ara启动子(由阿拉伯糖激活)以及PLtetO-1启动子(由无水四环素(aTc)激活)(Lutz和Bujard，Nucleic Acids Res.25(1997)，1203-1210)。
表1.可用于本发明的候选细菌菌株的例子：

    菌株               简述           参考文献需氧菌，革兰氏阳性保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)酸奶细菌；非致病性(人体所需的正常的有益微生物群的成份)；分离自保加利亚乳杆菌的blastolysin组分具有抗肿瘤作用(Bogdanov等，1975；Bogdanov等，1977；Ketlinskii等，1987)；可降低人类发生结肠癌的危险性(Wollowski等，2001)；ATCC#11842.Simonds等，1971，J Bacteriol107：382-384；Bogdanov等，1975，FEBSLett 57：259-261；Bogdanov等，1977，BiullEksp Biol Med 84：709-712；Ketlinskii等，1987，VoprOnkol 33：51-56；Wollowski等，2001，Am JClin Nutr 73：451S-455S干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)非致病性(人体所需的正常的有益微生物群的成份)；静脉注射的干酪乳杆菌LC9018菌株对小鼠皮下接种的肉瘤-180具有显著的生长抑制作用(Kato等，1981)；腹腔注射的干酪乳杆菌具有抗肿瘤活性(LC9018strain)(Kato等，1988)；ATCC#393.Kato等，1981，Gann 72：517-523；Kato等，1988，CancerImmunol Immunother 26：215-221嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)非致病性(人体所需的正常的有益微生物群的成份)；对肝脏肿瘤发生的抑制作用(Mizutani和Mitsuoka1980)；降低1，2-二甲肼(DMH)诱导雄性Sprague-Dawley大鼠发生肠道肿瘤的危险性(McIntosh等，1999)；显示由嗜酸乳杆菌发酵的牛乳对一种人类乳腺癌细胞系的生长具有明显的抗增殖作用(Biffi等，1997)；Mizutani and Mitsuoka 1980，Cancer Lett 11：89-95；Biffi等，1997，Nutr Cancer28：93-99；McIntosh等，1999，NutrCancer 35：153-159短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)非致病性(人体所需的正常的有益微生物群的成份)；类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)非致病性(人体所需的正常的有益微生物群的成份)；显示由类干酪乳杆菌发酵的牛乳对一种人类乳腺癌细胞系的生长具有明显的抗增殖作用(Biffi等，1997)；Biffi等，1997，Nutr Cancer28：93-99植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)非致病性(人体所需的正常的有益微生物群的成份)；Murosaki等，(2000)报道″在IL-12的产生明显受损时的肿瘤发生的晚期，需要每天施用植物乳杆菌L-137才会产生抗肿瘤作用″；Murosaki等，2000，CancerImmunol Immunother 49：157-164鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)非致病性(人体所需的正常的有益微生物群的成份)；唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)非致病性(人体所需的正常的有益微生物群的成份)；通过前生命期的乳杆菌(以牛乳喂养)而改变IL-10基因敲除的小鼠的肠道菌群可降低结肠癌以及粘膜炎症的发生率(O′Mahony等，2001)；O′Mahony等，2001，AlimentPharmacol Ther 15：1219-1225生孢乳杆菌(Lactobacillussporogenes)非致病性(人体所需的正常的有益微生物群的成份)；乳乳杆菌(Lactobacilluslactis)非致病性(人体所需的正常的有益微生物群的成份)；发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)ATCC#9338唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcusthermophilus)Yogurt bacteria；非致病性(人体所需的正常的有益微生物群的成份)；报道了以唾液链球菌嗜热亚种处理最初的肿瘤后大鼠出现了肿瘤特异性移植抗性(Kaklij和Kelkar 1996)；T-淋巴细胞参与了唾液链球菌嗜热亚种的抗肿瘤活性(Kaklij等，1991)；腹腔内施用唾液链球菌嗜热亚种完全治愈了很大一部分的具有腹水形式的肉瘤-180或Ehrlich癌性腹水的带瘤小鼠(Kelkar等，1988)；ATCC#BAA-250D.Kelkar等，1988，Cancer Lett42：73-77；Kaklij等，1991，Cancer Lett56：37-43；Kaklij和Kelkar 1996，BAA-250D.MicrobiolImmunol 40：55-58枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)非致病性；已经发现枯草芽孢杆菌菌血症与癌症患者的相关性(Banerjee等，1988)；Banerjee等，1988，Arch InternMed 148：1769-1774巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)非致病性；来自巨大芽孢杆菌的肽聚糖抑制肿瘤生长(Nauciel和Goguel 1977)；Nauciel和Goguel 1977，JNatl Cancer Inst 59：1723-1726多粘芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa)非致病性；耻垢分枝杆菌(Mycobacterium非致病性；生长迅速；Saito和Watanabe(1981)报道了″来自耻垢分Lamensans等，1975，ProcNatl Acad Sci USA 72：smegmatis)枝杆菌的细菌素使转化的细胞(而非未转化的细胞)产生了形态学改变并抑制其RNA、DNA和蛋白质的合成″；3656-3660；Saito和  Watanabe 1981，Microbiol Immunol 25：13-22母牛分枝杆菌(Mycobacteriumvaccae)非致病性；田鼠分枝杆菌(Mycobacteriummicroti)非致病性；ATCC#35782哈瓦那分枝杆菌(Mycobacteriumhabana)非致病性；生长缓慢，光色原(photochromogen)，最初分离自猴子；单核细胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)细胞内病原体粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)已经自肿瘤和感染性心内膜炎症被分离；Milbrandt ATCC#29212，51299 1998，Clin Cardiol 21：123-126需氧菌，革兰氏阴性大肠杆菌(Escherichia coli)静脉注射的大肠杆菌显示肿瘤特异性定殖。Shabahang等，未发表数据鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)Bermudes等已经用静脉注射的沙门氏菌作为蛋白质输送载体(Pawelek等，1997；Bermudes等，2000；Clairmont等，2000；Zheng等，2000；)Bermudes等发现在肿瘤组织中沙门氏菌(TK)-依赖型[(14)C]FIAU的Pawelek等，1997，Cancer Res57：4537-4544；Bermudes等，2000，Adv ExpMed Biol 465：57-63；Clairmont等，2000，J InfectDis 181：1996-2002；聚集较肌肉组织高至少30倍(Tjuvajev等，2001)；给患有转移性黑色素瘤的病人静脉施用减毒的鼠伤寒沙门氏菌的I期研究未发现抗肿瘤作用(Toso等，2002)Zheng等，2000，Oncol Res12：127-135；Tjuvajev等，2001，J ControlRelease 74：313-315；Toso等，2002，J Clin Oncol20：142-152霍乱弧菌(Vibrio cholera)静脉注射的霍乱弧菌具有肿瘤特异性定殖；已经有了霍乱弧菌的非致病性菌株；Shabahang等，未发表数据哈氏弧菌(Vibrio harveyi)非致病性；发光细菌；ATCC#700106荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)非致病性；通过多鞭毛运动；已有癌症病人荧光假单胞菌菌血症的报道(Hsueh等，1998)；荧光假单胞菌能结合神经细胞并作为病原体(Picot等，2001)；通常生长于26-30℃，但ATCC#17583可在37℃生长。Hsueh等，1998，J ClinMicrobiol 36：2914-2917；Picot等，2001，MicrobesInfect 3：985-995恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)已有癌症病人恶臭假单胞菌菌血症的报道(Martino等，1996)；恶臭假单胞菌的L-甲硫氨酸酶耗竭甲硫氨酸并抑制肿瘤生长(Kokkinakis等，1997)；通常生长于26℃，但ATCC#43142，47054可生长于37℃。Pekhov等，1983，Biull EkspBiol Med 95：87-88；Anaissie等，1987，Am J Med82：1191-1194；Martino等，1996，Eur J ClinMicrobiol Infect Dis 15：610-615；Kokkinakis等，1997，NutrCancer 29：195-204；Miki等，2000，Cancer Res60：2696-2702需氧菌，革兰氏阳性双歧双歧杆菌非致病性(人体所需的正常的有益Kimura等，1980，Cancer Res(Bifidobacteriumbifidum)微生物群的成份)；Kimura等(1980)发现其″经过静脉施用后在数种小鼠肿瘤内选择性定殖并生长″且″在静脉施用于带瘤小鼠48或96小时后在健康器官例如肝脏、脾脏、肾脏、肺血液、骨髓和肌肉内未检测到该细菌″；发现双歧双歧杆菌的发酵乳对一种人类乳腺癌细胞系具有抗增殖作用(Biffi等，1997)；ATCC#11863，1569640：2061-2068；Biffi等，1997，Nutr Cancer28：93-99长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)非致病性(人体所需的正常的有益微生物群的成份)；对肝脏肿瘤发生具有抑制作用(Mizutani和Mitsuoka 1980)；长双歧杆菌可″在全身应用后选择性定位于二甲基苯蔥(7，12-dimethylbenz[a]anthracene)诱导的大鼠乳腺肿瘤并在其中增殖″(Yazawa等，2001)；发现其选择性定位并生长于低氧肿瘤内(Yazawa等，2000)；ATCC#15707Mizutani和Mitsuoka 1980，Cancer Lett 11：89-95；Yazawa等，2000，CancerGene Ther7：269-274；Yazawa等，2001，BreastCancer Res Treat 66：165-170婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)非致病性(人体所需的正常的有益微生物群的成份)；发现婴儿双歧杆菌的发酵乳对一种人类乳腺癌细胞系(Biffi等，1997)和其他肿瘤细胞或肿瘤(Kohwi等，1978；Sekine等，1985；Sekine等，1995)具有强抗增殖作用；ATCC#15697Kohwi等，1978，Gann 69：613-618；Sekine等，1985，Cancer Res45：1300-1307；Sekine等，1995，Biol PharmBull 18：148-153；Biffi等，1997，Nutr Cancer28：93-99侧孢双歧杆菌(Bifidobacteriumlaterosporus)非致病性(人体所需的正常的有益微生物群的成份)；动物双歧杆菌(Bifidobacterium发现动物双歧杆菌的发酵乳对一种人类乳腺癌细胞系的生长具有抗增Biffi等，1997，Nutr Cancer28：93-99animals)殖作用(Biffi等，1997)；ATCC#25527衣氏放线菌(Actinomycesisraelii)放线菌是真菌样细菌，可形成丝状分枝。已知其生长于口腔和肠道。该微生物的致病性生长通常是感染部位创伤的结果，可导致放线菌病。迟缓真杆菌(Eubacteriumlentum)真杆菌科是肠道的正常菌群，但可引起机会性感染。迟缓真杆菌是最常见的分离的真杆菌，已经发现其与心内膜炎和一些伤口感染有关。厌氧消化链球菌(Peptostreptococcusanaerobius)某些外科病人发生的non-sparing厌氧菌(NSA)感染的最常见的细菌之一；ATCC#27337Chatterjee和Chakraborti1995，J Indian Med Assoc 93：333-5，339普氏消化球菌(Peptococcusprevotii)伤口感染；Chatterjee和Chakraborti1995，J Indian Med Assoc 93：333-5，339诺氏梭菌(Clostridiumnovyi)严格厌氧菌；土壤内野生；有氧条件下活动被抑制；Vogelstein实验室(Dang等，2001)发现″在小鼠肿瘤的无血管区域产生经静脉注射的诺氏梭菌-NT的孢子且其在活的肿瘤细胞周围被破坏″，″可将大量(达10⁸/500微升)诺氏梭菌和索氏梭菌孢子静脉注射进正常小鼠而不引起任何可察觉到的不良反应″；ATCC#19402Dang等，2001，Proc NatlAcad Sci USA 98：15155-15160；Nuyts等，2002，AnticancerDrugs 13：115-125索氏梭菌(Clostridiumsordellii)ATCC#9714不同梭菌(Clostridiumabsonum)ATCC#27555丙酮丁醇梭菌Theys等，(2001)证实″遗传工程化Theys等，1999，Appl Environ(Clostridiumacetobutylicum)的丙酮丁醇梭菌可将胞嘧啶脱氨酶特异性导向实体瘤″；其他相关文章(Theys等，1999)；ATCC#824Microbiol 65：4295-4300；Theys等，2001，Cancer GeneTher 8：294-297双酶梭菌(Clostridiumbifermentans)ATCC#17836艰难梭菌(Clostridiumdifficile)艰难梭菌与癌症病人之间的联系已有报道(Anand和Glatt 1993；Simon等，2000)；ATCC#700057Anand和Glatt 1993，ClinInfect Dis 17：109-113；Schuller等，1995，Arch DisChild 72：219-222；Wehl等，1999，Med PediatrOncol 32：336-343；Simon等，2000，InfectControl Hosp Epidemiol 21：592-596溶组织梭菌(Clostridiumhistolyticum)ATCC#19401产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)致病性；经常有癌症病人的产气荚膜梭菌菌血症的报道；产气荚膜梭菌肠毒素杀死肿瘤细胞并降低肿瘤生长(Michl等，2001)；ATCC#3624，13124Bodey等，1991，Cancer 67：1928-1942；Michl等，2001，Gastroenterology 12l：678-684拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)Brown等描述了″未证明该方法对肿瘤的特异性靶向，我们将灭活形式的拜氏梭菌静脉注射，当其转变为增殖状态时，将表达大肠杆菌硝基还原酶基因。经静脉注射灭活的梭菌属的孢子后的前5天中，10个肿瘤中均检测到硝基还原酶活性，提示自孢子形式到增殖状态的快速转变″(Lemmon等，1997)；其他关于拜氏梭菌导向肿Minton等，1995，FEMSMicrobiol Rev 17：357-364；Fox等，1996，Gene Ther 3：173-178；Lemmon等，1997，Gene Ther4：791-796瘤的文章(Minton等，1995，FEMSMicrobiol Rev 17：357-364；Fox等，1996)；ATCC#25752生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)无害的腐生物；Brown等描述了″给先前注射了CD-转化的生孢梭菌的孢子的小鼠全身施用5-FC产生了较最大耐受剂量的5-FU更强的抗肿瘤作用″；ATCC#19404Liu等，2002，Gene Ther 9：291-296金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)不动、非孢子形成及兼性厌氧菌；一种哺乳动物鼻粘膜相关性耐盐微生物，有良性及致病性菌株；金黄色葡萄球菌菌血症在癌症病人中常见；ATCC#25923表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)皮肤的非致病性正常菌群成分；厌氧菌，革兰氏阴性发酵氨基酸球菌(Acidaminococcusfermentant)见于伤口感染；Chatterjee和Chakraborti1995，J Indian Med Assoc 93：333-5,339植物细菌，革兰氏阳性密执安棍状杆菌密执安亚种(Clavibactermichiganensissubsp.番茄的病原体michiganensis)植物细菌，革兰氏阴性根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)植物肿瘤中的根癌土壤杆菌(Ullrich和Aloni 2000)；Kunik等，(2001，ProcNatl Acad Sci USA 98：1871-1876)描述了″土壤杆菌附着于并遗传转化数种人类细胞″；有报道称在多种癌症病人体内发现抗根癌土壤杆菌抗体(Aksac 1974，Turk Hij Tecr BiyolDerg 34：48-51)；生长于26-30℃；ATCC#15955Aksac 1974，Turk Hij TecrBiyol Derg 34：48-51；Zambryski等，1982，J MolAppl Genet 1：361-370；Rezmer等，1999，Planta 209：399-405；Ullrich和Aloni 2000，J ExpBot 51：1951-1960；Azmi等，2001，Planta 2001May；213(1)：29-36；Kunik等，2001，Proc NatlAcad Sci USA 98：1871-1876草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)无荚膜、非孢子形成、短棒状、具有单鞭毛、且对人无害；自草生欧文氏菌纯化的酪氨酸酚裂解酶显著抑制建立的B-16黑色素瘤的生长；Meadows等，1976，CancerRes 36：167-167茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobiumcaulinodans)共生性、定殖于植物、固氮；野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种(Xanthomonascampestris pv.vesicatoria)胡椒和番茄的致病菌野油菜黄单胞菌野油菜致病变种大豆和甘蓝的致病菌；大肠杆菌lac启动子在该植物致病菌中具有功能；Soby和Daniels 1996，ApplMicrobiol Biotechnol 46：(Xanthomonascampestris    pv.campestris)559-561
注：本表的内容并非是穷举性的，任何其他类似的细菌菌株，虽未列入本表，但也应被视为包括在内。
特别优选的是减毒的霍乱弧菌。
可用来制备用于肿瘤成像或对抗肿瘤治疗情况进行监测的诊断组合物的细菌的另一个实例是磁性细菌(magnetic bacterium)(金属结合细菌介导的肿瘤检测(MBBMTD))。使用此类细菌能够通过基于铁的对比剂的聚集而对肿瘤进行检测。磁性细菌可自新鲜的海水沉积物注分离得到。这些细菌能够产生磁性颗粒(Fe₃O₄)(Blakemore，Annu.Rev.Microbiol.36(1982)，217-238)。为此，其具有有效的铁摄入系统，使其能够同时利用不可溶性和可溶性形式的铁。Magnetospirillum magneticum AMB-1是此类磁性细菌的一种，其已经得到分离和培养以生产磁性颗粒(Yang等，Enzyme Microb.Technol.29(2001)，13-19)。由于预期这些磁性细菌(无论是天然存在的或经遗传工程修饰的)经静脉注射后会具有与例如霍乱弧菌相似的肿瘤内聚集能力，这些细菌可由于在肿瘤中聚集基于铁的对比剂，由此可通过MRI对肿瘤进行检测。与此类似，其他天然分离的金属聚集性细菌菌株可被用于肿瘤定向、吸附对比剂的金属、并最终用来进行肿瘤成像。
或者，例如痘苗病毒、AAV、逆转录病毒等病毒也可用于本发明的诊断和治疗组合物；表2列举了可用于本发明的病毒的实例。
表2.可用于本发明的病毒的实例：病毒株简述参考文献痘苗病毒(Vaccinia virus)我们发现病毒胸苷激酶突Yu等，2002，未发表数据变对于静脉注射的痘苗病毒在肿瘤中的积累是非必需的。Epstein-Barr病毒人乳头状瘤病毒zur Hausen 2002，Nat RevCancer 2：342-350逆转录病毒腺病毒Lindsey 2002，Lancet Oncol3：264腺相关病毒SV40病毒巨细胞病毒新城病病毒安全，复制并杀死肿瘤细胞；局部注射较全身注射更有效Schirrmacher等，2001，Int JOncol 18：945-952牛肠道病毒牛肠道病毒在体外对多种细胞具有很宽的组织定向性。同时对人类细胞具有肿瘤溶解活性。Smyth等，2002，Int J MolMed 10：49-53淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)高稳定性、低毒性、宿主范围广泛Beyer等，2002，J Virol 76：1488-1495慢病毒属麻疹病毒Edmonston-B株(MV-Ed)衍生物安全、减毒活病毒，发现其诱导在免疫缺陷小鼠上的人淋巴瘤异种移植物的消退Grote等，2001，Blood 97：3746-3754单纯疱疹病毒I型Lachmann和Efstathiou1999，Curr Opin Mol Ther1：622-632；Wu等，2001，Cancer Res61：3009-3015减毒的黄热(YF)病毒强效疫苗、安全Barrett 1997，Biologicals25：17-25；McAllister等，2000，J Virol74：9197-205
注：本表的内容并非是穷举性的，任何其他类似的病毒株，虽未列入本表，但也应被视为包括在内。
优选的病毒是痘苗病毒。
优选地，本发明的诊断或治疗组合物的细胞是一种哺乳动物细胞，例如干细胞，其与该生物体可以是自体的或异基因的。适当的细胞类型见表3。
表3.可用于本发明的哺乳动物细胞的实例：哺乳动物细胞简述参考文献干细胞已经发现经静脉注射在中枢神经系统以外植入的神经干细胞导向颅内肿瘤。此外，当颅内植入于肿瘤的远离部位时，例如对侧半球或脑室内，供体神经干细胞迁移经过正常的脑组织而导向人神经胶质瘤细胞。Aboody等，2000，Proc NatlAcad Sci USA 97：12846-12851；Herrlinger等，2000，MolTher 1：347-357各种肿瘤细胞例如，卵巢癌细胞可侵润病人的胸膜腔而导向恶性胸膜间皮瘤(Harrison等，2000，Ann Thorac Surg 70：407-411)。我们发现静脉注射的纤维肉瘤细胞聚集到乳腺肿瘤和皮下神经胶质瘤(Yu等，未发表数据)。
注：本表的内容并非是穷举性的，任何其他类似类型的哺乳动物细胞，虽未列入本表，但也应被视为包括在内。
在本发明的诊断和/或治疗组合物的一个进一步优选的实施方案中，发光或荧光蛋白是萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)或红色荧光蛋白(RFP)。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的诊断和/或治疗组合物的微生物或细胞额外含有编码萤光素酶的底物的基因。在一个更加优选的实施方案中，本发明的诊断和/或治疗组合物的微生物或细胞含有一种ruc-gfp表达盒，该表达盒含有Renilla萤光素酶(ruc)和Aequorea gfpcDNA序列，所述序列置于牛痘或luxCDABE盒的强合成早期/晚期(PE/L)启动子的控制下。
上述微生物和细胞的一种优选的用途是制备一种用于肿瘤成像的诊断组合物。本发明的诊断组合物可用来，例如在外科手术中，鉴别肿瘤和转移。此外，本发明的诊断组合物可用来监测抗肿瘤治疗情况。用于分析例如发光和/或荧光蛋白在生物体、器官或组织中的定位的合适的装置是本领域人员所熟知的，且在以上以及下文的实施例中所引用的文献中有进一步的描述。此外，微生物和细胞可被修饰以使得其能够结合金属，由此可用于MRI技术以使得对肿瘤的定位更具特异性。
本发明还涉及抗微生物制剂，例如抗菌或抗病毒化合物，如与一种可检测蛋白质相融合的肽或蛋白，在制备一种用于肿瘤成像或对抗肿瘤治疗情况进行检测的诊断组合物中的用途。通过这种抗微生物化合物例如一种光发射或放射性标记的抗微生物肽/蛋白质与定位于肿瘤中的细菌的结合(肽连接的肿瘤导向载体检测(Peptide-Linked-Tumor-Targeting-Vector Detection，PLTTVD))，该诊断组合物可用于对肿瘤进行检测。
本发明还涉及一种抗微生物制剂，例如抗菌或抗病毒化合物，如与一种治疗性蛋白质相融合的肽或蛋白，在制备一种用于治疗肿瘤的药物组合物中的用途。
天然存在的抗微生物蛋白的例子包括ubiquicidin(UBI，6.7kDa)和乳铁蛋白(hLF，77kDa)。UBI最初分离自鼠科巨噬细胞，后来分离自人气道上皮细胞。HLF存在于粘膜和中性粒细胞，且已知其结合革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的表面结构。已经设计了含有UBI或hLF的细菌结合域的合成的小肽用于细菌感染的成像，其可将细菌感染与无菌性炎症区别开(Nibbering等，Nucl.Med.Commun.19(1998)，1117-1121；Welling等，Nucl.Med.Biol.29(2000)，413-422；Welling等，Eur.J.Nucl.Med.27(2002)，2929-301)。将这些肽以^99mTc进行放射性标记，可由此利用平面闪烁扫描法在活体动物中进行实时显像。例如装备了低能量通用平行孔瞄准仪(low-energy general-purpose parallel-hole collimator)的平面γ照相机(例如Toshiba GCA 7100/UI，Tokyo，Japan)可用来对^99mTc-1标记的抗微生物肽在活体动物或人中的分布进行显像。为将这些合成的肽用于对肿瘤的检测，首先使患有肿瘤的个体感染一种特定的细胞外细菌的菌株。在细菌定殖于肿瘤后，将放射性标记的化合物，例如肽，静脉施用。标记的肽与所述细菌在肿瘤内的特异性结合可通过闪烁扫描法进行实时显像，由此在人和动物体内对肿瘤进行定位。处理用^99mTc进行标记，一些化合物，例如合成的肽，也可以顺磁性或超顺磁性金属颗粒进行标记以通过MRI进行显像，或者将化合物以放射性核素例如⁵⁵CO、⁶⁸Ga、⁶⁰CU(II)、¹²³I等标记，用于通过SPECT或PET进行非介入性显像。此外，这些化合物例如合成的肽也可以荧光探针、荧光蛋白(如绿色荧光蛋白(GFP)或DsRed)、或发光蛋白(如Renilla萤光素酶、萤火虫萤光素酶)进行标记，以便在个体中进行实时显像。
除了UBI和hLF，还要很多其他的由细菌、植物、无脊椎动物和包括人的脊椎动物产生的抗微生物肽/蛋白的例子(Schroder，Cell.Mol.LifeSci.56(1999)，32-46；Cole和Ganz，Biotechniques 29(2000)，822-826，828，830-831)，其也可用于本发明，例如来自乳酸菌的片球菌素PA-1(pediocinPA-1)、来自短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的短杆菌素S、来自猪白细胞的protegrin-1、来自绵羊髓系细胞的SMAP-29、来自亚洲蟾蜍的buforin I和buforin II、β-防卫素(beta-defensins)、LL-37、人组织蛋白酶抑制素(cathelicidin)hCAP-18的一种片段、来自鲶鱼的arasin I、颗粒溶解酶(granulysin)、来自詹氏丙酸杆菌(Propionibaeterium jensenii)的PAMP，等等。基于这些天然存在的抗微生物蛋白，可设计并合成小肽，以保留细菌结合能力而消除原有蛋白的杀菌作用。然后这些肽即可用于进行细菌介导的肿瘤检测。
与通过抗菌化合物(例如肽/蛋白质)检测细菌相似，抗病毒化合物(例如肽/蛋白质)可用于检测肿瘤中的病毒颗粒。铁乳蛋白(Lactoferricin)是可用于设计检测病毒颗粒的抗病毒肽/蛋白质的例子之一。除了所讨论的抗微生物肽/蛋白质，放射性标记或发光蛋白/探针标记的抗体片段也可用于导向定位于肿瘤的细菌或病毒，以检测肿瘤。
此外，抗微生物化合物可融合于一种金属结合蛋白(融合肽连接的肿瘤导向载体检测(Fusion-Peptide-Linked Tumor Targeting VectorDetection，PLTTVD))，以检测本发明的细菌、病毒等在肿瘤中的聚集。在融合构建体与遗传工程化的细菌等在肿瘤中结合后，静脉注射金属制剂(其可用于通过MRI、PET或SPECT进行检测)。通过细菌等对金属制剂的结合和吸附可间接对肿瘤进行检测。
本发明还涉及包含微生物或细胞的药物组合物，所述的微生物或细胞含有编码能够结合一种配体且进一步的是一种偶联了一种毒素的配体(＝嵌合毒素)的细胞受体的DNA序列。合适的能够偶联于配体的毒素是本领域已知的。一些嵌合毒素在前面已经提及。首先，通过将转铁蛋白缀合于突变的白喉毒素CRM 107(Johnson等，J.Neurosurg.70(1989)，240-248)而制备Tfn-CRM 107嵌合毒素，其导向转铁蛋白受体。其次，通过将抗-EGF受体抗体缀合于完整的假单胞外毒素A而制备425.3-PE免疫毒素(Myklebust等，Cancer Res.53(1993)，3784-3788)。第三，通过将转铁蛋白缀合于假单胞外毒素而制备Tfn-PE(Hall等，J.Neurosurg.76(1992)，838-844；Hall等，Neurosurgery 34(1994)，649-656)。在动物模型和病人中可发现，这些嵌合毒素具有抗成神经管细胞瘤、小细胞肺癌、神经胶质瘤异种异种物以及颅内肿瘤的抗肿瘤活性。因此，例如重组痘苗病毒可被设计为在肿瘤细胞表面特异性表达转铁蛋白受体，由此可使用这些受体导向型嵌合毒素进行抗肿瘤治疗。
本发明还涉及一种药物组合物，包含(a)一种微生物或细胞，其含有编码能够结合一种配体的细胞受体的DNA序列，以及(b)所述的配体，其偶联于一种治疗性蛋白质。合适的治疗性蛋白质以及通过将治疗性蛋白质连接于所述的配体蛋白以产生治疗性配体融合蛋白的方法是本领域人员已知的。合适的治疗性蛋白质的例子如图4和5所示。
表4.酶/前体药物对的实例，其中借助于静脉注射的微生物和细胞来输送酶基因：治疗性蛋白质(酶)，药物，前体药物简述参考文献单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)+更昔洛韦(Ganciclovir(GCV))最熟知的酶/前体药物组合Moolten Cancer Res.1986；46：5276-5281单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)+A-5021(1′S，2′R)-9{[1′，2′-双(羟甲基)环丙-1′-基]甲基}鸟嘌呤A-5021具有高度的选择性抗肝活性，且在疱疹病毒感染的细胞中被病毒TK选择性磷酸化。A 5021的抗疱疹活性与ACV和潘昔洛韦(penciclovir)相比对强。Hasegawa等，2000，CancerGene Ther 7：557-562辣根过氧化物酶(HRP)+吲哚-3-乙酸(IAA)当被纯化的HRP激活后，IAA可抑制在哺乳动物细胞中的集落形成，而在同样的浓度或时间条件下，酶和前体药物单独使用均无细Greco等，2000，CancerGene Thera.7：1414-1420胞毒性。HRP/IAA诱导的细胞杀灭在正常氧含量和缺氧条件下均有效。细菌羧基肽酶G2(CPG2)+4-([2-氯乙基][2-甲磺酰基乙氧基]氨基)苯甲酰-L-谷氨酸(CMDA)或+4-[N，N-双(2-碘乙烷)氨基]苯氧基羰基-L-谷氨酸(ZD2767P)CPG2可表达于哺乳动物细胞的细胞内或附着于其外表面，其可激活用于自杀性基因治疗的芥子前体药物。Spooner等，2000，CancerGene Ther.7：1348-1356Webley等，2001，Br JCancer 84：1671-1676人细胞色素P450 CYP1A2+醋氨酚醋氨酚通过细胞色素P450介导产生化学反应性代谢产物N-乙酰苯醌亚胺(N-acetylbenzoquinoneimine，NABQI)而具有细胞毒性。Thatcher等，2000，CancerGene Ther 7：521-525兔细胞色素P450 4B1(CYP4B1)+4-甘薯苦醇(4-ipomeanol，4-IM)CYP4B1在低达微摩尔的浓度下能够在前体药物4-IM处理后的神经胶质瘤细胞中诱导肿瘤细胞死亡。Mohr等，2000，Cancer GeneTher.7：1008-1014；Heuser等，2000，CancerGene Ther 7：806-12大鼠细胞色素P450 4B1(CYP2B1)+oxaphosphorines，例如异环磷酰胺(IFO)CYP2B1基因产物将oxaphosphorines激活为羟基形式，产生毒性产物磷酰胺氮芥和丙稀醛，分别使DNA和蛋白质烷化。Kammertoens等，2000，Cancer Gene Ther 7：629-636大肠杆菌硝基还原酶(NTR)+CB1954CB1954是一种弱的单功能烷化剂，被NTR转化为2-和4-羟氨基衍生物。细胞内的硫酯如乙酰辅酶A随后将后者转化为一种强双功能烷化剂，其能杀死增殖Djeha等，2000，CancerGene Ther.7：721-731；Djeha等，2001，Mol Ther 3：233-240Westphal等，2000，CancerGene Ther 7：97-106和非增殖细胞。PTX0147是表达来自巨细胞病毒(CMV)早期启动子/增强子NTR的质粒，并还携带b-球蛋白第二内含子和poly(A)序列以及一种G418选择标记物。Weedon等，2000，Int JCancer 86：848-854大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)，大肠杆菌尿嘧啶磷酸核糖基转移酶(UPRT)+5-氟胞嘧啶(5-FC)尽管表达CD，一些肿瘤细胞仍具有5-FC抗性，其原因可能在于哺乳动物细胞内缺乏一种有作用的胞嘧啶转运系统以及二氢嘧啶脱氢酶(DPD)对形成的50FU的降解。在基因转移策略中，为增强CD/5-FC系统的作用，可以转导将5-FU转化为其活性形式的酶的基因。大肠杆菌UPRT是候选之一。其是一种嘧啶补救酶且为细菌所特有。其在5-FU活化的第一步直接将5-FU转化为5-氟尿嘧啶单磷酸酯(FUMP)，并能够增强抗DPD的激活途径。Koyama等，2000，CancerGene Ther.7：1015-1022；Theys等，2001，CancerGene Ther 8：294-297；Kammertoens等，2000，Cancer Gene Ther 7：629-636；Block等，2000，CancerGene Ther 7：438-445；Bentires-Alj等，2000Cancer Gene Ther 7：20-26；Kawamura等，2000，CancerGene Ther 7：637-643；Li等，1997，Cancer GeneTher 4：113-117细胞色素P450酶+环磷酰胺(CPA)肝组织具有高含量的对CPA具有活性的P450酶，且是负责CPA活化的主要器官。肝组织中产生的活化的CPA通过血液进行循环，并进入肿瘤组织以发挥其治疗作用。肿瘤内CPA激活可导致在Huang等，2000，CancerGene Ther.7：1034-1042；Kan等，2001，Cancer GeneTher 8：473-482其作用部位出现局部高浓度的活性药物代谢物，这可产生最大的治疗作用而同时使肝脏药物激活相关的宿主毒性降至最低。兔羧酸酯酶+7-乙基-10-[4-(1-哌啶基)-1-哌啶基]羰基氧喜树碱(CPT-11)神经母细胞瘤细胞系或这些细胞与CD34(+)细胞按10∶90混合物暴露于复制缺陷型AdRSVrCE 24小时，随后将细胞暴露于1-5微摩尔的CPT-114小时增了CPT-11对3种神经母细胞瘤细胞系(SJNB-1，NB-1691和SKN-SH)的毒性达20-50倍，且消除其克隆形成能力。Meck等，2001，Cancer Res61：5083-5089蕈类酪氨酸酶+双-(2-氯乙烷基)氨基-4-羟基苯胺甲酮28合成了一种空间排列不严格的前体药物双-(2-氯乙烷基)氨基-4-羟基苯胺甲酮28并发现其被蕈类酪氨酸酶氧化，其发应速度高于酪氨酸甲基酯，其羧酸是酪氨酸酶的天然底物。Jordan等，2001，BioorgMed Chem 9：1549-1558大肠杆菌β-半乳糖苷酶+1-氯甲基-5-羟基-1，2-二氢-3H-苯基吲哚(CC-1065)或+1-(1′-氯乙基)-5-羟基-1，2-二氢-3H-苯基吲哚被半乳糖苷酶裂解的前体药物对人类支气管癌细胞系A549具有高毒性。Tietze等，2001，Chembiochem 2：758-765羧基肽酶G2(CPG2)的一种突变体，谷氨酸羧基肽酶+4-[双(2-碘乙烷基)氨所有这三种前体药物的激活不仅杀死表面表达突变体CPG2的细胞，而且通过Friedlos等，2002，CancerRes 62：1724-1729基]-苯氧基羰基-L-谷氨酸或+3-氟-4-[双(2-氯乙烷基)氨基]苯甲酰基-L-谷氨酸“旁观者效应”杀死周围的细胞。或+3，5-双氟-4-[双(2-碘乙烷基)氨基]苯甲酰基-L-谷氨酸
注：本表的内容并非是穷举性的，任何其他类似的酶/前体药物对，虽未列入本表，但也应被视为包括在内。
表5.可用于抗肿瘤性细菌介导的蛋白质治疗(BMPT)、病毒介导的蛋白质治疗(VMPT)或细胞介导的蛋白质治疗(CMPT)(例如哺乳动物细胞介导的蛋白质治疗(mCMPT))的治疗性蛋白质的进一步的实例：治疗性蛋白质，药物简述参考文献rsCD40LCD40的配体，使得肿瘤细胞对包括TNF-alpha、抗-Fas以及细胞毒药物在内的多种药物诱导的凋亡敏感。Eliopoulos等，2000，Mole.Cell.Biol.20：5503-5515Fas-配体Sharma等，2000，Pharmacol Ther.88：333-347TRAIL死亡受体(例如DcR2，DcRI，DR5，DR4)的配体Golstein 1997，Curr.Biol.7：R750-753.TNFTNF是TNFR1的配体，TNFR1介导细胞死亡信号。Baker和Reddy 1996，Oncogene 12：1-9；Theys等，1999，ApplEnviron Microbiol 65：4295-4300；Lammertyn等，1997，ApplEnviron  Microbiol 63：1808-1813重组抗体抗-GA733-2分泌型或膜结合型单克隆抗体(mAb)(CO17-1A)，特异于大多数胃肠道癌症的表面抗原(GA733-2)。Paul等，2000，CancerGene Ther 7：615-623抗癌药物阿霉素(ADM)、阿糖胞苷(Ara-C)、顺铂、柔红霉素、丝裂霉素C、氟尿嘧啶、喜树碱、顺铂(II)、CDDP等+抗-Fas抗体一些肿瘤细胞在其表面表达Fas抗原，IgM-抗-Fas MoAb可在这些细胞诱导凋亡。临床浓度的抗癌药物增强Fas受体在肿瘤细胞原生质膜上的表达。将ADM或Ara-C与IgM-抗-FasMoAb联合，可显著增强诱导HL60白血病细胞凋亡。因此，可以用细菌或病毒来输送编码抗-Fas抗体的基因。抗-Fas抗体在肿瘤细胞表面的表达可使得这些细胞对化疗药物敏感，由此可提高化疗的成效。Nakamura等，1997，Anticancer Res.17：173-179；Micheau等，1997，J.Natl.Cancer Inst.89：783-789；Chang等，1998，OsakaCity Med.J.44：173-180；Mizutani等，1997，Cancer79：1180-1189；Jiang等，1999，Hepatology 29：101-110；Mizutani等，1998，J.Urol.160：561-570细菌毒素微生物肽E492一种小分子量的通道形成细菌素(7，887 Da)，由肺炎克氏菌(Klebsiella pneumoniae)产生。已经发现微生物肽E492诱导某些人类细胞系凋亡。以zVAD fink(一种广谱的caspase抑制剂)处理，可完全阻断该细菌素的细胞毒作用，当微生物肽被用于抗肿瘤治疗时，这可提供一种安全机制。已经分离了微生物肽-E492-不敏感的大肠杆菌K12突变体，其可用作输送微生物肽的载体(Pugsley等，1986，J GenMicrobiol 132：3253-3259)。de Lorenzo 1984，ArchMicrobiol 139：72-75；Hetz等，2002，Proc NatlAcad Sci USA 99：2696-2701白喉毒素(DT)毒素标记的单克隆抗体已被用于导向肿瘤细胞表面受体以杀死细胞(Kreitman 2001，Curr PharmBiotechnol 2：313-325；Thomas等，2002，J Pediatr Surg 37：539-544)。毒素标记的蛋白质配体已被用于导向细胞表面受体(Olson等，1997，Int J Cancer 73：865-870；Arora等，1999，CancerRes 59：183-188；Wild等，2000，Br J Cancer 83：1077-1083).假单胞菌属外毒素大肠杆菌志贺菌毒素志贺菌毒素、志贺样毒素I(SLT-I)和志贺样毒素II(SLT-II)是细胞相关性细胞毒素，已发现其能够杀死肿瘤细胞。这些毒素通过诱导凋亡杀死靶细胞。O′Brien等，1992，CurrTop Microbiol Immunol180：65-94；Nakao和Takeda 2000，JNat Toxins 9：299-313大肠杆菌Vero细胞毒素(Verotoxin 1，VT1)VT1是一种大肠杆菌的亚单位毒素，仅对表达VT1受体球丙糖酰基神经酰胺(globotriaosylceramide-Gb3)的(肿瘤)细胞系具有活性。VT1的作用的一个例子是发现VT1可消除裸鼠体内的人类星细胞瘤的异种移植物。Farkas-Himsley等，1995，Proc Natl Acad Sci USA92：6996-7000；Arab等，1999，Oncol Res11：33-39植物毒素贯叶金丝桃素(Hyperforin)贯叶金丝桃素是一种衍生自植物的抗生素。已经发现贯叶金丝桃素可通过激活线粒体介导的凋亡途径抑制肿瘤生长。Hostanska等，2002，Pharmazie 57：323-331；Schempp等，2002，Oncogene 21：1242-1250
注：本表的内容并非是穷举性的，任何其他类似的治疗性蛋白质，虽未列入本表，但也应被视为包括在内。
由于使用静脉注射的遗传工程化的细菌、病毒或细胞可将肿瘤组织以配体受体进行标记，因此治疗性配体融合蛋白与配体受体的结合可使得该治疗性蛋白质导向肿瘤组织。细胞内的细菌和病毒对于以指定的受体蛋白对肿瘤细胞表面进行标记是特别有用的。不过，由于存在治疗性蛋白质对周围细胞的“旁观者效应”，细胞外细菌以及哺乳动物细胞也可用来施用治疗性蛋白质。
对于基因知道的酶前体药物治疗(GDEPT)(见下文)，例如，可使用细胞外细菌一分泌该酶-配体融合蛋白。可通过病毒标记具有受体蛋白的肿瘤细胞表面。在静脉施用前体药物后，不仅表达该受体的细胞将被活性药物杀死，其周围的肿瘤细胞(其或许并未标记受体)也将被杀死。
病毒(例如痘苗病毒)也可用于标记具有受体蛋白的肿瘤细胞表面。例如，通过静脉注射的遗传工程化的携带例如转铁蛋白受体基因(其同时编码一种用于细胞表面表达的单独的肽)的痘苗病毒可特异性感染肿瘤组织。肿瘤细胞表面表达转铁蛋白受体可使得这些细胞成为治疗性配体融合蛋白的靶向。在这种情况下，配体是转铁蛋白，而治疗性蛋白质可以是假单胞菌属外毒素(Pseudomonas exotoxin)(或任何其他的治疗性蛋白质)。通过肿瘤细胞对转铁蛋白/转铁蛋白受体对的内化，使得治疗性蛋白质被内化，继而将细胞毒性特异性输送至肿瘤细胞。转铁蛋白/转铁蛋白受体对仅仅是很多可以应用的配体-受体对的例子之一。此外，可以使用彼此具有高度特异性亲和力的突变的配体和突变的受体以避免与内源性蛋白的结合。
其他的合适的蛋白质的例子为人类内皮抑素(endostatin)和嵌合型PE37/TGF-α融合蛋白。内皮抑素是一种已知的胶原XVIII的羧基端肽(Ding等，PNAS USA 95(1998)，10443)。已经发现内皮抑素抑制内皮细胞的增殖和迁移，在体外诱导内皮细胞出现G1停滞和凋亡，且在多种肿瘤模型中具有抗肿瘤作用。静脉或肌肉注射编码内皮抑素的病毒DNA和阳离子脂质体复合的质粒DNA可在肿瘤内产生有限水平的内皮抑素表达。但是，瘤内注射纯化的内皮抑素可显著抑制肿瘤的生长。假单胞菌属外毒素是抑制细菌毒素，由铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)分泌。PE通过灭活延长因子2(EF-2)发挥其细胞毒作用，阻断哺乳动物细胞的蛋白合成。单链PE在功能上可分为三个结构域：结构域Ia是结合细胞表面受体缩必需的，结构域II是毒素转移至靶细胞内所必需的，而结构域III负责灭活EF-2以产生细胞毒性。PE40衍生自野生型的假单胞菌属外毒素，其缺乏结构域Ia。其他蛋白质例如抗体片段或蛋白配体可被插入以替代此结合结构域。这使得PE40-配体融合蛋白具有其受体特异性。一种高度特异性的遗传工程化的嵌合型毒素是TGF-α/PE40融合蛋白，其中TGF-α多肽的C端与PE40蛋白的N端发生框内融合。TGF-α是表皮生长因子受体(EGFR)的配体之一，发现其优选地表达于多种肿瘤细胞的表面。TGF-α-PE40融合蛋白显示出对细胞表面具有升高的EGFR的肿瘤细胞具有高度的细胞毒性，但其对周围的表面EGFR表达较低的细胞的毒性较低。TGF-α-PE40嵌合型蛋白的毒性取决于一个蛋白裂解步骤，该步骤将嵌合型蛋白转化为其活性形式，该步骤是由靶细胞完成的。为克服对蛋白裂解作用的依赖Theuer及其同事构建了一种新的不需要裂解加工的嵌合型毒素蛋白(J.Biol.Chem.267(1992)，16872)。该新的融合蛋白被称为PE37/TGF-α，其对肿瘤细胞的毒性高于TGF-α-PE40融合蛋白。
在本发明的诊断和/或治疗组合物的一个优选的实施方案中，配体并非是天然的配体，而是任何能够特异性结合所述受体的化合物，例如抗体。术语″抗体″优选地是指基本上由具有各种不同的表位特异性的混合单克隆抗体(pooled monoclonal antibodies)组成的抗体，也指不同的单克隆抗体制剂。单克隆抗体可采用本领域人员熟知的方法自含有抗原的特定受体的片段制备(见例如Kohler等，Nature 256(1975)，495)。在此，术语″抗体″(Ab)或″单克隆抗体″(Mab)意味着包括完整的分子以及能够与受体结合的抗体片段(例如Fab和F(ab′)2片段)。Fab和F(ab′)2片段缺乏完整抗体的Fc段，可自循环中更块地被清除，且较完整抗体而言具有较低的非特异性组织结合(Wahl等，J.Nucl.Med.24：316-325(1983)。因此，这些片段是优选的，且FAB或其他免疫球蛋白表达文库的产物也是优选的。此外，本发明的抗体包括嵌合型、单链和人源化的抗体。
抗体-配体，例如，可用于使用抗体和治疗性蛋白质之间的融合蛋白(即免疫治疗性蛋白质)的抗肿瘤治疗：首先，将编码细胞表面受体的基因通过静脉注射的遗传工程化的细菌和病毒输送至活体生物体的肿瘤细胞。此类受体可以是，例如，转铁蛋白受体、EGF受体、生长抑素受体等等。细菌或病毒感染后细胞表面表达受体，其可作为肿瘤细胞的标志。其次，制备抗体与治疗性蛋白质(例如一种毒素，见表5)之间的融合蛋白(免疫治疗性蛋白质)，所述抗体优选地为抗体片段(特异于过表达的表面受体)。静脉注射的融合蛋白可结合标记的肿瘤细胞，并在肿瘤组织中对这些细胞产生细胞毒作用。
本发明还涉及一种诊断和/或药物组合物，其含有一种如上所述的微生物或细胞且进一步含有(a)一种融合于一种适合用于肿瘤的治疗和/或清除转移的肿瘤的蛋白质的抗微生物化合物，和/或(b)一种融合于一种可检测的蛋白质或一种能够诱导可检测信号的蛋白质的抗微生物化合物。实施使用此类抗微生物化合物(例如肽/蛋白质)与治疗性蛋白质之间的融合蛋白的抗肿瘤治疗，首先要制备编码抗微生物肽/蛋白质与治疗性蛋白质(见表5)之间的杂合蛋白质的融合基因构建体。蛋白质表达后，对杂合蛋白进行纯化，并准备用于静脉注射。其次，将例如能够被所述的抗微生物肽/蛋白质识别并结合的发光细菌静脉注射于对象，以使其达到肿瘤特异性聚集。抗微生物肽/蛋白质与肿瘤内的细菌的特异性结合使得治疗性蛋白质特异性浓聚于肿瘤部位，由此引发肿瘤特异性的细胞毒作用。
此外，所述的适合用于肿瘤的治疗和/或清除转移的肿瘤的蛋白质可以是一种酶，其能够将施用于生物体的非活性物质(前体药物)转化为一种活性物质，即能够杀死肿瘤或转移肿瘤的毒素(基因指导的酶前体药物治疗(GDEPT))。GDEPT的原理在于一种酶/蛋白将一种全身施用的非毒性前体药物激活为具有活性的毒性药物，其对肿瘤具有细胞毒作用。为达到特异性，GDEPT是一种分为两步的治疗。在第一步，施用编码一种外源性酶的基因，并将其导向肿瘤，在该处可以用特异性转录元件使其表达。在第二步，施用前体药物，其由在肿瘤部位表达的所述外源性酶激活。如果所述的酶/蛋白仅存在于肿瘤中，则活性药物也仅在肿瘤部位产生，且因此其仅对肿瘤细胞发挥细胞毒作用，而同时将全身毒性降至最低。编码酶/蛋白的基因是由静脉注射的本发明的遗传工程化的细菌、病毒或(哺乳动物)细胞而特异性地输送至肿瘤部位。这些基因可以置于组成型启动子或外源性调控的诱导型启动子的控制下，以便进一步保证对前体药物的转化仅出现于靶组织，即肿瘤。此类启动子例如为IPTG-、抗生素-、热-、pH-、光-、金属-、氧-、宿主细胞-、药物-、细胞周期-或组织特异性-诱导型启动子。
例如，所述的酶可以是葡糖苷酸酶，其将低毒形式的化疗药物葡糖醛酸基柔红霉素转化为毒性更强的形式。优选地，编码此酶的基因受控于一种组成型或诱导型启动子。可用于本发明的药物组合物的酶/前体药物对的其他例子列于表4，见上。
此外，本发明的输送系统甚至允许使用这样的一些化合物，所述的化合物由于在全身应用时毒性过高而在目前没有用于肿瘤的治疗。此类化合物包括抑制延长因子的蛋白、结合核糖体亚单位的蛋白、修饰核苷酸的蛋白、核酸酶、蛋白酶或细胞因子(例如IL-2、IL-12等)，后者是因为实验数据提示细胞因子的局部释放可能对肿瘤的免疫抑制状态具有积极的作用。
此外，所述的微生物或细胞可含有一种细菌人工染色体(BacterialArtificial Chromosome，BAC)或哺乳动物人工染色体(MammalianArtificial Chromosome，MAC)，BAC或MAC编码一种特定途径上的若干或所有蛋白，所述的途径例如为抗血管生成、凋亡、伤口愈合或抗肿瘤生长。此外，所述的细胞可以是一种计算机设计的、编码多种组合的此类蛋白的cyber cell或cyber virus。
在施用方面，本发明的微生物或细胞优选地组合了适当的药物学载体。适当的药物学载体的例子是本领域熟知的，包括磷酸缓冲液、水、乳剂例如油/水乳剂、各种类型的湿化剂、无菌溶液等。此类载体可通过常规方法配制并以适当的剂量施用于对象。所述微生物或细胞的施用可以不同的途径实现，例如通过静脉、腹腔内、皮下、肌肉、局部或皮内施用。优选的施用途径是静脉注射。当然，施用途径取决于肿瘤的性质以及药物组合物中的微生物或细胞的种类。剂量方案由主治医师基于各种临床因素而确定。如医学领域所熟知的，任何一个病人的剂量均取决于多种因素，包括病人的身高体重、体表面积、年龄、性别、拟施用的具体的化合物、施用的时间以及途径、肿瘤的类型、大小和部位、全身情况以及同时施用的其他药物的情况。
可以使用本发明的微生物或细胞进行治疗的优选的肿瘤为膀胱肿瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、脑瘤、结肠肿瘤、肺部肿瘤、卵巢癌和胰腺癌；肝脏肿瘤、皮肤肿瘤。
附图说明
图1：裸鼠皮下C6神经胶质瘤中GFP表达的体外成像
将C6神经胶质瘤细胞(5×10⁵)皮下植入右股外侧。在肿瘤细胞植入后的指定时间，用1×10⁸pfu的rVV-ruc-gfp病毒颗粒通过静脉感染动物。用荧光立体显微镜监测GFP的表达。所示为皮下神经胶质瘤的明视野(上方)、荧光(中)、以及明视野荧光重叠(底部)的图像。在小至22mm³的肿瘤(B-B″)或长达18天的肿瘤(大约为2500mm³)(A-A″)中可观察到GFP信号。在较长时间的肿瘤中，GFP表达呈现″斑片″样图案(在A′中箭头所示)。在静脉注射病毒后的4(C-C″)、7(D-D″)和14(E-E″)天，在同一动物的肿瘤中可连续监测到标记基因的表达。(条＝5mm)
图2：肿瘤血管生成的显像
将C6神经胶质瘤细胞(5×10⁵)皮下植入裸鼠的右股外侧。植入10天后，用1×10⁸pfu的rVV-ruc-gfp病毒颗粒通过静脉感染动物。这是病毒7天后监测到GFP的表达。随着牛痘介导的基因表达，亮绿色的荧光背景上可见皮下C6神经胶质瘤表面的显像。所示为皮下神经胶质瘤的明视野(A)、荧光(B)、以及明视野荧光重叠(C)图像。(条＝5mm)
图3：同一动物的皮下神经胶质瘤中GFP的表达
右股外侧皮下植入5×10⁵C6神经胶质瘤细胞后5天，静脉注射10⁸的rVV-ruc-gfp病毒颗粒。注射病毒后5天，将动物麻醉并处死以便在荧光显微镜下分析GFP的表达。对肿瘤进行外部显像(A-K)、伴有皮肤反射的重叠显像(B-B″)、横截面显像(C-C″)以及切除的腿部的显像(D-D″)。所示为皮下神经胶质瘤的明视野(A)、荧光(B)、以及明视野荧光重叠(C)图像。最强的GFP表达为斑片状，位于右侧肿瘤的外表面(C-C″中的双箭头)。肿瘤组织与正常肌肉组织中的GFP表达的区别(D-D″中的箭头)明显可见。星号标出反射的皮肤(B-B″和D-D″)。(条＝5mm)
图4：表达GFP的肿瘤细胞的明视野(A)和荧光(B)图像
自静脉注射1×10⁸的rVV-ruc-gfp病毒颗粒的裸鼠制备神经胶质瘤组织的冰冻切片(30微米厚)。(条＝50微米)
图5：麻醉裸鼠的弱光成像显示，在存在静脉注射的底物腔肠荧光素的情况下，Renilla萤光素酶-触发的光发射的定位(5微克乙醇溶液)
图6：基于GFP基因表达，在各种肿瘤模型中监测肿瘤特异性病毒感染
包括裸鼠的皮下PC-3人类前列腺肿瘤(A-A″)和MCF-7人类乳腺肿瘤(B-B″)，Lewis大鼠的颅内C6大鼠神经胶质瘤(C-C″，箭头指示肿瘤的部位)，以及C57小鼠的MB-49小鼠膀胱肿瘤(D-D″)。在静脉注射1×10⁸的rVV-ruc-gfp病毒颗粒后对动物监测7天。所示为肿瘤的明视野(上)、荧光(中)、以及明视野荧光重叠(底部)图像。(条＝5mm)
图7：在乳腺肿瘤模型中监测牛痘介导的GFP表达
给携带乳腺肿瘤的裸鼠静脉注射1×10⁸的rVV-ruc-gpf病毒颗粒。对原发肿瘤(A-A″，B-B″，和C-C″)和转移肿瘤(D-D″，E-E″，和F-F″)进行外部显像(A-A″和D-D″)，去除被覆的皮肤(B-B″和E-E″)，将其分开(C-C″和F-F″)置于明视野、荧光(′)以及明视野荧光重叠(″)图像。对同一动物的肺部转移肿瘤的GFP表达进行显像(G-G″)。(条＝5mm(A-A″至F-F″)，条＝1mm(G-G″))。
图8：在弱光成像仪下，基于对光发射的检测，对光发射细菌自裸鼠的清除进行显像
给裸鼠静脉注射10⁷的减毒的鼠伤寒沙门氏菌(A，B)和霍乱弧菌(C，D)。两者均以携带lux操纵子的pLITE201进行转化。在注射细菌后20分钟(A，C)和2天(B，D)收集光子。
图9：减毒的细菌归巢于神经胶质瘤
患有右后腿C6神经胶质瘤的裸鼠被静脉注射10⁷减毒的鼠伤寒沙门氏菌(A-D)和霍乱弧菌(E-H)，两者均以编码lux操纵子的pLITE201质粒DNA进行转化。在弱光成像仪下收集光子1分钟。注射鼠伤寒沙门氏菌的小鼠的整个躯体立即显示出发光(A)。而注射霍乱弧菌的小鼠在肝脏区域可见发光(E)。注射细菌后2天，两组小鼠均仅在肿瘤区域有发光(B，F)。感染鼠伤寒沙门氏菌的肿瘤的光发射在注射细菌后4天(C)和6天(D)缓慢消失。感染霍乱弧菌的肿瘤在注射后4天(G)和6天(H)的光发射增加极显著，提示细菌在肿瘤组织内的持续复制。
图10：细菌归巢于乳腺肿瘤
给具有右侧乳腺区域乳腺肿瘤的裸鼠静脉注射10⁷减毒的霍乱弧菌(A-D)或10⁷大肠杆菌(E-F)，两者均以编码lux操纵子的pLITE201质粒DNA进行转化。在弱光成像仪下收集光子1分钟。输送细菌后20分钟，肝脏可见发光的霍乱弧菌(A)。注射后48小时，在右侧乳腺部位观察到原发的乳腺肿瘤以及左侧乳腺部位的一处转移肿瘤(箭头)和切开的伤口部位(B)的光发射。第5天，光发射仅见于肿瘤区域，而未见于伤口区域(C)。注射细菌后8天，发光活性自较小的肿瘤区域消失，但在原发乳腺肿瘤中仍很强(D)。静脉注射细菌后2天也观察到大肠杆菌在裸鼠中归巢于乳腺肿瘤(E：侧面，F：腹侧)。
图11：在C57小鼠细菌归巢于膀胱肿瘤
给C57小鼠静脉注射10⁷减毒的霍乱弧菌，该细菌以编码lux操纵子的pLITE201进行转化。施用细菌后9天，在整体动物观察到膀胱部位有发光(A)。处死动物切开腹部暴露膀胱。光发射局限于膀胱部位(B)。切除小鼠膀胱后(C)，所有光发射均消失(D)，如弱光光子发射图像重叠于切除的膀胱的照片图像所示。
图12：在Lewis大鼠细菌归巢于脑部神经胶质瘤
给Lewis大鼠静脉注射10⁸减毒的霍乱弧菌，该细菌以编码lux操纵子的pLITE201进行转化。注射细菌后24小时，在弱光成像仪下观察到动物的头部出现微弱的发光。处死动物切除大脑。自有(A)和没有(B)脑部肿瘤的大鼠收集光子发射1分钟。在具有脑部肿瘤的大鼠的脑部观察到强烈的发光(以箭头显示于A)。对照脑组织中完全没有发光(B)。
图13：转化的人纤维肉瘤细胞归巢于裸鼠的皮下神经胶质瘤
给具有皮下神经胶质瘤的裸鼠静脉注射5×10⁵人纤维肉瘤细胞，该细胞以来自pLEIN的逆转录病毒永久转化。注射后7天，将动物麻醉并置于荧光立体显微镜下监测。经皮肤仅在整体小鼠的肿瘤区域观察到荧光细胞(A1-3)。通过重叠的皮肤的反射暴露肿瘤组织(B1-3)，以及在肿瘤的横截面(C1-3)，可在不同区域观察到荧光斑片。近距离观察小鼠的器官发现动物的肺部存在小簇状荧光细胞，说明纤维肉瘤细胞在肿瘤组织以外对非组织具有亲和力(D1-3)。(条＝5mm(A1-C3)，条＝1mm(D1-D3))。
图14：减毒的单核细胞增生利斯特氏菌归巢于皮下前列腺肿瘤
给右侧后腿具有皮下人类PC3前列腺肿瘤的裸鼠静脉注射10⁷减毒的单核细胞增生利斯特氏菌，该细菌以携带gfpcDNA的psod-gfp质粒DNA转化。在荧光立体显微镜下观察GFP荧光。注射细菌27小时后，仅在肿瘤部位检测到GFP信号。肿瘤显示为一组可见光(a)、荧光(b)以及可见光和荧光重叠(C)的图像。(条＝5mm)
实施例
实施例1：材料和方法
(A)菌株。所用的菌株为减毒的鼠伤寒沙门氏菌(SL7207 hisG46，DEL407[aroA544：：Tn10])，减毒的霍乱弧菌(Bengal 2 Serotyp 0139，M010DattRS1)，和减毒的单核细胞增生利斯特氏菌(D2 mpl，actA，plcB)。以上菌株由Prof.W.Gbel(University of Wurzburg，Germany)惠赠。
(B)质粒构建体。含有luxCDABE盒的质粒pLITE201来自Dr.Marines，Biotech 24，1998，56-58)。具有置于木糖启动子控制下的gEp-cDNA，lux AB，lux CD，和lux E的操纵子序列的质粒pXylA-dual由Dr.Phil Hill(University of Nottingham，UK)惠赠。
(C)细菌转化
通过电穿孔转化细菌。
(D)肿瘤细胞系。大鼠C6亚硝基脲诱导的神经胶质瘤细胞系(ATCC，Rockille，MID)培养于RPMI-1640培养基(Cellgro，Mediatech，Inc.，Herndon，VA)，添加了10％(v/v)FBS和1 x青霉素/链霉素。人类PC3前列腺癌细胞系(ATCC，Rockville，MD)和MB-49小鼠膀胱肿瘤细胞和大鼠9L神经胶质瘤细胞培养于DMEM培养基(Cellgro，Mediatech，Inc.，Herndon，VA)，添加了L-谷氨酰胺和10％(v/v)FBS。HT1080纤维肉瘤细胞(ATCC，Manassas，VA)培养于F12最低必需培养基(Cellgro，Mediatech，Inc.，Herndon，VA)，添加了10％FBS和1x青霉素/链霉素。MCF-7人类乳腺癌细胞系(ATCC，Rockville，MD)，其以携带pro-IGFIIcDNA(来自Dr.Daisy DeLeon，Loma Linda University，Loma Linda，CA)的质粒永久转化，培养于DMEM/F12培养基，添加了5％FBS和560μg/ml的G418(Life Technologies，Grand Island，NY)。
(E)产生并增殖逆转录病毒以产生一种发光的稳定转化的细胞系。PT67包装细胞(Clontech，Palo Alto，CA)培养于DMEM培养基，添加了10％(v/v)FBS。长至70％汇合，以磷酸钙沉淀方法(Profection MammalianTransfection Systems，Promega，Madison，WI)，用pLEIN(Clontech，PaloAlto，CA)转化PT67细胞12小时。添加新鲜的培养基。转化48小时后自PT67细胞收集逆转录病毒上清液，以0.45μm滤膜过滤，加入到靶HT1080细胞，同时加入Polybrene(1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物)达终浓度为4μg/ml。培养基于24小时后更换，细胞以400μg/ml的G418选择处理且逐步增加至1200μg/ml。
(F)重组痘苗病毒的增殖。痘苗病毒Lister株(LIVP)用作野生病毒。通过同源重组将ruc-gfp-盒(Wang等，Proc.Biolumin.Chemilumin.9，1996，419-422)插入痘苗病毒基因组构建了重组痘苗病毒rVV-ruc-gfp。将病毒颗粒以0.1pfu/细胞的多重感染(MOI)加入到CV-1单层细胞中，继而37℃孵育1h，每10min轻度搅拌，由此在CV-1细胞中扩增病毒。然后去除含有病毒颗粒的上清液，将单层细胞以无血清培养基洗涤一次。加入完全培养基，将细胞在37℃孵育。在CV-1细胞中增殖的rVV-ruc-gfp病毒体通过蔗糖梯度纯化。感染72h后，以50％结晶紫乙醇溶液染色细胞，进行噬菌斑分析重组病毒的滴度。
(G)产生携带肿瘤植入体的小鼠。5-6周龄的雄性BALB/c无胸腺nu/nu小鼠(25-30g体重)和Lewis大鼠(250-300g体重)购自Harlan(Frederick，MD)。C57BL/6JMin/+小鼠来自Jackson实验室(Bar Harbor，ME)，Min(多发肠道肿瘤)是一种常染色体显性性状，涉及鼠Apc基因的850位密码子的无意义突变，导致这些动物易于发生自发性肠腺瘤形成。
为在裸鼠中建立肿瘤，培养C6神经胶质瘤细胞，收集并计数(Trypan Blue排除法)。消毒皮肤，将5×10⁵细胞悬浮于100μl的PBS中，并皮下注射至每只小鼠的右股外侧。用数字卡尺记录肿瘤大小以监测肿瘤的生长。瘤体积(mm³)以公式(L×H×W)/2估计，其中L为长度，W为宽度，而H是肿瘤的高度(mm)。
通过注射C6神经胶质瘤细胞至大鼠的头颅内产生脑内神经胶质瘤。注射前，将大用戊巴比妥钠(NembutalSodium solution，Abbot实验室，North Chicago，IL；60mg/kg体重)麻醉。做中线头皮切口(0.5-1cm)，牵开皮肤，在颅骨上开1mm钻孔，其位置在brigma的左侧2mm和后方2.5mm。将肿瘤细胞置于胰岛素注射器，使用29-号针头及立体固定装置。将针头垂直插入钻孔，深度为3mm。在脑内注射5×10⁵C6细胞，体积为10μl，针头保持原位15秒而后退出。外科缝合头皮切口。携带皮下前列腺肿瘤的小鼠在皮下植入3×10⁶ PC3人类前列腺细胞后一个月产生。
将MB-49小鼠膀胱肿瘤细胞植入C57小鼠膀胱以产生具有膀胱肿瘤的动物。为产生乳腺肿瘤动物(Tian和DeLeon，待发表)，首先给雌性小鼠皮肤内植入0.72mg/90天-释放的17β-雌二醇弹丸(InnovativeResearch，Rockville，MD)以促使乳腺肿瘤形成和转移。雌激素弹丸植入一天后，在乳腺脂肪垫植入1×10⁶以pro-IGF-II(Dull等，Nature 310(1984)，777-781)转化的MCF-7人乳腺癌细胞。对于同位移植体，将来自植入的细胞的肿瘤切除并切碎为1-mm³立方体，用于移植到乳腺脂肪垫。
(H)在活体动物中分析Renilla萤光素酶。在Renilla萤光素酶分析前将小鼠以戊巴比妥钠(60mg/kg体重)麻醉。静脉注射5μl的腔肠荧光素(0.5g/μl稀释的乙醇溶液)和95μl的萤光素酶分析缓冲液(0.5MNaCl；1mM EDTA；0.1M磷酸钾，pH7.4)的混合物后，测定Renilla萤光素酶活性。对整个动物在暗盒中成像，使用Hamamatsu ARGUS100弱光摄像机，并使用Image Pro Plus 3.1软件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)记录图像。将模拟彩色的光子发射图像叠加到动物的灰度(greyscale)图像上，以便精确定位光发射的位置。
(I)检测发光和荧光。成像前，对小鼠和大鼠进行戊巴比妥钠麻醉(60mg/kg体重)。将动物置于暗盒中进行光子计数并记录叠加图像(ARGUS100，Hamamatsu，Hamamatsu，Japan)。按照动物的腹背方向收集光子1分钟。随后记录光照图像，然后将弱光图像与光照图像叠加以记录发光活性的位置。
使用装备了汞灯光源和GFP滤镜的(激发波长470nm)的LeicaMZ8立体荧光显微镜进行活体动物肿瘤内GFP表达的成像。用SONYDKC-5000 3CCD数码相机捕捉图像。
(J)肿瘤组织的组织学。麻醉后将动物以过量的戊巴比妥钠施以安乐死。切除所需的组织，以Tissue-Tek OCT化合物(Miles Scientific，Naperville，IL)包埋，并立即置于液氮，不固定。-20℃进行冷冻切片，使用Reichert-Jung Cryocut 1800低温保持器。以Leica荧光显微镜监测组织的GFP荧光并以Photoshop软件记录图像。
实施例2：给小鼠静脉注射重组痘苗病毒rVV-ruc-gfp所得的结果
(A)监测免疫缺陷小鼠中病毒介导的标记基因表达
将携带Renilla萤光素酶GFP融合表达盒(rVV-ruc-gfp)的痘苗病毒(1×10⁸pfu)静脉导入无肿瘤的裸鼠。每3天观察动物，为时2周，在静脉注射腔肠荧光素后即可以弱光成像仪监测萤光素酶催化的光发射，并以荧光显微镜观察GFP表达。自外部成像时，动物既无明显的发光也无绿色荧光，除去某些小的皮肤破损部位。在破损愈合后此类发光和荧光信号即消失。病毒感染后1周和2周处死动物，切除其器官以检测发光和GFP荧光信号。病毒注射后1周，在脑、肝、肺、脾脏、肾脏或睾丸未能检测到发光或绿色荧光。这提示rVV-ruc-gfp病毒并无器官特异性，且病毒似乎在经全身输送后被免疫系统迅速自动物体内清除。
(B)活体裸鼠神经胶质瘤中痘苗病毒介导的标记基因表达的显像
测定了注射的痘苗病毒在携带皮下植入的C6神经胶质瘤的裸鼠的分布。裸鼠携带大约为500mm³的肿瘤，给其静脉注射1×10⁸pfu的rVV-ruc-gfp病毒。注射病毒7天后，以荧光显微镜监测动物的GFP的表达以确定肿瘤内是否有病毒的感染和增殖，肿瘤已经长至大约2500mm³令人惊异地，绿色荧光仅出现在活体动物的肿瘤区域。注射病毒7天后，GFP荧光强烈并局限于肿瘤部位呈斑片状(图1A-A″)。这些斑片通常位于血管分支末端，提示病毒局部感染了围绕毛细血管渗漏端的肿瘤细胞。在对同一个肿瘤的实时观察过程中，来自这些斑片中心的GFP信号开始消失，而新的绿色荧光中心开始在消退的斑片周围以环形出现。新的强烈GFP荧光可能是由于在肿瘤生长和扩大过程中，病毒感染在肿瘤内向邻近细胞进展的结果。在仔细检查小鼠后，除了肿瘤部位，在体表或切除的器官中均未见到可检测的绿色荧光。这清楚说明，基于光发射，成熟的实体瘤能够容易地通过标记的痘苗病毒而定位，且其同时证明病毒颗粒对于肿瘤组织的亲和力。
为确定肿瘤的大小以及血管生成是否为病毒停留在肿瘤内的决定性因素，在皮下植入C6细胞后1天，给裸鼠静脉注射1×10⁸rVV-ruc-gfp痘苗病毒颗粒。令人惊异地，病毒注射4天后，GFP见于5-天的C6肿瘤，其瘤体大约为25mm³(图1B-B″)。由于需要大约4天才能产生足够水平的标记基因的表达以满足荧光显微镜检测，因此在活体小鼠中无法通过在小于5天的植入的肿瘤内的GFP表达的显像而测定标记的痘苗病毒对肿瘤的定向。
在宿主的血流中注射rVV-ruc-gfp痘苗病毒可导致GFP表达并聚集于肿瘤部位，这一发现适合用于非创伤性的肿瘤检测，其使得我们能够在同一个动物中实时地跟踪该病毒的进入和复制过程(图1 C-C″，D-D″和E-E″)。在注射病毒后的20天内，发现同一动物内的GFP荧光水平持续增强，20天为计划处死动物的时间。这种增强的可检测的荧光是肿瘤组织中病毒强烈复制的指征，而肿瘤组织似乎是为病毒起着保护性免疫豁免环境的作用。病毒在肿瘤中的复制已经通过检测病毒的滴度和细胞培养中的分离的病毒颗粒的光发射而得到证实。有趣的是，逐渐增大的肿瘤的周边的血管和新生血管的位置可通过在明亮的绿色荧光背景中进行外部显像而发现并证实(图1A-A″，D-D″，E-E″和图2)。
为确定肿瘤中病毒感染的部位，将动物处死并仔细reflect肿瘤上的皮肤以便暴露肿瘤。在暴露的肿瘤中，GFP荧光仅仅集中在肿瘤组织(图3B-B″和D-D″)，非肿瘤的肌肉未显示任何病毒感染的荧光，如图3D-D″中箭头所示。覆盖于肿瘤的皮肤也无荧光(图3B-B″和D-D″中的星号所示)。不过，肿瘤的横断面显示强烈的绿色荧光区域主要为肿瘤周边的斑片(图3C-C″中的双箭头)，推测其可能是活跃分裂的肿瘤细胞的所在。
为进一步基于GFP表达检测C6神经胶质瘤中的病毒感染的模式，将肿瘤组织作切片在荧光显微镜下进行显微镜分析。比较分析各种组织切片发现GFP荧光存在于肿瘤中大群的细胞中(图4)，但在正常组织例如心脏、肺、肝、脾脏和肾脏中未见到荧光。
除了GFP，重组rW-ruc-fp病毒携带一种第二标记基因，其编码Renilla萤光素酶，后者是作为与GFP形成的融合蛋白。因此我们可以直接将肿瘤中的GFP荧光与来自Renilla萤光素酶的光发射叠加。静脉注射腔肠荧光素(Renilla萤光素酶的底物)后，弱光摄像机立即记录到仅出现于肿瘤区域的强萤光素酶活性(图5)。通过降低弱光摄像机的敏感性以避免光检测的饱和，我们可以鉴定Renilla萤光素酶基因表达于肿瘤周边的局部斑片。这些斑片样图案与GFP信号精确相关。
(C)输送至血液中的痘苗病毒对植入动物体内的不同的肿瘤的亲和力
为了确定痘苗病毒是否仅被神经胶质瘤吸引，或者是否这种吸引可见于其他的肿瘤，将重组痘苗病毒以重组方式引入携带不同类型的植入肿瘤的小鼠。这些肿瘤模型之一是植入了皮下PC-3人前列腺癌的裸鼠。尽管PC3植入体的肿瘤与神经胶质瘤相比生长速度很慢，当静脉注射同样的病毒滴度(1×10⁸)，这些肿瘤在痘苗病毒感染方面具有同样的动力学(图6A-A″)。与在神经胶质瘤中的发现相似，最初在注射病毒后4天检测到GFP表达，且在3周的观察期间，荧光持续存在。
也使用了具有乳腺肿瘤的裸鼠进行标记的牛痘注射。在接受用pro-IGF-11cDNA转染的MCF-7人类乳腺癌细胞的植入后，允许这些乳腺肿瘤生长6个月。在注射痘苗病毒时，肿瘤已经达到最大生长，且肿瘤体积(大约400-500mm³)未在实验阶段明显变化。与以前的实验相似，6静脉施用1×10⁸rVV-ruc-gfp病毒颗粒后，在乳腺肿瘤区域观察到强GFP表达(图6B-B″，图7A-A″和B-B″)而在机体的其他部位则没有。
对病毒感染的乳腺肿瘤的横断面进行检测发现，荧光“岛”遍布肿瘤，无任何中心或周边感染的偏向(图7C-C″)。这些乳腺肿瘤模型中所用的MCF-7肿瘤细胞已知其可以转移，且除了原发的实体肿瘤，一种相似的转移肿瘤见于显示GFP荧光的机体的左侧(图7D-D″，E-E″，和F-F″)。也对切除的肺组织进行检测以检查是否有转移。肺表面的转移的肿瘤小至0.5mm直径也对GFP荧光呈阳性(图7G-G″)。存在Renilla萤光素酶介导的光发射证实了该萤光素酶-GFP融合蛋白在乳腺肿瘤中的表达，但当将底物腔肠荧光素静脉注射至活体动物时，在机体其他部位无此种光发射。这些实验显示静脉施用的痘苗病毒颗粒可在裸鼠中选择性聚集于原发以及转移的乳腺肿瘤并在其中复制，似乎是一种肿瘤微环境的免疫缺陷状态的结果。
为确定病毒颗粒是否能够离开肿瘤并重新回到循环中，我们将C6神经胶质瘤细胞注射至小鼠的大腿以便在已经携带感染了标记的痘苗病毒的乳腺肿瘤的动物中形成一种第二肿瘤。如果大量的病毒颗粒被肿瘤释放回循环中，它们将能够定殖于新进植入的神经胶质瘤中。对第二肿瘤的监测发现，在植入神经胶质瘤细胞后7和14天未见到新的神经胶质瘤中出现GFP信号。为确定新植入的神经胶质瘤能够能够成为标记的痘苗病毒的靶，静脉注射了第二剂rVV-ruc-gfp病毒(1×10⁸pfu)。5天后，在已经有GFP表达的原始乳腺肿瘤以外，检测到了在新形成的神经胶质瘤肿瘤中的特异性GFP表达。这说明被感染的肿瘤中的病毒颗粒完全不会释放回循环，或者其释放的量不足以感染第二肿瘤并在其中复制。
另两种肿瘤模型，包括具有颅内C6大鼠神经胶质瘤的Lewis大鼠以及膀胱内有MB-49小鼠膀胱肿的C57小鼠，被用于注射牛痘。为确定病毒颗粒的肿瘤亲和力是否为局限于缺乏T淋巴细胞功能的裸鼠的现象，或者其是否为肿瘤的一种普遍的保护特性因而也存在于具有免疫活性的动物中，使用了具有颅内C6大鼠神经胶质瘤的Lewis大鼠和膀胱内有MB-49小鼠膀胱肿瘤的C57小鼠。将100μl中的总量为5×10⁵的C6神经胶质瘤细胞立体植入4只具有免疫活性的Lewis大鼠中的2只中，且让肿瘤生长5天。另外2只大鼠论注射磷酸缓冲液作为对照。在第6天，通过股静脉给所有4只大鼠静脉注射rVV-ruc-gfp病毒颗粒。注射病毒5天后，4只动物全部处死，仔细切除大脑进行荧光显微镜分析。在植入颅内肿瘤的脑中检测到GFP表达(图6C-C″)，而对照脑中无GFP表达。在平行实验中，有或没有膀胱肿瘤的C57小鼠被分成2组。一组静脉注射rVV-ruc-gfp痘苗病毒(1×10⁸pfu)，另一组注射盐水作为对照。注射病毒5天后，处死动物并以荧光显微镜检测。GFP表达见于C57小鼠的膀胱肿瘤区域，而未见于对照小鼠(图6D-D″)。
总之，实验说明痘苗病毒颗粒选择性聚集并保留在多种肿瘤中，可能是被肿瘤微环境所保护，且其不能在免疫抑制以及具有免疫活性的动物的非肿瘤组织中存活。静脉注射的携带发光双标记基因的痘苗病毒定向于肿瘤的过程证实，痘苗病毒系统能够检测活体动物中的原发的以及转移的肿瘤。
实施例3：将细菌的和哺乳动物的发光细胞静脉注射至小鼠的结果
(A)静脉注射后存在于整个动物中的发光细菌的显像
为确定静脉注射的发光细菌在动物体内的命运，在麻醉下将50μl中的10⁷携带pLITE201质粒的细菌注射至小鼠的左侧股静脉。缝合切口，以弱光成像仪(ARGUS 100 Camera System，Hamamatsu，Hamamatsu，Japan)实时监测小鼠，并收集光子1分钟。成像每隔2天重复一次以确定给定动物是否存在光发射。发现静脉注射细菌至小鼠后的光发射分布图具有所用的细菌菌株的特征。血液内注射减毒的霍乱弧菌引起光发射立即定位于肝脏。而注射鼠伤寒沙门氏菌则广泛播散于动物的全身，提示细菌与宿主细胞系统之间的相互作用存在差别(图8A-8D)。注射后24和48小时同样的动物的成像显示所有可检测的光发射自早期迅速减弱，并自注射的动物中完全消失。这提示自股静脉注射至血液中的发光细菌被清除。这一过程被对切除器官的光子发射分析所证实，这些器官缺乏光发射。在具有免疫活性的小鼠和大鼠中也得到相似的结果，提示两种系统均能有效自血液中清除细菌。
(B)细菌在裸鼠中归巢于神经胶质瘤
为确定细菌是否优选地定殖于肿瘤组织，给右侧后腿具有10天的肿瘤(大约500mm³)的裸鼠通过股静脉注射10⁷鼠伤寒沙门氏菌或10⁷霍乱弧菌的50μl体积的细菌悬液。注射后，缝合切口，以弱光成像仪观察动物6天。在各个观察时间点，准确收集光子1分钟。注射鼠伤寒沙门氏菌的小鼠中，发光细菌自动物的全身较少，与非肿瘤小鼠的情况相似(图9A)。注射霍乱弧菌的裸鼠在观察的早期仅在肝脏区域显示发光活性(图9E)。无论注射何种细菌，注射后2天，发光活性仅见于肿瘤区域(图9B和9F)。注射后4和6天以弱光成像仪监测小鼠，发现注射鼠伤寒沙门氏菌的动物的肿瘤内的可检测发光的量减小(图9C和9D)。这与注射霍乱弧菌的小鼠的肿瘤内的发现形成鲜明对比，后者显示细菌不仅在肿瘤内存活，而且能够增殖，其瘤块具有显著增强的光发射(图9G和9H)。
给右侧后腿携带皮下人类PC3人前列腺肿瘤的裸鼠静脉注射10⁷减毒的单核细胞增生利斯特氏菌，该细菌以携带gfpcDNA的psod-gfp质粒DNA转化。以荧光立体显微镜观察GFP荧光，注射细菌27小时后，GFP信号仅见于肿瘤区域(图10)。动物的其他部位无GFP信号。
(C)确定细菌感染所需的神经胶质瘤的最小体积和时间
本实验的目的是为确定肿瘤的大小是否对细菌的定殖具有任何影响。如上所述，通过皮下注射神经胶质瘤细胞在裸鼠的右侧后腿诱导肿瘤。在诱导肿瘤的第0、2、4、6、8、和10天，通过股静脉注射减毒的鼠伤寒沙门氏菌和具有pLITE201质粒的霍乱弧菌。在注射后2和4天，以弱光成像仪准确收集光子1分钟以确定肿瘤中是否存在发光细菌。以数字卡尺测量尺度以确定肿瘤的体积。诱导肿瘤后第8天是肿瘤中出现发光活性的最早的时间点。相应的肿瘤体积为大约200mm³。
(D)细菌归巢至裸鼠的乳腺肿瘤
为确定细菌在肿瘤中的定殖是否局限于神经胶质瘤细胞，或者是否这是所有肿瘤中均有的普遍现象，给右侧乳垫携带肿瘤的雌性裸鼠静脉注射10⁷霍乱弧菌，为50μl的细菌悬液。接种后的前10分钟，以弱光成像仪监测动物1分钟，并证实肝脏区域的典型的发光图形(图11A)。2天后，尽管肝脏的发光细菌消失，但乳腺肿瘤内出现标记的霍乱弧菌的定殖。除了主要的肿瘤，左侧乳腺的一处转移肿瘤出现发光活性(图11B)。第5天，定殖于动物伤口的细菌已经清除，不过，肿瘤仍然发光(图11C)。图11D显示细菌在主要肿瘤中的持续的定殖和增殖，但转移的、小的肿瘤的细菌被清除。发光活性在右侧乳腺肿瘤持续超过45天。使用大肠杆菌进行了相似的实验，以证实细菌归巢于肿瘤与菌株无关(图s HE和11F)。
为确定来自肿瘤的细菌是否大量进入血循环以定殖于其他部位，在这些动物的右侧后腿诱导了一种第二肿瘤(C6神经胶质瘤)。让该肿瘤生长10天。该神经胶质瘤未出现发光活性，说明缺乏能够引起在肿瘤中定殖的大量细菌。不过，当给该动物再次静脉注射10⁷减毒的霍乱弧菌后，该腿部肿瘤出现强烈的发光活性。
这些实验结果证实，较大的肿瘤可更有效地长时间保留细菌。此外，不会有足够量的肿瘤内的细菌逃逸至血液中去感染其他的敏感部位，例如其他肿瘤。
(E)细菌在具有免疫活性的小鼠中归巢至膀胱肿瘤
给C57小鼠静脉注射10⁷减毒的霍乱弧菌，该细菌已经被编码lux操纵子的pLITE201转化。在输送细菌后第9天，以弱光成像仪收集光子1分钟记录到发光活性。光发射出现于整体动物的膀胱部位(图12A)。处死动物切开腹部以暴露膀胱。这证实发光活性局限于膀胱(图12B)。切除小鼠的膀胱后，在动物的任何部位都不再有可见的发光活性，不过，切除的膀胱持续显示存在光发射(图12C)。基于本实验结果，说明在具有免疫活性的小鼠以及裸鼠中，细菌均能够定向于肿瘤。此外，细菌也能定向于较小的肿瘤。
(F)细菌归巢于大鼠脑部的神经胶质瘤
给患有脑部神经胶质瘤的Lewis大鼠自股静脉注射10⁸减毒的、携带pLITE201质粒的霍乱弧菌，以确定细菌是否能够穿透血脑屏障并在具有免疫活性的动物中定向于肿瘤。次日以弱光成像仪监测整体动物1分钟，自颅骨观察到低水平的发光活性。处死大鼠取出一片脑组织以进一步评价发光细菌的确切定位。切除的脑组织在成像仪下显像，证实脑的特定区域具有强烈的发光活性(图13A)。不具有脑部肿瘤的对照大鼠也注射了标记的细菌，并进行相似的显像，但无任何发光活性(图13B)。
(G)转化的人纤维肉瘤细胞在裸鼠中归巢于皮下神经胶质瘤
给具有人乳腺肿瘤裸鼠静脉注射5×10⁵的人类纤维肉瘤细胞，该细胞用来自pLEIN的逆转录病毒永久转化。注射后7天，将动物以戊巴比妥钠麻醉，置于荧光立体显微镜下监测。通过皮肤，荧光细胞仅见于整体小鼠的肿瘤区域(图14A1-3)。暴露皮肤下的肿瘤组织后(图14B1-3)，以及在肿瘤的横断面(图14C1-3)，在不同区域可见荧光斑片。近距离观察小鼠的器官发现动物的肺部存在小簇状荧光细胞，提示纤维肉瘤细胞除了肿瘤组织还对肺具有亲和力。
实施例4：构建携带编码光发射蛋白质的表达盒的细菌质粒载体和顺式构象的治疗性基因表达构建体
(A)基本原理
采用如上所述的光发射表达系统，可基于光发射，在动物中进行肿瘤成像达45天。这提示在没有筛选的条件下，细菌具有非常高的质粒DNA稳定性。因此，将治疗性基因盒与光发射蛋白质表达盒以顺式构象放置于同一个复制子上，光发射可以作为治疗性构建体的存在和稳定的指示。与光发射蛋白质不同，需要将治疗性蛋白质，内皮抑素和假单胞菌属外毒素/TGF-α融合蛋白，子细菌分泌到培养基肿瘤细胞的细胞质中，以抑制肿瘤生长。为实现将蛋白质自细胞外的复制大肠杆菌细胞分泌到肿瘤内，可设计两种不同的信号序列构建体。为分泌内皮抑素，可将ompF信号序列放置于内皮抑素编码序列的上游，其可促进向细胞间隙的分泌。为将内皮抑素释放至培养基，需要另一种蛋白质，PAS蛋白，与内皮抑素共表达。PAS可引起膜泄漏，并引起分泌蛋白释放至培养基(Tokugawa等，J.Biotechnol.37(1994)，33；Tokugawa等，J.Biotechnol.35(1994)，69)。第二种构建体用于自大肠杆菌分泌假单胞菌属外毒素/TGF-α融合蛋白，其含有OmpA信号序列，位于融合基因的上游，且外毒素的结构域II中的序列可促进自细胞间隙至培养基的分泌(Chaudhary等，PNAS85(1988)，2939；Kondo等，J.Biol.Chem.263(1988)，9470；Kiharaand Pastan，Bioconj.Chem.5(1994)，532)。为促进内皮抑素和假单胞菌属外毒素/TGF-α融合蛋白自单核细胞增生利斯特氏菌的分泌，可将李斯特菌溶胞素(listeriolysin，LLO)的信号序列(Mengaud等，Infect.Immun.56(1988)，766)放置于各个编码序列的上游。
为调节内皮抑素和假单胞菌属外毒素/TGF-α融合蛋白在细菌内的表达水平，可产生一种载体，其中治疗性蛋白质的编码基因置于T7启动子或P_spac合成启动子(Freitag和Jacobs，Infect.Immun.67(1999)，1844)的控制下。在没有外部诱导的情况下，大肠杆菌和单核细胞增生利斯特氏菌内的治疗性蛋白质的水平很低。细菌内的治疗性蛋白质保持最低水平为随后静脉注射该遗传工程化的细菌提供了极大的安全性。随后，描述了构建6个质粒DNA，以用于在大肠杆菌和单核细胞增生利斯特氏菌中组成型或在调控下表达内皮抑素和假单胞菌属外毒素/TGF-α的融合蛋白。所有转移至大肠杆菌的质粒均含有组成型表达的细菌lux操纵子，而所有转移至单核细胞增生利斯特氏菌的质粒均含有组成型表达的sod-gfp盒。质粒s BSPT#1-Esi和BSPT#2-Pti仅能够在大肠杆菌中复制，而质粒sBSPT#3#4，#5，和#6在大肠杆菌和单核细胞增生利斯特氏菌中复制。
(B)构建用于蛋白表达以及自大肠杆菌分泌的质粒载体
如下构建用于大肠杆菌的内皮抑素分泌载体。人内皮抑素的编码序列(591bp)通过PCR自质粒pES3中扩增，在两端引入所需的限制性位点，继而连接入pBluescript(Clontech Corp.，USA)克隆载体以产生pBlue-ES。ompF信号序列(Nagahari等，EMBO J.4(1985)，3589)以Taq聚合酶扩增，并在框内插入至内皮抑素序列的上游，产生pBlue-ompF/ES。将由T7启动子驱动的该表达盒切下，并插入至pLITE201载体，见实施例1(B)，其携带luxCDABE盒，由此产生质粒pLITE-ompF/ES。PAS因子(76氨基酸的多肽)的编码序列将用Taq聚合酶扩增自解藻朊酸弧菌(Vibrio alginolyticus)的DNA(以前称为解毒无色杆菌(Achromobacteriophagus))(NCIB 11038)，引物为5′-GGGAAAGACATGAAACGCTTA3-′和5′-AAACAACGAGTGAATTAGCGCT-3′，并插入至pCR-Blunt(Clontech Corp.，USA)的多克隆位点以产生置于lac启动子控制下的表达盒。得到的质粒称为pCR-PAS。自pCR-PAS切下连接于pas基因的启动子比国内插入至pLITEompF/ES以产生最终的质粒BSPT#1-ESI。
质粒pVC85(Kondo等，1998，J.Bjol.Chem 263.94709475)含有T7启动子，其后为anompA信号序列，以及编码假单胞菌属外毒素(PE40)的结构域II和III的序列。编码PE40的DNA序列将以限制性酶切下并以PE37/TGF-α(假单胞菌属外毒素A280-613/TGF-α)的片段取代，后者得自质粒CT4(Kihara&Pastan，1994，Bioconjug.Chem.5：532-538)，由此产生质粒pVC85-PE37/TGF-α。连接于T7启动子的ompAPE37/TGF-α表达盒将被切下并插入至pLITE201以产生最终的质粒BSPT#2-PTI。
(C)构建用于蛋白表达和自单核细胞增生利斯特氏菌分泌的质粒载体
内皮抑素或PE37/TGF-α的基因将被插入至质粒pCHHI中的李斯特菌溶胞素(LLO)信号序列的下游以产生pCHHI-ES和pCCHI-PE37/TGF-α。将以上的分泌盒连接于得自pCHHI载体的李斯特菌溶胞素启动子以得到治疗性蛋白质的组成型表达。自质粒psod-gfp(Gotz等，PNAS，待发)切下该sod-gfp表达盒，将其插入至pCHHI-ES以产生BSPT#3-Esc，并插入至pCCHI-PE37/TGF-α以产生BSPT#4-PTc。为表达置于IPTG诱导型启动子控制下的治疗性蛋白质，将BSPT#3-ESc和BSPT#4-PTc中的李斯特菌溶胞素启动子以来自质粒pSPAC(Yansura和Henner，PNAS USA81(1984)，439)的P_spac启动子取代，产生BSPT#5-Esi和BSPT#6-Pti。P_spac是一种杂合启动子，由枯草芽孢杆菌噬菌体SPO-1启动子和lac操纵子组成。IPTG-诱导的自P_spac启动子的GFP表达已经在单核细胞增生利斯特氏菌和哺乳动物细胞细胞质中有报道。实施例5：证实萤光素酶和GFP在细菌中的表达并验证内皮抑素和重组毒素/TGF-α和融合蛋白的分泌及其在细胞培养物中的功能
为检测在活体动物的肿瘤组织中存在大肠杆菌和单核细胞增生利斯特氏菌，需要细菌中有足够的组成型表达的萤光素酶和GFP。因此，在用实施例4的构建体转化受体大肠杆菌或单核细胞增生利斯特氏菌后，将选择萤光素酶光发射或GFP荧光最高的克隆。除了在进行静脉注射前对各个选定的克隆的光发射进行表征，还需要确定选定的转化子可将内皮抑素和假单胞菌属外毒素/TGF-α的融合蛋白分泌至培养基。通过自细胞沉淀中提取蛋白质来确定在大肠杆菌和单核细胞增生利斯特氏菌内合成的内皮抑素和假单胞菌属外毒素/TGF-α融合蛋白的存在。培养基中的分泌的蛋白质将被浓缩并以凝胶分离进行分析，并以Western印迹进行定量。必须确定培养基中的大肠杆菌或单核细胞增生利斯特氏菌中各个质粒构建体表达的新合成的蛋白质的百分比。还必须确定的是，除了组成型表达的内皮抑素和假单胞菌属外毒素/TGF-α融合蛋白，还可以通过在培养基中将IPTG添加至细菌培养物，而在大肠杆菌和单核细胞增生利斯特氏菌中诱导表达。为了设计将来的肿瘤治疗方案，需要首先在细菌培养物中比较限定时间段内由组成型表达系统分泌的蛋白相对于诱导型表达水平的相对量。同样重要的是需要确定上述推荐的构建体在大肠杆菌和单核细胞增生利斯特氏菌中产生的两种蛋白质具有生物学活性。两种蛋白质首先在大肠杆菌中合成，并证明是具有活性的。
以下实验结果将证明通过OmpF信号肽和PAS孔形成蛋白的表达，内皮抑素是否能够成功地自大肠杆菌中分泌出来。这些实验还将显示，使用OmpA信号肽和PE的结构域II，是否能够使得PE40/TGF-α和PE37/TGF-α融合蛋白自细菌中分泌出来。此外，李斯特菌溶胞素信号肽也可促进内皮抑素以及嵌合型毒素/TGF-α融合蛋白分泌至培养基，以及分泌至被感染的肿瘤细胞的细胞质中。采用内皮细胞迁移抑制分析，以及蛋白质合成抑制分析，可以预期确定分泌至培养基的两种蛋白质具有生物学活性。这些蛋白的表达和量可通过将组成型启动子以能够被IPTG诱导的启动子取代而进行调节。
除了以下的分泌系统，可供选择的分泌系统例如大肠杆菌HlyBD-依赖型分泌途径(Schlor等，Mol.Gen.Genet.256(1997)，306)也是可用的。来自其他的革兰氏阳性细菌的可供选择的分泌信号，例如芽孢杆菌属的内木聚糖酶(endoxylanase)信号肽(Choi等，Appl.Microbiol.Biotechnol.53(2000)，640；Jeong和Lee，Biotechnol.Bioeng.67(2000)，398)也可使用。
(A)确定内皮抑素和假单胞菌属外毒素/TGF-α融合蛋白自细菌分泌至培养基中
大肠杆菌菌株(DH5α和BL21(DE3)将以BSPT#1-Esi和BSPT#2-PTi质粒DNA进行转化。单核细胞增生利斯特氏菌菌株EGDA2将以质粒sBSPT#3-Esc、BSPT#4-PTc、BSPT#5-Esi和BSPT#6-Pti单独进行转化。在接种于含有适当的抗生素的培养皿后，将自转化混合物中筛选单独的克隆。将使用弱光成像仪和荧光显微镜对这些克隆的萤光素酶和GFP表达分别进行筛选。将自各个转化批次中选择三个光发射最强的克隆作进一步研究。为验证内皮抑素和假单胞外毒素/TGF-α融合蛋白能够自各个选定的转化体中分泌，将细胞在最低培养基中培养以达到对数生长期。将细菌离心，将上清液以0.45-μm孔径滤膜进行过滤，将该无细菌培养基用于沉淀分泌的蛋白质。离心收集沉淀物，将沉淀物洗涤、干燥、并重悬于样品缓冲液中，以便进行凝胶分离。经10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离后，相应于10μl细菌培养物的蛋白样品将与来自200μl的培养物上清液的蛋白质进行比较。将进行Western印迹分析，使用多克隆抗内皮抑素抗体(依照以下抗体制备方法：Timpl，Methods Enzymol.82(1982)，472)和抗TGF-α的单克隆抗体(Oncogene Research Products，Cambridge，MA，USA)。通过在生长的不同时间对生长培养基进行取样以确定用于分泌的最佳的生长条件。相似的方法已经用于分析鼠伤寒沙门氏菌培养物上清液中的分泌蛋白质(Kaniga等，J.Bacteriol.177(1995)，3965)。通过这些方法，将可以确定细菌培养物的培养基中由各个构建体在没有诱导的条件下产生的分泌蛋白的量。为估计培养基中的分泌蛋白质的量的增加，可进行IPTG-依赖型启动子激活实验，其通过将IPTG加入到对数生长期的细菌中达3至6小时，并以上述方法对分泌的蛋白质进行分析。
(B)通过迁移抑制实验验证由大肠杆菌和单核细胞增生利斯特氏菌分泌的内皮抑素的生物学活性
已经发现内皮抑素抑制血管内皮生长因子(VEGF)-诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的迁移。因此，可以通过Cascade Biologics，Portland，OR提供的HUVEC迁移抑制分析来检测由细菌分泌的内皮抑素的生物学活性。细胞迁移的抑制48-孔趋化室(Neuro Probe，Galthersburgs，MD)中进行测试(Polverine等，Methods Enzymol.198(1991)，440)。将来自各个分泌构建体的无细菌上清液添加到HUVEC中，预孵育30min。孵育后，将HUVEC置于上层室中。可通过显微镜分析对由VEGF₁₆₅(R&DSystems，Minneapolis，NIN)诱导的HUVEC向下层的迁移进行定量。培养基中的功能性内皮抑素的浓度与对HUVEC迁移的抑制程度成正比。
(C)测试肿瘤细胞培养物中的分泌的重组PE毒素的细胞毒活性
可基于通过灭活EF-2而抑制蛋白质的从新合成而测定嵌合型毒素对哺乳动物细胞的抑制作用(Carroll和Collier，J.Biol.Chem.262(1987)，8707)。从大肠杆菌和单核细胞增生利斯特氏菌中的各种重组PE分泌构建体的表达得到无细菌上清液样品，将其加入到C6神经胶质瘤细胞或HCTI 16结肠癌细胞中。经培养基处理后，该哺乳动物细胞被施以脉冲量的[³H]-亮氨酸，并测定其在蛋白成分中的整合。为确定单核细胞增生利斯特氏菌感染的哺乳动物细胞中是否存在分泌的嵌合型毒素蛋白，以庆大霉素将该细菌自培养基中清除。将细胞浆中含有单核细胞增生利斯特氏菌的哺乳动物细胞裂解，通过过滤将细菌自裂解物中除去。将采用蛋白合成抑制实验对含有分泌的嵌合型毒素的哺乳动物细胞裂解物进行分析。对肿瘤细胞培养物中[³H]-亮氨酸掺入的抑制将与培养基和细胞裂解物中的具有生物学活性的嵌合型毒素蛋白的量成正比。
实施例6：测定静脉注射的细菌在活体动物的肿瘤中的进入、定位和分布
(A)基本原理
由于仅有一小部分静脉注射的细菌通过进入肿瘤而逃离免疫系统，鉴于活体动物内十分有限的光发射，因此对其进行即刻的定位是不可能的。只能通过将肿瘤切片以鉴定早期的光发射中心而确定其定位。如果稍迟一些看切片，那么由于细菌的快速复制，将看到细菌会遍布整个肿瘤。为确定一或多种细菌是否从同样的部位进入，可使用红色荧光蛋白标记细胞外复制的大肠杆菌，而以绿色荧光蛋白标记细胞内复制的单核细胞增生利斯特氏菌。通过观察红色和绿色荧光在组织切片中的分布，可以单独或同时在肿瘤的中央或外围区域对大肠杆菌和单核细胞增生利斯特氏菌的进入部位及其复制和定殖进行测定。可以预期的是，在植入的肿瘤中的进入和分布模式与自发性肿瘤中的情况是相似的，因此，基于细菌的诊断和蛋白质治疗将成为一种有效的方法。
通过以下(B)部分的描述，发光细菌在自发性肿瘤中的进入、复制以及分布是能够与其在植入的肿瘤中的分布模式进行比较的。此外，双标记实验可使得操作者对细胞内复制的大肠杆菌和细胞外复制的单核细胞增生利斯特氏菌在同一肿瘤切片中进行精确的定位。最后，可以确定(经过5天的细菌定殖后)细菌是否在肿瘤中均匀的分布抑或偏向定位于肿瘤的周边或是坏死中心。由于患有自发性肿瘤的动物具有免疫活性，因此细菌进入自发性肿瘤的机会可能会降低，而这一问题可通过增加静脉注射的细菌的数量而克服。
(B)将表达红色荧光蛋白的大肠杆菌和表达绿色荧光蛋白的单核细胞增生利斯特氏菌静脉注射至具有植入的和自发性肿瘤的裸鼠和啮齿动物
本实验使用了含有置于一种组成型启动子控制下的DsRed(Matz等，Nat.Biotech.17(1999)，969)表达盒的E.coli(DH5α)。将含有各个毒力基因的框内缺失的单核细胞增生利斯特氏菌EGD株衍生物以组成型SOD启动子驱动的绿色荧光蛋白盒的进行单独标记。
首先在具有植入的C6神经胶质瘤或HCT116结肠癌的裸鼠中研究细菌在肿瘤内的分布。将C6神经胶质瘤或HCT116结肠癌细胞(5×10⁵，100μl)皮下注射到动物的右侧后腿。注射肿瘤细胞后12天，将动物麻醉并外科手术暴露左侧股静脉。静脉注射发光细菌(1×10⁶细胞重悬于50μl盐水中)，并外科缝合切口。用卡尺每周3次测量肿瘤。肿瘤体积如下计算：短径x长径x高度/2。
基于GFP或RFP，还将用肿瘤组织的冰冻切片对细菌在肿瘤的定位进行分析。采用一种缓慢的组织冷冻方案后的冰冻切片，可获得可靠的形态学和组织学的保存，并获得可重复的GFP或RFP测定(Shariatmadari等，Biotechniques30(2001)，1282)。简言之，自处死的动物切除肿瘤组织，置于含有PBS的Petri盘中，并切成所需的大小。将样品在含4％多聚甲醛(PFA)的PBS中于室温混合2h。以PBS洗涤，以Tissue-Tek在室温包埋，4℃达24h，然后于-70℃缓慢冷冻。切片前，将组织置于-20℃达30min，然后以Reichert-Jung Cryocut 1800低温保持器切成10-至50-μm厚的切片，并收集于聚-L-赖氨酸(1％)-处理的显微镜玻片上。切片过程中，材料保持于室温以避免多次冷冻和融化。最后，以PBS洗涤切片，在PBS中封片，并避光置于4℃。
为监测光发射大肠杆菌和单核细胞增生利斯特氏菌自血液进入肿瘤，将给27只裸鼠注射C6肿瘤细胞，27只裸鼠注射HCT116结肠癌细胞。肿瘤发生12天后，给C6组中的9只和HCT116组中的9只静脉注射含有RFP构建体的大肠杆菌。每组中的另外9动物静脉注射GFPcDNA构建体转化的单核细胞增生利斯特氏。每种肿瘤模型的其他9只动物则同时接受大肠杆菌和单核细胞增生利斯特氏菌(每种1×10⁶细胞)。在注射后5小时、25小时、和5天，各组取3只动物处死，切除肿瘤，如上进行冷冻切片。随后，每种肿瘤被切成两部分，一半的肿瘤用于制备厚切片(60-75μm)，其将由荧光立体显微镜观察细菌在肿瘤切片中的分布，所述的切片得自不同的实验时间点。对目的区域进行鉴定，制备薄切片，并用激光扫描细胞仪分析并用共聚焦显微镜分析，并进行图象重建。
在平行的实验中，具有自发性肿瘤的动物，入表6所列，将静脉注射含有细菌lux操纵子的大肠杆菌进行实验。每种肿瘤模型均使用2只动物，并每天用弱光成像仪监测萤光素酶的光发射。预期自发性肿瘤与植入的肿瘤具有相似的基于细菌萤光素酶表达的成像。自发性肿瘤模型中的两种，具有结肠腺癌的小鼠和具有乳腺组织腺癌的小鼠，将接受静脉注射的表达RFP的大肠杆菌和表达GFP的单核细胞增生利斯特氏菌，如上所述，以进行细菌定殖实验。可以预期的是，这些实验将强调基于细菌的诊断和蛋白质治疗系统的重要性。
表6.自发性肿瘤动物模型  动物  品系名称    肿瘤    来源  参考文献  小鼠  129/Sv-  Madh3^tmIpar自发性结肠腺癌Jackson实验室Bar Harbor，MEZhu等，Cell 94(1988)，703  小鼠  FVB/N-TgN  (UPII-SV40T)  29Xrw自发性膀胱癌伴肝脏转移Jackson实验室Bar Harbor，MEZhang等，Cancer Res.59(1999)，3512  小鼠  FVB-neuN  (N#202)自发性乳腺癌Jackson实验室Bar Harbor，MEGuy等，PNASUSA 89(1992)，10578  大鼠  F344/CrCrlBR自发性垂体癌Charles River实验室Wilmington，MAHosokawa等，Toxicol.Pathol.21(1993)，283
实施例7：在具有植入或自发性肿瘤的啮齿动物验证细菌介导的肿瘤导向和细菌分泌的蛋白质治疗
(A)基本原理
如上所述，静脉注射发光细菌可引起其仅在动物的肿瘤区域进入、复制和聚集。可通过对肿瘤中的光发射进行成像而对这一过程进行监测。将内皮抑素和嵌合型毒素基因表达盒以顺式构象放置于一种光发射基因盒，由此提供了一种间接的体内检测系统检测其由细菌在时间上和空间上的输送。
将内皮抑素和嵌合型毒素基因盒连接于一种信号肽编码序列，后者促进这些蛋白分泌至肿瘤的细胞外间隙或者进入被感染的肿瘤细胞的细胞浆中。预期由细菌分泌至肿瘤的细胞外间隙的两种蛋白与直接注射纯化的蛋白将发挥相同的功能。两种均自单核细胞增生利斯特氏菌分泌至被感染的肿瘤细胞的细胞浆中，这将与以前报道的病毒性内皮抑素系统相似。该细菌系统可以在肿瘤中用作一种组成型分泌系统或用作一种外来添加的IPTG-激活的分泌系统。通过调控定殖于肿瘤中的细菌内的治疗性蛋白质的表达水平，可以测定抑制肿瘤生长的蛋白质的分泌的量。不加入IPTG，静脉注射的细菌的抑制性蛋白质的分泌将在循环中保持最低。这将在输送细菌的过程中对患有肿瘤的受体动物提供极大的安全性。使用BSPT系统，治疗的开始和过程可以使用IPTG来调节。在完成治疗后，细菌可以用抗生素来清除，与治疗细菌感染相似。
(B)测定由大肠杆菌和单核细胞增生利斯特氏菌分泌的内皮抑素和假单胞菌属外毒素/TGF-α融合蛋白在具有植入肿瘤的动物中对肿瘤生长的影响
大肠杆菌和单核细胞增生利斯特氏菌分泌的内皮抑素的抑制作用和嵌合型毒素的细胞毒作用将乳腺检测。35只具有10天的C6肿瘤的裸鼠将被注射细菌构建体，如下：(a)5中小鼠注射分泌内皮抑素的遗传工程化的大肠杆菌；(b)5只小鼠注射分泌嵌合型毒素的遗传工程化的大肠杆菌；(c)5只小鼠注射遗传工程化的分泌内皮抑素的单核细胞增生利斯特氏菌；(d)5只小鼠注射遗传工程化的分泌嵌合型毒素的单核细胞增生利斯特氏菌；(e)5只小鼠注射分泌内皮抑素和嵌合型毒素的大肠杆菌；(f)对照：5只小鼠注射仅表达细菌萤光素酶的大肠杆菌，5只小鼠注射表达GFP的单核细胞增生利斯特氏菌。注射细菌时，将测定每种肿瘤的体积。注射后3天，通过弱光成像仪或者荧光立体显微镜监测细菌在肿瘤中的复制。每天测量光发射和肿瘤的体积直至注射细菌后20天。注射后10天，处死每组的一只动物并用Western印迹分析肿瘤组织中的分泌蛋白的水平。这些实验可以引起接受内皮抑素处理的动物的肿瘤生长的抑制，或是在接受嵌合型毒素蛋白治疗的动物引起更加明显的肿瘤消退。预期对照动物的肿瘤生长不会受到细菌的影响。
在一个跟踪实验中，使用具有自发性乳腺组织腺癌的小鼠(株系FVB-neuN(N#202)，表6)以研究分泌的蛋白质对肿瘤生长的作用。使用与C6肿瘤分析相同的实验方案。在完成肿瘤治疗时，肿瘤组织中存在的内皮抑素或嵌合型毒素用Western印迹分析确定。使用相同的实验设计分析在C6肿瘤和自发性乳腺肿瘤小鼠模型中IPTG诱导对细菌产生内皮抑素和嵌合型毒素的作用。预期对细菌中蛋白质表达的多次IPTG诱导可能是成功的肿瘤治疗所需的。
在肿瘤治疗的任何阶段，均可能会需要从动物中除去含有发光和治疗基因的细菌。为进行这一实验，对具有12天C6肿瘤的小鼠静脉注射表达细菌萤光素酶的大肠杆菌。注射后3天，通过每日两次腹膜内注射庆大霉素(5mg/kg体重)或者新发现的克林沙星(clinafloxacin)(CL960)(Nichterlein等，Zentralbl.Bakteriol.286(1997)，401)开始抗生素治疗。这一治疗进行5天，通过每天成像来自动物的光发射而监测抗生素对细菌的作用。
通过完成上述实验，预期分泌进肿瘤的内皮抑素和嵌合型毒素蛋白会导致对肿瘤生长的抑制和可测得的肿瘤消退。预期肿瘤消退在具有植入肿瘤和具有自发性肿瘤的啮齿动物组中均会实现。
在肿瘤治疗中同时施用分泌的内皮抑素和嵌合型毒素的实验可能给出最令人鼓舞的结果。通过给予抗生素除去遗传工程化的细菌是本发明的细菌分泌的蛋白质治疗(BSPT)的一个附加安全措施。