杂环衍生物与使用方法.pdf

本发明提供治疗小肠液亏损、百日咳、炭疽病以及与平滑肌受缩相关病症的方法。本发明还提供在活体内和在活体外抑制腺苷酸环化酶的方法。

1.  一种在活体外抑制腺苷酸环化酶的方法，该方法包括让腺苷酸环化酶与含有一定量的含杂环化合物的组合物接触，该化合物能有效抑制由三磷酸腺苷(ATP)产生3′，5′-单磷酸腺苷(cAMP)。

2.  根据权利要求1所述的方法，其中含杂环化合物选自未取代的杂环化合物、联苯基杂环衍生物、前列腺素类似物或它们的组合。

3.  根据权利要求2所述的方法，其中含杂环化合物选自未取代的杂环化合物、联苯基杂环衍生物或它们的组合。

4.  根据权利要求3所述的方法，其中含杂环化合物是未取代的杂环化合物。

5.  根据权利要求4所述的方法，其中未取代的杂环化合物是咪唑。

6.  根据权利要求3所述的方法，其中含杂环化合物是联苯基杂环衍生物。

7.  根据权利要求6所述的方法，其中联苯基杂环衍生物选自如下：


及其组合。

8.  根据权利要求6所述的方法，其中联苯基杂环衍生物是celebrex或DuP-697。

9.  一种在活体内抑制腺苷酸环化酶的方法，该方法包括让含有腺苷酸环化酶的细胞与含有一定量的含杂环化合物的组合物接触，该化合物能有效抑制由(ATP)产生cAMP。

10.  根据权利要求9所述的方法，其中含杂环化合物选自未取代的杂环化合物、联苯基杂环衍生物、前列腺素类似物或它们的组合。

11.  根据权利要求10所述的方法，其中含杂环化合物选自未取代的杂环化合物、联苯基杂环衍生物或它们的组合。

12.  根据权利要求11所述的方法，其中含杂环化合物是未取代的杂环化合物。

13.  根据权利要求12所述的方法，其中未取代的杂环化合物是咪唑。

14.  根据权利要求11所述的方法，其中含杂环化合物是联苯基杂环衍生物。

15.  根据权利要求14所述的方法，其中联苯基杂环衍生物选自如下：


及其组合。

16.  根据权利要求15所述的方法，其中联苯基杂环衍生物是celebrex或DuP-697。

17.  根据权利要求9所述的方法，其中细胞取自受治疗者。

18.  根据权利要求9所述的方法，其中细胞是在受治疗者体内。

19.  一种在活体内抑制腺苷酸环化酶的方法，该方法包括让含有腺苷酸环化酶的细胞与含有一定量的含杂环衍生物的组合物接触，该衍生物能有效抑制由(ATP)产生cAMP，其中该细胞不含有具有ADP-核糖基化活性的病原体多肽，以及其中杂环衍生物选自联苯基杂环衍生物、前列腺素类似物或它们的组合。

20.  根据权利要求19所述的方法，其中杂环衍生物选自如下：



及其组合。

21.  根据权利要求19所述的方法，其中细胞取自受治疗者。

22.  根据权利要求19所述的方法，其中细胞是在受治疗者体内。

23.  根据权利要求19所述的方法，其中该组合物还含有有效量的甲硝基羟乙唑。

24.  一种治疗受治疗者小肠液亏损的方法，该方法包括给患有小肠液亏损或有小肠液亏损发展危险的受治疗者服用一种组合物，该组合物含有有效量的杂环衍生物，该衍生物选自联苯杂环衍生物、前列腺素类似物或它们的组合，其中小肠液亏损与具有ADP-核糖基化活性的病原体多肽没有关系。

25.  根据权利要求24所述的方法，其中杂环衍生物选自如下：



及其组合。

26.  根据权利要求24所述的方法，其中该组合物还含有有效量的甲硝基羟乙唑、消炎痛或它们的组合。

27.  一种在活体内抑制腺苷酸环化酶的方法，该方法包括让含有腺苷酸环化酶的细胞与含有一定量的含杂环化合物的组合物接触，该化合物能有效抑制由(ATP)产生cAMP，其中该细胞含有具有ADP-核糖基化活性的病原体多肽。

28.  根据权利要求27所述的方法，其中含杂环化合物选自未取代的杂环化合物、联苯基杂环衍生物、前列腺素类似物或它们的组合。

29.  根据权利要求28所述的方法，其中含杂环化合物选自未取代的杂环化合物、联苯基杂环衍生物或它们的组合。

30.  根据权利要求29所述的方法，其中含杂环化合物是未取代的杂环化合物。

31.  根据权利要求30所述的方法，其中未取代的杂环化合物是咪唑。

32.  根据权利要求28所述的方法，其中含杂环化合物是联苯基杂环衍生物。

33.  根据权利要求32所述的方法，其中联苯基杂环衍生物选自如下：


及其组合。

34.  根据权利要求27所述的方法，其中含杂环化合物是甲硝基羟乙唑。

35.  一种治疗受治疗者小肠液亏损的方法，该方法包括给患有小肠液亏损或有小肠液亏损发展危险的受治疗者服用一种组合物，该组合物含有有效量的含杂环化合物，其中小肠液亏损与具有ADP-核糖基化活性的病原体多肽没有关系。

36.  根据权利要求35所述的方法，其中含杂环化合物选自未取代的杂环化合物、联苯基杂环衍生物、前列腺素类似物或它们的组合。

37.  根据权利要求36所述的方法，其中含杂环化合物选自未取代的杂环化合物、联苯基杂环衍生物或它们的组合。

38.  根据权利要求37所述的方法，其中含杂环化合物是未取代的杂环化合物。

39.  根据权利要求38所述的方法，其中未取代的杂环化合物是咪唑。

40.  根据权利要求35所述的方法，其中含杂环化合物是联苯基杂环衍生物。

41.  根据权利要求40，其中联苯基杂环衍生物选自如下：


及其组合。

42.  根据权利要求35所述的方法，其中含杂环化合物是甲硝基羟乙唑、消炎痛或它们的组合。

43.  根据权利要求35所述的方法，其中杂环衍生物不是celecoxib。

44.  一种抑制受治疗者平滑肌收缩的方法，该方法包括给患有与平滑肌收缩相关病症或有与平滑肌收缩相关病症发展危险的受治疗者服用一种组合物，该组合物含有有效量的含杂环衍生物，该杂环衍生物选自联苯基杂环衍生物、前列腺素类似物或它们的组合。

45.  根据权利要求44，其中杂环衍生物选自如下：



及其组合。

46.  根据权利要求44所述的方法，其中该组合物还含有有效量的甲硝基羟乙唑、消炎痛或它们的组合。

47.  一种治疗受治疗者百日咳的方法，该方法包括给患有百日咳或有百日咳发展危险的受治疗者服用一种组合物，该组合物含有有效量的含杂环化合物。

48.  根据权利要求47所述的方法，其中含杂环化合物选自未取代的杂环化合物、联苯基杂环衍生物、前列腺素类似物或它们的组合。

49.  根据权利要求48所述的方法，其中含杂环化合物选自未取代的杂环化合物、联苯基杂环衍生物或它们的组合。

50.  根据权利要求49所述的方法，其中含杂环化合物是未取代的杂环化合物。

51.  根据权利要求50所述的方法，其中未取代的杂环化合物是咪唑。

52.  根据权利要求48所述的方法，其中含杂环化合物是联苯基杂环衍生物。

53.  根据权利要求52，其中联苯基杂环衍生物选自如下：


及其组合。

54.  根据权利要求47所述的方法，其中含杂环化合物是甲硝基羟乙唑、消炎痛或它们的组合。

55.  一种治疗受治疗者炭疽病的方法，该方法包括给患有炭疽病或有炭疽病发展危险的受治疗者服用一种组合物，该组合物含有有效量的含杂环化合物。

56.  根据权利要求55所述的方法，其中含杂环化合物选自未取代的杂环化合物、联苯基杂环衍生物、前列腺素类似物或它们的组合。

57.  根据权利要求56所述的方法，其中含杂环化合物选自未取代的杂环化合物、联苯基杂环衍生物或它们的组合。

58.  根据权利要求57所述的方法，其中含杂环化合物是未取代的杂环化合物。

59.  根据权利要求58所述的方法，其中未取代的杂环化合物是咪唑。

60.  根据权利要求55所述的方法，其中含杂环化合物是联苯基杂环衍生物。

61.  根据权利要求60，其中联苯基杂环衍生物选自如下：


及其组合。

62.  根据权利要求55所述的方法，其中含杂环化合物是甲硝基羟乙唑、消炎痛或它们的组合。

杂环衍生物与使用方法
继续申请的日期
该申请要求保护2000年6月8日提出的美国临时申请序号60/210412的利益。
政府基金
本发明得到美国政府的支持，由国家变态反应和感染疾病研究所(NIAID)授予的拨款号2 R01 AI 21463，由NIAID授予的拨款号2 R01AI 18401，由国家环境卫生科学研究所(NIEHS)授予的拨款号ES06676；以及由NIEHS授予的拨款号R01 ES06839。政府对本发明拥有一些权利。
背景技术
人体与非人动物体内腹泻疾病可能由几类病原体引起，其中包括病毒、细菌、寄生虫和轮状病毒。最流行的是大肠杆菌和霍乱弧菌。腹泻疾病是在欠发达国家中发病率和死亡率的普遍病因。这些疾病也折磨着发达国家中的人们。例如，在美国每年有200 000多个5岁或更小的儿童因急性腹泻疾病而住院。传染性腹泻在全世界是发病率和死亡率的主要原因，在美国也是很普遍一类的疾病。
由于腹泻起因很多，对于同一个人可能发生急性传染性腹泻一次以上，因此与典型地出现一次的大多数慢性病症不一样。与其它消化性疾病不一样，传染性腹泻是通过人与人接触传染的，或通过污染的食品或水传染的，并通过家庭、学校、日间托儿中心、疗养院和社区呈地域性地传播或传染。腹泻疾病对农业生产中饲养的动物，特别是牛犊和猪也是严峻的问题。
发明的简要说明
本发明在治疗受治疗者小肠液亏损技术中是超前的。本发明提供一种治疗受治疗者小肠液亏损的方法。该方法包括给患有小肠液亏损或有小肠液亏损发展危险的受治疗者服用一种组合物，该组合物含有有效量的含杂环化合物如杂环衍生物，像联苯杂环衍生物、前列腺素类似物或它们的组合。在本发明这个方面的某些具体实施方案中，小肠液亏损与具有ADP-核糖基化活性的病原体多肽不相关，而在另一方面，小肠液亏损与具有ADP-核糖基化活性的病原体多肽有关系。
本发明在抑制腺苷酸环化酶技术里是超前的。该化合物抑制腺苷酸环化酶的能力是令人惊奇的和出乎意外的，因为曾设计某些化合物专用于与环加氧酶1或环加氧酶2的活性位点进行反应。本发明提供一种在活体外抑制腺苷酸环化酶的方法。该方法包括让腺苷酸环化酶与一种含有一定量含杂环化合物的组合物接触，该化合物能有效抑制由三磷酸腺苷(ATP)产生3′，5′-单磷酸腺苷(cAMP)。腺苷酸环化酶可以是在活体内，在这种情况下，该方法包括让含有腺苷酸环化酶的细胞与该组合物接触。在某些具体实施方案中，这种细胞并不含有具有ADP-核糖基化活性的病原体多肽。在这些具体实施方案中，含杂环的化合物优选地是联苯基杂环衍生物、前列腺素类似物或它们的组合。在其它具体实施方案中，该细胞含有具有ADP-核糖基化活性的病原体多肽。
本发明也提供一种抑制受治疗者平滑肌收缩的方法。该方法包括让患有与平滑肌收缩相关的病症或有与平滑肌收缩相关的病症发展危险的受治疗者服用一种组合物，该组合物含有有效量的杂环衍生物，例如联苯基杂环衍生物，前列腺素类似物或它们的组合。
本发明还提供一种治疗患百日咳病人的方法，其中包括让患有百日咳或有百日咳发展危险的受治疗者服用一种组合物，该组合物含有有效量的含杂环化合物。
本发明还提供一种治疗患炭疽病病人的方法，其中包括让患有炭疽病或有炭疽病发展危险的受治疗者，服用一种组合物，该组合物含有有效量的含杂环化合物。
除非特别指出，不定冠词“一”、定冠词“该”和“至少一个”可互换使用，意指一个或一个以上。
附图简要说明
图1.与对照小鼠相比，组氨酸对由霍乱毒素(1微克)引起小肠液在小鼠肠袢中积累的抑制作用。垂直线条表示在算术平均值上下的标准误差。星号表示如由Dunnett′s Multiple Group Comparison检验确定的显著性差异(P＜0.05)。在每个线条上标出每组鼠的数量。CT对照，小鼠只接受霍乱毒素(CT)；CT+L-his(0.93毫克)，小鼠接受CT和0.93毫克L-组氨酸；CT+L-his(0.37毫克)，小鼠接受CT和3.7毫克L-组氨酸；CT+L-his(14.8毫克)，小鼠接受CT和14.8毫克L-组氨酸。
图2.在Ussing室中I_sc的标准化值。对照，该组织在两侧用氯化钠溶液冲洗；PGE₂，往基底外侧溶液添加1微摩尔PGE₂，该溶液刺激Na⁺传输，增加稳态短路电流(I_sc)达14％(诱导最大PGE₂的I_sc变化是18±3％，p＜0.01)；PGE₂+L-组氨酸，1微摩尔PGE₂+10毫摩尔L-组氨酸溶液在37℃培养30分钟，然后加到基底外侧(I_sc降低到30±9％对照)；差，PGE₂与PGE₂+L-组氨酸的差，它是78±21％(p＜0.025)；I_sc(微安/厘米²)，短路电流(每平方厘米微安培)。
图3.板A。PGE₂与PGE₂加合物的C-18反-相分离。板B。[³H]-PGE₂和咪唑的C-18反-相色谱。Imi，咪唑；PGE₂-IMI和PGE₂-Imi，PGE₂-咪唑。
图4.使用纯化的PGE₂-咪唑共价加合物抑制CT-诱导cAMP生成。垂直线条表示由用cAMPELISA复制时分析典型实验得到的三份相同样品平均值的标准偏差。星号表示由Dunnett′s Multiple GroupComparison检验确定的统计显著性差异(P＜0.05)。cAMP(微微摩尔)，微微摩尔环AMP；CT，霍乱毒素；PGE₂-Imi，PGE₂-咪唑。
图5.使用PGE₂-咪唑加合物降低CT-诱导的小肠液在鼠肠袢中的积累。在用CT(1微克/环)激发的时间里，PGE₂-咪唑加合物滴入扎结肠袢。在横轴上列出往每个袢注入纯化的PGE₂-咪唑量。板A-在标准6小时培养期后鼠进行尸体剖检，测量积累的小肠液。垂直线条表示由每组5-8鼠得到的在算术平均值上下的标准偏差。星号表示如由Dunnett′s Multiple Group Comparison检验确定的显著性差异(P＜0.05)。板-B-采用cAMPELISA分析在板A鼠的小肠液和负袢PBS洗液中的环AMP水平。垂直线条表示由每组5-8鼠得到地在算术平均值上下的标准偏差。
图6.PGE₂-(4.7毫摩尔)与181毫摩尔组氨酸混合时，PGE₂-组氨酸共价加合物的生成。在37℃(pH7.0)在N₂下培养直到24小时后，使用26％乙腈和0.1％TFA洗脱，采用C-18反相柱色谱分离反应混合物。测定在每个时限里在12.5分钟内移动的PGE₂-组氨酸峰(190纳nm)面积。
图7.PGE₂-组氨酸加合物的稳定性。小的峰I，来自图3A的峰I。
图8.实验对象A。PGE₂-组氨酸加合物在m/z403处由假-分子离子得到的电喷雾-MS/MS子离子谱。实验对象B。甲基酯化的PGE₂-咪唑(¹⁵N)加合物在m/z419处由假-分子离子得到的电喷雾-MS/MS子离子谱。
图9.(A)一维质子核磁共振(¹H NMR)谱，(B)二维总校正光谱法(2DTOCSY)谱，以及(C)在600MHz在D₂O中PGE₂-咪唑(¹⁵N)加合物的2D¹⁵N-标记质子异核多带相干光谱法(¹⁵N/¹H HMBC谱)，在(C)中，F1是¹⁵N二维，而F2是¹H二维。
图10.(A)提出的PGE₂-咪唑加合物生成机制，(B)PGB₂和PGB₂-咪唑加合物的结构。
图11.Celecoxib降低CT-诱导小肠液在鼠肠袢中积累。CT，霍乱毒素；CT+袢中celecoxib，用霍乱毒素和两份80微克剂量的celecoxib(一份在用CT激发时注入肠腔，两小时后腹膜内第二次注射)；CT+只是celecoxib IP，用霍乱毒素和两份80微克剂量的celecoxib(一份在用CT激发时注入腹膜内，两小时后腹膜内第二次注射)。垂直线条表示平均值上下的标准偏差。星号表示如采用Tukey检验确定的与正对照的显著性差异(P＜0.05)。
图12.咪唑(2.7毫摩尔)、PGE₂-组氨酸加合物(52微摩尔)和celecoxib(0.52微摩尔)对酶腺苷酸环化酶(4.6纳摩尔)的影响。空白没有任何酶和抑制剂，而酶(E)仅有酶，无任何抑制剂。含有特定抑制剂的酶表示为E+咪唑，E+PGE₂-氨组酸和E+celecoxib。如采用Student检验确定的，与对照值(E)的显著性差异可用*P≤0.05和*P≤0.001表示。
图13.小肠液的霍乱毒素积累激发用COX-1抑制剂SC-560处理的鼠肠扎结袢。N，动物数；CT1微克/袢，每个袢加1微克霍乱毒素；CT+9Nm sc-560，每个袢加1微摩尔霍乱毒素和9纳摩尔SC-560。星号表示如采用Tukey检验确定的与正对照的显著性差异(P＜0.05)。
图14.腺苷酸环化酶的PGE₂-组氨酸加合物IC₅₀。
图15.腺苷酸环化酶的celecoxib IC₅₀。
图16.腺苷酸环化酶的咪唑加合物IC₅₀。
本发明优选具体实施方案的详细描述
本发明提供涉及使用组合物的方法，该组合物含有一种含杂环化合物，特别地杂环衍生物。如本文所使用的“含杂环”化合物包括未取代的杂环化合物(优选地，咪唑、吡唑、噻吩以及呋喃)，更优选地，咪唑以及它们的衍生物。如本文所使用的“含杂环化合物”是包含杂环结构的化合物，其中5个原子构成封闭环，并且5元环中至少一元是杂原子。该杂原子优选地是氮、氧或硫。优选地，含杂环化合物是一种“杂环衍生物”，它包含5-元芯的杂环，有至少一个环取代基。形成杂环衍生物芯结构的含杂环化合物实例包括咪唑、、吡唑、噻吩以及呋喃。
优选地，使用至少一个非稠环结构，优选地，非稠5-或6-元环取代杂环衍生物，这些环可以选择性地被进一步取代。这种环结构可以与该芯杂环中的杂原子键合或不键合。该芯杂环可以选择性地用非环取代基取代。这样的取代基包括卤素原子(优选地溴)，(C1-C4)烷基(优选地，甲基)，全氟化(C1-C4)烷基(优选地，CF₃)，羰基，N₂O，(C1-C4)烷氧基(优选地，OCH₃)，羟基取代(C1-C4)烷基(优选地，CH₂CH₂OH)，羧酸取代(C1-C4)烷基(优选地，CH₂COOH)，和CH₂CH(NH₂)COOH。
如果在杂环衍生物中有取代的5-或6-元环，则可用卤素原子(优选地氟或氯)、(C1-C4)烷氧基(优选地，OCH₃)，(C1-C4)烷基(优选地，甲基)，饱和或未饱和的(C1-C10)烷基取代，选择性地用羟基，羰基，和/或羧酸，或下述基团取代：

与该芯杂环键合的优选环结构是如下结构：

对于本发明某些优选的方法，环结构是前列腺素。这样的杂环衍生物在本文称之“前列腺素类似物”。对于本发明某些其它的优选方法，该环结构是取代或未取代的苯环。对于特别优选的方法，杂环衍生物有两个苯环，它们可以被取代或不被取代。这样的杂环衍生物在本文称之“联苯杂环”衍生物。优选地，取代或未取代的苯环是非稠环。同样地，在本发明的某些方面，联苯基杂环不包括消炎痛，它具有下述结构：

联苯基杂环衍生物的优选实例包括下述衍生物：

式中R¹是全氟化(C1-C4)烷基(优选地，CF₃)或H；R²和R³每个各自是卤素原子(优选地氟或氯)、(C1-C4)烷氧基(优选地，-OCH₃)，(C1-C4)烷基(优选地，甲基)，H，或

式中R⁴和R⁵每个各自是H，或


式中R⁶是卤素原子(优选地，溴)或H；以及R⁷和R⁸每个各自是卤素原子(优选地，F)，H，或

式中R⁹和R¹⁰每个各自是饱和或未饱和的(C1-C10)烷基，选择性地用羟基、羰基和/或羧酸取代的饱和或未饱和的(C1-C10)烷基。
优选地，R⁹是下述基团：

R¹⁰是下述基团：

联苯基杂环的更优选实例包括：
rofecoxib(由纽约，whitehouse station，Merck & Co.，以商品名VIOXX获得的产品)，它具有下述的结构：

celecoxib(由伊利诺斯州，斯科基，Searle & Co.，以商品名CELEBREX获得的产品)，它具有下述的结构：

一种由密执安州，安阿伯，Cayman Chemical Co.，以商品名SC-560获得的化合物，它具有下述的结构：

以及一种由Cayman Chemical Co.，以商品名DuP-697获得的化合物，它具有下述的结构：

作为本文使用的术语“前列腺素类似物”，它系指一类除了芯5-元杂环外还有前列腺素的杂环衍生物。作为本文使用的术语“前列腺素”，它是20-碳脂肪酸，典型地由花生四烯酸得到的20-碳脂肪酸。优选地，前列腺素是PGE₂，它具有下述的结构：

前列腺素是PGE₂时，优选地该杂环与前列腺素的C11共价结合。前列腺素类似物的优选实例包括前列腺素E2-咪唑(PGE₂-咪唑)加合物，它具有下述的结构：

以及列腺素E2-组氨酸(PGE₂-组氨酸)加合物，它具有下述的结构：

在与前列腺素共价结合的这种杂环存在下，通过培养前列腺素可以生产出本发明的前列腺素类似物。优选地，使用的前列腺素是PGE₂、PGA₂或PGB₂。由密苏里州，圣路易斯，Sigma Chemical Co.可以得到前列腺素。培养条件优选地包括温度约25-40℃，更优选地约37℃。混合物的pH优选地是约6.5以上，更优选地约pH7.4。任选地，该混合物可以含有缓冲液，将pH保持在所希望的值。这种培养优选地进行约1小时至约24小时，更优选地约24小时。由于在氧存在下前列腺素有被氧化的趋势，所以优选地在例如氮气的惰性气体存在下前列腺素与该杂环之间进行反应。优选地，当加到前列腺素的杂环是组氨酸时，使用L-组氨酸。采用该技术领域中已知的方法，其中包括例如质谱和核磁共振(NMR)可以确定前列腺素类似物的结构。
本发明方法中使用的组合物还可以含有药用载体。典型地，如下面“使用方法中”描述的，使用该组合物时，该组合物包括药用载体。本发明组合物可以配制成适合所选择服用方法的各种形式的药物制剂。配方包括适合口服、直肠、阴道、肠内、肌肉内、腹膜内、鼻内、静脉内、子宫颈或子宫植入的、经粘膜、经皮用的或其组合使用的配方。这里描述该化合物的日剂量典型地是约1毫克/千克，直到约10毫克/千克。
这些配方通常为单位剂量形式，采用药剂学技术领域中熟知的方法可以制备这些配方。所有制备药物组合物的方法包括将活性组分(例如杂环衍生物)与载体放在一起的步骤，该载体是一种或多种补充组分。一般地，将活性化合物与液体载体、细粒固体载体或这两者充分均匀地混在一起制备配方，然后如果必要的话，使产品成型成合乎需要的配方。
典型地，本发明的组合物可以每天服用约1-5次。可以与载体材料组合以生产单次用药量形式的活性组分的量将随受治疗者与特别的服用方式而改变。典型的制剂含有约5-95％活性化合物(重量/重量)。优选地，这样的制剂含有约20-80％活性化合物。在这样治疗使用的组合物中含有杂环化合物的量是这样的，用药量水平对于防止或抑制受治疗者有这种病症或有这种病症危险应是有效的。
适合于肠胃道用药的配方通常包括无菌的组合物水制剂或无菌粉剂分散液，它们与接受者的血液优选地是等渗的。可以在液体制剂中含有的等渗剂，它包括糖、缓冲液和氯化钠。可以制备该组合物水溶液，并且任选地与无毒性的表面活性剂混合。可以制备在水、乙醇、多元醇(例如乙二醇、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、乙二醇酯及其混合物中的分散液。最终的用药量形式是无菌流体，在生产与储存条件下是稳定的。例如使用脂质体，在分散液的情况下使用适当的粒度或使用表面活性剂可以达到必需的流动性。采用任何能够保持组合物生物活性的一般方法，优选地采用过滤器灭菌，可以达到液体制剂灭菌。制备粉剂的优选方法包括真空干燥和无菌注射液的冷冻干燥。使用各种杀菌剂，例如杀细菌、杀病毒和杀真菌剂，其中包括对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等，都可以防止后续的微生物污染。含有缓释剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以达到动物长期吸收这种组合物。
适合口服的本发明配方可以呈分立单位，例如片剂、锭剂、胶囊、糖锭、囊剂或扁囊剂，每种含有预定量的活性化合物，这些化合物呈粉状或颗粒状、呈含有有杂环化合物的脂质体形式，或呈在含水液体或非含水液体中溶液或悬液形式，例如糖浆、酏剂、乳剂或饮剂。
片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可以含有一种或多种下述物质：粘结剂如黄耆胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂如磷酸二钙；崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂如硬脂酸镁；甜味剂如蔗糖、果糖、乳糖或天冬酰苯丙氨酸甲酯；以及天然或人工调味剂。单元用药量形式是胶囊时，它还可以含有液体载体，例如植物油或聚乙二醇。各种其它材料可以涂层存在，或以别的形式改性固体单元用药量形式的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以涂布明胶、蜡、虫胶或糖等。糖浆或酏剂可以含有一种或多种甜味剂、防腐剂如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、延迟糖结晶的试剂、提高任何其它组分溶解度的试剂如多元醇，例如甘油或山梨糖醇、染料和调味剂。在制备任何单元用药量形式时使用的材料在使用量方面是基本无毒性的。含杂环化合物可以加入到缓释制剂和组合中。
本文描述的含杂环化合物可以直接加入受治疗者所吃的食物里，像添加剂，增补剂等。任何食物都适合于这个目的，尽管已经用作营养增补或营养强化源的加工食物，例如面包、谷类食品、乳等，可能是比较方便用于这种目的的。
使用方法
本发明还涉及受治疗者的某些病症以及各种活体外的治疗方法。病症包括例如小肠液亏损、百日咳、炭疽病和平滑肌收缩，这里更详细地描述这些病症。这些方法包括受治疗者服用一种组合物，该组合物含有有杂环化合物，而受治疗者有其中一种病症正在发展或已发展的危险。如本文使用的术语“受治疗者”包括人，农业上重要的动物如牛、猪、家禽、羊和马以及其它动物(例如小鼠、老鼠、狗、猫和兔)，它们可以用作研究本文所述病症的动物模型。
治疗本文所述病症可以是预防性的，或另外可以在本文所述病症发展后开始治疗。预防性治疗，例如在受治疗者表现出本文所述病症的症状之前和/或在暴露于与本文所述一种病症相关的病原体(即由其引起的)之前，这种治疗在本文称之有发展这种病症危险的受治疗者的治疗。因此，在本文所述病症出现之前、期间或之后，可以服用组合物。在病症发展后开始治疗可以减轻其中一种病症的症状严重性，或完全消除这些症状。特别适合于接受该组合物的治疗者非限制性实例是接受抗生素治疗的那些治疗者，特别是中年以上的和非常年轻的治疗者，优选地与抗生素相关结肠炎的有关抗生素治疗，那些旅行到引起小肠液亏损的病原体的地方(例如，可能感染Traveler腹泻的那些地方)的治疗者，以及受HIV感染的那些治疗者。
患有本文所述病症或有本文所述病症发展危险的受治疗者服用的组合物包括有效量的含杂环化合物，优选地，杂环衍生物，在某些具体实施方案中，联苯-取代的杂环衍生物和/或前列腺素类似物。本文所使用的“有效量”是有效降低或防止(对于预防治疗)受治疗者与本文所述病症相关的症状的量。
本发明的一个方面涉及治疗受治疗者小肠液亏损的方法。本文所使用的“小肠液亏损”系指各类腹泻(即能形成大便的正常个体相比，粪便排泻频率和/或粪便排泻的流动性增加)。小肠液亏损可能由例如从肠细胞到肠管腔的小肠液分泌(例如水和/或电解质)增加，从肠管腔吸收水和/或电解质减少，和/或血液和粘液移动到肠管腔造成的。小肠液亏损通常与病原体存在相关，尽管具有高渗透压性的食物可能引出过量分泌水和电解质。这种情况与先天性肠炎疾病相反，这种疾病包括Crohn疾病和溃疡性结肠炎。后一种慢性病与任何特别的感染因素无关，是由结肠和肠道其它部位的无法控制的炎症所造成的。
引起小肠液亏损的病原体包括在肠管腔存在的病原体(例如霍乱弧菌)或在肠细胞存在的病原体(例如，志贺菌属)，以及可能不是在肠管腔和肠细胞中的病原体(HIV)。病原体实例包括病毒、寄生虫和细菌(例如参见Cotran等人《疾病的罗宾斯病理基础》(RobbinsPathologic Basis of Disease)，第5版，W.B.Sanders Co.费城，第328-335页(1994))。由病原体引起的小肠液亏损在该技术领域中是指许多途径，其中包括例如腹泻、痢疾、Travelers腹泻和腹泻(scours)(在小牛中)。
与小肠液亏损相关的病毒包括肠的病毒(例如，轮状病毒、肠的腺病毒和Norwalk-状病毒)以及HIV。肠病毒典型地侵入和破坏中上绒毛的成熟宿主上皮细胞，这样由于从肠管腔吸收钠和水减少而引起小肠液亏损。HIV感染常常造成小肠液亏损。典型地，小肠液亏损与一种病原体存在相关，因免疫受到抑制，受治疗者不能从肠道清除这种病原体。在受到HIV感染的受治疗者体内，与小肠液亏损相关的病原体包括隐孢子虫属、贝氏等孢子球虫、沙门氏菌属、大肠杆菌、空肠弯曲杆菌和志贺菌属。与小肠液亏损相关的寄生虫包括溶组织内阿米巴、结肠内阿米巴、隐孢子虫属和兰伯贾第虫。
与小肠液亏损相关的细菌包括空肠弯曲杆菌、耶尔森氏菌属(其中包括小肠结肠炎耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌)、志贺菌属(其中包括志贺痢疾杆菌、弗氏志贺菌、波伊德志贺菌和宋内志贺菌)、沙门氏菌属(其中包括例如鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌)、艰难梭状芽孢杆菌、致肠病的大肠杆菌(EPEC)、enterohemmorhagic大肠杆菌(EHEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)和肠产毒性大肠杆菌(ETEC)和霍乱弧菌。
与小肠液亏损相关的病原体可以分成两组，一组为通过产生多肽造成小肠液亏损，而多肽可引起G_sα的ADP-核糖基化作用(在肠细胞中有49kDa多肽G蛋白质)，另一组造成小肠液亏损，但产生具有ADP-核糖基化作用活性的多肽。如本文使用的术语“多肽”，是指一种氨基酸聚合物，不是指特定长度的氨基酸聚合物。因此，例如，在多肽定义中包括术语肽、低聚肽、蛋白质、酶和毒素。“病原体多肽”是由病原体产生的多肽。如本文使用的术语“ADP-核糖基化作用”，是指二磷酸腺苷核糖(ADP核糖)与G_sα的氨基酸的共价加合物。催化这种加合物的多肽具有“ADP-核糖基化作用活性”。
产生具有ADP-核糖基化作用活性的多肽的病原体包括ETEC菌株，这些菌株产生对热不稳定的肠毒素和霍乱弧菌。该多肽在该技术领域中典型地称之“肠毒素”。由霍乱弧菌产生的肠毒素常常称之“霍乱毒素”。往病原菌生长的介质里分泌具有ADP-核糖基化作用活性的病原体多肽。
可以通过在缓冲液存在下，分析ADP-核糖从尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸转移到精氨酸氨基酸来测定多肽的ADP-核糖基化活性(例如参见Lai等人《Biochem.Biophys.Res.Commun.》，102，1021-1027(1981))。优选地，ADP-核糖基化活性的待试验多肽的浓度是约1-10微摩尔。优选地，该缓冲液含有约0.1摩尔4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)缓冲液，约pH7.0，约0-20％乙二醇，约0-50毫摩尔dithiohthreitol(DTE)，约300微克多精氨酸以及41.4毫摩尔含有约10微居里[¹⁴C]NAD⁺的NAD⁺。典型地，在约24℃培养该分析物约1-60分钟。可加入冷的10％三氯乙酸(TCA)停止反应，多精氨酸沉淀，接着在微纤维过滤器上用冷的10％TCA洗涤。用闪烁法测量结合的[¹⁴C]NAD⁺-核糖基化多精氨酸的放射性。在这种沉淀中的¹⁴C水平高于在负对照沉淀中的¹⁴C水平，表明多肽具有ADP-核糖基化作用活性。以每分钟计数(cpm)的¹⁴C水平应随肠毒素而改变。典型分析表明，0.2微摩尔霍乱毒素有500cpm，而1.3微摩尔应有14000cpm。使用分离的多肽或使用在培养物上清液中存在的多肽，都可以采用这种分析方法。“分离”的多肽是指从其自然环境获得的或采用化学或酶方法合成的多肽。可以使用的正对照样品包括表达霍乱毒素的霍乱弧菌培养上清液或表达肠毒素的大肠杆菌的培养上清液。
由细菌引起的另一类小肠液亏损在本技术领域中常常称之与抗生素相关的结肠炎或假膜结肠炎。受治疗者在接受广谱抗生素治疗后通常会出现这种情况，主要在急性或慢性小肠液亏损的成人上出现这种情况。未接受抗生素治疗的受治疗者，例如在外科手术后或除慢性虚弱疾病外，很少出现这种病症(参见例如Cotran等人，《疾病的罗宾斯病理基础》，第5版，W.B.Sanders Co.费城，第795页(1994))。与抗生素相关的结肠炎典型地是由杀艰梭状芽孢杆菌(clostridiumdifficile)引起的，尽管其它的细菌也可以引起这种疾病。
在本发明的某些方面，当小肠液亏损与具有ADP-核糖基化作用活性的病原体多肽无关联(例如小肠液亏损与抗生素治疗、受治疗者年龄和/或例如被病毒、细菌、寄生虫或其组合感染相关)时，在组合物中有含杂环化合物是联苯基杂环衍生物、前列腺素类似物或它们的组合。在本发明这个方面种可以使用的联苯基杂环实例包括celecoxib，rofecoxib、SC-560和DuP-697。在本发明这个方面种可以使用的前列腺素类似物包括PGE₂-组氨酸和PGE₂-咪唑。任选地，除了这些杂环衍生物外，该组合物可以含有有效量的甲硝基羟乙唑(由Searly and Co.以商品名FLAGYL获得)和/或有效量的消炎痛(从Merck & Co.以商品名INDOCIN获得)。这两者之中，硝基羟乙唑是优选的。
在本发明另一个方面，当小肠液亏损与具有ADP-核糖基化作用活性的病原体多肽相关(例如小肠液亏损与霍乱弧菌、ETEC或其组合相关)时，在组合物中有含杂环化合物优选地是未取代的杂环化合物(例如咪唑)、联苯基杂环衍生物，前列腺素类似物或它们的组合。更优选地，在组合物中有含杂环化合物可以是未取代的杂环化合物(例如咪唑)、联苯基杂环衍生物、或它们的组合。在本发明这个方面种可以使用的联苯基杂环实例包括rofecoxib、SC-560、DuP-697，在某些具体实施方案中，celecoxib。优选地，对这种方法该组合物不含有celecoxib。在本发明这个方面种可以使用的前列腺素类似物实例包括PGE₂-咪唑和PGE₂-组氨酸。在这种方法中适用的组合物含有有效量的甲硝基羟乙唑和/或有效量的消炎痛。这两者之中，硝基羟乙唑是优选的。
本发明还涉及一种治疗者中百日咳的治疗方法。百日咳是一种由百日咳博代氏杆菌引起的呼吸道疾病。在接触百日咳博代氏杆菌后，呼吸道细胞就增加了cAMP水平。该方法包括患百日咳或有百日咳发展危险的受治疗者服用含有有效量的含有杂环化合物的组合物。在该组合物中含杂环化合物优选地是未取代的杂环化合物(例如咪唑)、联苯基杂环衍生物、前列腺素衍生物或它们的组合。在该组合物中含杂环化合物更优选地是联苯基杂环衍生物、前列腺素衍生物或它们的组合。选择性地，除了这些杂环衍生物外，该组合物可以含有有效量的甲硝基羟乙唑和/或有效量的消炎痛。这两者之中，硝基羟乙唑是优选的。
本发明的另一方面涉及治疗者中炭疽病治疗方法。炭疽病是一种由炭疽杆菌引起的常见致命疾病。一个在引起疾病中很重要的由炭疽杆菌表达的因子是浮肿因子，一种通过提高cAMP水平而引起组织浮肿的腺苷酸环化酶。这种方法包括患有炭疽病或有炭疽病发展危险的受治疗者，服用一种含有有效量的含有杂环化合物的组合物。在该组合物中含有杂环化合物优选地是未取代的杂环化合物(例如咪唑)、联苯基杂环衍生物、前列腺素衍生物或它们的组合。在该组合物中含杂环化合物更优选地是联苯基杂环衍生物、前列腺素衍生物或它们的组合。在该组合物中含杂环化合物更优选地是联苯基杂环衍生物、前列腺素衍生物或它们的组合。选择性地，除了这些优选的杂环衍生物外，该组合物可以含有有效量的甲硝基羟乙唑和/或消炎痛。这两者之中，硝基羟乙唑是优选的。
本发明提供在活体外或在活体内抑制腺苷酸环化酶的方法。腺苷酸环化酶可以来自原核生物体或来自真核生物体。产生腺苷酸环化酶的原核生物体实例包括例如铜绿假单孢菌(它产生腺苷酸环化酶ExoY，在急性眼睛发病机理中起作用，例如参见Yahr等人《Proc.Natl.Acad.Sci.USA.》，95，13899-13904(1998))，百日咳博代氏杆菌(它产生腺苷酸环化酶CyaA，在百日咳中起作用，例如参见Ladant和Ullmann，《Trends Microbiol》，7，172-176(1999))，以及炭疽杆菌(它产生腺苷酸环化酶浮肿因子，并且在炭疽病中起作用，Leppla，《Adv.Cyclic.Nucl.Prot.Phosphor.Res.》17，189-198(1984))。如本文使用的术语“在活体外”是指无细胞系统，其中包括例如分离的腺苷酸环化酶或含有腺苷酸环化酶的细胞提取物。在活体外抑制腺苷酸环化酶的方法包括让腺苷酸环化酶与含有一定量的含杂环化合物的组合物进行接触，而该化合物可有效抑制由三磷酸腺苷(ATP)产生3′，5′-一磷酸腺苷(cAMP)。可以从细胞中分离或采用化学或酶方法合成腺苷酸环化酶。这样的在活体外的方法可以用于各种应用，例如筛选具有抑制腺苷酸环化酶的活性的化合物。
如本文使用的术语“在活体内”是指在受治疗者体内存在的细胞。术语“在活体内”也包括从受治疗者体内取出的细胞，例如原细胞或细胞系，在扎结袢内存在的细胞。这样在活体内的方法可以用于例如筛选和效力分析。扎结袢系指本技术领域已知的模型系统，这种系统可以用于分析由具有ADP-核糖基化作用活性的病原体多肽增加腺苷酸环化酶活性所引起的小肠液亏损。典型地，暴露出一部分鼠肠，并采用缝合方法分离这些片段。可以往片段加入能提高肠细胞腺苷酸环化酶活性的化合物，例如肠毒素，再可以测量在加入一定时间后在其片段积累的小肠液的量。除了加入例如肠毒素的化合物外，本发明的组合物也可以加入，再可以确定该抑制腺苷酸环化酶的能力。
抑制在活体内腺苷酸环化酶的方法包括让从受治疗者取出的细胞或在受治疗者体内的细胞与一种组合物进行接触，该组合物含有一定量的可有效抑制从ATP产生cAMP的杂环衍生物。该细胞含有腺苷酸环化酶和具有ADP-核糖基化活性的病原体多肽。几种病症是与过量的腺苷酸环化酶活性相关的，并且包括例如在腹泻疾病中的小肠液亏损，如百日咳中气管或支气管水肿，以及如在炭疽病中肺、胃肠道和散布的水肿。本文描述这样的病症。抑制腺苷酸环化酶的方法可以用于治疗这样的病症。
在另一方面，抑制在活体内腺苷酸环化酶的方法包括让从受治疗者取出的细胞或在受治疗者体内的细胞与一定量的可有效抑制从ATP产生cAMP的杂环衍生物进行接触。该细胞含有腺苷酸环化酶，不含有具有ADP-核糖基化活性的病原体多肽。
通过测量腺苷酸环化酶的活性，可以确定本发明含杂环化合物是否能抑制腺苷酸环化酶。这可以通过测量组织的cAMP和在结扎袢模型中得到分泌液的量进行确定，这在实施例1描述了。通过活体外酶分析中由ATP产生cAMP也可以测量腺苷酸环化酶的活性。如本文使用的术语“抑制”是指防止、降低或倒转分泌液的量，或生成cAMP。典型地，对ATP的α磷酸进行放射性标记，例如用³²P标记。这种分析可以在含有约20毫摩尔HEPES缓冲液(约pH7.4)，约4毫摩尔氯化镁，约0.2毫克/毫升BSA，约1毫摩尔cAMP以及约1毫摩尔DTT的缓冲液进行。该杂环衍生物和从市场获得的腺苷酸环化酶(由百日咳博代氏杆菌或其它来源)加到缓冲液，让其在37℃培养约20分钟。分离cAMP，例如采用氧化铝分离，测定放射性cAMP的量。
对于抑制腺苷酸环化酶的方法，该组合物中含杂环化合物优选地是未取代的杂环化合物(例如咪唑)、联苯基杂环衍生物、前列腺素类似物或它们的组合。更优选地，在组合物中含杂环化合物可以是未取代的杂环化合物(例如咪唑)、联苯基杂环衍生物、或它们的组合。在本发明这个方面种可以使用的联苯基杂环实例包括rofecoxib、SC-560、DuP-697，在某些具体实施方案中，celecoxib。优选地，抑制腺苷酸环化酶的方法含有celecoxib和DuP-697。在这种方法中使用的组合物可以含有有效量的甲硝基羟乙唑和/或有效量的消炎痛。这两者之中，硝基羟乙唑是优选的。
本发明还涉及平滑肌收缩的治疗方法，其中包括例如在早产期间收缩子宫。该方法包括让患有平滑肌收缩或有平滑肌收缩发展危险的受治疗者服用一种组合物，该组合物含有一定量的含杂环化合物，而这种化合物可有效抑制或控制早产，延长至基本上足月。在这种组合物中的含杂环化合物是联苯基杂环衍生物、前列腺素类似物或它们的组合。
本发明还涉及改善由PGE₂调节的炎症反应的方法。前列腺素，例如PGE₂以及白细胞三烯(例如LTB₄)是已知在炎症期间产生的。在高水平的情况下，PGE₂是原-炎症的，因为它刺激合成IL-8，而在低水平的情况下，它可以是保护细胞的，因为它具有刺激产生细胞活素IL-10的能力。后者细胞活素(IL-10)可降低炎症，而前者(IL-8)发出信号，让多形核白细胞的中性白细胞(一类白细胞)浸润到受侵袭的组织。由一种细胞，例如受损伤的细胞典型地产生PGE₂，并且由这种细胞释放出来，与第二个细胞上的受体相互作用。第二个细胞可以是白细胞，它的功能是释放对微生物有毒的物质。这些物质包括活性氧物种(其中包括游离羟基、过氧化物阴离子和单态氧)、溶解蛋白酶和酸。对微生物有毒时，它们对于宿主自己的组织也是非常毒的。可预料本发明的前列腺素，优选地PGE₂-咪唑或PGE₂-组氨酸，会与PGE₂受体结合，并且抑制PGE₂结合，以及可能其它的前列腺素。可进一步预料PGE₂-咪唑或PGE₂-组氨酸与PGE₂受体结合不会引起在该受体含有的细胞中的反应。通过改善由PGE₂调节的炎症反应可以治疗的病症实例包括例如牛的大肠杆菌病和乳腺炎，胰腺炎，Barrett食道，胃食管回流疾病综合症(GERDS)和肝炎。
通过下述实施例说明本发明。应当理解，要根据本文提出的本发明的保护范围和实质全面理解特别实施例，材料，量和方法步骤。
实施例
实施例1
通过与L-组氨酸的反应降低霍乱毒素诱导的PGE₂活性。
材料与方法
试剂。从Sigma Chemical公司(密苏里州，圣路易)购买霍乱毒素(CT)和L-组氨酸(HCI)。在用0.2微米(μm)过滤器灭菌之前，用氯化钠调节到300毫渗透压摩尔(mosmol)来新制备注射用175毫摩尔(Mm)1-组氨酸(pH7.0)溶液。咪唑、1-甲基-L-组氨酸和3-甲基-L-组氨酸是从Sigma Chemical公司(密苏里州，圣路易)购买的，U-[¹⁵N]-咪唑是从剑桥同位素实验室(安杜佛，马萨诸塞州)获得。磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)是用137毫摩尔NaCl、2.7毫摩尔KCl、1.2毫摩尔CaCl₂·2H₂O、0.49毫摩尔MgCl₂·6H₂O、8.1毫摩尔Na₂HPO₄和1.47毫摩尔KH₂PO₄(pH7.4)制得。
鼠肠袢分析。雌成鼠Swiss-Webster鼠(鼠龄6-8星期)从TaconicFarm公司(germantown，纽约)购买，装在德克萨斯州，加尔维斯敦，UTMB处的特别无病原体的动物设备中。在外科手术之前，给鼠喂水，不喂食物18小时，以减少小肠食物量。在三氟溴氯乙烷麻醉下，切开腹中线，露出小肠。在每支鼠中构造用“00”缝合丝线结扎的单根5厘米小肠段。在观察6小时后，通过子宫颈离位使这些动物无痛致死，再取出肠袢。测量腔流体的量，并以每厘米微升(μl/cm)表示。注入1微克(μg)CT，其中有或没有175毫摩尔L-组氨酸在100微升PBS中的溶液，完成肠激发，接着在激发时腹膜内注射(100微升)175毫摩尔L-组氨酸，此后每2小时，直到在6小时结束试验。在另外试验中，改变L-组氨酸剂量，与在激发时与其后在不同的时间，采用腔或腹膜内方法用药。流体积累与细胞培养数据(见下面)，独立样品采用两-端Student T检验，或采用Dunnett′s Multiple GroupComparison检验进行分析(Epistat Services，理查森，德克萨斯州)。
细胞培养液分析。使用cAMP ELISA测量了在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中L-组氨酸对PRG₂刺激腺苷酸环化酶活性的抑制作用。在35毫米盘中平铺CHO细胞(4×10⁵)，该盘所在的Ham′s F12介质含有10％胎牛血清(FBS)。在有5％CO₂气氛下于37℃培养过夜后，用2毫升有或没有L-组氨酸(4.7毫摩尔)的介质覆盖已附着的细胞。在指定浓度下用CT刺激所有细胞6小时。
离子传输研究。在配置平滑的非洲爪蟾表皮的Ussing室中，由短路电流估算L-组氨酸对对PRG₂刺激的钠传输的抑制作用。Ussing室可以用于分析PEG₂-咪唑、PEG₂-组氨酸、L-组氨酸和其它化合物对Cl^-传输通过上皮细胞的影响，或用于分析安装在Ussing室单元中生长在透明膜插入物上的极化肠上皮细胞融合单层。组织或细胞可以用不同浓度(10-1000纳克/毫升)细菌毒素刺激，这些细菌毒素包括CT、大肠杆菌STa、大肠杆菌STb或大肠杆菌LTs(I和II)。选择了这些蛋白质毒素，因为某些增加cAMP水平(例如CT和LTs)，而另一些增加cGMP水平(STa)。在这些研究中，在补充10％胎牛血清、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的DMEM中，在5％CO₂气氛下于37℃培养细胞。按照0.5×10⁶细胞/毫升密度接种细胞，并在1厘米²PET径迹蚀刻的、透明的、0.4毫米膜插入物上生长(Falcon)。如用伏特-欧姆表测量的电阻达到200Wcm²时，可达到单层融合(EVOM，World PrecisionInstruments)。另外，上皮组织可以拉伸通过该膜，并直接用于分析Cl^-离子传输。装有上皮细胞或细胞融合单层的过滤器放进Ussing室中(World Precision Instruments)，如Beltinger等人所描述的(《Amer.J.Physiol》，276，C848-C855(1999))，并且在刺激前，让单层平衡30分钟。在有或没有PEG₂-组氨酸(5毫克/毫升)或CT+PEG₂-咪唑(5毫克/毫升)的情况下，使用含有CT(10-1000毫克/毫升)或其它肠毒素(STa，STb和LTs)的介质培养单层。对照只含有介质和含有PEG₂-组氨酸、PEG₂-咪唑或其它抑制药物的介质。使用双电压夹钳(World Precision Instruments)，测量基部短路电流(SCC毫安/厘米²)和电阻(Wcm²)。刺激肠毒素和PEG₂加合物加到基底外侧和顶上表面，测量SSC的变化。
PEG₂(Sigma Chemical公司)稀释达到浓度1微摩尔，在加到室之前在37℃与10毫摩尔L-组氨酸一起培养30分钟。短路电流I_sc降低是L-组氨酸改变PEG₂生物学活性的指示。在Ussing室研究中使用的主要溶液是由90毫摩尔NaCl、2.5毫摩尔KCl、1.0毫摩尔MgCl₂、0.5毫摩尔NaH₂PO₄、1.8毫摩尔CaCl₂和10.0毫摩尔Hepes组成的NaCl林格溶液。使用四甲基-氯化铵(TMA-Cl)林格溶液，其中用90毫摩尔TMA-Cl代替NaCl，KCl、CaCl₂和Hepes保持如NaCl林格同样的浓度。使用与NaCl林格同样的组分和浓度，只是NaCl浓度降低到85毫摩尔，制备10毫摩尔L-组氨酸。20微升PGE₂溶于水中的的溶液加入NaCl林格或L-组氨酸溶液，达到所希望浓度1微摩尔，这样制得PGE₂溶液。这些溶液中每种溶液滴定到pH7.6，摩尔渗透压浓度为205-220mosmol/ml。
环AMP分析。从培养液上清液提取3′，5′-一磷酸腺苷(cAMP)，采用以前描述的辐射测量蛋白质激酶-结合分析进行定量(Peterson等人《Toxicon》，21，761-775(1983))，或采用辐射测量cAMP结合分析分析上清液(Peterson等人《Toxicon》，21，761-775(1983))，或采用生产者建议的方法的ELISA(Biomedical Technologies公司，斯托顿，马萨诸塞，目录号BT-730)。ELISA是以cAMP和cAMP的碱性磷酸盐衍生物对有限量抗体的竞争性结合为基的。与抗体结合的酶-标记的cAMP量随cAMP浓度增加而降低。
PGE₂与咪唑的反应。把U-[¹⁵N]-咪唑加到反应化合物，有利于采用质谱和NMR进行PGE₂与咪唑的结构分析，该反应混合物在37℃培养不同的时限，直到24小时。使用2.5微居里[5，6，8，11，12，14，15³H]-PGE₂代替PGE₂进行了一些反应(Amersham Radiolabled Chemicals，圣路易斯，密苏里州)。5毫摩尔PGE₂(Sigma Chemical公司)与58毫摩尔咪唑或U-[¹⁵N]-咪唑合并制备出反应混合物。为了使pH保持在7.4，反应混合物含有浓缩的(3.3x)PBS(457毫摩尔NaCl、9毫摩尔KCl、4毫摩尔CaCl₂·2H₂O、1.6毫摩尔MgCl₂·6H₂O、27毫摩尔NaH₂PO₄和4.9毫摩尔KH₂PO₄)。这种反应没有任何PBS是实质性的，因为当用0.01N NaOH将水溶液手工调节到中性pH，并采用质谱分析24小时-粗制反应混合物时，在37℃出现生成加合物。
反相色谱。采用在C18(Serva，帕拉母斯，新泽西州)柱(4.6×250毫米)上反相色谱分离PGE₂和L-组氨酸/咪唑共价加合物，所述柱用26％乙腈在0.1％TEA中的溶液，以1.5毫升/分流动进行平衡。在190nm处柱洗脱液中检测出PGE₂和L-组氨酸(或咪唑)共价加合物，选择的馏分(1.5毫升)在真空下干燥。采用质谱法(MS)和核磁共振(NMR)光谱法表征新生成衍生物的分子结构。
NMR光谱学。HPLC纯化样品汇集起来溶于750微升100％的D₂O(剑桥同位素公司)中，再在20℃下分析。采用2D-自动相关(COSY)和2D-总相关(TOCSY；80毫秒混合时间)光谱提供PGE₂-咪唑-加合物所有氢的光谱查定(Bax和Davis，《J.Magn.Reson》，65，355-360(1985)；Aue等人《化学物理杂志》(J.Chem.Phys.)，64，2229-2246(1976)以及Bax和Summers《美国化学学会杂志》，(J.Am.Chem.Soc.)108，2093-2094(1986))。采用¹⁵N-¹H反相检测2D-异核多重键相关光谱测定咪唑与PGE₂共价结合位置。所有光谱都收集在有外参考HDO(4.70ppm)的Varian Unity-Plus 600MHz光谱仪上。
质谱。用VG Analystical ZAB-2SE高-场质谱仪进行正离子快原子轰击-质谱法(FAB-MS)。使用铯离子枪轰击样品，该样品在甘油/硫代甘油(以体积/体积计，1∶1)基体中进行分析。使用VG Bio-Q(QuattroII以上)四极质谱仪进行电喷雾离子化-MS。样品以10微升/分流速注入乙腈∶水(以体积/体积计，1∶1)的溶剂中，该溶剂含有0.1％三氟醋酸。以氩气作为碰撞气体，使用碰撞-活化离解法，由单电荷母离子产生子离子谱。
使用甲醇∶HCl(以体积/体积计，3∶1)或d₃甲醇∶HCl(以体积/体积计，3∶1)反应剂进行甲基酯化。在把该反应剂加到冻干的多份样品之后，在室温下进行反应10分钟，最后在氮气下干燥。使用由三氟醋酸酐∶醋酸(以体积/体积计，2∶1)构成的反应剂，对冻干的多份样品进行乙酰基化。混合后，在室温下进行反应10分钟，最后在氮气下干燥。
结果
L-组氨酸降低小场液在用霍乱毒素激发的鼠肠袢中的积累。图1总结了对照鼠与服用L-组氨酸的CT激发鼠的小场液积累反应。在这个实验中，让鼠服用不同剂量的L-组氨酸：在六小时观察期，在激发时间通过腔注入100微升175、44或11毫摩尔L-组氨酸，接着在0、2和4小时三次100微升腹膜内注入175、44或11毫摩尔L-组氨酸。6小时后结束实验。由于鼠接受4次注射，每支鼠的总L-组氨酸剂量是14.8、3.7和0.93毫克(592、148和39.7毫克/千克)。这些结果表明，随着L-组氨酸剂量增加，小肠液积累量降低。但是，只是在试验的最高L-组氨酸剂量(14.8毫克)观察到统计的显著性差异(P＜0.05)。
L-组氨酸对PGE₂-诱导的钠传输的影响。L-组氨酸可以降低CT-诱导小肠液在鼠肠袢中积累的一个可能机制可能是L-组氨酸与PGE₂进行化学反应的能力，从而降低其生物学活性。在活体外，L-组氨酸降低安装在改进Ussing室中的平滑的非洲爪蟾表皮中的钠传输和PGE₂-诱导的钠传输(图2)。PGE₂(1微摩尔)增加由稳态Na⁺决定的电流(I_sc)达14％(最大的PGE₂-诱导的I_sc变化是18±3％，n＝5，P＜0.01)，1微摩尔PGE₂加10毫摩尔L-组氨酸使I_sc降低到对照的30±9％(n＝5，P＜0.025)。由这些数据可以认为，PGE₂和L-组氨酸之间的相互作用可能降低PGE₂对离子传输的刺激效果。
PGE₂-咪唑-组氨酸加合物的分离。PGE₂-咪唑或组氨酸一起在活体外在氮气下培养(pH7.4，37℃，24小时)导致生成PGE₂-咪唑或PGE₂-组氨酸共价加合物。如PGE₂-咪唑共价加合物所说明的(图3A)，采用C18反相色谱法分离这些加合物。使用C18反相色谱柱，使用在0.1％TFA中的26％的乙腈溶液洗脱，得到色谱图。因为咪唑的亲水性，在柱的空白体积洗脱咪唑。相反地，在21分钟洗脱PGE₂-，而分别在约44和46分钟洗脱PGA₂和PGB₂。在37℃，pH7.0，培养24小时的PGE₂和咪唑混合物进行色谱分离时，在约10和12分钟出现两个新峰。L-组氨酸反应混合物(37℃，pH7.0，24小时)得到类似的图案，只是PGE₂-组氨酸峰在8和9分钟洗脱出来。峰I和II的干馏分含有PGE₂-咪唑加合物，它们再进行色谱分离，可洗脱出可与图3A峰II比较的单峰。含有[³H]-PGE₂和咪唑的反应混合物的色谱(图3B)，也得到与峰II(图3A)相符的单峰，该混合物含有极少量的磷酸盐缓冲液。使用与板A同样的柱和同样的条件得到色谱图。观察到与峰II(板A)相同的单放射性峰。板A PGE₂-咪唑峰I或II的再色谱分离，以与[³H]-PGE₂-咪唑洗脱相符的单峰洗脱。观察到PGE₂-组氨酸共价加合物的真正相同色谱图，只是在稍微更早的时间(8和9分钟)洗脱两个PGE₂-组氨酸峰。
质谱法揭示，含有PGE₂-组氨酸的两个HPLC峰的分子量是489Da，而每个PGE₂-咪唑峰的分子量是403Da。在对照实验中，生成加合物不需要低pH的HPLC缓冲液，因为未纯化的粗制PGE₂和咪唑混合物(37℃，pH7.0，24小时)的质谱分析揭示了存在加合物。同样地，我们观察到咪唑与PGA₂和PGB₂反应，它们在结构上与PGE₂相似，但在第11个碳上缺少-OH基团(见图10A和10B)。采用ESI-MS得到的PGA₂-咪唑和PGB₂-咪唑加合物质量与PGE₂-咪唑共价加合物质量(403Da)相同。
通过用甲基阻断L-组氨酸咪唑环中的π或τ氮原子，确定与PGE₂的C11反应的在L-组氨酸咪唑环中两个氮原子。制备了含有1-甲基-L-组氨酸或3-甲基--L-组氨酸的PGE₂混合物，并进行了色谱分离。使用1-甲基-L-组氨酸时检测了加合物，因为与C11共价结合获得了τ氮原子。相反地，τ氮原子被3-甲基--L-组氨酸的甲基保护，不能生成任何加合物。因此，L-组氨酸的τ氮原子对于与PGE₂的C11共加键合是很重要的。
L-组氨酸/咪唑对CT-诱导的cAMP生成的影响。采用竞争性结合cAMP的放射性测量，L-组氨酸降低了PGE₂和CT刺激在活体外CHO细胞中cAMP生成的能力(图4)。这些结果表明如图6中分离的纯化PGE₂-咪唑加合物对CT-刺激CHO细胞中cAMP水平的影响。往CT刺激的CHO细胞培养物加入纯化PGE₂-咪唑加合物可造成显著抑制CT诱导的cAMP生成(P＜0.05)。浓度0.5微克/毫升在6小时培养期降低cAMP水平达约50％。
PGE₂-咪唑加合物可降低CT诱导的小肠液的积累。考虑到纯化PGE₂-咪唑能抑制CT-刺激CHO细胞中cAMP生成(图4)，试验了这种加合物阻断CT-诱导的小肠液在鼠肠袢中积累的能力。图5表明缓慢加入肠腔的剂量低到100微克的PGE₂-咪唑显著地降低CT-诱导的小肠液积累。在6小时观察期间，剂量200微克完全阻断小肠液亏损，接着CT激发。PGE₂-咪唑处理可明显降低在肠袢小肠液中的cAMP水平(图5B)，并且与小肠液积累减少相一致。
PGE₂-组氨酸加合物的生成速率。通过测量C18反相色谱的190nm主要吸收峰下相对面积(约10-12分)确定加合物的生成速率(图3A)。确定了反应混合物的pH6.5或更高时，PGE₂-组氨酸加合物生成量最大。PGE₂与组氨酸之间生成(峰II)的加合物的量是与培养时间相关的，其中T1/2等于约10小时(图6)。PGE₂曲线向下倾斜表明反应中消耗PGE₂，而加合物曲线显示向上倾斜，它的生成增加。PGA₂曲线表明在反应期间由于PGE₂或加合物降解而生成PGA₂。PGE₂-咪唑生成动力学与PGE₂-组氨酸非常类似。
PGE₂-咪唑加合物的稳定性。如图3A所描述的，采用C18反相色谱分离纯化的PGE₂-咪唑加合物(峰II)，并冻干储存。接着，20微克等分样品稀释在水(200微克/毫升)中，在37℃、pH5.5下培养指定时间。样品进再行色谱分离，并对每个峰下面积进行积分。该加合物出现稳定约12小时，此后到24小时有一些很明显的降低，在1星期内仅仅留下10％(图7)。加合物降解时，PGA₂峰(44分)浓度增加，含有咪唑的空体积峰变得更大。除了PGA₂外，出现了第二个很小的峰，它比PGE₂-咪唑峰早1-2分钟。这个峰与在PGE₂和咪唑粗制反应混合物最初色谱期间观察的PGE₂-咪唑加合物峰(图3A)类似。色谱前用PBS中和加合物可促进从PGE₂-咪唑加合物快速除去咪唑基团，完全转化需12-24小时。在4℃下储存时含有加合物的部分逐渐变坏，但是在N₂下储存冻干加合物制剂在-70℃是稳定的。
PGE₂-咪唑加合物的质谱分析。从HPLC峰(图3A-峰I或峰II)分离的PGE₂-咪唑加合物快速原子轰击质谱(FAB-MS)分析显示了在m/z403处强(M+H)⁺假分子离子。采用电喷雾离子化光谱(ESI-MS)得到类似的结果。分析U-[¹⁵N]-咪唑产物证实了加合物中存在单咪唑部分，这种产物给出了在m/z405处强假分子离子。PGE₂-咪唑加合物成功酯化表明存在游离羧酸。这可通过产物的FAB-MS谱予以证实，该谱表明在m/z419(甲醇)和m/z422(d₃-甲醇)处(M+H)⁺假分子离子。采用ESI-MS分析乙酰基化加合物(U-[¹⁵N]-标记的)表明在m/z489处(M+H)⁺与两个乙酰基团的反应相一致。
还进行过PGE₂-咪唑加合物和许多衍生物的碰撞-诱导离解(CID)(Zirrolli等人，《J.Am.Soc.Mass Spectrom.》，1，325-335(1990))。得到的PGE₂-咪唑加合物谱列于图8A。在m/z69和95处主要子离子可以指定是咪唑部分碎裂，这可以用U-[¹⁵N]-标记的加合物的相应子离子谱加以证实，该谱表明在m/z71和m/z97处类似强子离子(图8B)。在U-[¹⁵N]-加合物谱中保留的在m/z263的信号是与有关碎裂机制是一致的，该机制涉及除去咪唑和在C15劈裂。可认为在m.z385的信号为从分子离子除去水，然而在m/z100-200之间的低强度离子是与沿亚甲基链裂解相一致的。图8B说明了酯化PGE₂-咪唑加合物的ESI-MS/MS子离子谱，支持已经给出的离子指定。
采用NMR导出PGE₂-咪唑加合物的结构。由NMR分析和质谱的碎裂过程图形可导出有关PGE₂-咪唑化学结构的特别信息。PGE₂-咪唑加合物的1D ¹H NMR谱(峰II)示于图9A。通过2D COSY和TOCSY谱的分析完成了¹H信号的指定(图9B)。在获得2D NMR谱的过程中，因出现几个新峰而注意到样品有一些降解。这些指定是简单明了的，在TOCSY谱中交叉的峰与许多偶合质子相关。因此，可看到H-13(5.55ppm)到H-14、H-15和H-12(为了交叉峰的出现；参见图10，鉴定质子)的TOCSY相关性。H-5(5.45ppm)表明与H-7、H-2、H-4和H-3的相关性。H-14(5.45ppm)是与H-13、H-15和H-12相关的。H-6(5.32ppm)是与H-5、H-7、H-2和H-4相关的。H-11(4.84ppm)表明在二维F-2上与H-10、H-12、H-8和H-7相关(水预饱和使斜峰和在F1二维中的相关性变得不清晰)。H-15(4.03ppm)与H-13、H-14、H-15、H-16、H-16′、H-17和H-17′相关。H-10(3.07ppm)与H-11、H-12、H-8和H-17相关。连续的高磁场，H-12、H-8、H-7、H-2、H-4和H-3显示预期的交叉峰。最后，H-19(1.16ppm)、H-18(1.08ppm)和H-20(0.76ppm)以及H-15和H-16显示出彼此相关，因此完成前列腺素加合物质子的顺序连接性。通过COSY和TOCSY谱以及U-¹⁵N-标记的咪唑PGE₂-咪唑加合物样品的¹⁵N/¹H HMBC谱指定低磁场咪唑环质子(图9C)。后一谱把¹⁵N/¹H偶合咪唑氮与咪唑质子H-2、H-4和H-5以及两个前列腺素质子关联起来。因此，咪唑的N-1(5.02ppm)显示出与咪唑H-2(8.81ppm)、H-4(7.46ppm)和H-5(7.62ppm)以及前列腺素质子H-12(2.90ppm)和H-10′(2.79ppm)相关。可惜，或者因为偶合小，或者因为最接近HDO共振，部分信号饱和，只是观察到H-11质子很小的暂时确定的交叉峰。H-10和H-12的相关性(强三-键偶合)证实咪唑环与前列腺素骨架共价连接的位点。另外，发现H-11(+0.74ppm；+值表示加合物低磁场位移)，H-10′，H-10′(+0.65和+0.35ppm)，H-12(+0.47ppm)，H-8(+0.27ppm)和H-14(-0.19ppm)在与游离PGE₂加合物相关的加合物中显著的化学位移扰动。
讨论
用CT激发并施用L-组氨酸的鼠肠袢积累小肠液显著低于相应CT激发对照鼠(图1)。一般地，观察的L-组氨酸剂量，以最大保护免受CT-诱导小肠液积累的鼠肠袢是相当大的(592毫克/千克)，甚至在毒素激发的同时开始治疗也是如此。
PGE₂和咪唑或L-组氨酸反应混合物的C18反相色谱揭示了在约10-12分的相邻峰(图3A)。峰I可能是加合物的不稳定异构体，因为峰I馏分干燥后，其材料用同样柱再进行色谱分离，只是得到峰II。在相邻峰中含有的加合物(异构体)质量经测定是PGE₂-咪唑403Da和PGE₂-组氨酸489Da。由洗脱[³H]-PGE₂-咪唑为类似于峰II(图3A)的单峰(图3B)，提供了进一步的证据。通过在37℃，pH5.5水中培养不同时间，研究了纯化PGE₂-咪唑加合物(峰II)的稳定性。在这些条件下，纯化PGE₂-咪唑加合物的半寿命是约2.5天。随着PGE₂-咪唑加合物变坏，除去了咪唑基团，导致出现PGA₂。空体积峰含有释放的咪唑，尽管注意到少量的峰I加合物。
证明L-组氨酸与PGE₂进行化学反应(图3)，我们认为L-组氨酸抑制PGE₂在用CT激发的鼠肠袢中起作用的可能性。曾证明，纯化PGE₂-咪唑加合物可降低在用CT刺激的CHO细胞培养上清液中cAMP水平(图4)。曾猜测L-组氨酸以及PGE₂-咪唑加合物会干扰在CT-处理的细胞中PGE₂的活性。采用PGE₂-特别放射性免疫检测测量在活体内或在活体外PGE₂的减少是不可能的，因为PGE₂-组氨酸(或咪唑)加合物显示出与抗体同样好地同PGE₂反应。部分地，L-组氨酸可以用作PGE₂-失活化合物，这就为PGE₂在小肠中在CT-诱导分泌水和电解质时的作用提供附加的支持。另外，PGE₂-组氨酸共价加合物可以用作抑制PGE₂刺激腺苷酸环化酶的有影响的化合物。的确，纯化的PGE₂-咪唑加合物抑制CT-诱导的小肠液在鼠肠袢中的积累(图5A)。在这种情况下，咪唑部分可能使PGE₂在离子传输时的自然刺激作用失活，但PGE₂-加合物与PGE₂的结构类似性是可能的，这种结构类似性能使它干扰CT-诱导的PGE₂的作用和小肠液积累。其它PGE₂类似物(例如PGA₂和PGB₂)也以较低效力降低在鼠肠袢中积累CT-诱导的小肠液。
试验了另一种有效的亲核试剂，N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)，以测定它是否抑制分泌CT-诱导的小肠液。按照剂量238毫摩尔(100微升)，在6小时内每小时注入I.P.，NAC(pH7.0)对于鼠阻止在小肠袢中分泌CT-诱导小肠液是没有任何保护作用的。往肠腔注入NAC和CT混合物(pH没有预先调节到7.0)阻断了所有肠液积累。NAC对离子传输的作用可能源于NAC溶液的低pH。结论是NAC可能损害CT蛋白质毒素，或降低小肠上皮细胞的生存能力。
NMR结果确定了，咪唑环在C11与PGE₂共价连接，事实上，在这个碳上取代羟基(图解I)。PGE₂-组氨酸得到类似的数据。另外，使用L-组氨酸的甲基化衍生物，确定了离碳链最远的τ氮原子与PGE₂的C11进行反应。这种化学转化最合理的解释是PGE₂开始脱水(可能地通过咪唑基团的一般酸/碱催化)得到PGA₂或PGB₂(图10A)。往这种α，β-未饱和酮中添加Facile Michael-咪唑会得到11-脱氧-11-咪唑基-PGE₂(PGA₂)。如由pH依赖于生成这种加合物所表明的，这是通过咪唑的碱形式出现的。在附加实验中，实质上如本文所描述的，使用用PGA₂和PGB₂取代PGE₂的咪唑制备反应混合物。我们观察到所有三种二十碳酸酐与咪唑生成共价加合物，每种都精确地具有相同的质量(403Da)。这些结果支持了图10A中示出的结果顺序。
前列腺素是反应性很强的物质，很容易脱水。的确，曾证明白蛋白可以催化相关PGD₂前列腺素的类似脱水反应。PGE₂也脱水。在前列腺素中特别共同的双键异构化，并且可能的是开始的11-脱氧-Δ¹⁰-PGE₂也可以重排成比较完全的共轭PGB₂。在HPLC曲线中观察到的峰II(图3A)或者是11-脱氧-11-咪唑基-PGE₂产物的另一个异构体，或者是咪唑与PGB₂的C-12加合生成的12-脱氧-12-咪唑基-PGB₂(图10B)是特别可能的。因此，值得注意的是，PGB₂与咪唑生成加合物，其分子量与11-脱氧-11-咪唑基-PGE₂的相同(图10B)。PGB₂加合物谱确定了，该加合物在结构上与由PGE₂生成的加合物类似。因此，这样支持了咪唑-催化脱水或碱催化脱水(或两者)可以解释PGE₂与咪唑之间反应的观点。
前面已指出，白蛋白可以与各种前列脲素共价结合，例如15-酮-13，14-二氢-PGE₂，以及一种可能的机制是在C-11通过亲核加到α，β-未饱和酮脱水产物上。详细是NMR结构分析说明11-脱氧-11-咪唑基-PGE₂证实了这样一种转化的确是特别可能的。容易加入咪唑以及组氨酸的咪唑环，可强烈地认为组氨酸可以是负责蛋白质与PGE₂共价连接的一种残基。这样增加了前列腺素可能以共价方式通过组氨酸的咪唑环改变蛋白质，从而改变蛋白质或二十碳酸酐活性的可能性。
实施例2
联苯杂环抑制小肠液亏损
鼠肠袢的分析
雌性成年鼠Swiss-Webster鼠(25-30克)从Taconic Farm公司(Germantown，纽约)购买，装在德克萨斯州，加尔维斯敦，UTMB处的特别无病原体的动物设备中。在外科手术之前，给鼠喂水，不喂食物18小时，以减少小肠食物量。在醚麻醉下，切开腹中线，露出小肠。用“00”缝合丝线结扎的单根5厘米小肠段，注入在100微升中1微克霍乱毒素。在观察6小时后，通过子宫颈离位使这些动物无痛致死，再取出肠袢。测量腔流体的量，并以每厘米微升(μl/cm)表示，同时为光学显微镜或电子显微镜准备组织。在某些实验中，注入100微克(μg)CT，接着在激发同时立刻注入160微克/100微升celecoxib(溶于3％在磷酸盐缓冲盐溶液中的二甲基亚砜里)。在激发后6小时测量小肠液的体积。在尸检时收集小肠液和组织样品。使用报告COX-2特效的celecoxib用药量，观察到对CT-诱导的小肠液积累的抑制影响。
结果
图11表明celecoxib显著降低CT-诱导的小肠液在鼠肠袢中积累。
实施例3
杂环衍生物抑制腺苷酸环化酶
腺苷酸环化酶活性的分析。
通过测量酶与[³²P]-ATP作用产生释放的[³²P]-cAMP，确定腺苷酸环化酶活性。该反应如下：
[³²P]-ATP+腺苷酸环化酶＝[³²P]-cAMP+PPi
下面描述的腺苷酸环化酶分析与大多数其它在活体外酶分析是类似的，其中纯化的腺苷酸环化酶在缓冲液中与放射性标记底物三磷酸腺苷([³²P]-ATP)混合在一起。含有腺苷酸环化酶的粗制酶或真核细胞膜可以代替纯化的酶。在培养20分钟后，通过计数生成³²P-cAMP的水平，可确定[³²P]-ATP向³²P-cAMP的转化。
方法。在含有20毫摩尔Hepes缓冲液、4毫摩尔MgCl₂、0.2毫克/毫升BSA、1毫摩尔cAMP和1毫摩尔DTT，pH7.4的反应缓冲液中，构建底物[³²P]-ATP(NEN，波士顿，马萨诸塞州)。由纯化腺苷酸环化酶(0.46-4.6纳摩尔)(List Biological Cambell CA)，底物和激动剂/抑制剂(1-10纳摩尔)组成的40微升反应物在37℃下进行20分钟，使用10微升0.5N HCl停止该反应。该反应混合物转移到小氧化铝柱(Pierce，罗克福德，伊利诺斯州)中，与0.005N HCl平衡，再在500×克下离心。该柱用2 00微升0.005N HCl，在上述速度下旋转洗涤三次。用200微升醋酸铵缓冲液冲洗树脂三次，将[³²P]-cAMP洗脱到管中。装有洗脱[³²P]-cAMP的管转移到闪烁管。加闪烁鸡尾酒，混合与计数。产生的[³²P]-cAMP是腺苷酸环化酶活性的度量。
统计分析。由3个值得到平均和标准偏差(SD)。数据用Student t检验(一尾)进行评价，P值≤0.05被认为是与对照有显著差异。
结果。这些结果表明，celecoxib、PGE₂组氨酸和咪唑每种都抑制腺苷酸环化酶酶活性(图12)。图12中的数据还表明，SC560和rofecoxib在试验条件下无腺苷酸环化酶活性。图13表明SC560抑制霍乱毒素诱导的小肠液分泌，尽管未曾证明在试验条件下通过抑制腺苷酸环化酶可做到这一点(图12)。在试验条件下，Rofecoxib不抑制霍乱毒素诱导的分泌。Celecoxib被认定是环加氧酶-2(COX-2)的高特效抑制剂。Celecoxib抑制腺苷酸环化酶的机制还不清楚；但是，观察到咪唑也抑制腺苷酸环化酶。由于咪唑是celecoxib化学结构的一部分，这个部分参与抑制腺苷酸环化酶的功能活性是可疑的。已知咪唑结合二价阳离子(例如Mg⁺⁺，Zn⁺⁺和Ca⁺⁺)，还知道这些金属阳离子是腺苷酸环化酶活性所需要的。事实上，近来有关测定由X-射线结晶学导出的鼠腺苷酸环化酶结构的报告表明，在腺苷酸环化酶二价阳离子(Mg⁺⁺和Zn⁺⁺)的催化位点存在两个结合部位。我们觉得celecoxib的咪唑基团能让药物在酶的活性位点与金属离子结合，这样会不让底物(ATP)进入。最后结果应是抑制腺苷酸环化酶活性。从小肠生理学观点来看，这样一种抑制剂会降低或阻止霍乱毒素诱导的小肠液亏损(腹泻)。
剂量反应曲线的获得
方法。如实施例1较早所描述的进行腺苷酸环化酶酶活性的分析；但是，运用这种分析来评价各种抑制剂(例如PGE₂-组氨酸、celecoxib和咪唑)。每个实验的酶量是0.46纳摩尔，每种抑制剂的浓度改变，以便确定阻止50％酶活性的剂量(IC₅₀)。
结果。图14-16汇集的结果表明，可以抑制腺苷酸环化酶，这形成一种降低或阻止由几种腹泻疾病因子引起的肠液分泌的策略。图14说明了在抑制腺苷酸环化酶时PGE₂-组氨酸的剂量反应。抑制50％酶活性(0.46纳摩尔)的PGE₂-组氨酸的IC₅₀剂量是21.5微摩尔。图15说明用celecoxib进行类似实验时，它的IC₅₀剂量是20毫摩尔。图16说明只是咪唑具有抑制腺苷酸环化酶活性；但是，它的效力不高(IC₅₀＝1.57毫摩尔)。表1汇集了各种腺苷酸环化酶抑制剂的抑制效力。B.acthracis的水肿因子用作腺苷酸环化酶时观察到类似结果。
表1、抑制腺苷酸环化酶所需要通常获得药物的摩尔浓度