鳗弧菌减毒菌株及其应用 【技术领域】
本发明涉及鳗弧菌减毒菌株及其应用。
背景技术
鉴于世界人口的不断增长及天然渔业的日渐枯竭，水产养殖业显得日益重要。上世纪90年代以来，世界海水养殖业产量以5％的速率递增，2001年全球海水养殖产量已达1510万吨。预计到2010年，我国的海水鱼类养殖产量将达到50万吨，才能满足人们对海水鱼产品的需求。由于水土资源有限，从提高养殖面积来增加产量难以持续发展。因此，规模化、集约化、高密度养殖模式逐渐成为我国海水鱼类养殖业的发展主流。然而随着海水养殖业的不断稳步发展，各种病害问题日益突出，对养殖的产量及成长造成严重影响。世界银行统计报告指出，仅1996年全球在海水养殖业中因病害造成的损失就达30亿美元。在我国，近几年发展起来的海水网箱养殖和工厂化养殖鱼类的突发性、暴发性疾病频繁发生。目前，我国的海水养殖平均死亡损失率在30％以上，每年的经济损失多达160亿元，病害问题已成为制约海水养殖业健康发展的重要因素。
针对各种病害的发生，以抗生素为代表的化学疗法对病害的控制和防治曾发挥了积极作用。但是，这种病害控制措施造成的环境污染、抗药病原的大量出现、水产品的药物残留等负面影响日趋严重。在欧盟、美国和加拿大，以抗生素为主的化学药物在水产养殖业中已逐渐被禁用。其中，根据欧盟食品安全白皮书的规定，欧盟国家禁止使用抗生素药物的养殖水产品进入贸易市场。日本也已开始限制使用多种抗生素药物用于养殖鱼类和虾类病害的防治。
作为世界上的水产养殖大国，我国的海水养殖品出口量只占到了养殖总量的6％左右，一个主要地制约因素就是我国的水产品质量安全问题突出，药物和有害物残留超标严重，成为扩大出口的主要障碍。近几年我国水产品出口因质量安全问题受到欧盟、日本等国家和地区的限制。同时，由于病害严重，突发性强，为规避病害风险，生产者普遍提早收获，造成产品规格偏小，也影响了出口率和出口价格。为了增强水产养殖业的国际市场竞争力，扩大水产养殖的出口创汇，国家已提出并开始推广建立无公害养殖技术规范，其中一个主要技术指标就是禁止使用抗生素药物，以确保养殖水产品的食品质量安全。
为遏制各种环境因素和养殖密度激增等造成的养殖鱼类病害日趋严重的发展趋势，推进海水养殖业的可持续发展，世界粮农组织结合发达国家渔业发展的成功经验(Ormonde P.Fisheries resources：trends in production，utilization and trade.In：Nomura I(ed.).The State of World Fishery andAgriculture 2002.Rome：FAO Information Division，2002，p3-45.)，倡导“系统管理途径”(System management approaches，SMA)养殖模式预防各种病害的发生。这一措施中的一个主要内容就是提倡以疫苗接种为代表的各种免疫防治技术的应用。这些措施的采用将大大减少化学药物的使用，既避免了对环境的污染，又增加了水产品的消费安全性。作为符合环境友好、可持续发展战略的经济有效的疾病控制策略和手段，接种疫苗在现代水产养殖规范中正成为世界各国研究和开发的主要前沿和应用领域。
疫苗具有针对性强、抗病周期长、可终身免疫、效果显著和防治主动的特点。以病原细菌细胞灭活体为基本形式的灭活疫苗(Kill vaccine)为水产养殖病害防治提供了有效手段，但灭活疫苗普遍具有给药不便(注射给药才具有较好的免疫保护力)的技术应用缺陷，对于需要免疫成千上万数量的鱼类养殖业来说极为不便，给药成本往往不能为水产养殖业所承受。而且，对于病害发生严重的鱼苗和幼鱼则无法实施注射给药，同时，对许多病害灭活疫苗往往效果不佳或无效。这一切都给水产养殖病害免疫防治技术的广泛应用带来了阻碍。减毒活菌疫苗因具有给药方便(可浸泡给药)、免疫效价高、成本低廉、可开发广谱疫苗的新技术优势，已成为当前国际上水产养殖用疫苗研究和开发的热点和前沿领域。
鳗弧菌是严重危害我国及世界水产养殖鱼类的一类细菌性重要病原体，主要导致养殖鱼类的出血性败血病等弧菌病，其主要致病毒力因子为鳗弧菌含有的pJM1类质粒编码的铁摄取系统(WuH.，Ma Y.，et al.Completesequences of virulence plasmid pEIB 1 from the marine fish pathogen Vibiroanguillarum strain MVM425 and location of its replication region.Journal ofApplied Microbiology，2004，97：11021-1028)。目前的主要防治手段为使用抗生素(我国)和灭活疫苗(国外普遍采用)。
美国专利有利用转座子插入突变技术构建鳗弧菌减毒活疫苗的报道(UnitedState Patent 5,284,653)。使用转座子等基因重组构建技术开发的减毒活疫苗含有抗生素抗性标记和外源基因片段，可能在使用时传播到其它病原体内，具有先天性的潜在环境危害风险。毒力易回复和不可控的环境传播风险是该种疫苗应用所必须重视和解决的。鉴于此，该类减毒疫苗被包括中国在内的各国生物制品安全检查管理机构审批法规认定为具有较高环境安全风险的生物制品而难以进入商业化开发进程。
【发明内容】
本发明需要解决的技术问题是：提供能用于制备具有环境和产品安全性的防治养殖鱼类弧菌病疫苗的菌株及由其所制备的疫苗。
本发明所说的鳗弧菌减毒菌株是Vibrio anguillarum MVAV6203或Vibrioanguillarum MVAV6204，该两株菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉，武汉大学)，保藏号分别为CCTCC NO：M204066和CCTCC NO：204067，保藏日期2004年9月15日。所述菌株的特性如下：
(1)大小形态：为湾杆菌，弧形，菌体长度约为1.4～2.6μm，直径约为0.5～0.8μm，具有极生单鞭毛可帮助其运动；
(2)适合生长环境：最适生长温度为25～28℃，最适pH7.6，无NaCl或高于6～7％(w/v)NaCl不生长，最适NaCl浓度为2.0～3.0％(w/v)；
(3)培养特性：兼性厌氧，革兰氏阴性，在补加芳香氨基酸的TCBS平板上菌落呈黄色，必须补加芳香氨基酸才能在M9基本培养基中生长。
上述菌株由鳗弧菌MVM425(Vibrio anguillarum MVM425)采用现有技术减毒而得，其中Vibrio anguillarum MVAV6203缺失了Vibrio anguillarum MVM425染色体上芳香氨基酸合成代谢途径的aroC基因，而Vibrio anguillarumMVAV6204同时缺失了Vibrio anguillarum MVM425染色体上的aroC基因和内源性质粒pEIB1上的angE基因。
Vibrio anguillarum MVM425是从我国黄海海域养殖渔场内爆发鳗弧菌弧菌病的病鱼体内分离得到，是一种强致病力野生毒株(马悦等，“海洋鱼类弧菌病疫苗的制备——新型简易鳗弧菌培养基优化”，《高技术通讯》Vol.11(7)，2001)。该野生毒株染色体含有芳香氨基酸代谢途径合成基因aroC(Q.Chen，et al.Chromosome-mediated 2，3-Dihydroxybenzoic acid is a prescursor in the biosynthesisof the plasmid-mediated siderophore anguibactin in Vibrio anguillarum.J.Bacteriol.1994，176：4226-4234)，该基因缺失突变株表现为芳香氨基酸营养缺陷型表征。已证实，该毒株携带有pEIB1毒性质粒，并已完成了其全序列测定工作(Genbank登录号AY255699)，该质粒属于pJM1类野生的游离质粒，编码铁摄取系统。angE基因是pEIB1介导编码的鳗弧菌铁摄取系统合成的重要基因，该基因缺失突变株表现为铁营养缺陷型表征(Qin L.Ma Y.et al.Cloning，identification andexpression of an entE homologue angE from Vibiro anguillarum serotype O1.ArchMicrobiol，2004，181：287-293)。
本发明所说的菌株(Vibrio anguillarum MVAV6203或Vibrio anguillarumMVAV6204)可用于制备防治养殖鱼类弧菌病疫苗，即将所说的菌株经斜面、种子和发酵培养后，与在药理上可接受的配体混合，使菌体细胞浓度为106～109CFU/ml即为防治养殖鱼类弧菌病疫苗。
其中：菌株(或称疫苗株)培养的培养基可选用LB培养基，而其中的蛋白胨可以是酪蛋白胨、胰蛋白胨或大豆蛋白胨，补加NaCl至2.5(w/v)％，同时补加下列氨基酸：苯丙氨酸20mg/L、酪氨酸20mg/L、色氨酸20mg/L、对氨基苯甲酸20mg/L和对羟基苯甲酸20mg/L；本发明选用大豆蛋白胨。培养基必须包含0.2～0.5mM的Fe3+。所述的Fe3+的形式可以是柠檬酸铁铵或FeCl3，优选柠檬酸铁铵。所说的配体推荐使用海水生理盐水，其组份为：NaCl 20g/L，KCl 0.7g/L，MgCl2·6H2O 4.8g/L，NaHCO3 0.11g/L，MgSO4·7H2O 3.5g/L，CaCl2·2H2O 1.6g/L，海水生理盐水的pH＝7.2。
上述疫苗的给药方式可采用注射给药或浸泡给药，当采用注射给药时，给药量为106～108CFU/尾；采用浸泡给药时，浸泡液浓度为106～108CFU/ml，浸泡时间为1～15分钟。
本发明由鳗弧菌野生毒株Vibrio anguillarum MVM425减毒得到二株基因无标记缺失突变株：Vibrio anguillarumMVAV6203(ΔaroC)和Vibrio anguillarumMVAV6204(ΔaroCΔangE)，相对于其野生毒株MVM425具有明显的低毒性，可有效地保护试验用鱼免受强弧菌病致病力鳗弧菌野生株的侵染。后文试验表明，该活疫苗免疫效果显著，具有非常好的水产养殖鱼类弧菌病防治效果。特别是该减毒疫苗可方便地通过浸泡给药获得高效免疫保护力。同时，该减毒疫苗株不含有任何外源基因片段和抗生素抗性标记，毒力和毒力相关基因框内大片段缺失，毒力不可回复，具有技术上的环境和产品安全性，有实际的商业开发应用价值。
【具体实施方式】
下面结合实施例对本发明作进一步阐述，其目的在于更好理解本发明的内容和体现本发明的实质性特点，因此所举之例不应视为对本发明保护范围的限制：
实施例1
鳗弧菌减毒活疫苗制备
培养基与海水生理盐水组成：
1)LB斜面培养基：大豆蛋白胨(Difco)10g/L，酵母浸出物(Merck)5g/L，NaCl25g/L，琼脂18g/L，pH 7.5；
2)种子培养基：大豆蛋白胨(Difco)10g/L，酵母浸出物(Merck)5g/L，NaCl25g/L，苯丙氨酸20mg/L，酪氨酸20mg/L，色氨酸20mg/L，对羟基苯甲酸20mg/L，对氨基苯甲酸20mg/L，pH 7.5；
3)发酵培养基：大豆蛋白胨(Difco)10g/L，酵母浸出物(Merck)5g/L，NaCl25g/L，柠檬酸铁铵0.2-0.5mmol，苯丙氨酸20mg/L，酪氨酸20mg/L，色氨酸20mg/L，对羟基苯甲酸20mg/L，对氨基苯甲酸20mg/L，pH6.8；
4)海水生理盐水：NaCl 20，KCl 0.7，MgCl2·6H2O 4.8，NaHCO3 0.11，MgSO4·7H2O 3.5，CaCl2·2H2O 1.6，g/L，pH7.2，过滤除菌。
疫苗制备：
取接种环保存于LB斜面培养基上的减毒疫苗株(Vibrio anguillarumMVAV6203或Vibrio anguillarum MVAV6204)种子，接种于装有100ml液体LB种子培养基的500ml摇瓶，在28℃下振荡培养(转速200转/分钟)。12小时后，取5ml生长旺盛的菌液(O.D＝4.0左右)接种于100ml新鲜发酵培养基，28℃培养12小时。用无菌海水生理盐水洗涤3次，离心收获菌体(2000×g，15分钟，15℃)，无菌海水生理盐水稀释成一定浓度悬液(106-109CFU/ml)，保藏于15℃备用。
实施例2
以牙鲆为试验动物的半数致死量LD50测定：
试验用鱼先置于SPF(Specific Pathogen Free)实验室适应养殖1周，以剔除不正常个体。在感染试验前，再将SPF试验用鱼放养于感染实验室(ChallengeLab)中20L感染试验水槽，继续喂养1周，每槽放养20条(平均体长12-15cm)。试验水槽每天使用无菌陈海水替换2/3体积养殖水，水温20℃，上下波动2℃。
将试验用鱼随机分组，每组2个水槽平行试验。在感染试验中，每组试验鱼分别用一定浓度梯度剂量(102～108CFU/尾)的野生毒株和减毒疫苗株通过肌肉注射进行人工感染。记录10天内，每组每个感染剂量下每天的死亡尾数，并计算累计死亡率，测定LD50值(见表1)。
表1鳗弧菌毒性株MVM425和减毒株对牙鲆的致病力试验
组别 感染剂量 死亡数(尾) 实验数(尾) 死亡率(％)
MVM425 1×103CFU/尾 10 20 50
MVAV6203 1×108CFU/尾 0 20 0
MVAV6204 1×108CFU/尾 0 20 0
对照 0.85％生理盐水，0.2ml/尾 0 20 0
注：以上数据为2组平行试验的平均值。
上述结果表明，减毒株MVAV6203和MVAV6204具有明显的减毒效应，在所试验浓度范围内对牙鲆基本无毒。
实施例3
以牙鲆为试验动物的注射给药免疫保护试验：
试验牙鲆随机分为12组，每组3个平行水槽，10尾/槽。将制备的减毒活疫苗采用肌肉注射方式免疫。注射免疫剂量为106CFU/尾和108CFU/尾，肌肉注射试验牙鲆。对照组注射无菌生理盐水。分别于4周和8周后将各组免疫牙鲆用鳗弧菌野生毒株活菌(肌肉注射感染108CFU/尾)进行人工感染攻毒。在15天内观察统计对照组和免疫组死亡数，计算每组的免疫保护率(见表2，表3)。
按下列公式计算免疫保护率：
免疫保护率％＝(对照组死亡率-免疫组死亡率％)/对照组死亡率×100％，
表2鳗弧菌减毒活疫苗注射免疫牙鲆4周后攻毒的免疫保护性试验
组别 免疫剂量 试验尾数 死亡尾数 累计死亡率(％) 免疫保护率
(％)
MVAV6203 108CFU/尾 30 0 0 100
MVAV6203 106CFU/尾 30 0 0 100
MVAV6204 108CFU/尾 30 0 0 100
MVAV6204 106CFU/尾 30 0 0 100
免疫对照 生理盐水 30 29 96.7 /
攻击对照 / 30 0 0 /
表3鳗弧菌减毒活疫苗注射免疫牙鲆8周后攻毒的免疫保护性试验
组别 免疫剂量 试验尾数 死亡尾数 累计死亡率(％) 免疫保护率
(％)
MVAV6203 108CFU/尾 30 2 6.7 93.3
MVAV6203 106CFU/尾 30 0 0 100
MVAV6204 108CFU/尾 30 3 1 0 90.0
MVAV6204 106CFU/尾 30 2 6.7 93.3
免疫对照 生理盐水 30 30 100 /
攻击对照 / 30 0 0 /
从上可以看出，两株减毒疫苗具有良好的鳗弧菌野生毒株感染防治效果，注射免疫4周后的免疫保护率为100％，8周后攻毒的免疫保护率为90％以上。在106-108CFU/尾接种剂量范围内表现出十分稳定的给药安全性。
实施例4：
以牙鲆为试验动物的浸泡给药免疫保护试验：
试验牙鲆随机分为12组，每组3个平行水槽，10尾/槽。将制备的减毒活疫苗采用浸泡方式免疫。浸泡免疫是将制备好的疫苗原液用无菌陈海水稀释成106CFU/ml或108CFU/ml，放入浸泡无菌空水槽，然后将各组试验牙鲆依次浸泡处理，浸泡时间控制在1分钟至15分钟之间。对照组不做任何处理。分别于4周和8周后将各组免疫牙鲆用鳗弧菌野生毒株活菌(肌肉注射感染108CFU/尾)进行人工感染攻毒。在15天内观察统计对照组和免疫组死亡数，计算每组的免疫保护率(见表4，表5)。
按下列公式计算免疫保护率：
免疫保护率％＝(对照组死亡率-免疫组死亡率％)/对照组死亡率×100％，
表4鳗弧菌减毒活疫苗浸泡免疫牙鲆4周后攻毒的免疫保护性试验
组别 免疫剂量 试验尾数 死亡尾 累计死亡率 免疫保护率
数 (％) (％)
MVAV6203 108CFU/ml,15min 30 0 0 100
MVAV6203 106CFU/ml，15min 30 0 0 100
MVAV6204 108CFU/ml，15min 30 0 0 100
MVAV6204 106CFU/ml，15min 30 0 0 100
免疫对照 / 30 30 100 /
攻击对照 / 30 0 0 /
表5鳗弧菌减毒活疫苗浸泡免疫牙鲆8周后攻毒的免疫保护性试验
组别 免疫剂量 试验尾数 死亡尾数 累计死亡率(％) 免疫保护率(％)
MVAV6203 108CFU/ml，1min 30 3 10 90
MVAV6203 106CFU/ml，15min 30 1 3.3 96.7
MVAV6204 108CFU/ml，1min 30 4 13.3 86.7
MVAV6204 106CFU/ml，15min 30 2 6.7 93.3
免疫对照 生理盐水 30 30 100 /
攻击对照 / 30 0 0 /
从上可以看出，两株减毒疫苗具有良好的鳗弧菌野生毒株感染防治效果，浸泡免疫4周后的免疫保护率为100％，8周后攻毒的免疫保护率平均90％左右。浸泡时间有效范围在1min-15min，浸泡给药剂量在106-108CFU/ml范围内表现出十分稳定的给药安全性。和注射给药效果相比，浸泡免疫表现出基本一致的免疫效果，说明本发明疫苗可方便地通过浸泡给药方式获得高效力的免疫保护性。