一种诱导干细胞向胰岛样细胞分化的方法及其应用 【技术领域】
本发明涉及生物医学领域，具体地说是利用PDX-1基因在胰腺生长发育过程中的重要作用，构建含该基因的病毒载体，用来感染干细胞；或构建表达载体、纯化PDX-1蛋白，添加于诱导培养液中，诱导干细胞向胰岛样细胞分化，并将获得的细胞植入糖尿病患者体内用于糖尿病的治疗。
背景技术
近几年，胰岛细胞移植治疗糖尿病取得了一些疗效，但供者细胞来源不足、严重的免疫排斥反应等困难却极大的限制了这种疗法的应用。干细胞作为一类具有自我更新及多向分化潜能的细胞，已经逐渐成为人们寻找胰岛细胞的新资源，如骨髓中的间充质干细胞(MSCs)易于分离培养扩增，遗传背景稳定，体内植入反应较弱，在特定的诱导条件下可分化为多种组织细胞，是修复骨、软骨等组织或细胞损伤的首选种子细胞，也是基因治疗的理想靶细胞。
对干细胞进行适当的基因修饰，使之成为能分泌胰岛素的细胞，是治疗I型糖尿病的策略之一，而引入PDX-1基因，即胰腺十二指肠同源框蛋白1，有可能获得能分泌胰岛素的细胞。PDX-1基因在胰腺生长发育过程中扮演了很重要的角色，它不但可以调控胰岛素的表达，还可以调控葡萄糖转运子(Glut-2)、葡萄糖激酶(GK)等基因地表达。
由于干细胞是相对静止的一群细胞，利用脂质体转染效率很低，选用病毒载体则可获得较高的转染效率。腺病毒载体不整合到染色体中，携带的外源基因表达水平高，表达时间短，是转染PDX-1最合适的载体。因为PDX-1是一个调控基因，它可以启动自身基因及下游基因的表达，瞬时表达就足以发挥功能。
利用PDX-1具有蛋白转导结构域的特点，构建表达载体、纯化PDX-1蛋白，添加于诱导培养液中，可以克服基因治疗的不安全因素。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种获得大量胰岛样细胞团以用于糖尿病细胞治疗的方法。采用以下技术方案：
1)构建含PDX-1基因的原核表达载体：表达、纯化PDX-1蛋白。
2)构建含PDX-1基因的病毒载体，以腺病毒载体为例：用电穿孔法使穿梭质粒pAdtrack-CMV-PDX-1与病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组。利用脂质体介导重组腺病毒载体转染293细胞，包装并扩增腺病毒。
3)诱导干细胞分化：通过直接添加PDX-1蛋白，或转染含PDX-1基因的病毒载体，可以诱导干细胞分化为胰岛样细胞。
4)将获得的胰岛样细胞以一定数量植入糖尿病患者体内，腹腔或经肝门脉移植，可以发挥降血糖作用。
本发明的内容未公开发表，本领域的技术人员如不花费创造性劳动根本不能根据现有的技术推断得到本发明的诱导分化方法。
【具体实施方式】
实施例1、PDX-1蛋白的表达、纯化
设计含有NdeI、XhoI位点的PDX-1基因上、下游引物，PCR扩增全长片段，电泳回收，连入pGEM-T easy载体(Promega公司产品)，测序正确后，NdeI、XhoI双酶切目的片段及pET-24a(+)，回收、连接。IPTG诱导表达，并纯化该蛋白。
实施例2、pAdv-PDX-1腺病毒载体的构建
携带PDX-1基因的质粒由美国Hui HongXiang博士馈赠。PDX-1是通过smaI位点插入PBluscriptII KS载体中的。在smaI位点两端选择BamHI及XhoI酶切。BamHI、BglII是同尾酶，故选择BglII及XhoI酶切腺病毒穿梭质粒pAdtrack-cmv。将酶切产物电泳回收，16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂卡那霉素抗性平板筛选，取1μl菌液进行PCR鉴定。提取PCR鉴定为阳性的菌液质粒，行双酶切鉴定。选择BglII及XhoI位点进行酶切鉴定，切出了400bp的小片段及9.7kb的大片段。
选用PmeI酶切1μg穿梭质粒pAdtrack-cmv-PDX-1，70％乙醇沉淀质粒，加5μlH2O。线性化的穿梭质粒与100ng超螺旋质粒pAdEasy-1电穿孔共转化至BJ5183感受态菌中，菌液涂卡那霉素抗性平板筛选。选择20个小克隆，分别接种于含卡那霉素的LB培养液，37℃摇菌过夜。提取质粒，重组质粒均大于40kb，经0.7％琼脂糖电泳可初步鉴定。根据电泳结果，选取质粒作PacI限制性酶切鉴定。重组质粒可被酶切出4.5kb的小片段及38.6kb的大片段。
取鉴定好的重组病毒质粒5μg行PacI限制性酶切。用Lipofectine 2000(Invitrogen公司产品)包裹线性化质粒转染293细胞，转染12h后去掉转染液，加含5％胎牛血清的DMEM培养液继续培养7～10天，当细胞出现CPE时，收集细胞，-70℃和37℃反复冻融三次，离心取上清。用病毒上清再次感染293细胞，收集上清。用TCID50法测定病毒滴度(参考AdEasy Vector Systerm操作方法)，滴度为6.3×107PFU/mL。
实施例3、骨髓间充质干细胞的分离培养和扩增
无菌条件下，挤出肋骨中的骨髓，肋骨可以由非血液系统疾病胸外科手术后获得；或由非血液系统疾病或正常人髂后上棘抽取骨髓，约5ml。向骨髓液中加入含10％胎牛血清的α-MEM(Gibico公司产品)充分混合，1500r/min离心5min，弃上清，再加入5ml完全培养液混匀后轻轻叠加到密度为1.073的Percoll分离液上，1500r/min离心20min，取白细胞膜层以上的部分，加入完全培养液洗两遍。按1×106/ml密度接种于完全培养基中，置37℃，5％CO2饱和湿度的孵箱中培养。培养72h后更换培养液，以后每4d换液一次。细胞达80％融合后用25％胰酶消化，按1∶3传代继续扩增培养。
实施例4、PDX-1诱导骨髓间充质干细胞向胰岛样细胞分化
直接添加PDX-1蛋白于培养液中；或选择病毒感染MSCs合适的MOI(MOI＝150)，根据细胞数，计算所需病毒量感染MSCs，孵育2h后，补加含有10％胎牛血清的α-MEM培养液，继续培养1周，诱导分化。
实施例5、胰岛样细胞团的鉴定
利用RT-PCR鉴定巢蛋白(nestin)，神经生成素3(ngn3)，PDX-1，GK、Glu2、胰岛素，胰高血糖素基因的表达。利用primer 3软件设计基因引物，序列如下： 基因 正义引物 反义引物 退火温 度 长度 nestin AGAGGGGAATTCCTG GAG CTGAGGACCAGGACTCTCTA 54℃ 495bp ngn3 CTTCGCCCACAACTACATC TG ATCTGAGAAAGCCAGACTGC CTG 58℃ 259bp PDX-1 CCCATGGATGAAGTCTACC GTCCTCCTCCTT TTTCCAC 52℃ 262bp GK AGGTAGAGCAGATCCTGGC A TCACCTTCTCCCACCTTCAC 60℃ 241bp Glut-2 CAATGACAGAAGATAAGGT CAC TGCTACTAACATGGCTTTGA 47℃ 395bp 胰岛素 ACCCAGCCGCAGCCTTTGT G TTCCACAATGCCACGCTTCTG C 56℃ 223bp 胰高血 糖素 AGGCAGACCCACTCAGTG A AACAATGGCGACCTCTTCTG 56℃ 308bp
结果表明：
转染PDX-1基因的细胞(1周)弱表达nestin、ngn3、Glut2基因，高表达PDX-1，GK、胰岛素，胰高血糖素基因。
利用免疫组化鉴定胰岛素、胰高血糖素抗原的表达。结果显示：诱导的细胞表达胰岛素、胰高血糖素、生长抑素蛋白。
利用放射免疫分析法检测胰岛素水平。挑取转染PDX-1基因1周的细胞团，置24孔板中，分3孔，每孔约90～100个细胞团，直径约150μm。各孔加入1mL含5.6mmol/L葡萄糖的KRBB缓冲液，置37℃孵箱中孵育1h。弃掉旧缓冲液，以含5.6mmol/L葡萄糖、16.7mmol/L葡萄糖的KRBB缓冲液依次孵育1h，收集上清。收集各孔的细胞团，加入酸乙醇溶液，4℃过夜，用细胞超声破碎仪破细胞，上清保存于-20℃。用放射免疫分析法检测各上清中的胰岛素含量。用BCA(Bicinchoninic acid，二喹啉甲酸)测定法检测细胞内总蛋白含量。结果：诱导的胰岛样细胞团在5.6mmol/L葡萄糖浓度下胞内胰岛素含量为(54.45±9.14)ng/mg蛋白；而在16.7mmol/L葡萄糖浓度下胞内胰岛素含量为(130.14±12.24)ng/mg蛋白。具有一定的糖反应性。
实施例6、体内移植实验
首先制作糖尿病大鼠模型。取成年Wistar大鼠，雌雄不限，体重约180-200g。按70mg/kg剂量给每只大鼠腹腔注射链脲霉素。链脲霉素粉剂用0.1M柠檬酸缓冲液(pH＝4.5)配制成液体使用，现配现用。当大鼠血糖升高(≥16.7mmol/L)且稳定一周，表明糖尿病模型已经建成。无菌条件下，向糖尿病大鼠肾包囊下或肝门脉小分支注入1000个胰岛样细胞团。术后，定期观测血糖情况。结果：糖尿病大鼠在植入细胞后第二周时血糖平均下降5.6mmol/L。表明诱导的胰岛样细胞团具有降血糖作用。