用于治疗缺铁性贫血的铁糊精化合物 本发明涉及新的铁糊精化合物并涉及其制备方法。本发明进一步涉及铁糊精在制备治疗人或家畜的缺铁性贫血的药物组合物中的应用。
【发明背景】
从全球来看，缺铁性贫血已经被描述为最普遍的人类病理状况之一，可能是最普遍的人类病理状况。除非采取合适的预防措施，在现代农场喂养的猪和其它家养动物中缺铁性贫血也是问题。
虽然缺铁性贫血通常可以通过口服给药包含铁的制剂被预防或治愈，但是在许多情况下优选应用可肠胃外给药地铁制剂来避免口服给药的生物利用度变化和确保有效的给药。
因此，用于肠胃外应用，即指皮下、肌内或静脉内给药的包含铁的制剂，已经被兽医或人类医生从业者使用了很多年。
虽然各种包含铁的物质已经被使用或被建议作为抗缺铁性贫血的肠胃外可注射用制剂的组分，但是如今最普遍可接受的制剂是那些包含与葡聚糖缔合的羟基氧化铁(或氢氧化铁)的结合产品。葡聚糖是由微生物肠系膜样明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)产生的聚合的碳水化合物。
尽管葡聚糖在许多方面是理想的化合物，但是它也有缺点，即在人体内其仅以有限的程度代谢。此外，当肠胃外给药时，葡聚糖会引起过敏反应。
用于肠胃外注射的包含铁的制剂显然应该满足若干需求，包括用于血红蛋白合成的铁的易得性，无局部或全身副作用以及使得在环境温度有令人满意的贮藏期限的储存稳定性。
通常理想的是口服给予铁制剂，因为对于接受者这是最方便的。在口服给予铁制剂后频繁遇到的缺点是消化不良。良好的铁制剂应该在胃肠道中以受控方式向机体提供铁，以便提供通过肠上皮吸收的足够的铁，并且不应该对消化有这样的不利影响。
GB1,076,219公开了用于预防或治疗缺铁性贫血的包含铁、低分子量糊精或葡聚糖和山梨醇的复合物的制备方法。
US4927756公开了铁葡聚糖化合物的制备过程，其中葡聚糖的分子量为2000-4000。进一步陈述的是分子量低于1000Da的葡聚糖和糖类在反应条件下分解，产生毒性产物。
WO9900160公开了由重量平均分子量为700-1400和数均分子量为400-1400道尔顿的葡聚糖与羟基氧化铁稳定缔合构成的铁葡聚糖。公开的铁葡聚糖复合物使过敏副作用的发生数减少。
另外的已知用于治疗缺铁性贫血的铁制剂例如铁-蔗糖和铁-葡糖酸盐化合物。这些化合物与铁结合的不紧密，结果是游离Fe3+离子的浓度较高，当肠胃外给予时其增加了铁化合物的毒性，并且当口服给予时会导致消化障碍。
已有描述，在Banthu人中缺铁性贫血的发生率很低，而铁过载的相对发生率较为频繁。作为谷物稀粥饮食在铁锅中传统制备的结果，铁主要通过饮食供给。尽管还没有提供直接的证据，但是人们假设铁被胃的酸性介质溶解，与来自水解的饮食淀粉的糖混合，然后被传输至小肠，在那里富含糖和铁的食物团被中和以形成铁的可溶性碳水化合物复合物。这些可溶性铁糖复合物能容易地被传送和被肠道吸收，而没有观察到粘膜阻碍。(Spiro和Saltman.Polynuclear complexes of Iron andtheir biological Implications：Structure and bonding，第116-156页)。
不管上面提及的关于铁产品制备的方法，理想的是提供可用于制备治疗或预防缺铁性贫血的组合物的制剂的铁化合物，此铁化合物不提供固有的与葡聚糖相关的问题。
【发明内容】
本发明的目标是提供用于治疗缺铁性贫血的新的铁制剂，此制剂满足所有下面的要求：
-当口服给予时，铁在肠内吸收的高度有效性，而不引起消化问题；
-以在肠内容易吸收的方式提供铁；
-当肠胃外给予时铁的高度有效性，而没有由Fe3+的高局部浓度引起毒性的风险；
-与过敏反应无关；
-包含大量铁；
-能够形成包含大量铁的所述铁制剂的稳定的溶液，此溶液满足药物组合物的基本需求，即能被灭菌，优选通过高压灭菌，并且在环境温度经长期储存其是稳定的。
本发明出乎意料地实现了，即本发明的铁糊精化合物迎合所有上面的需求。
按照本发明，提供铁(III)-糊精化合物。
糊精化合物是通过水解淀粉制备的。糊精是主要通过α-1，4-糖苷键连接在一起的葡萄糖单元构成的糖类。
糊精通常是通过淀粉的解聚作用制备的，利用已知的解聚方法，例如酸、碱或酶。取决于起点的淀粉，其也包含位于聚合葡萄糖链的支化点的少量α-1，6-糖苷键。因此糊精也可以包含相似低比例的α-1，6-糖苷键。通过调整解聚淀粉的条件，能够促进断裂α-1，4-糖苷键或α-1，6-糖苷键，这样键的这些类型之间的比例在起始的淀粉和制备的糊精之间不同。
淀粉和糊精的特性之一是它们的胶凝性质。与葡聚糖相比，淀粉与高等糊精甚至在适当的浓度就胶凝化，这使得处理更加困难。
淀粉和糊精的胶凝性质可以通过水解降低分子量来降低，然而，水解不应该太广泛，因为已知当与铁在缔合复合物中结合时，糖和小糊精会引发毒性问题。
优选地水解淀粉直到它不与碘形成强有色的复合物。水解至这一程度的淀粉的溶液包含在理想的分子尺寸范围内的大量的糊精，并且具有足够低的能允许容易和准确地处理溶液的粘度。
按照本发明，淀粉的分子量优选是通过酸水解形成的，利用强无机酸例如硫酸、磷酸或盐酸。盐酸是水解淀粉的优选酸。
此外发明人认识到，理想的是纯化糊精至狭窄分子量分布，以便获得更均匀的铁-糊精复合物。
因此，本发明的重要特征是将糊精水解至合适低的分子量，并且被分成狭窄范围的分子量，避免高分子量糊精和低分子糖类。
按照本发明将与铁结合的糊精的重量平均分子量(MW)必须低于3000道尔顿，并且数均分子量(Mn)必须高于400道尔顿。
糊精的分子量必须狭窄这一点是本发明的另一个重要特征，即最高分子量的糊精的10％部分具有低于4500道尔顿的平均分子量，并且90％的糊精具有低于3000道尔顿的分子量。另外重要的是10％部分的最低分子量具有重量平均分子量为340道尔顿或更高。
在优选的具体实施方案中，最高分子量的糊精的10％部分具有低于4000Da的平均分子量，90％的糊精具有低于3000道尔顿的分子量，且10％部分的最低分子量具有重量平均分子量为800道尔顿或更高。
本发明人出乎意料地发现，这种糊精部分具有足够低的粘度，其允许糊精溶液的容易和可靠的处理，并且进一步这种糊精部分以非常均一的尺寸提供与铁的缔合复合物。
分级原则上可以利用已知分级低聚糖的方法来做，其适于分级成狭窄范围的分子量。这些方法包括色谱纯化、离子色谱方法和利用膜分离技术的纯化，其中通过膜方法纯化是优选的。尤其优选的是利用分离点在340-800道尔顿范围的膜的膜方法，被用来除去低分子量的糖类。
与利用膜方法的分离相比，传统利用的基于沉淀的分级技术不是用于本发明的合适的分级技术，可能因为获得的糊精部分不会足够狭窄。所以，利用通过传统沉淀分级的糊精制备的铁糊精化合物不会具有本发明铁糊精化合物的有益性质。
在与铁结合之前，除去糊精的还原能力。这可以通过将糊精的末端醛基氢化成醇来做到。这一还原可以利用公知的步骤进行。利用硼氢化钠的氢化是优选的。
在氢化后，糊精的还原能力应该低于3.0％，利用铜氧化方法测定。
纯化的和氢化的糊精作为水溶液与至少一种水溶性铁盐结合；向得到的溶液中加入碱以形成氢氧化铁，并加热得到的混合物来将氢氧化铁转化成羟基氧化铁作为与糊精的缔合化合物。
水溶性铁盐的优选的例子是氯化铁。
该方法的优选具体实施方案包括下面：
(i)制备包含纯化的氢化糊精和至少一种水溶性铁盐的水溶液；
(ii)通过加入碱调节所述水溶液的pH至高于7的值；
(iii)加热混合物至温度高于85℃，直到它转变成黑色或暗棕色胶体溶液，其能被过滤通过0.45μm的过滤器；和
(iv)利用过滤、加热和膜方法以及添加一种或多种稳定剂来进一步纯化和稳定，并任选地干燥溶液来获得作为稳定粉末的理想的铁-糊精化合物。
甚至更优选的是通过加入碱在步骤(ii)中将水溶液的pH值调节至高于8.5的值。
稳定化通过添加有机羟酸优选的是柠檬酸盐合适地发生。
在一个优选的方面，本发明涉及呈水溶性粉末包含高至50％(w/w)铁的铁糊精化合物。优选地，粉末的铁含量在10-50％(w/w)范围内，更优选的在20-45％(w/w)范围内，甚至更优选的在30-42％(w/w)范围内。
本发明因此涉及铁-糊精化合物，其非理想副作用的发生频率极低，并且在灭菌和作为水溶液的储存期间也是令人满意地稳定的，此铁-糊精化合物可以被用作通过肠胃外或口服给药的用来预防或治疗动物或人类患者缺铁的药物组合物中的成分，此铁-糊精化合物的特征在于其包含与羟基氧化铁稳定缔合的氢化糊精，此糊精的重量平均分子量(Mw)低于3000道尔顿，优选大约1000道尔顿，数均分子量(Mn)等于或高于400道尔顿。
可选地，省略干燥操作，从纯化的溶液生产注射液体，而不用中间干燥它。
在进一步优选的具体实施方案中，通过在水溶液中的硼氢化钠来进行糊精的氢化。
本发明人出乎意料地发现，与先前已知的铁糊精化合物相比，本发明的铁糊精化合物具有显著的优点。
首先，利用本发明的方法可以制备具有很高铁含量的铁糊精，以铁与总铁糊精复合物之间的比率计算。
其次，本发明的铁糊精化合物在水中溶解度高，这使得其能够制备包含极大量铁的本发明的铁糊精的水溶液。这些溶液是稳定的，并且不会通过储存例如通过胶凝或沉淀变质。
此外本发明的铁糊精化合物的溶液可以通过高压灭菌法被灭菌，而溶液没有本质的物理改变。因此，溶液可以被高压灭菌，而复合物的分子量或溶液的粘度没有任何显著的改变。
所以，本发明的铁糊精化合物提供了制备每质量单位包含极高量的铁的药物组合物的可能性，此组合物满足对于药物组合物的所有需求，例如能被高压灭菌并且在环境温度能长时间保持稳定。
例如按照本发明可以制备包含20％铁的注射液体。这种包含高含量铁的注射液体提供了有利条件，即较少量的液体需要被注射入被治疗的受试者，这对于被治疗的受试者以及进行治疗的人显然也是有利条件。
因此，在另一方面，本发明提供包含按照本发明的铁糊精化合物的水溶液，其中铁含量高至35％。优选地，铁含量在1-35％范围内，更优选在5-35％范围内，甚至更优选在5-30％范围内，并且最优选在10-25％范围内。包含1、2、5、10、20、25、30％铁的水溶液也是本发明的优选的具体实施方案。
水溶液可以利用任何公认的保存技术被保存，例如高压灭菌、在无菌条件下通过0.2-0.5微米过滤器过滤或加入防腐剂。作为防腐剂的例子可以提及的是0.5％的苯酚。
高压灭菌是保存本发明水溶液的优选方法。尤其优选的是在121-135℃的温度高压灭菌5-40分钟时间段。如果水溶液的pH低于7.5，优选高压灭菌溶液的时间段小于40分钟。
在进一步优选的具体实施方案中，所述水溶液是药物组合物。
在本说明书中，术语药物组合物应该被广泛地理解，并且包含治疗或预防人类个体或动物例如家养动物缺铁性贫血的组合物。
包含本发明铁糊精化合物的药物组合物可以利用对于技术人员公知的方法制备。
在一个具体实施方案中，通过提供本发明的铁糊精的水溶液来制备注射液体，如果需要在合适的溶剂中稀释，调节pH，通过过滤灭菌并填充入预先灭菌的安瓿或小瓶。
在另一个具体实施方案中，通过提供本发明的铁糊精的水溶液来制备注射液体，如果需要在合适的溶剂中稀释，调节pH，填充入预先灭菌的安瓿或小瓶，然后通过高压灭菌法来灭菌充填好的安瓿或小瓶。
本发明的一个优选的具体实施方案提供意欲给予人的注射液体，注射液体的每质量单元包含1-20％铁。
本发明的另一个优选的具体实施方案提供意欲给予动物的注射液体，注射液体的每质量单元包含10-30％铁。
口服应用的制剂可以利用对于本领域技术人员公知的方法生产。作为口服应用的制剂的例子，可以提及的是片剂、胶囊、糖浆、糊剂和混合物。
包含本发明的铁糊精化合物的药物组合物可以配有另外的营养剂或制药学上有用的试剂，例如维生素，优选水溶性维生素，微量营养素例如微量金属例如钴、铜、锌或硒，或抗生素例如泰乐菌素。在水中不溶的维生素甚至也可以利用合适的乳化剂被乳化进入包含本发明铁糊精化合物的水溶液。
技术人员会意识到此优点，即与葡聚糖相比，没有与糊精相关的过敏问题。结果是即使高分子量分子的除去不如预期的有效率，在接受者中诱导不利的反应的风险也减少，因为所有分子量的糊精都是安全的，不会倾向于引起任何过敏反应。
出乎意料地，本发明的铁糊精每重量单元碳水化合物可以结合等量或更多铁，并且与现有技术的铁糊精相比是更易溶的。糊精进一步包含位于糖基团6-位的伯醇基团，在那在碱性条件下可以除去伯醇基团的质子。不希望被任何理论束缚，假设所述伯醇基团的结合性质是造成此事实的原因，即糊精和铁的结合与葡聚糖与铁的结合不同。
与先前已知的铁糊精化合物相比，本发明的铁糊精化合物是更易溶的，并且在生产和储存期间胶凝的趋势较小。
当本发明的铁糊精化合物以药学有效量被口服给予时，其提供铁在肠内吸收的令人满意的利用度，而对于消化没有任何副作用。
现在通过下面的非限制性实施例对发明做进一步说明。
实施例
实施例1
糊精的水解和氢化
在pH1.5，在温度95℃水解Mw＞3000的明胶形成的糊精。通过取样并利用凝胶渗透色谱法色谱分析地分析它们来监测反应。
当糊精的分子量达到理想值，即重量平均分子量低于3000Da，通过冷却和中和终止水解。
通过水解，低分子量糊精和葡萄糖形成。
使冷却和中和的糊精溶液进行分离点值为340-800Da的膜纯化过程，以便除去在水解期间形成的葡萄糖和较小的糊精，然后利用折射计测定糊精的含量并利用铜氧化测定还原糖。
通过用硼氢化钠处理来减少还原能力(RC)。在用硼氢化钠处理后，还原能力低于3.0％。
接下来，将溶液中和至pH＜7.0，并随后被除去离子。利用葡聚糖作为标准，色谱分析地测定平均分子量和分子量分布。
实施例2
制备铁糊精化合物
将如上生产的A kg糊精溶液与在水溶液中的B kg FeCl3·6H2O混合。向搅拌的混合物中加入呈饱和水溶液的C kg Na2CO3，接下来利用浓的含水NaOH(27％w/v)(大约251)将pH升高至10.0。
将因此获得的混合物加热至高于85℃，直到它转变成黑色或暗棕色胶体溶液，它能够过滤通过0.45μm过滤器并随后被冷却。在冷却后，利用浓的盐酸(大约2-51)将溶液调节至pH5.8。利用膜方法纯化溶液，直到溶液中的氯含量低于0.15％，在包含5％w/v铁的溶液的基础上计算。
如果溶液的氯含量低于加入的期望的氯化钠，利用盐酸或氢氧化钠将pH值调节至5.6，并将溶液过滤通过0.45μm膜过滤器。
最后，将溶液喷雾干燥以形成铁-糊精粉末。
至于A、B、C的值，见下表。
实施例3
制备铁糊精柠檬酸盐化合物
将如实施例1制备的A kg糊精溶液与在水溶液中的B kg FeCl3·6H2O混合。向搅拌的混合物中加入呈饱和水溶液的C kg Na2CO3，接下来利用浓的含水NaOH(27％w/v)(大约251)将pH升高至10.0。
将因此获得的混合物加热至高于85℃，直到它转变成黑色或暗棕色胶体溶液，它能够过滤通过0.45μm过滤器并随后被冷却。在冷却后，利用浓的盐酸(大约2-51)将溶液调节至pH5.8。利用膜方法纯化溶液，直到溶液中的氯含量低于0.15％，在包含5％w/v铁的溶液的基础上计算。
加入量为D kg的柠檬酸盐，并利用氢氧化钠将pH调节至高于8.0，并通过升高温度至高于100℃ 60分钟来稳定溶液。
随后利用盐酸调节pH值至pH5.6。万一溶液的氯含量低于预期，利用氯化钠调节它。
然后，将溶液过滤通过0.45μm膜过滤器，并喷雾干燥以形成铁-糊精粉末。
表I按照实施例1-3制备的铁糊精化合物 批号 A Kg Mw Da Mn Da RC ％ B Kg C Kg D Kg TS423 207 1500 860 2.8 150 80 0 TS424 207 1500 860 2.8 150 80 3.6 TS425 138 1500 860 2.8 150 80 3.6 TS426 120 2150 910 2.6 150 80 3.6 TS427 120 2150 910 2.6 150 80 0 TS501 105 1544 840 2.6 150 80 3.6
实施例4
分析制备的铁糊精化合物
分析铁糊精制剂的化学组成。结果见下面表II。
利用凝胶渗透色谱法进一步测量形成的复合物的分子量。在包含复合物的溶液中没有检测到游离铁。
表II.复合物的分析数据 批号 铁含量％ 糊精含量％ Mp TS 423 24.7 56.8 465,000 TS 424 23.1 50.2 313,000 TS 425 28.6 40.0 270,000 TS 426 36.9 37.6 282,000 TS 427 33.3 37.6 240,000 TS 501 35.1 N.A. 284,000
N.A.＝未分析
实施例5
铁糊精制剂的毒性检验
作为包含2％Fe(III)的水溶液制备的在表I中公开的制剂能够在120℃高压灭菌而没有副作用。
此外，当作为水溶液制备时，最终的制剂能通过按照USP24进行的异常毒性实验。
实施例6
利用下面的一般过程制备在表III中列出的铁糊精。
一般过程
将在实施例1中制备的还原能力(RC)为1.05％的A kg糊精溶液(批号T02013-1)与在水溶液中的B kg FeCl3·6H2O混合。向搅拌的混合物中加入呈饱和水溶液的Ca kg Na2CO3，接下来通过加入Cb 1浓的NaOH(27％w/v)将pH升高至10。
将因此获得的混合物加热至高于85℃，直到它转变成黑色或暗棕色胶体溶液，它能够过滤通过0.45μm过滤器。在冷却后，利用浓盐酸将溶液调节至pH大约6.0(5.0-7.0)。利用膜分离纯化该溶液，直到溶液中的氯含量低于0.15％，在包含5％w/v铁的溶液的基础上计算。
加入量为D kg的柠檬酸，并利用氢氧化钠将pH调节至高于8.0，并通过提高温度至高于100℃60分钟来稳定溶液。
随后利用盐酸调节pH至大约7.5(6.0-9.0)。万一溶液的氯含量低于预期，利用氯化钠对其进行调节。
接下来将溶液过滤通过0.45μm过滤器，并喷雾干燥以形成铁糊精粉末。
表III
在实施例6中制备的铁糊精 批号 A Kg Mw Da Mn Da RC ％ B Kg Ca Kg Cb l D Kg TZ122 105 1250 860 1.05 300 173 45 7.2 TZ121 105 1250 860 1.05 250 144 45 6.0 TZ118 105 1250 860 1.05 200 116 25 4.8 TZ120 105 1250 860 1.05 150 87 20 3.6
利用相同量的成分制备相似的铁糊精，但是不用柠檬酸(数据未显示)
实施例7
分析实施例6的铁糊精制剂的化学组成。结果见下面表IV。
利用凝胶渗透色谱法进一步测量形成的复合物的分子量。在包含复合物的溶液中没有检测到游离铁。
表IV铁糊精粉末的分析数据 批号 铁含量％ 糊精含量％ TZ 122 40.0 23.3 TZ 121 38.6 27.2 TZ 118 35.8 29.7 TZ 120 31.6 38.6
实施例8
在实施例6中制备的铁糊精化合物被用来制备包含100mg铁(III)/ml(10％)和200mg铁(III)/ml(20％)的水溶液。在121℃高压灭菌前和高压灭菌20和40分钟后分析溶液。在高压灭菌后，铁糊精溶液似乎没有变化。结果见下面表V-VIII。
表V
10％w/v铁糊精溶液的分析数据，在121℃高压灭菌前和高压灭菌20分钟和40分钟后测量的相对粘度。 批号高压灭菌前高压灭菌20分钟高压灭菌40分钟 TZ 122 2.42 2.32 2.63 TZ 121 2.61 2.38 2.65 TZ 118 2.77 2.82 2.70 TZ 120 3.51 3.21 3.36
表VI
10％w/v铁糊精溶液的分析数据，在高压灭菌前和高压灭菌20分钟后和40分钟后测量的峰值分子量。 批号高压灭菌前高压灭菌20分钟高压灭菌40分钟 TZ 122 229,000 224,000 234,000 TZ 121 206,000 207,000 215,000 TZ 118 206,000 209,000 208,000 TZ 120 184,000 188,000 191,000
表VII
20％铁糊精溶液的分析数据，在121℃高压灭菌前和高压灭菌20分钟和40分钟后测量的相对粘度。 批号高压灭菌前高压灭菌20分钟高压灭菌40分钟 TZ 122 9.62 9.37 10.98 TZ 121 10.9 10.7 11.0 TZ 118 12.61 13.2 13.2 TZ 120 23.3 22.8 22.4
表VIII
20％铁糊精溶液的分析数据，在高压灭菌前和高压灭菌20分钟后和40分钟后测量的峰值分子量。 批号高压灭菌前高压灭菌20分钟高压灭菌40分钟 TZ 122 227,000 229,000 219,000 TZ 121 208,000 213,000 239,000 TZ 118 206,000 213,000 217,000 TZ 120 185,000 194,000 194,000
此外，这些制剂可以通过按照USP 24进行的异常毒性实验。