将含有白蛋白的制剂灭菌的方法.pdf

本发明涉及用于将含有白蛋白的制剂灭菌，以降低其中一种或多种活性生物污染物或病原体的含量的方法，所述活性生物污染物或病原体是例如病毒、细菌(包括细胞间和细胞内细菌，例如支原体属、尿原体属、nanobacteria、衣原体属、立克次氏体)、酵母、霉菌、真菌、朊病毒或单独或联合引起TSEs的类似物和/或单细胞或多细胞寄生物。这些方法涉及用辐射法将含有白蛋白的制剂例如血浆蛋白组分灭菌的方法。

1.  用于将含有对辐射敏感的白蛋白的制剂灭菌的方法，所述方法包括：
(i)将至少一种稳定剂以有效保护所述含有白蛋白的制剂免受所述辐射损害的量加到所述含有白蛋白的制剂中；和
(ii)用适宜的射线以有效速率将所述含有白蛋白的制剂照射能将所述含有白蛋白的制剂有效灭菌的时间。

2.  用于将含有对辐射敏感的白蛋白的制剂灭菌的方法，所述方法包括：
(i)将所述含有白蛋白的制剂的残余溶剂含量降低到有效保护所述含有白蛋白的制剂免受所述辐射损害的水平；和
(ii)用适宜的射线以有效速率将所述含有白蛋白的制剂照射能将含有白蛋白的制剂有效灭菌的时间。

3.  用于将含有对辐射敏感的白蛋白的制剂灭菌的方法，所述方法包括：
(i)将所述含有白蛋白的制剂的温度降低到有效保护所述含有白蛋白的制剂免受所述辐射损害的水平；和
(ii)用适宜的射线以有效速率将所述含有白蛋白的制剂辐射能将含有白蛋白的制剂有效灭菌的时间。

4.  用于将含有对辐射敏感的白蛋白的制剂灭菌的方法，所述方法包括：
(i)给所述含有白蛋白的制剂施加至少一种选自下列的稳定化处理：
(a)降低所述含有白蛋白的制剂的残余溶剂含量，
(b)降低所述含有白蛋白的制剂的温度，和
(c)将至少一种稳定剂加到所述含有白蛋白的制剂中；和
(ii)用适宜的射线以有效速率将所述含有白蛋白的制剂照射能将含有白蛋白的制剂有效灭菌的时间，其中所述至少一种稳定化处理和辐射速率一起有效地保护所述含有白蛋白的制剂免受所述辐射损害。

5.  用于将含有对辐射敏感的白蛋白的制剂灭菌的方法，所述方法包括：
(i)给所述含有白蛋白的制剂施加至少两种选自下列的稳定化处理：
(a)降低所述含有白蛋白的制剂的残余溶剂含量，
(b)降低所述含有白蛋白的制剂的温度，和
(c)将至少一种稳定剂加到所述含有白蛋白的制剂中；和
(ii)用适宜的射线以有效速率将所述含有白蛋白的制剂辐射能将含有白蛋白的制剂有效灭菌的时间，其中所述至少两种稳定化处理一起有效地保护所述含有白蛋白的制剂免受所述辐射损害，并且其中所述至少两种稳定化处理可以以任何次序进行。

6.  按照权利要求2、4或5的方法，其中所述溶剂是水。

7.  按照权利要求6的方法，其中通过加入有机溶剂来降低所述残余水含量。

8.  按照权利要求2、4或5的方法，其中所述溶剂是有机溶剂。

9.  按照权利要求2、4或5的方法，其中在将所述残余溶剂含量降低后，将所述含有白蛋白的制剂悬浮在有机溶剂中。

10.  按照权利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述有效速率不超过约3.0kGy/小时。

11.  按照权利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述有效速率不超过约2.0kGy/小时。

12.  按照权利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述有效速率不超过约1.0kGy/小时。

13.  按照权利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述有效速率不超过约0.3kGy/小时。

14.  按照权利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述有效速率超过约3.0kGy/小时。

15.  按照权利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述有效速率是至少约6.0kGy/小时。

16.  按照权利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述有效速率是至少约18.0kGy/小时。

17.  按照权利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述有效速率是至少约30.0kGy/小时。

18.  按照权利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述有效速率是至少约45kGy/小时。

19.  按照权利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述含有白蛋白的制剂保持在低氧气氛中。

20.  按照权利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述含有白蛋白的制剂保持在含有至少一种稀有气体的气氛中。

21.  按照权利要求20的方法，其中所述稀有气体是氩。

22.  按照权利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述含有白蛋白的制剂保持在真空中。

23.  按照权利要求2、4或5的方法，其中用选自下列的方法将所述残余溶剂含量降低：冻干、干燥、浓缩、加入溶质、蒸发、化学萃取、喷雾干燥和玻璃化。

24.  按照权利要求2、4或5的方法，其中所述残余溶剂含量小于约15％。

25.  按照权利要求2、4或5的方法，其中所述残余溶剂含量小于约10％。

26.  按照权利要求2、4或5的方法，其中所述残余溶剂含量小于约3％。

27.  按照权利要求2、4或5的方法，其中所述残余溶剂含量小于约2％。

28.  按照权利要求2、4或5的方法，其中所述残余溶剂含量小于约1％。

29.  按照权利要求2、4或5的方法，其中所述残余溶剂含量小于约0.5％。

30.  按照权利要求2、4或5的方法，其中所述残余溶剂含量小于约0.08％。

31.  按照权利要求1、2、3、4或5的方法，其中在所述照射所述含有白蛋白的制剂的步骤之前，把至少一种增敏剂加到所述含有白蛋白的制剂中。

32.  按照权利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述含有白蛋白的制剂含有至少一种选自下列的生物污染物或病原体：病毒、细菌、酵母、霉菌、真菌、朊病毒或单独或联合引起TSE的类似物和/或单细胞或多细胞寄生物。

33.  按照权利要求1、4或5的方法，其中所述至少一种稳定剂是抗氧化剂。

34.  按照权利要求1、4或5的方法，其中所述至少一种稳定剂是自由基清除剂。

35.  按照权利要求1、4或5的方法，其中所述至少一种稳定剂是联合稳定剂。

36.  按照权利要求1、4或5的方法，其中所述至少一种稳定剂是配体。

37.  按照权利要求36的方法，其中所述配体是肝素。

38.  按照权利要求1、4或5的方法，其中所述至少一种稳定剂减轻反应性氧物质引起的损害。

39.  按照权利要求1、4或5的方法，其中所述至少一种稳定剂选自：抗坏血酸或其盐或酯；谷胱甘肽；6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-甲酸；尿酸或其盐或酯；蛋氨酸；组氨酸；N-乙酰半胱氨酸；硫辛酸；甲醛次硫酸钠；五倍子酸或其衍生物；五倍子酸丙酯和它们两种或多种的混合物。

40.  按照权利要求39的方法，其中所述两种或多种附加稳定剂的混合物选自：抗坏血酸、或其盐或酯与尿酸、或其盐或酯的混合物；抗坏血酸、或其盐或酯与6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-甲酸的混合物；抗坏血酸、或其盐或酯、尿酸、或其盐或酯与6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-甲酸的混合物；和尿酸、或其盐或酯；硫辛酸；甲醛次硫酸钠；五倍子酸或其衍生物；五倍子酸丙酯与6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-甲酸的混合物。

41.  按照权利要求1、4或5的方法，其中所述至少一种稳定剂是二肽类稳定剂。

42.  按照权利要求41的方法，其中所述二肽类稳定剂选自甘氨酰基-甘氨酸(Gly-Gly)、肌肽和鹅肌肽。

43.  按照权利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述辐射是粒子辐射或电磁辐射或它们的混合物。

44.  按照权利要求43的方法，其中所述电磁辐射选自无线电波、微波、可见和不可见光、紫外线、X-射线辐射、γ辐射和它们的联合。

45.  按照权利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述辐射是γ辐射。

46.  按照权利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述辐射是E-射线辐射。

47.  按照权利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述辐射是可见光。

48.  按照权利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述辐射是紫外线。

49.  按照权利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述辐射是X-射线辐射。

50.  按照权利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述辐射是多色可见光。

51.  按照权利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述辐射是红外线。

52.  按照权利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述辐射是一种或多种波长的可见光与紫外线的联合。

53.  按照权利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述辐射是在室温进行的。

54.  按照权利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述辐射是在低于室温的温度进行的。

55.  按照权利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述辐射是在低于所述含有白蛋白的制剂的冰点的温度进行的。

56.  按照权利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述辐射是在低于所述含有白蛋白的制剂的低共熔点的温度进行的。

57.  按照权利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述辐射是在高于室温的温度进行的。

58.  组合物，其中包含至少一种含有白蛋白的制剂和一定量的至少一种稳定剂，其中所述量的稳定剂能有效保护所述含有白蛋白的制剂在用辐射灭菌后仍可实现其预期应用。

59.  包含至少一种含有白蛋白的制剂的组合物，其中所述含有白蛋白的制剂的残余溶剂含量处于能有效保护所述含有白蛋白的制剂在用辐射灭菌后仍可实现其预期应用的水平上。

60.  权利要求59的组合物，其中所述残余溶剂含量低于约15％。

61.  权利要求59的组合物，其中所述残余溶剂含量低于约10％。

62.  权利要求59的组合物，其中所述残余溶剂含量低于约5％。

63.  权利要求59的组合物，其中所述残余溶剂含量低于约2％。

64.  权利要求59的组合物，其中所述残余溶剂含量低于约1％。

65.  权利要求59的组合物，其中所述残余溶剂含量低于约0.5％。

66.  权利要求59的组合物，其中所述残余溶剂含量低于约0.08％。

67.  权利要求58或59的组合物，其中所述含有白蛋白的制剂是玻璃状或玻璃化的。

68.  权利要求58或59的组合物，其中所述含有白蛋白的制剂还包含至少一种选自单克隆免疫球蛋白、多克隆免疫球蛋白、糖苷酶、硫酸酯酶、尿激酶、凝血酶和因子VIII的蛋白。

69.  权利要求59的组合物，其中所述含有白蛋白的制剂的蛋白浓度为至少约0.5％。

70.  权利要求59的组合物，其中所述含有白蛋白的制剂的蛋白浓度为至少约1％。

71.  权利要求59的组合物，其中所述含有白蛋白的制剂的蛋白浓度为至少约5％。

72.  权利要求59的组合物，其中所述含有白蛋白的制剂的蛋白浓度为至少约10％。

73.  权利要求59，其中所述含有白蛋白的制剂的蛋白浓度为至少约15％。

74.  权利要求59的组合物，其中所述含有白蛋白的制剂的蛋白浓度为至少约20％。

75.  权利要求59，其中所述含有白蛋白的制剂的蛋白浓度为至少约25％。

76.  权利要求59的组合物，其中所述含有白蛋白的制剂的蛋白浓度为至少约50％。

77.  权利要求59的组合物，其中所述含有白蛋白的制剂的蛋白浓度能有效地保护所述含有白蛋白的制剂免受辐射损害。

78.  按照权利要求6的方法，其中在将所述残余溶剂含量降低后，将所述含有白蛋白的制剂悬浮在有机溶剂中。

79.  治疗血容量减少性休克的方法，包括对有此需要的人给药有效量的含有白蛋白的制剂，其中所述制剂已经按照权利要求1、2、3、4、或5的方法进行过灭菌。

80.  治疗烧伤的方法，包括对有此需要的人给药有效量的含有白蛋白的制剂，其中所述制剂已经按照权利要求1、2、3、4、或5的方法进行过灭菌。

81.  在接受心肺旁路术的患者中保持液体容量方法，包括对有此需要的人给药有效量的含有白蛋白的制剂，其中所述制剂已经按照权利要求1、2、3、4、或5的方法进行过灭菌。

82.  治疗急性肝功能衰竭的方法，包括对有此需要的人给药有效量的含有白蛋白的制剂，其中所述制剂已经按照权利要求1、2、3、4、或5的方法进行过灭菌。

83.  在患有选自下列的病症的患者中预防富含蛋白质的流体螯合的方法：急性腹膜炎、胰腺炎、纵隔炎和过度蜂窝织炎，所述方法包括对有此需要的人给药有效量的含有白蛋白的制剂，其中所述制剂已经按照权利要求1、2、3、4、或5的方法进行过灭菌。

84.  治疗低白蛋白血症的方法，包括对有此需要的人给药有效量的含有白蛋白的制剂，其中所述制剂已经按照权利要求1、2、3、4、或5的方法进行过灭菌。

85.  治疗有或没有水肿的低蛋白血症的方法，包括对有此需要的人给药有效量的含有白蛋白的制剂，其中所述制剂已经按照权利要求1、2、3、4、或5的方法进行过灭菌。

86.  治疗成人呼吸窘迫综合症的方法，包括对有此需要的人给药有效量的含有白蛋白的制剂，其中所述制剂已经按照权利要求1、2、3、4、或5的方法进行过灭菌。

87.  治疗新生儿溶血疾病的方法，包括对有此需要的人给药有效量的含有白蛋白的制剂，其中所述制剂已经按照权利要求1、2、3、4、或5的方法进行过灭菌。

88.  治疗急性肾病的方法，包括对有此需要的人给药有效量的含有白蛋白的制剂，其中所述制剂已经按照权利要求1、2、3、4、或5的方法进行过灭菌。

89.  在经受肾透析的患者中预防休克或低血压的方法，包括对有此需要的人给药有效量的含有白蛋白的制剂，其中所述制剂已经按照权利要求1、2、3、4、或5的方法进行过灭菌。

90.  治疗由于烧伤、挤压伤、腹部急症、脱水、感染或其中血浆流体而不是红细胞显著损失的其它原因引起的休克的方法，所述方法包括对有此需要的人给药有效量的含有白蛋白的制剂，其中所述制剂已经按照权利要求1、2、3、4、或5的方法进行过灭菌。

91.  治疗由于出血引起的休克的方法，包括对有此需要的人给药有效量的含有白蛋白的制剂，其中所述制剂已经按照权利要求1、2、3、4、或5的方法进行过灭菌。

92.  培养细胞的改进方法，其中所述改进包括将含有白蛋白的制剂加到培养所述细胞的生长培养基中，所述制剂已经按照权利要求1、2、3、4、或5的方法进行过灭菌。

93.  通过培养细胞生产细胞代谢产品的改进方法，其中所述改进包括将含有白蛋白的制剂加到培养所述细胞的生长培养基中，所述制剂已经按照权利要求1、2、3、4、或5的方法进行过灭菌。

94.  按照权利要求93的方法，其中所述产品是蛋白。

95.  按照权利要求93的方法，其中所述产品是重组蛋白。

96.  权利要求58或59的组合物，其中所述含有白蛋白的制剂还包含选自下列的至少一种生物材料：血红蛋白、抗凝血酶III、多糖、疫苗、胶原、明胶、胰蛋白酶、胎牛血清、运铁蛋白、胰岛素、人生长激素、因子IX、纤维蛋白原、因子XIII、因子XIIIa、因子VII、因子VIIa、生长因子、免疫毒素、骨形态发生蛋白、成骨蛋白、细胞因子、因子XI和血浆。

97.  权利要求58或59的组合物，其中所述含有白蛋白的制剂还包含选自下列的至少一种组织：心脏瓣膜、皮肤、骨、血管、神经、韧带和角膜。

将含有白蛋白的制剂灭菌的方法
                     发明领域
本发明涉及用于将含有白蛋白的制剂灭菌，以降低其中一种或多种活性生物污染物或病原体的含量的方法，所述活性生物污染物或病原体是例如病毒、细菌(包括细胞间和细胞内细菌，例如支原体属、尿原体属、nanobacteria、衣原体属、立克次氏体)、酵母、霉菌、真菌、朊病毒或单独或联合引起TSE的类似物和/或单细胞或多细胞寄生物。本发明特别涉及用辐射法将含有白蛋白的制剂例如血浆蛋白组分(PPF)产品灭菌的方法。
                      发明背景
白蛋白是高度溶解的椭圆体状蛋白质(MW66,500)，其构成血浆胶体渗透压的70-80％。因此，白蛋白对于调节循环血液的容量相当重要。当静脉内注射时，5％的白蛋白将会使循环血浆容量增加约相当于所输注的体积。这种外加的液体降低了血浓度，并使血液粘度得以降低。容量扩大的程度和持续时间取决于初始血容量。当治疗血容量减少的患者时，所输注的白蛋白的作用可以持续多个小时。在具有正常血容量的个体中，血液稀释持续很短的时间。
白蛋白还是一种输送蛋白质，并在循环中结合天然存在的、治疗性的、和有毒的物质。
白蛋白遍布于细胞外的水中，并且身体白蛋白总量的60％以上位于血管外流体隔室中。在一个体重70千克的人中，全部的白蛋白约是350克；其具有15-20天的循环生命期，每天约更新15克。
阻止或逆转外周水肿所必需的最小血清白蛋白水平是未知的。虽然毫无疑问它在患者之间是有差异的，有若干证据表明，其每分升减少接近2.5克。这种浓度造成了20mmHg的血浆胶体渗透压(相当于5.2g/dL的总蛋白质浓度)。
治疗上经常将含有白蛋白，包括血浆蛋白组分的制剂提供给人和动物。例如，将含有白蛋白的制剂频繁给药于患有一种或多种下列适应症的人：伴随或不伴随休克的血容量减少；低白蛋白血症，其可由下述原因引起：白蛋白产生不足(起因于营养不良、烧伤、严重损伤、先天性白蛋白缺乏血症、肝病、感染、恶性肿瘤或内分泌失调)、过度分解代谢(起因于烧伤、严重损伤、胰腺炎、甲状腺毒症、天疱疮或肾病)、身体白蛋白损失(起因于出血、肾排泄过度、烧伤渗出物、渗出性肠病或表皮脱落性皮肤病)和/或体内白蛋白再分配(起因于严重损伤、腹水肝硬化或各种炎症)；心肺旁路手术之前或期间；和用于烧伤或肝硬化的治疗。
多种不同的用于治疗的含有白蛋白的制剂可以或已经可以从市场上买到，包括例如Albuminar(Centeon/Aventis Behring)、Buminate(Baxter Laboratories)、Plasbumin(BayerBiological)、Albutein(Alpha Therapeutic)、白蛋白(人)(Immuno-U.S.)、Albumarc(American Red Cross)和人血清白蛋白(Swiss Red Cross)。各种血浆蛋白组分产品也可以或已经可以从市场上买到，包括，例如Plasma-Plex(Centeon/Aventis Behring)、Protenate(Baxter Laboratories)、Plasmanate(BayerBiological)和Plasmatein(Alpha Therapeutic)。
白蛋白也在治疗用的天然或重组蛋白质的制剂中用做稳定剂。例如，最近，在含有用于血友病A的因子VIII(例如得自Baxter-Hyland/Immuno的Recombinate)、用于多发性硬化的β-1b干扰素(例如得自Berlex Laboratories的Betaseron)、用于贫血的红细胞生成素(例如得自Amgen的Epogeng)、用于Gaucher’s病的阿糖脑苷酶—一种改性形式的β-葡糖脑苷脂酶(例如得自Genzyme的Ceredase)和用于遗传缺陷的抗凝血酶III(例如得自Bayer的Thrombate或得自Pharmacia & UpJohn的Atnativ)的治疗制剂中，白蛋白作为稳定剂存在。在这样的制剂中，白蛋白占全部蛋白质含量的99％以上。
白蛋白也在疫苗制剂中用作稳定剂，所述疫苗制剂是例如蜱传脑炎(TBE)病毒疫苗和麻疹、流行性腮腺炎和风疹病毒疫苗(例如得自Merck的MMR_II)、狂犬病疫苗(例如得自Evans/Medeva的Evans PolioVaccine)。在这样的制剂中，白蛋白也占全部蛋白质含量的99％以上。
含有白蛋白的制剂也在细胞培养用的培养基中用做营养剂，包括细胞(重组等)培养物生产所要求的产品和疫苗生产。这样的制剂可以例如从Sigma-Aldrich、Irvine Scientific、Intergen和ValleyBiomedical购得。
很多为人、兽医、诊断和/或试验使用而制备的含有白蛋白的制剂会含有有害的和具有潜在危险的生物污染物或病原体，例如病毒、细菌(包括细胞间和细胞内细菌，例如支原体属、尿原体属、nanobacteria、衣原体属、立克次氏体)、酵母、霉菌、真菌、朊病毒或单独或联合引起TSE的类似物和/或单细胞或多细胞寄生物。所以，在产品使用前将任何生物污染物或病原体进行灭活是极为重要的。当将物质直接给药于患者，例如在输血、血液因子替代治疗、器官移植和通过静脉内、肌内或其它形式地注射或输注来进行的人治疗中，这是尤其关键的。对于含有各种血浆和/或血浆衍生物的在培养基中制备的或者经由细胞或重组细胞培养制备的生物材料或可能遭受支原体菌属、朊病毒、细菌、病毒和其它生物污染物或病原体污染的生物材料来说，也是很关键的。
大多数生产生物材料的操作涉及将生物材料进行关于一种或多种特定生物污染物或病原体的筛选或测试，而不是将污染物或病原体从材料中除去或将之灭活。仅不使用对生物污染物或病原体测试呈阳性的材料。筛选操作的实例包括对来自献血者的人血中的特定病毒进行测试。然而，这样的操作并不总是可靠的，并且不能探测到某些病毒的存在，特别是以非常低的数目存在的病毒。鉴于与假阴性结果所带来的后果，这降低了测试的价值或确定性。在某些情况下，例如在获得性免疫缺乏综合症(爱滋病)情况下，假阴性结果能够对生命构成威胁。此外，在某些情况下，即使不需要数月，也需要数周才能确定物质是否被污染。因此，在制备生物学材料的过程中或之后，需要使用一定的技术将污染物或病原体杀死或灭活。
而且，迄今为止，没有用于鉴定生物学材料内的朊病毒的、适于筛选出潜在供体或感染材料的可靠测试或测定。这使得对于将朊病毒消灭于生物学材料内，同时仍然保持所要求的材料活性的有效方法的需要提高了。
在进行测定灭活病毒的技术能力中，很少使用有关的确切病毒。这是由于对进行试验的工作人员的安全考虑以及与容器设备和废物的处理有关的困难和费用。在此场所，使用相同科和纲的模型病毒。
一般说来，最难灭活的病毒是那些具有由蛋白质形成的外壳的病毒，而它们当中最难灭活的又是那些具有最小尺寸的病毒，这是大家公认的。这在γ辐射和大多数其它形式的辐射中已经得到证明，之所以如此是因为这些病毒的极小尺寸与很小的基因组有关。辐射到分子上的直接效果的大小与分子大小成正比，就是说，目标分子越大，效果就越好。作为必然的结果，在γ辐射中已经被证实，病毒的基因组越小，灭活病毒所需要的辐射剂量就越高。
在关系到得自人和动物的生物学材料的病毒当中，最小的因而也就是最难灭活的病毒属于细小病毒(Parvoviruses)和稍大的包被蛋白质的肝炎(Hepatitis)病毒。在人中，细小病毒属B19和甲型肝炎病毒是所担心的病毒。在得自猪的材料中，相应的最小病毒是猪细小病毒。因为这种病毒对人无害，所以经常被选择作为人B19细小病毒的模型病毒。这种模型细小病毒病毒的灭活例证被看作这样的充分证据，即所使用的方法也会杀死人B19病毒和甲型肝炎病毒，并且通过引申，该方法也会杀死较大的和硬度较弱的病毒如HIV、CMV、乙型和丙型肝炎病毒以及其它病毒。
最近的努力集中在将产品中的污染物除去或将之灭活的方法上。这样的方法包括加热处理、过滤和向产品中加入化学灭活剂或增敏剂。
目前的美国食品和药品监督管理局的标准要求是，含有白蛋白的制剂的加热处理应当在约60℃加热最少10个小时，而这会对敏感的生物学材料造成损害。事实上，加热灭活能够破坏某些生物学材料的生物学活性的50％或更多。
过滤涉及对产品进行过滤以便用物理方式除去污染物。遗憾的是，这种方法也会将具有高分子量的产品除去。而且，在某些情况下，小的病毒用过滤器还是除不掉。
化学增敏操作涉及加入与病毒的DNA/RNA结合并通过UV或者其它辐射激活的有毒物质。辐射产生反应中间体和/或自由基，其与病毒的DNA/RNA结合，将DNA/RNA骨架中的化学键打破，和/或将其交联或复合，使得病毒不再能够复制。该操作需要将未结合的增敏剂从产品中洗出来，因为增敏剂是有毒性的，否则将由于诱变和致癌作用而不能施用给患者，
用γ射线照射产品是将产品灭菌的另一种方法。当给予高总剂量时，γ射线能够有效地消灭病毒和细菌(Keathly等人，“辐射后还有生物吗？第2部分”BioPharm 1993，七月至八月，和Leitman，“USeof Blood Cell Irradiation in the Prevention of Post TransfusionGraft-vs-Host Disease”，Transfusion Science 10：219-239(1989))。然而，本领域发表的文献告戒，γ辐射会损害对辐射敏感的产品，例如血液、血液产品、蛋白质和含蛋白质的产品。特别是，已经证明，高辐射剂量对红细胞、血小板和粒细胞是有害的(Leitman)。美国专利4,620,908揭示，为了保持蛋白质产品的活力，辐射之前必须将蛋白质产品冷冻。该专利认为，“如果使用γ辐射而同时蛋白质材料处于例如室温，该材料也将会遭到彻底的破坏，就是说，材料的活性会变得如此低以至于事实上是无效的”。遗憾的是，很多敏感的生物材料，例如单克隆抗体(Mab)，如果为了辐射目的而经受冷冻然后在给药患者之前融化，就会丧失活力和活性。
鉴于上述的困难，仍然需要能够有效地降低活性生物污染物或病原体的水平而同时对制剂不造成不利影响的、将含有白蛋白的制剂灭菌的方法。
                      发明概述
因此，本发明的目的是提供通过降低活性生物污染物或病原体的水平而同时对制剂不造成不利影响来将含有白蛋白的制剂灭菌的方法。本发明的其它目的、特征和优点将在随后的优选实施方案的详细描述中加以阐明，并且通过该描述将会部分地显而易见或通过本发明的实施来获悉。本发明的这些目的和优点可通过说明书和权利要求书中特别指出的组合物和方法来实现和达到。
根据这些和其它的目的，本发明的第一个实施方案涉及用于将含有对辐射敏感的白蛋白的制剂灭菌的方法，所述方法包括：(i)将至少一种稳定剂以有效保护所述含有白蛋白的制剂免受辐射损害的量加到含有白蛋白的制剂中；和(ii)用适宜的射线以有效速率将所述含有白蛋白的制剂照射能将含有白蛋白的制剂有效灭菌的时间。
本发明的另一个实施方案涉及用于将含有对辐射敏感的白蛋白的制剂灭菌的方法，所述方法包括：(i)将所述含有白蛋白的制剂的残余溶剂含量降低到有效保护含有白蛋白的制剂免受辐射损害的水平；和(ii)用适宜的射线以有效速率将所述含有白蛋白的制剂照射能将含有白蛋白的制剂有效灭菌的时间。
本发明的另一个实施方案涉及用于将含有对辐射敏感的白蛋白的制剂灭菌的方法，所述方法包括：(i)将所述含有白蛋白的制剂的温度降低到有效保护含有白蛋白的制剂免受辐射损害的水平；和(ii)用适宜的射线以有效速率将所述含有白蛋白的制剂照射能将含有白蛋白的制剂有效灭菌的时间。
本发明的另一个实施方案涉及用于将含有对辐射敏感的白蛋白的制剂灭菌的方法，所述方法包括：(i)给所述含有白蛋白的制剂施加至少一种选自下列的稳定化处理：(a)降低所述含有白蛋白的制剂的残余溶剂含量，(b)将至少一种稳定剂加到所述含有白蛋白的制剂中；和(c)降低所述含有白蛋白的制剂的温度；和(ii)用适宜的射线以有效速率将所述含有白蛋白的制剂照射能将含有白蛋白的制剂有效灭菌的时间，其中所述稳定化处理和辐射速率一起有效地保护所述含有白蛋白的制剂免受辐射损害。
本发明的另一个实施方案涉及用于将含有对辐射敏感的白蛋白的制剂灭菌的方法，所述方法包括：(i)给所述含有白蛋白的制剂施加至少两种选自下列的稳定化处理：(a)降低所述含有白蛋白的制剂的残余溶剂含量，(b)将至少一种稳定剂加到所述含有白蛋白的制剂中；和(c)降低所述含有白蛋白的制剂的温度；和(ii)用适宜的射线以有效速率将所述含有白蛋白的制剂辐射能将含有白蛋白的制剂有效灭菌的时间，其中所述至少两种稳定化处理可以以任何次序进行，并且一起有效地保护所述含有白蛋白的制剂免受辐射损害。
本发明还提供了包含白蛋白和一定量的至少一种稳定剂的含白蛋白制剂，其中所述量的稳定剂能有效保护制剂在用辐射灭菌后仍可实现其预期应用。
本发明还提供了包含白蛋白的制剂，其中残余溶剂含量已被降至能有效保护制剂在用辐射灭菌后仍可实现其预期应用的水平。
本发明还提供了包含白蛋白和一定量的至少一种稳定剂的含白蛋白制剂，其中残余溶剂的含量已被降低，并且其中所述量的稳定剂和所述水平的残余溶剂含量一起有效保护制剂在用辐射灭菌后仍可实现其预期应用。
本发明还提供了包含白蛋白的制剂，其中制剂的总蛋白浓度能有效保护制剂在用辐射灭菌后仍可实现其预期应用的水平。
                    附图简述
附图1A、1B和1C显示了在不同水平的残余溶剂含量以及在或不在挥发性稳定剂存在下照射的血浆蛋白组分。
附图2A-2F显示了进行了辐射和用于瘙痒病感染性分析的人白蛋白(25％)，所述白蛋白用得自具有改变瘙痒病的仓鼠(263K株)的10％脑匀浆以1∶100比例感染。
附图3A和3B显示了以10或40kGy的总剂量照射的冻干白蛋白(含有5％尿激酶)。
附图4A-4B显示了预先用或未用氩气吹扫的照射的白蛋白样本。
附图5A-5F显示了以18.1、23和30.4kGy的总剂量照射，通过用于聚集和裂解的SDS-PAGE和用于二聚和聚合的HPLSEC进行分析的白蛋白溶液(25％)样本。
附图6A是表明γ辐射后掺入PPV的血浆蛋白质组分中病毒载量减少的图。附图6B-6C是表明照射的血浆蛋白组分的SDS-PAGE分析结果的凝胶。
附图7是表明含有白蛋白和因子VIII的制剂在γ照射后因子VIII的活性的图。
                优选实施方案的详细描述
A.定义
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本领域技术人员所通常理解的相同含义。
除非另有说明，本文所用的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数含义。
本文所用术语“含有白蛋白的制剂”意指任何由活的生物体衍生或获得的制剂，其含有血液蛋白质白蛋白、重组白蛋白或转基因白蛋白，重组白蛋白和转基因白蛋白都具有天然序列或改性序列，或其变型或衍生物。含有白蛋白的制剂的实例包括但不限于Albuminar(Centeon/Aventis Behring)、Buminate(Baxter Laboratories)、Plasbumin(Bayer Biological)、Albutein(Alpha Therapeutic)、白蛋白(人)(Immuno-U.S.)和Albumarc(American Red Cross)以及血浆蛋白组分产品，包括例如Plasma-Plex(Centeon/AventisBehring)、Protenate(Baxter Laboratories)、Plasmanate(Bayer Biological)和Plasmatein(Alpha Therapeutic)。
本文所用术语“灭菌”意指将在依据本发明处理的含有白蛋白的制剂中发现的至少一种活性生物污染物或病原体的水平降低。
本文所用术语“生物材料”意指任何由活的生物体衍生或获得的物质。生物材料的实例包括但不限于下列：细胞；组织；血液或血液组分；蛋白，包括重组蛋白或转基因蛋白，以及蛋白质性质的材料；酶，包括消化酶，例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-半乳糖苷酶和艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶；免疫球蛋白，包括单和多免疫球蛋白；植物药材；食品等。优选的生物材料包括但不限于下列：韧带；腱；神经；骨，包括去除矿物质的骨基质、移植物、关节、股骨、股骨头等；牙齿；皮移植片；完整或加工过的骨髓，包括骨髓细胞悬浮液；心脏瓣膜；软骨；角膜；动脉和静脉；器官，包括移植器官，例如心脏、肝、肺、肾、肠、胰腺、肢和指；脂质；碳水化合物；胶原，包括天然的、无纤维的(afibrillar)、atelomeric、可溶的和不可熔的、重组和转基因的胶原，二者具有天然序列或改性序列；壳多糖及其衍生物，包括NO-羧基脱乙酰壳多糖(NOCC)；干细胞、朗罕氏细胞岛以及其它移植细胞，包括基因改变的细胞；红细胞；白细胞，包括单核细胞；和血小板。
本文所用术语“生物污染物或病原体”意指这样的生物污染物或病原体，其在直接或间接与含有白蛋白的制剂接触时，可以对含有白蛋白的制剂或其接受者产生有害的作用。这样的其它的生物污染物或病原体包括本领域技术人员已知的通常存在于或感染含白蛋白制剂的各种各样的病毒、细菌(包括细胞间和细胞内细菌，例如支原体属、尿原体属、nanobacteria、衣原体属、立克次氏体)、酵母、霉菌、真菌、朊病毒或单独或联合引起TSEs的物质和/或单细胞或多细胞寄生物。其它生物污染物或病原体的实例包括但不限于下列：病毒，例如人免疫缺陷病毒和其它的逆转录病毒、疱疹病毒、线状病毒、circoviruses、副粘液病毒、巨细胞病毒、肝炎病毒(包括甲型、乙型和丙型肝炎病毒及其它们的变种)、痘病毒、披膜病毒、Ebstein-Barr病毒和细小病毒；细菌，例如埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、链球菌属(Streptococcus)以及葡糖球菌属(Staphalococcus)；nanobacteria；寄生虫，例如锥虫属和疟疾寄生虫，包括疟原虫属类；酵母；霉菌；真菌；支原体和尿原体属、衣原体属；立克氏体，例如Coxiella burnetti；和朊病毒以及已知在哺乳动物中单独或联合引起传播性海绵状脑病(TSEs)，例如瘙痒病、传播性貂脑病、慢性消耗病(通常见之于骡、鹿和麋鹿)、猫海绵状脑病、牛海绵状脑病(疯牛病)、Creutzfeld-Jakob病(包括变异的CJD)、致命性家族失眠症、Gerstmann-Straeussler-Scheinker综合症、kuru和Alpers综合症的类似物。本文所用术语“活性生物污染物或病原体”意指这样的生物污染物或病原体，其能够单独或与另一种因子，例如另一种生物污染物或病原体或天然蛋白(野生型或突变型)、或抗体联合在含有白蛋白制剂和/或其接受者中产生有害的作用。
本文所用术语“血液组分”意指可以从全血中分离出来的一种或多种组分，包括但不限于下列：细胞血液组分，例如红细胞、白细胞和血小板；血液蛋白，例如血液凝固因子、酶、白蛋白、纤溶酶原、纤维蛋白原和免疫球蛋白；以及液态血液组分，例如血浆、血浆蛋白组分(PPF)、冷凝蛋白、血浆组分和含血浆组合物。
本文所用术语“细胞血液组分”意指全血的一种或多种组分，包括细胞，例如红细胞、白细胞、干细胞和血小板。
本文所用术语“血液蛋白”意指通常在全血中发现的一种或多种蛋白。在哺乳动物，包括人中发现的血液蛋白的实例包括但不限于下列：凝血蛋白，包括维生素K依赖型，例如因子VII和因子IX，和非维生素K依赖型，例如因子VIII和von Willebrands因子；白蛋白；脂蛋白，包括高密度脂蛋白和低密度脂蛋白；补体蛋白；球蛋白，例如免疫球蛋白IgA、IgM、IgG和IgE；等。优选的一组血液蛋白包括因子I(纤维蛋白原)、因子II(前凝血酶)、因子III(组织因子)、因子V(前促凝血球蛋白)、因子VI(促凝血球蛋白)、因子VII(转变加速因子前体，血清凝血酶原转变)、因子VIII(抗血友病因子A)、因子IX(抗血友病因子B)、因子X(Stuart-Prower因子)、因子XI(血浆促凝血酶原激酶前体)、因子XII(哈格曼因子)、因子XIII(protransglutamidase)、yon Willebrands因子(vWF)、因子Ia、因子IIa、因子IIIa、因子Va、因子VIa、因子VIIa、因子VIIIa、因子Ixa、因子Xa、因子XIa、因子XIIa和因子XIIIa。另一组优选的血液蛋白包括在红细胞内部发现的蛋白，例如血红蛋白和各种各样的生长因子，以及这些蛋白的衍生物。还有一组优选的血液蛋白类包括在市售的血浆蛋白组分产品例如Plasma-Plex(Centeon/AventisBehring)、Protenate(Baxter Laboratories)、Plasmanate(Bayer Biological)和Plasmatein(Alpha Therapeutic)中发现的蛋白。
本文所用术语“液态血液组分”意指全血的一种或多种液态非细胞组分，例如血浆(在凝固前发现的人或动物全血的液态非细胞部分)和血清(在凝固后发现的人或动物全血的液态非细胞部分)。
本文所用术语“生物相容溶液”意指这样的溶液，含有白蛋白的制剂可以暴露于其中，例如通过悬浮或溶解来暴露于其中，并保持活性，即保持其本质的生物或生理特性。
本文所用术语“生物相容缓冲液”意指具有适于维持其中的材料完整性的pH和渗透特性(例如张力、重量摩尔渗透压浓度和/或胶体渗透压)的生物相容溶液。适宜的生物相容缓冲液具有4-8.5的pH值，并且是等渗的或仅仅适度低渗或高渗的。对于本领域技术人员来说，生物相容缓冲液是已知和容易获得的。
本文所用术语“稳定剂”意指将接受辐射的含有白蛋白的制剂的损害降低至不足以妨碍材料的安全和有效使用的水平。稳定剂的实例包括但不限于下列：抗氧化剂；自由基清除剂，包括自旋捕获剂；联合稳定剂，即能有效猝灭I型和II型光动力反应的稳定剂；和能够稳定结合于其上的分子的配体，例如肝素。稳定剂的优选实例包括但不限于下列：乙醇；丙酮；脂肪酸，包括6，8-二巯基-辛酸(硫辛酸)及其衍生物和类似物(α，β，二氢，二去甲和四去甲硫辛酸)，硫辛酸、6，8-二巯基-辛酸、二氢硫辛酸酯(DL-6，8-二巯基辛酸甲酯)、硫辛酰胺、二去甲甲酯和四去甲二氢硫辛酸、呋喃脂肪酸、油酸和亚油酸以及棕榈酸及其盐和衍生物；黄酮类、phenylpropaniods、和flavenols，例如栎精、芸香苷及其衍生物、芹黄素、氨基黄酮、儿茶素、橙皮苷和柚皮苷；胡萝卜素，包括β-胡萝卜素；Co-Q10；叶黄素；多元醇，例如甘油、甘露醇；糖，例如木糖、葡萄糖、核糖甘露糖、果糖和海藻糖；氨基酸及其衍生物，例如组氨酸、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、谷氨酸、色氨酸、辛酸钠、N-乙酰色氨酸和蛋氨酸；叠氮化物，例如叠氮化钠；酶，例如超氧化物岐化酶(SOD)和过氧化氢酶；尿酸及其衍生物，例如1，3-二甲基尿酸和二甲基硫脲；别嘌醇；硫醇，例如谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽和半胱氨酸；微量元素，例如硒；维生素，例如维生素A、维生素C(包括其衍生物和盐，例如抗坏血酸纳和棕榈酰抗坏血酸)和维生素E(及其衍生物和盐，例如生育酚乙酸酯和α-tocotrienol)；色满醇-α-C6；6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-甲酸(Trolox)和衍生物；体外蛋白，例如明胶和白蛋白；三-3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮(MCI-186)；西替沃酮；puercetin；柯因；二甲亚砜(DMSO)；哌嗪二乙磺酸(PIPES)；咪唑；甲氧沙林(MOPS)；1，2-二噻烷-4，5-二醇；还原物质，例如丁化羟基茴香醚(BHA)和丁化羟基甲苯(BHT)；胆固醇；普罗布考；吲哚衍生物；硫汞撒；拉扎碱和甲磺酸替拉扎特；proanthenols；proanthocyanidins；硫酸铵；Pegorgotein(PEG-SOD)；N-叔丁基-α-苯基硝酮(PBN)；4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-醇(-oxyl)(Tempol)；抗坏血酸盐、尿酸盐和Trolox C的混合物(Asc/尿酸盐/Trolox C)；蛋白质和肽，例如甘氨酰基甘氨酸和肌肽，其中每一氨基酸可以呈D或L形式；地奥司明；pupurogalin；五倍子酸及其衍生物，包括但不限于五倍子酸丙酯、甲醛次硫酸钠和水飞蓟素。特别优选的实例包括能有效猝灭I型和II型光动力反应的单一稳定剂或稳定剂的联合，以及能够被作为气体施用和/或易于通过蒸发、低压和类似的方法除去的挥发性稳定剂。
本文所用术语“残余溶剂含量”意指含有白蛋白的制剂中的可自由利用的液体的量或部分。可自由利用的液体意思是存在于被灭菌的含有白蛋白的制剂中的、没有结合到或与含有白蛋白的制剂一种或多种非液体组分络合的液体，例如水或有机溶剂(例如乙醇、异丙醇、丙酮、聚乙二醇等)。可自由利用的液体包括细胞内的水。本文中作为水提及的残余溶剂含量是指通过FDA批准、改进的Karl Fischer方法(Meyer和Boyd，Analytical Chem.，31：215-219，1959；May，等人，J.Biol.Standardization，10：249-259，1982；Centers forBiologics Evaluation and Research，FDA，Docket No.89D-0140，83-93；1990)或近红外线光谱法测定的水平。其它溶剂的残余水平的定量测定可以用本领域众所周知的方法来进行，这取决于所使用的溶剂。残余溶剂与溶质的比例也可以看作是溶质在溶剂内浓度的反映。当如此表示时，溶质的浓度越高，则残余溶剂的量就越低。
本文所用术语“增敏剂”意指这样的物质，其可以选择性地针对病毒、细菌、朊病毒和/或寄生性污染物，使它们对于辐射灭活更加敏感，因此与没有增敏剂相比，就使得有可能使用较低的辐射速度或较低的辐射剂量和/或较短的辐射时间。适宜的增敏剂的实例包括但不限于下列：补骨脂素及其衍生物和类似物(包括3-乙氧羰基补骨脂素)；inactines及其衍生物和类似物；含有卤素取代基和增加水溶性的基团例如季铵离子或磷离子的当归根素、凯林和香豆素；结合核酸的化合物；溴化血卟啉；酞菁染料；红紫素；卟啉；二血卟啉酯的卤化或由金属原子取代的衍生物、血卟啉衍生物；苯并卟啉衍生物、氢化二苯并卟啉二马来酰胺、氢化二苯并卟啉、二氰基二砜、四乙酯基氢化二苯并卟啉和四乙酯基氢化二苯并卟啉二丙酰胺；阿霉素和柔红霉素，其可以用卤素或金属原子进行修饰；力确兴；BD肽、S2肽；S-303(ALE化合物)；染料，例如金丝桃素、亚甲蓝、曙红、荧光素(及其衍生物)、黄素、份菁染料540；光敏化合物，例如佛手内酯；和SE肽。另外，也可以使用结合到朊病毒并因此增加它们的辐射灭活的敏感性的原子。这样的原子的实例是铜离子，其结合到朊病毒蛋白是，并且由于蛋白中Z数目高于其它原子，在辐射特别是γ辐射期间，增加了朊病毒蛋白吸收能量的概率。
本文所用术语“蛋白质性质的材料”意指，由活生物体产生或获得的包含至少一种蛋白质或肽的任何材料。蛋白质性质的材料可以是呈其自然状态，或加工/纯化和/或衍生化后的天然材料，或者是人工制得的材料，其由化学合成或重组/转基因技术制得，并任选经过加工/纯化和/或衍生化。蛋白质性质的材料的实例包括但不限于下列：从细胞培养物制得的蛋白质和肽；奶和其它奶制品；腹水；激素；生长因子；从动物组织提取或分离的材料，包括药物，例如肝素和胰岛素，或植物物质；血浆，包括新鲜的、冷冻的和冻干的血浆，以及血浆蛋白组分；纤维蛋白原及其衍生物、血纤蛋白、血纤蛋白I、血纤蛋白II、可溶性血纤蛋白和血纤蛋白单体、和/或血纤蛋白密封产品；全血；蛋白质C；蛋白质S；α-1抗-胰蛋白酶(α-1蛋白酶抑制剂)；丁基-胆碱酯酶；抗凝血剂，例如香豆素(华法林)；链激酶；组织血纤维蛋白溶酶原活化剂(tPA)；红细胞生成素(EPO)；尿激酶；neupogen；抗-凝血酶-3；α-葡糖苷酶；(胎)牛血清/马血清；肉；免疫球蛋白，包括抗血清、单克隆抗体、多克隆抗体和通过基因工程或制得的抗体；白蛋白；α-球蛋白；β-球蛋白；γ-球蛋白；凝血蛋白；补体蛋白；和干扰素。
本文所用术语“辐射”意指辐射足够的能量，以将被辐射的含白蛋白制剂中的至少一些组分灭菌。辐射的类型包括但不限于下列：(i)粒子辐射(亚原子粒子如中子、电子和/或质子流)；(ii)电磁辐射(发生于各种电磁场，例如无线电波，可见(单色和多色)和不可见光，红外线、紫外线，X-射线，以及γ射线及其混合物)；和(iii)声音和压力波。这样的射线经常被称做电离(在被辐射的材料中能够产生离子)射线，例如γ射线，和非离子射线，例如可见光。这样的射线源可以是多种多样的，通常，对具体的辐射源的选择并没有严格要求，只要在适当的时间以适当的速度发出足够的辐射来实现灭菌即可。在实践中，γ射线通常由钴和铯的同位素产生，而UV和X射线则分别由辐射UV和X-射线的机器产生，电子通常用于在经由机器产生被称做“E-射线”辐射的方法中灭菌材料。单色和多色的可见光都由机器产生，并且在实践中与由相同或不同机器产生的不可见光，例如红外线和UV联合使用。
本文所用术语“保护”意指将接受照射的含有白蛋白的制剂的任何损害减至不足以妨碍在辐射后安全和有效使用材料的水平。也就是说，与没有存在该物质或方法相比，如果存在的该物质或进行该方法使得材料受到较小的辐射损害，则该物质或方法“保护”含有白蛋白的制剂免受辐射损害。因此，在“保护”材料的物质存在或保护材料的方法被实施的情况下，在辐射后可以安全和有效地使用含有白蛋白的制剂，但是在同等情况下，如果没有该物质或未实施该方法，辐射后含有白蛋白的制剂就不能安全和有效地使用。
B.特别优选的实施方案
本发明的第一个优选实施方案涉及用于将含有对辐射敏感的白蛋白的制剂灭菌的方法，所述方法包括：用适宜的射线以有效地灭菌材料和保护材料免受辐射损害的速率将含有白蛋白的制剂辐射能将材料有效灭菌的时间。
本发明的另一个优选实施方案涉及用于将含有对辐射敏感的白蛋白的制剂灭菌的方法，所述方法包括：(i)将至少一种稳定剂以有效保护所述含有白蛋白的制剂免受辐射损害的量加到含有白蛋白的制剂中；和(ii)用射线以有效速率将所述含有白蛋白的制剂辐射能将材料有效灭菌的时间。
本发明的另一个优选实施方案涉及用于将含有对辐射敏感的白蛋白的制剂灭菌的方法，所述方法包括：(i)将所述含有白蛋白的制剂的残余溶剂含量降低到有效保护含有白蛋白的制剂免受辐射损害的水平；和(ii)用射线以有效速率将所述含有白蛋白的制剂辐射能将含有白蛋白的制剂有效灭菌的时间。
本发明的另一个优选实施方案涉及用于将含有对辐射敏感的白蛋白的制剂灭菌的方法，所述方法包括：(i)将所述含有白蛋白的制剂的温度降低到有效保护含有白蛋白的制剂免受辐射损害的水平；和(ii)用射线以有效速率将所述含有白蛋白的制剂辐射能将含有白蛋白的制剂有效灭菌的时间。
本发明的另一个优选实施方案涉及用于将含有对辐射敏感的白蛋白的制剂灭菌的方法，所述方法包括：(i)给所述含有白蛋白的制剂施加选自下列的稳定化处理：(a)降低所述含有白蛋白的制剂的残余溶剂含量，(b)将至少一种稳定剂加到所述含有白蛋白的制剂中；和(c)降低所述含有白蛋白的制剂的温度；和(ii)用射线以有效速率将所述含有白蛋白的制剂辐射能将含有白蛋白的制剂有效灭菌的时间，其中所述稳定化处理和辐射速率一起有效地保护所述含有白蛋白的制剂免受辐射损害。
本发明的另一个优选实施方案涉及用于将含有对辐射敏感的白蛋白的制剂灭菌的方法，所述方法包括：(i)给所述含有白蛋白的制剂施加至少两种选自下列的稳定化处理：(a)降低所述含有白蛋白的制剂的残余溶剂含量，(b)将至少一种稳定剂加到所述含有白蛋白的制剂中；和(c)降低所述含有白蛋白的制剂的温度；和(ii)用射线以有效速率将所述含有白蛋白的制剂辐射能将含有白蛋白的制剂有效灭菌的时间，其中所述至少两种稳定化处理可以以任何次序进行，并且一起有效地保护所述含有白蛋白的制剂免受辐射损害。
按照本发明的一些方法，在用射线照射含有白蛋白的制剂之前将稳定剂加入。优选将该稳定剂以有效保护含有白蛋白的制剂免受辐射损害的量加到含有白蛋白的制剂中。适宜的稳定剂的量，可以根据所使用的本发明特定方法的某些特征而变化，例如根据所使用的特定的稳定剂和/或接受辐射的特定含有白蛋白的制剂的性质和特征和/或其预期应用而变化，并且可以由本领域技术人员凭借经验确定。
按照本发明的一些方法，在用射线照射含有白蛋白的制剂之前将含有白蛋白的制剂的残余溶剂含量降低。优选将残余溶剂的含量降至能有效保护含有白蛋白的制剂免受辐射损害的水平。残余溶剂的适宜的水平可以根据所使用的本发明特定方法的某些特征而变化，例如根据接受辐射的特定含有白蛋白的制剂的性质和特征和/或其预期应用而变化，并且可以由本领域技术人员凭借经验确定。对于有些含有白蛋白的制剂，要求将残余溶剂含量保持在一个特定范围内，而不是一个具体的值。
当溶剂是水，特别是当一种或多种消化酶的制剂是固相时，残余溶剂含量一般小于约15％，典型地小于约10％，更典型地小于约9％，甚至更典型地小于约8％，通常小于约5％，优选小于约3.0％，更优选小于约2.0％，甚至更优选小于约1.0％，还更优选小于约0.5％，还甚至更优选小于约0.2％，而最优选小于约0.08％。
溶剂可以优选为非水溶剂，更优选在辐射下不易于形成自由基的非水溶剂，而最优选为在辐射下不易于形成自由基，并且具有很少或没有溶解氧或其它在辐射下易于形成自由基的气体的非水溶剂。挥发性非水溶剂是特别优选的，甚至更优选的是其为稳定剂的非水溶剂，例如乙醇和丙酮。
在本发明的某些实施方案里，溶剂可以是水与非水溶剂例如乙醇和/或丙酮的混合物。在这样的实施方案中，非水溶剂优选为在辐射下不易于形成自由基的非水溶剂，而最优选为在辐射下不易于形成自由基，并且具有很少或没有溶解氧或其它在辐射下易于形成自由基的气体的非水溶剂。挥发性非水溶剂是特别优选的，甚至更优选的是其为稳定剂的非水溶剂，例如乙醇和丙酮。
在优选的实施方案中，当残余溶剂是水时，通过把含有白蛋白的制剂溶解或悬浮于能够溶解水的非水溶剂中，来降低含有白蛋白的制剂的残余溶剂的含量。优选地，这样的非水溶剂在辐射下不易于形成自由基，并且具有很少或没有溶解氧或在辐射下易于形成自由基的其它气体。
当含有白蛋白的制剂是液相时，残余溶剂的含量的降低可以通过多种方法来实现，例如通过增加溶质的浓度。以这种方法，溶解于溶剂内的含有白蛋白的制剂的蛋白质浓度可以增加至一般至少约0.5％，典型地至少约1％，通常至少约5％，优选至少约10％，更优选至少约15％，甚至更优选至少约20％，还甚至更优选至少约25％，而最优选至少约50％。
在本发明的某些实施方案中，可以发现，特定含有白蛋白的制剂的残余溶剂含量是在一个范围内，而不是一个具体值。对于特定含有白蛋白的制剂的优选残余溶剂含量，这样的范围可以由本领域技术人员凭借经验确定。
虽然不想受敷于任何可操作性理论，但是据信，残余溶剂含量的降低，降低了含有白蛋白的制剂的自由度，降低了用于自由基产生的目标数目，并限制了这些自由基的溶解度。因此，通过将含有白蛋白的制剂温度降至低于它的低共熔点或低于它的冰点，或通过玻璃化同样降低含有白蛋白的制剂的自由度，也可以达到类似的结果。与其它可以接受的结果相比，这些结果可以容许使用更高的辐射速率和/或剂量。因此，本文所述方法可以在任何不导致含有白蛋白的制剂受到不可接受的损害，即会妨碍安全和有效使用含有白蛋白的制剂的温度下实施。优选地，本文所述方法在室温或低于室温，例如低于被辐射的含有白蛋白的制剂的低共熔点或冰点的温度下进行。
按照本发明的方法，损害的“可以接受的水平”可以根据所使用的本发明特定方法的某些特征，例如特定含有白蛋白的制剂的性质和特征，和/或所使用的二肽类稳定剂，和/或被照射的含有白蛋白的制剂的预期应用而变化，并且可以由本领域技术人员凭借经验确定。因此，损害的：“不可接受的水平”是将会妨碍安全和有效使用被辐射的含有白蛋白的制剂的损害水平。在给定的含有白蛋白的制剂中，损害的特定水平可以用任何本领域技术人员已知的方法和技术确定。
可以用本领域技术人员已知的，用于从含有白蛋白的制剂中降低溶剂，不给含有白蛋白的制剂造成不可接受的损害水平的任何方法和技术，将含有白蛋白的制剂的残余溶剂含量降低。这样的方法包括但不限于蒸发、浓缩、离心浓缩、玻璃化和喷雾干燥。
特别优选的降低含有白蛋白的制剂的残余溶剂含量的方法是冻干法。
另一特别优选的降低含有白蛋白的制剂中残余溶剂的方法是玻璃化法，其可以用本领域技术人员已知的方法和技术来进行，包括添加溶质和/或附加溶质例如蔗糖，以提高含有白蛋白的制剂的低共熔点，然后逐渐降低含有白蛋白的制剂的压力，以便除去残余的溶剂例如水。所得玻璃状材料将具有降低的残余溶剂含量。
按照本发明的某些方法，可以用任何本领域技术人员已知且可采用的方法，将被灭菌的含有白蛋白的制剂固定于固体表面上。例如，可以将被灭菌的含有白蛋白的制剂作为生物或非生物基质上的包衣或表面提供。
在本发明方法中，所使用的辐射可以是任何将被处理的含有白蛋白的制剂有效灭菌的辐射。该辐射可以是粒子辐射，包括E-射线辐射。优选地，该辐射是电磁辐射，包括X-射线、红外线、可见光、UV光和各种波长电磁射线的混合物。特别优选的射线形式是γ射线。
按照本发明方法，对含有白蛋白的制剂的辐射，是用有效灭菌含有白蛋白的制剂，而同时不产生对该材料造成不可接受的损害水平的速率的射线进行的。射线的适宜速率可以根据所使用的本发明方法的某些特征而变化，例如根据被辐射的特定含有白蛋白的制剂的性质和特征，有关射线的特定形式和/或被灭活的特定的生物污染物或病原体而变化。射线的适宜速率可以由本领域技术人员凭借经验确定。优选地，辐射速率在灭菌过程中是恒定的。当该速率不切实际或不符合要求时，可以使用变动的或不连续的辐射。
按照本发明方法，可以将辐射速率进行优化以产生产品收率和完成操作所需时间的最有利组合。在本文所述方法中，使用低(＜3kGy/小时)和高(＞3kGy/小时)速率都可以达到这样的结果。对辐射速率进行优选以优化含有白蛋白的制剂的收率，而同时仍然使含有白蛋白的制剂得以灭菌。虽然降低辐射速率可减小对含有白蛋白的制剂的损害，但其也会导致为达到特定要求的总剂量而需要较长的辐射时间。因此，在某些情况下可以优选较高剂量的速率，以例如将后勤问题和成本减到最小，并且当按照本文所述方法使用时，可保护含有白蛋白的制剂免受辐射损害。
按照本发明特别优选的实施方案，辐射速率不高于约3.0kGy/小时，更优选为约0.1kGy/小时-3.0kGy/小时，甚至更优选为约0.25kGy/小时-2.0kGy/小时，还甚至更优选为约0.5kGy/小时-1.5kGy/小时，最优选为约0.5kGy/小时-1.0kGy/小时。
按照本发明另一个特别优选的实施方案，辐射速率为至少约3.0kGy/小时，更优选为至少约6kGy/小时，甚至更优选为至少约16kGy/小时，甚至更优选为至少约30kGy/小时，而最优选为至少约45kGy/小时或更高。
按照本发明方法，被灭菌的含有白蛋白的制剂是用射线对其辐射能有效将含有白蛋白的制剂灭菌的时间。与辐射速率相联合，适宜的辐射时间产生施用于含有白蛋白的制剂的适当辐射剂量。适宜的辐射时间可以根据有关辐射的特定形式和速率和/或特定含有白蛋白的制剂的性质和特征而变化。适宜的辐射时间可以由本领域技术人员凭借经验确定。
按照本发明的方法，将被灭菌的含有白蛋白的制剂用射线照射至能有效地将含有白蛋白的制剂灭菌，而同时不给该材料造成不可接受水平的损害的总剂量。辐射的适宜总剂量可以根据所使用的本发明方法的某些特征而变化，例如根据被灭菌的特定含有白蛋白的制剂的性质和特征，有关照射的特定形式和/或被灭活的特定生物污染物或病原体而变化。辐射的适宜总剂量可以由本领域技术人员凭借经验确定。优选地，辐射的总剂量为至少25kGy，更优选为至少45kGy，甚至更优选为至少75kGy，而还更优选为至少100kGy或更高，例如150kGy或200kGy或更高。
被辐射的含有白蛋白的制剂的特定几何形状，例如厚度和离辐射源的距离可以由本领域技术人员凭借经验确定。
按照本发明的某些方法，在照射之前，可以任选将有效量的至少一种增敏剂加到含有白蛋白的制剂中，以例如提高辐射对含有白蛋白的制剂中的生物污染物和病原体的作用效果，同时用本文所述方法将辐射对含有白蛋白的制剂的有害作用降至最小。适宜的增敏剂是本领域技术人员已知的，包括补骨脂素及其衍生物和inactines及其衍生物。
按照本发明的方法，含有白蛋白的制剂的辐射可以在对被辐射的含有白蛋白的制剂无害的任何温度进行。按照一个优选的实施方案，将含有白蛋白的制剂在室温下进行照射。依据另一个优选的实施方案，将含有白蛋白的制剂在低温下，即低于室温的温度下，例如在0℃、-20℃、-40℃、-60℃、-78℃或-196℃温度下进行照射。按照本发明的该实施方案，优选在含有白蛋白的制剂的冰点或低共熔点温度下或低于所述冰点或低共熔点的温度下对含有白蛋白的制剂进行辐射。按照另一个优选的实施方案，在高温下，即高于室温的温度下，例如在37℃、60℃、72℃或80℃下对含有白蛋白的制剂进行辐射。虽然不希望受敷于任何理论，但是据信，使用高温可以增强辐射对生物污染物或病原体的作用效果，并因此可以使用较低的辐射总剂量。
最优选地，含有白蛋白的制剂的辐射在保护制剂免受辐射损害的温度下进行。适宜的温度可以由本领域技术人员凭借经验确定。
在本发明的某些实施方案中，进行辐射的温度可在一个范围内，而不是在一个具体值上。对于特定含有白蛋白的制剂的辐射来说，这样的优选温度范围可由本领域技术人员凭借经验确定。
按照本发明的方法，含有白蛋白的制剂的照射可以在不对被灭菌的含有白蛋白的制剂造成损害的任何压力下进行。按照一个优选的实施方案，将一种或多种消化酶的制剂在高压下进行照射。更优选地，将含有白蛋白的制剂在由于施用声波或使用挥发物而造成的高压力下进行照射。虽然不希望受敷于任何理论，但是据信，使用高压可增强辐射对生物污染物或病原体的作用效果和/或增强由一种或多种稳定剂提供的保护作用，并因此可以使用较低总剂量的辐射。适宜的压力可由本领域技术人员凭借经验确定。
一般地，按照本发明方法，进行灭菌的含有白蛋白的制剂的pH值为约7。然而，在本发明的某些实施方案中，含有白蛋白的制剂可以具有小于7，优选小于或等于6，更优选小于或等于5，甚至更优选小于或等于4，最优选小于或等于3的pH值。在另外的本发明实施方案中，含有白蛋白的制剂可以具有大于7，优选大于或等于8，更优选大于或等于9，甚至更优选大于或等于10，最优选大于或等于11的pH值。按照本发明的某些实施方案，进行灭菌的制剂的pH值在包含于制剂中的酶的等电点或接近等电点。适宜的pH水平可由本领域技术人员凭借经验确定。
同样地，按照本发明方法，含有白蛋白的制剂的辐射可以在不对被处理的含有白蛋白的制剂造成损害的任何气氛下进行。按照一个优选的实施方案，将含有白蛋白的制剂置于低氧或惰性气氛下。当使用惰性气氛时，该气氛优选由稀有气体，例如氦或氩，更优选高分子量稀有气体，最优选氩组成。按照另一个优选的实施方案，在辐射时将含有白蛋白的制剂置于真空下。按照本发明特别优选的实施方案，在照射之前将含有白蛋白的制剂(冻干的、液体的或冷冻的)贮藏在真空或惰性气氛(优选稀有气体，例如氦或氩，更优选高分子量稀有气体，最优选氩)下。按照本发明另一优选的实施方案，在辐射前，将含有白蛋白的液体制剂置于低压下，以减少溶于液体中的气体特别是氧气的量，同时采用或不采用减少溶剂的先前步骤例如冻干。这样的除气法可以使用本领域技术人员已知的方法进行。
在另一个优选的实施方案中，当含有白蛋白的制剂包含有溶解于其中或与之结合的氧或其它气体时，可以用任何本领域技术人员已知的方法和技术，例如通过有控制地降低装有被处理制剂的容器(刚性或柔性)内的压力，或者通过将制剂置于大致相等体积的容器中，将制剂内的或与制剂结合的这些气体的量降低。
在本发明的某些实施方案中，当被处理的含有白蛋白的制剂是组织时，按照任何本领域技术人员已知的方法和技术，将至少一种稳定剂引入其中，包括把组织在含有稳定剂的溶液中浸泡，优选在压力、高温和/或在渗透促进剂例如二甲亚砜存在下进行浸泡。将至少一种稳定剂引入组织内的其它方法包括但不限于施加含有稳定剂的气体，优选在压力和/或高温度下施加；将稳定剂或含有稳定剂的溶液直接注射到组织中；把组织置于低压下，然后引入含有稳定剂的气体或溶液；以及两种或多种这些方法的组合。按照这样的方法，可以将一种或多种稳定剂引入到组织内。
应当理解，本文所描述的一个或多个特征的组合的使用，会进一步将由辐射所造成的对含有白蛋白的制剂的有害作用减至最小，而同时保持辐射操作对生物污染物或病原体的充分作用效果。例如，除了使用稳定剂以外，在辐射之前，还可以把含有白蛋白的特定制剂冻干，置于降低的温度下和贮存于真空中，以便进一步使有害作用减至最小。
特定生物污染物或病原体对射线的敏感性一般是通过确定灭活或杀死样本中约37％的目标物所需的剂量来计算的，其称为D₃₇值。含有白蛋白的制剂的所需组分也可以被看作具有与消除约37％其所需生物和生理特征所需的辐射剂量相等的D₃₇值。
按照本发明的某些优选方法，含有白蛋白的制剂的灭菌，是在导致生物污染物或病原体的D₃₇值下降，而同时不降低含有白蛋白的制剂的D₃₇值的条件下进行的。按照本发明的其它优选方法，含有白蛋白的制剂的灭菌是在导致含有白蛋白的制剂的D₃₇值增加的条件下进行的。按照本发明的最优选方法，含有白蛋白的制剂的灭菌是在导致生物污染物或病原体的D₃₇值降低，而同时含有白蛋白的制剂的D₃₇值增加的条件下进行的。
                        实施例
下面的实施例是对本发明的举例说明而不是限制。其它适当的修正和改进是本领域技术人员所通常遇见的变化，并完全在本发明的实质和范围内。除非另有说明，否则全部辐射皆使用⁶⁰Co源来实现。
实施例1
在本试验中，在不同水平的残余溶剂含量以及有或没有挥发性稳定剂存在下，将血浆蛋白组分照射(45kGy，1.9kGy/小时，室温)。
方法
在玻璃小瓶中，配制市售血浆蛋白组分(2mg/ml)样本，其具有含少量乙醇和丙酮的9％的水，或基本上不含乙醇或丙酮的1％的水。将样本用γ射线照射(45kGy总剂量，1.9kGy/小时和室温)，然后进行结构完整性分析。用SDS-PAGE、HPLSEC和反相HPLC测定结构完整性。
对于SDS-PAGE，按照以下方法制备三份12.5％凝胶：将4.2ml丙烯酰胺；2.5ml 4X-Tris(pH8.8)；3.3ml水；100微升10％APS溶液；和10μl TEMED置于具有1×Running Buffer(15.1g Tris基质；72.0g甘氨酸；在1升水中的5.0g SDS，稀释5倍)的电泳装置中。将被照射的和对照样本(1mg/ml)在Eppindorf管中用样本缓冲液(+/-β-ME)稀释，然后离心数分钟。分析20μl每一稀释样本(～10μg)。
对于反相HPLC，把每一样本溶解在水中至10mg/ml的终浓度。然后把这些溶液连续稀释到0.1％三氟乙酸中以达到所需要的浓度。将10μg每一样本负载到Aquapore RP-300(C-8)2.1×30mm MicroboreHPLC上：Applied Biosystems 130A Separation System，流速为0.2ml/分钟。溶剂A：0.1％三氟乙酸；溶剂B：70％乙腈，30％水，0.085％三氟乙酸。
对于HPLSEC，将每一样本稀释至0.4μg/μl，将50μl负载到用于浓度分析的20μg Phenomenex-Biosep S3000(分子范围5kDa-700kDa)上：20μl 2mg/ml贮备液+80μl洗脱缓冲液(50mM NaP_i+100mM NaCl pH6.7)；流速为1ml/分钟。
结果
在辐射至45kGy时，两个样本都显示出了白蛋白的某些破坏，而与含有较少的水和基本上不含挥发性稳定剂的样本相比，具有含少量乙醇和丙酮的9％水的样本显示出较轻的破坏和较高的结构复原率。然而，对于白蛋白的随后使用来说，两个样本的结构复原率都是足够的。
更具体来说，如附图1A所示，SDS-PAGE分析表明了具有含少量乙醇和丙酮的9％水的样本具有较好的白蛋白单体复原率。同样地，如附图1B所示，HPLSEC也表明了具有含少量乙醇和丙酮的9％水的样本具有较少的聚集。如附图1C所示，反相HPLC显示了辐射的样本和对照样本之间的并不显著的差异。
实施例2
将人白蛋白(25％)用得自具有改变瘙痒病的仓鼠(263K株)的10％脑匀浆以1∶100比例感染。通过涡旋将该样本混合，并把4份6-ml等份试样的瘙痒病感染的白蛋白分配到10-ml血清小瓶中。将一个小瓶作为冷冻对照在-80℃贮藏。把三个小瓶放入市售辐射设备中。将一个小瓶(0kGy对照)冷藏以防止细菌生长。将其余小瓶在室温(20-25℃)以0.4kGy/小时的速率照射至总剂量为26或50kGy。辐射剂量用附在每一个小瓶上的辐射剂量计和置放于接近小瓶的外部辐射剂量计确定。测定被照射的样本和0kGy对照样本的瘙痒病感染性。
通过把0.05ml样本接种到12只仓鼠脑内，然后将其喂养6个月加以观察来测定感染性。评价三个临床终点：抖动、不能饲养和死亡。与未辐射的对照组比较，在用以较高剂量处理的样本接种的组中，每一临床症状的出现迟延了至少8-10天。将数据与列线图进行比较，所述列线图是用关于大量以极限稀释系列方式感染的动物的潜伏时间的剂量反应建立的(R.Rowher，未出版数据)。该列线图表示了疾病开始的天数(通过抖动表明的)与接种的log₁₀ LD₅₀之间的关系。
辐射对生物材料(白蛋白)的作用效果通过如下所述的SDS-PAGE凝胶电泳和高效尺寸排阻色谱法测定。
在Mighty Small Mini-Vertical Unit SE250/SE260内，在8％聚丙烯酰胺凝胶上进行SDS-PAGE。将样本在PBS中进行1∶100稀释，然后在含有或不含有5％β-巯基乙醇的Laemmli Sample Buffer(Bio-Rad)中进行1∶1稀释。样本负载量是12.5μg/道。分子量标志物是Low-Range Standard(Bio-Rad)。电泳在125伏特进行30分钟。在50％甲醇、10％乙酸中用0.1％Coomassie Brilliant Blue R-250将凝胶染色，然后用5％甲醇、9％乙酸脱色。
在130A Separation System(Applied Biosystems)内，在7.8×300mm Biosep SEC柱(Phenomenex，Torrence，CA)上进行HPSEC。在使用之前，用0.22μm滤器将0.05M磷酸钠、0.1M氯化钠的洗脱剂缓冲液(pH6.7)过滤。在洗脱剂缓冲液中，将白蛋白溶液稀释至终浓度为1.25mg/ml，注射25μl(31.25μg蛋白)。流速1ml/分钟。通过在280nm的吸收度进行检测。
结果
对于未被照射的对照样本，疾病发作(抖动)的中值潜伏时间是75天。对于被辐射的样本，将样本辐射至总剂量25kGy和50kGy，疾病发作的中值潜伏时间分别是88天和90天。与列线图比较给出的估计值是，对于未被照射的对照样本，log₁₀效价为6.5，而对于被照射至总剂量25kGy和50kGy的样本，则分别是4.8和4.6。根据这些估计值，对于被照射至总剂量25kGy和50kGy的样本，中值减少因数分别是1.7和1.9。这些数据给出了中值减少值的估计值，但是没有给出通过该试验预测的最大可能减少。为了给出这种最大可能减少，应当将对照组的95％置信区间(CI)的最小值与辐射处理组的95％CI的最大值进行比较。该计算将获得位于95％CI内的效价的最大减少因数。对于50kGy组，该值为3.5对数减少。
生物污染物或病原体对射线的敏感性通常用其D₃₇值表示。这表示将活性生物污染物或病原体的数目降至其辐射前数目的37％所需的辐射剂量。因此，D₃₇值越低，特定生物污染物或病原体对辐射作用的敏感性就越高。实验测定的瘙痒病朊病毒的D₃₇值约为47kGy(Rohwer，Nature，308，5960，pp.658-662，1984)。利用本文所述方法，出乎意料的发现，瘙痒病朊病毒的D₃₇仅为4.5kGy。因此，使用本实验中所采用的方法和制剂降低了朊病毒的D₃₇值。这样，就实现了增加对瘙痒病朊病毒的杀伤力，而同时保持了本实验使用的生物材料—一种市售治疗用25％人白蛋白溶液的完整性。
实现了增加对瘙痒病朊病毒的杀伤力，而同时保持了被处理的、含有白蛋白的制剂的本质生物和生理特征。在用γ射线照射至25、50和100kGy的总剂量之前和之后，对这种特定生物材料-25％人白蛋白溶液进行检查。如凝胶电泳(附图2A-2B)所示，在最高达50kGy的辐射剂量下，白蛋白大部分是完整的，只有少量的裂解和聚集，以及单体形式白蛋白的量仅有轻微减少。对于所有白蛋白样本，都获得了类似结果而与是否含有任何抗坏血酸盐和/或仓鼠无关。在较高剂量时，在白蛋白样本中发现较小的变化，主要形式是白蛋白的聚合增加。
更为详细的分析是用HPSEC进行的。如附图2C-2F所示，在照射时，白蛋白单体的量减少(在10.5分钟为峰值)，二聚物的量增加(9分钟)以及聚合物的量增加(7.2分钟)。这些变化在抗坏血酸盐存在的情况下都减小了。其余在12.6和15.3分钟的峰值分别是抗坏血酸盐和N-乙酰基色氨酸稳定剂的峰值。
实施例3
在本试验中，在约4℃，以1.847kGy/小时的速率将冻干的白蛋白(含有5％尿激酶)照射至总剂量为10和40kGy。
使用TSK凝胶G4000SW_x130cm×7.8mm柱通过凝胶过滤分析样本，分离范围是20kDa-7,000kDa，洗脱缓冲液是0.1M磷酸钠/0.1M硫酸钠(pH6.5)，流速是1ml/分钟。
如附图3A所示，当冻干然后照射至10kGy或40kGy总剂量时，在白蛋白中没有发生变化。相反，如附图3B所示，当照射至40kGy总剂量时，液体白蛋白样本表示出显著降解。
实施例4
在该试验中，制备白蛋白溶液(25％)的样本并将样本的一半用氩气喷雾。
将样本以0.91、0.92或1.01kGy/小时的速率分别辐射至总剂量18.1、23和30.4kGy。用SDS-PAGE对被辐射的样本进行聚集和裂解分析，用HPLSEC对其进行二聚作用和聚合作用分析。
如附图4A-4B所示，即使对于被辐射至总剂量30.4kGy的样本，SDS-PAGE也仅显示了少量的裂解(在减少的凝胶上在66kDa谱带下的双峰)和聚集(在未减少的凝胶上的116kDa谱带)。
HPLSEC显示了如下峰值：