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描述了一种鉴定受一种或多种脓毒症或炎症诱导物调节和受阳离子肽抑制的多聚核苷酸或多聚核苷酸谱型的方法。一种鉴定代表炎症或脓毒症应答受抑制的多聚核苷酸表达谱型的方法。该方法包括在存在或缺少肽的情况下，将细胞与LPS、LTA、CpG DNA和/或完整微生物或微生物成分接触；检测在存在或缺少该肽的情况下细胞的多聚核苷酸表达谱型，其中在该肽存在时的谱型代表炎症或脓毒症应答受到抑制。还包括由本发明的方法鉴定的化合物和试剂。在另一方面，本发明提供用于强化个体的先天免疫的方法和化合物。

1.  一种鉴定受一种或多种脓毒症或炎症诱导物调节和受阳离子肽抑制的多聚核苷酸或多聚核苷酸谱型的方法，该方法包括将一种或多种多聚核苷酸与一种或多种脓毒症或炎症诱导物接触，并同时或随后立即将该种或该多种多聚核苷酸与阳离子肽接触，检测表达上的变化，其中一种变化作为受脓毒症或炎症诱导物调节和受阳离子肽抑制的多聚核苷酸或多聚核苷酸谱型的标志。

2.  根据权利要求1的方法，其中该脓毒症或炎症诱导物为LPS，LTA或CpG DNA，细菌成分或整个细胞，或相关试剂。

3.  根据权利要求1的方法，包括在和脓毒症或炎症诱导物接触之前和之后检测多聚核苷酸的表达水平。

4.  通过权利要求1的方法确定的多聚核苷酸或多聚核苷酸谱型。

5.  根据权利要求3的多聚核苷酸，其中该多聚核苷酸编码涉及炎症或脓毒症应答的多肽。

6.  一种鉴定阻止脓毒症或炎症的试剂的方法，该方法包括将权利要求5的多聚核苷酸与一种试剂进行组合，其中，与不存在该试剂时的表达相比较，在存在该试剂时该多聚核苷酸的表达受到了调节，并且在表达上的这种调节影响炎症或脓毒症应答。

7.  根据权利要求6的方法，其中该影响为抑制炎症或脓毒症应答。

8.  通过权利要求6的方法确定的试剂。

9.  根据权利要求8的试剂，其中该试剂为肽、肽模拟物、化学化合物、核酸分子或多肽。

10.  根据权利要求8的试剂，其中该肽是选自SEQ ID NO：4-54。

11.  一种鉴定代表炎症或脓毒症应答受抑制的多聚核苷酸表达谱型的方法，该方法包括：
在存在或缺少阳离子肽的情况下，将细胞与LPS、LTA、CpG DNA和/或完整细菌或细菌成分接触；
检测在存在或缺少该肽的情况下细胞的多聚核苷酸表达谱型，其中在该肽存在时的谱型代表炎症或脓毒症应答受到抑制。

12.  根据权利要求11的方法，进一步包括将细胞与一种或多种被怀疑能够抑制炎症或脓毒症应答的化合物接触，确定提供了与抑制炎症或脓毒症应答的阳离子肽相类似的多聚核苷酸表达谱型的化合物。

13.  通过权利要求11确定的化合物。

14.  一种鉴定强化先天免疫的试剂的方法，该方法包括：
将一种或多种编码涉及先天免疫的多肽的多聚核苷酸与感兴趣的试剂接触，其中，与不存在该试剂时的多聚核苷酸表达相比较，在存在该试剂时该多聚核苷酸的表达被调节，并且该被调节的表达导致先天免疫的强化。

15.  根据权利要求14的方法，其中该试剂不刺激脓毒症反应。

16.  根据权利要求14的方法，其中该试剂抑制炎症或脓毒症应答。

17.  根据权利要求14的方法，其中该试剂阻止炎症或脓毒症应答。

18.  根据权利要求16或17的方法，其中该试剂增加抗炎多聚核苷酸的表达。

19.  根据权利要求18的方法，其中抗炎基因选自包括IL-1R拮抗剂同源物1(AI167887)、IL-10Rβ(AA486393)、IL-10Rα(U00672)、TNF受体成员1B(AA150416)、TNF受体成员5(H98636)、TNF受体成员11b(AA194983)、HLAII的IK细胞因子减量调节物(R39227)、TGF-B诱导性早期生长应答2(AI473938)、CD2(AA927710)、糖皮质素相关性多聚核苷酸(AK000892)或IL-10(M57627)的基因。

20.  根据权利要求19的方法，其中该试剂抑制TNF-α的表达。

21.  根据权利要求19的方法，其中该试剂抑制白介素的表达。

22.  根据权利要求23的方法，其中该白介素为IL-8。

23.  根据权利要求16的方法，其中该试剂为肽。

24.  根据权利要求23的方法，其中该肽选自SEQ ID NO：4-54。

25.  通过权利要求14的方法确定的试剂。

26.  根据权利要求25的试剂，其中该试剂为肽、肽模拟物、化学化合物或核酸分子。

27.  一种鉴定多聚核苷酸表达谱型以确定选择性地强化先天免疫的化合物的方法，该方法包括：
检测在有阳离子肽接触时和无阳离子肽接触时细胞的多聚核苷酸表达谱型，其中，在该肽存在时的谱型代表先天免疫的刺激；
检测在有一种受测化合物接触时细胞的多聚核苷酸表达谱型，其中，使用该受测化合物时的谱型与在该阳离子肽存在时观察到的谱型相类似，则表示该受测化合物强化先天免疫。

28.  通过权利要求27的方法确定的化合物。

29.  根据权利要求27的方法，其中该化合物不刺激脓毒症反应。

30.  根据权利要求27的方法，其中该多聚核苷酸表达谱型包括促炎多聚核苷酸的表达。

31.  根据权利要求30的方法，其中该促炎多聚核苷酸包括环指蛋白10(D87451)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶MASK(AB040057)、KIAA0912蛋白(AB020719)、KIAA0239蛋白(D87076)、RAP1、GTP酶激活蛋白1(M64788)、FEM-1样死亡受体结合蛋白(AB007856)、组织蛋白酶S(M90696)、假想蛋白FLJ20308(AK000315)、pim-1癌基因(M54915)、蛋白酶体亚基β型5(D29011)、KIAA0239蛋白(D87076)、气管支气管黏蛋白5亚型B(AJ001403)、cAMP应答元件结合蛋白CREBPa、整连蛋白αM(J03925)、与Rho相关的激酶2(NM004850)、PTD017蛋白(AL050361)、未知基因(AK001143、AK034348、AL049250、AL16199、AL031983)、视黄酸受体(X06614)、G蛋白偶联受体(Z94155、X81892、U52219、U22491、AF015257、U66579)、趋化因子(C-C基序)受体7(L31584)、肿瘤坏死因子受体超家族成员17(Z29575)、干扰素γ受体2(U05875)、细胞因子受体样因子1(AF059293)、I类细胞因子受体(AF053004)、凝集因子II(凝血酶)受体样2(U92971)、白血病抑制因子受体(NM02310)、干扰素γ受体1(AL050337)或它们的任意组合。

32.  根据权利要求27的方法，其中该表达谱型包括编码趋化因子的多聚核苷酸的表达。

33.  根据权利要求27的方法，其中该表达谱型包括细胞分化因子的表达。

34.  根据权利要求27的方法，其中该多聚核苷酸表达谱型包括细胞表面受体的表达。

35.  根据权利要求34的方法，其中该细胞表面受体包括趋化因子受体或整连蛋白受体。

36.  一种鉴定能够选择性强化先天免疫的试剂的方法，包括：
将含有一种或多种编码涉及先天免疫的多肽的多聚核苷酸的细胞与感兴趣的试剂接触，其中，与不存在该试剂时的表达相比较，在存在该试剂时该种多聚核苷酸或该多种多聚核苷酸的表达被调节，并且该被调节的表达导致先天免疫的强化。

37.  根据权利要求26的方法，其中该表达谱型被应用于筛选强化先天免疫的化合物。

38.  根据权利要求28的化合物，其中该化合物刺激趋化因子或趋化因子受体表达。

39.  根据权利要求38的化合物，其中该趋化因子或趋化因子受体是CXCR4、CCR5、CCR2、CCR6、MIP-1α、IL-8、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4或MCP-5。

40.  根据权利要求28的化合物，其中该化合物为肽、肽模拟物、化学化合物或核酸分子。

41.  一种鉴定既能够抑制或阻止脓毒症或炎症应答又能够强化先天免疫的试剂的方法，包括：
将含有i)一种或多种编码能够抑制炎症或脓毒症应答的多肽的多聚核苷酸和ii)一种或多种编码涉及先天免疫的多肽的多聚核苷酸的细胞与感兴趣的试剂接触，其中，与不存在该试剂时的表达相比较，在存在该试剂时该种多聚核苷酸或该多种多聚核苷酸的表达被调节，并且该被调节的表达导致炎症或脓毒症应答的抑制和先天免疫的强化。

42.  一种由哺乳动物个体的核酸样品推断该个体的感染状态的方法，该方法包括鉴定该核酸样品中的多聚核苷酸表达谱型，例示为表55中的至少两种多聚核苷酸的表达与未感染的个体相比有增加。

43.  一种由哺乳动物个体的核酸样品推断该个体的感染状态的方法，该方法包括鉴定该核酸样品中的多聚核苷酸表达谱型，例示为表56中的至少两种多聚核苷酸的表达与未感染的个体相比有减少。

44.  一种由哺乳动物个体的核酸样品推断该个体的感染状态的方法，该方法包括鉴定该核酸样品中的多聚核苷酸表达谱型，例示为表57中的至少两种多聚核苷酸与未感染的个体相比较的多聚核苷酸表达。

45.  根据权利要求30、31或32的任意一个的方法，其中该感染状态由细菌、病毒、真菌或寄生物引起。

46.  根据权利要求30、31或32的任意一个的方法，其中该感染状态由革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌引起。

47.  具有由权利要求31的方法鉴定的感染状态的个体的多聚核苷酸表达谱型。

48.  作为CXCR-4的拮抗剂的阳离子肽。

49.  一种鉴定作为CXCR-4的拮抗剂的阳离子肽的方法，包括在受测肽存在或不存在的情况下将T细胞和SDF-1接触，并测量趋化性，其中，在受测肽存在时趋化性降低，则表明该肽是CXCR-4的拮抗剂。

50.  包含通式X₁X₂X₃IX₄PX₄IPX₅X₂X₁(SEQ ID NO：4)的被分离的阳离子肽，其中X₁是一个或两个R、L或K，X₂是一个C、S或A，X₃是一个R或P，X₄是一个A或V，X₅是一个V或W。

51.  根据权利要求38的阳离子肽，其中该肽选自：LLCRIVPVIPWCK(SEQ ID NO：5)，LRCPIAPVIPVCKK(SEQ ID NO：6)，KSRIVPAIPVSLL(SEQ ID NO：7)，KKSPIAPAIPWSR(SEQ ID NO：8)，RRARIVPAIPVARR(SEQ ID NO：9)和LSRIAPAIPWAKL(SEQID NO：10)。

52.  根据权利要求38的肽，其中该肽具有抗炎症活性。

53.  根据权利要求38的肽，其中该肽具有抗脓毒症活性。

54.  包含通式X₁LX₂X₃KX₄X₂X₅X₃PX₃X₁(SEQ ID NO：11)的被分离的阳离子肽，其中X₁是一个或两个D、E、S、T或N，X₂是一个或两个P、G或D，X₃是一个G、A、V、L、I或Y，X₄是一个R、K或H，X₅是一个S、T、C、M或R。

55.  根据权利要求42的阳离子肽，其中该肽选自：DLPAKRGSAPGST(SEQ ID NO：12)，SELPGLKHPCVPGS(SEQ IDNO：13)，TTLGPVKRDSIPGE(SEQ ID NO：14)，SLPIKHDRLPATS(SEQ ID NO：15)，ELPLKRGRVPVE(SEQ ID NO：16)和NLPDLKKPRVPATS(SEQ ID NO：17)。

56.  根据权利要求42的肽，其中该肽具有抗炎症活性。

57.  根据权利要求42的肽，其中该肽具有抗脓毒症活性。

58.  包含通式X₁X₂X₃X₄WX₄WX₄X₅K(SEQ ID NO：18)的被分离的阳离子肽，其中X₁是一至四个选自A、P或R的氨基酸，X₂是一个或两个芳香性氨基酸(F、Y和W)，X₃是一个P或K，X₄是零至两个选自A、P、Y或W的氨基酸，X₅是一至三个选自R或P的氨基酸。

59.  根据权利要求46的阳离子肽，其中该肽选自：RPRYPWWPWWPYRPRK(SEQ ID NO：19)，RRAWWKAWWARRK(SEQ ID NO：20)，RAPYWPWAWARPRK(SEQ ID NO：21)，RPAWKYWWPWPWPRRK(SEQ ID NO：22)，RAAFKWAWAWWRRK(SEQ ID NO：23)和RRRWKWAWPRRK(SEQ ID NO：24)。

60.  根据权利要求46的肽，其中该肽具有抗炎症活性。

61.  根据权利要求42的肽，其中该肽具有抗脓毒症活性。

62.  包含通式X₁X₂X₃X₄X₁VX₃X₄RGX₄X₃X₄X₁X₃X₁(SEQ ID NO：25)的被分离的阳离子肽，X₁是一个或两个R或K，X₂是一个极性或带电荷的氨基酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、R和H)，X₃是C、S、M、D或A，X₄是F、I、V、M或R。

63.  根据权利要求50的阳离子肽，其中该肽选自：RRMCIKVCVRGVCRRKCRK(SEQ ID NO：26)，KRSCFKVSMRGVSRRRCK(SEQ ID NO：27)，KKDAIKKVDIRGMDMRRAR(SEQ ID NO：28)，RKMVKVDVRGIMIRKDRR(SEQ ID NO：29)，KQCVKVAMRGMALRRCK(SEQ ID NO：30)和RREAIRRVAMRGRDMKRMRR(SEQ ID NO：31)。

64.  根据权利要求50的肽，其中该肽具有抗炎症活性。

65.  根据权利要求50的肽，其中该肽具有抗脓毒症活性。

66.  包含通式X₁X₂X₃X₄X₁VX₅X₄RGX₄X₅X₄X₁X₃X₁(SEQ ID NO：32)的被分离的阳离子肽，X₁是一个或两个R或K，X₂是一个极性或带电荷的氨基酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、R和H)，X₃是一个C、S、M、D或A，X₄是一个F、  I、V、M或R，X₅是一个A、I、S、M、D或R。

67.  根据权利要求54的阳离子肽，其中该肽选自：RTCVKRVAMRGIIRKRCR(SEQ ID NO：33)，KKQMMKRVDVRGISVKRKR(SEQ ID NO：34)，KESIKVIIRGMMVRMKK(SEQ ID NO：35)，RRDCRRVMVRGIDIKAK(SEQ ID NO：36)，KRTAIKKVSRRGMSVKARR(SEQ ID NO：37)和RHCIRRVSMRGIIMRRCK(SEQ ID NO：38)。

68.  根据权利要求54的肽，其中该肽具有抗炎症活性。

69.  根据权利要求54的肽，其中该肽具有抗脓毒症活性。

70.  包含通式KX₁KX₂FX₂KMLMX₂ALKKX₃(SEQ ID NO：39)的被分离的阳离子肽，其中X₁是一个极性氨基酸(C、S、T、M、N和Q)；X₂是一个A、L、S或K，X₃是1-1 7个选自G、A、V、L、I、P、F、S、T、K和H的氨基酸。

71.  根据权利要求58的阳离子肽，其中该肽选自：KCKLFKKMLMLALKKVLTGLPALKLTK(SEQ ID NO：40)，KSKSFLKMLMKALKKVLTTGLPALIS(SEQ ID NO：41)，KTKKFAKMLMMALKKVVSTAKPLAILS(SEQ ID NO：42)，KMKSFAKMLMLALKKVLKVLTTALTLKAGLPS(SEQ ID NO：43)，KNKAFAKMLMKALKKVTTAAKPLTG(SEQ ID NO：44)和KQKLFAKMLMSALKKKTLVTTPLAGK(SEQ ID NO：45)。

72.  根据权利要求58的肽，其中该肽具有抗炎症活性。

73.  根据权利要求58的肽，其中该肽具有抗脓毒症活性。

74.  包含通式KWKX₂X₁X₁X₂X₂X₁X₂X₂X₁X₁X₂X₂IFHTALKPISS(SEQ ID NO：46)的被分离的阳离子肽，其中，X₁是疏水性氨基酸，X₂是亲水性氨基酸。

75.  根据权利要求62的阳离子肽，其中该肽选自：KWKSFLRTFKSPVRTIFHTALKPISS(SEQ ID NO：47)，KWKSYAHTIMSPVRLIFHTALKPISS(SEQ ID NO：48)，KWKRGAHRFMKFLSTIFHTALKPISS(SEQ ID NO：49)，KWKKWAHSPRKVLTRIFHTALKPISS(SEQ ID NO：50)，KWKSLVMMFKKPARRIFHTALKPISS(SEQ ID NO：51)和KWKHALMKAHMLWHMIFHTALKPISS(SEQ ID NO：52)。

76.  根据权利要求62的肽，其中该肽具有抗炎症活性。

77.  根据权利要求62的肽，其中该肽具有抗脓毒症活性。

78.  含有序列KWKSFLRTFKSPVRTVFHTALKPISS(SEQ ID NO：53)的被分离的阳离子肽。

79.  含有序列KWKSYAHTIMSPVRLVFHTALKPISS(SEQ ID NO：54)的被分离的阳离子肽。

80.  根据权利要求28的方法，其中该试剂为锌指蛋白(AF061261)；细胞周期基因(S70622)；IL-10受体(U00672)；转移酶(AF038664)；同源框蛋白(AC004774)；分叉头型蛋白(AF042832)；未知(AL096803)；KIAA0284蛋白(AB006622)；假想蛋白(AL022393)；受体(AF112461)；假想蛋白(AK002104)；蛋白(AL050261)；多肽(AF105424)；SPR1蛋白(AB031480)；脱氢酶(D17793)；转移酶(M63509)；和过氧化物酶体因子(AB013818)。

81.  具有由权利要求56鉴定的感染状态的个体的多聚核苷酸表达谱型，其中被增量调节的基因是登记号D87451，环指蛋白10；登记号AL049975，未知；登记号U39067，真核翻译起始因子3亚基2；登记号AK000942，未知；登记号AB040057，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶MASK；登记号AB020719，KIAA0912蛋白；登记号AB007856，FEM-1样死亡受体结合蛋白；登记号AL137376，未知；登记号AL137730，未知；登记号M90696，组织蛋白酶S；登记号；登记号AK001143，未知；登记号AF038406，NADH脱氢酶；登记号AK000315，假想蛋白FLJ20308；登记号M54915，pim-1癌基因；登记号D29011，蛋白酶体亚基β型5；登记号AL034348，未知；登记号D87076，KIAA0239蛋白；登记号AJ001403，气管支气管粘蛋白5亚型B；登记号J03925，整连蛋白αM；与Rho相关的激酶2(NM_004850)、PTD017蛋白(AL050361)、未知基因(AK001143、AK034348、AL049250、AL16199、AL031983)，视黄酸受体(X06614)、G蛋白偶联受体(Z94155、X81892、U52219、U22491、AF015257、U66579)、趋化因子(C-C基序)受体7(L31584)、肿瘤坏死因子受体超家族成员17(Z29575)、干扰素γ受体2(U05875)、细胞因子受体样因子1(AF059293)、I类细胞因子受体(AF053004)、凝集因子II(凝血酶)受体样2(U92971)、白血病抑制因子受体(NM_002310)、干扰素γ受体1(AL050337)或它们的任意组合。

82.  根据权利要求32的方法，其中该趋化因子包括CXCR4、CXCR1、CXCR2、CCR2、CCR4、CCR5、CCR6、MIP-1α、MDC、MIP-3α、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5和RANTES。

83.  根据权利要求33的方法，其中该细胞分化因子包括TGFβ诱导性早期生长应答2(AI473938)，锌指蛋白(AF061261，U00115，X78924)，和转录因子(U31556，AL137681，X68560)。

84.  根据权利要求38的化合物，其中该化合物改变激酶活性。

85.  根据权利要求84的化合物，其中该激酶选自MAP激酶激酶3(D87116)，MAP激酶激酶6(H07920)，MAP激酶激酶5(W69649)，MAP激酶7(H39192)，MAP激酶12(AI936909)，被MAP激酶激活的蛋白激酶3(W68281)，或MAP激酶激酶1(L11284)。

86.  根据权利要求21的化合物，其中该化合物降低蛋白酶体亚基表达。

87.  根据权利要求86的化合物，其中该蛋白酶体亚基包括具有登记号D11094，L02426，D00763，AB009398，AF054185，M34079，M34079或AL031177的多聚核苷酸。

88.  降低SDF-1受体的多聚核苷酸表达的被分离的阳离子肽。

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相关申请资料
本申请依据35 USC 119(e)要求基于于2001年12月3日提出申请的美国专利申请序列号60/336,632的优先权，在此完整引用作为参考。
技术领域
[0001]本发明总体上涉及肽，更具体地，涉及作为治疗有效的肽，和有效地用于与微生物感染引起的病理相关的药物开发和有效地调节先天免疫或抗炎活性的肽。
发明背景
[0002]感染性疾病是世界范围内导致死亡的主要原因。根据1999年世界卫生组织的研究，每年有超过1.3千万人死于感染性疾病。在北美，感染性疾病是导致死亡的第三大祸首，每年有20％的死亡归咎于感染性疾病，而且自1980年以来它就以50％的速度递增。许多药物治疗和手术治疗成功的关键也都在于对感染性疾病的控制。抗生素的发现和使用已经成为现代医学的重大成就之一。没有抗生素，医生就无法开展复杂的手术、化疗和大多数医学干预，例如导管插入术(catheterization)。
[0003]目前，抗生素在世界范围内的销售量为260亿美元。然而，抗生素的滥用和某些不正当应用已经导致进化出对抗生素具有抗性的新菌株。抗生素抗性已经成为医学领域的一个组成部分。不能用抗生素对付一些细菌，如具有万古霉素抗性的肠球菌，VRE和具有甲氧苯青霉素(methicillin)抗性的葡萄球菌，MRSA菌株，于是，被这些细菌感染的病人常常就会死去。对于新药开发来说，抗生素的发现已经成为最困难的领域之一，许多大的制药公司已经削减或者完全停止了它们的抗生素开发项目。然而，随着抗生素抗性问题的急剧增涨，包括不能被治疗的感染性疾病的出现，对新型抗微生物疗法的医学需求显然未能得到满足，对先天免疫能够产生影响的制剂将成为这样的一类制剂之一。
[0004]先天免疫系统是极为有效的、高度进化的普遍的防御系统。先天免疫的要素(elements)总是低水平地存在，当受到刺激时，它们能非常快速地被激活。刺激包括细菌信号传导分子和身体细胞表面的谱型识别受体间的相互作用，或其它致病机理。每天，人类都要通过各位所消化的食物和水分、各位所呼吸的空气、各位所触摸到的物体表面、宠物和人，接触到成千上万的潜在的病原微生物。先天免疫便发挥作用以防止这些病原体引起疾病的发生。先天免疫系统不同于所谓的适应性免疫(它包括抗体和抗原特异性B淋巴细胞及T淋巴细胞)，因为前者总是存在的，能立刻产生效应，并且对于任何特定的病原体都是相对非特异性的。适应性免疫要求放大特定的识别要素(recoginationelements)，因此需要数天至数周才能发生响应。即便用疫苗接种预先刺激了适应性免疫，它也可能需要三天或者更长时间对一种病原体作出反应，然而，先天免疫可以立刻或很快地(数小时)地进行反应。先天免疫涉及各种效应物功能，包括吞噬细胞、补体等等，但是尚未被完全理解。一般说来，许多先天免疫响应都是由微生物信号传导分子结合到宿主细胞表面上的谱型识别受体而“触发”的，该谱型识别受体称之为Toll样受体。在炎症反应中，有许多这样的效应物功能(effector function)聚集到一起。然而，一个太剧烈的炎症反应会导致对身体有害的反应，在极端的情况中可能出现脓毒症，以及很可能死亡。
[0005]在感染过程中，结构性组分从感染原(infectious agents)上释放出来，导致炎症应答，当它未受到抑制时，则有可能导致潜在的致死状况，脓毒症。在北美每年有大约780,000例脓毒症患者。脓毒症的发生可能是在社区获得的传染病如肺炎导致的结果，也可能是治疗外伤、癌症或大外科时的并发症。当身体完全无法控制炎症应答时，便会发生严重的脓毒症，身体器官开始失去机能。在北美每年有多达120,000人死于脓毒症。脓毒症也可能涉及病原微生物或血液中的毒素(例如，败血症)，它是人类死亡的一个主要原因。革兰氏阴性细菌是与这类疾病联系最为普遍的生物。然而，革兰氏阳性细菌也在越来越多地引起感染病。革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌以及它们的组分都能导致脓毒症。
[0006]微生物组分的存在引起促炎细胞因子的释放，在这些促炎细胞因子中，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是极其重要的。TNF-α和其它促炎细胞因子又能够导致其它促炎介质(pro-inflammatory mediator)的释放并导致炎症级联反应(pro-inflammatory cascade)。革兰氏阴性脓毒症通常是由细菌外膜组分，脂多糖(LPS，也被称为内毒素)地释放引起的。血液中的内毒素，被称为内毒素血症(endotoxemia)，它主要来自于细菌感染，可以在抗生素治疗过程中被释放。革兰氏阳性脓毒症可由细菌的细胞壁组分的释放引起，这些细胞壁组分例如脂磷壁酸(LTA)、肽聚糖(PG)、由链球菌产生的鼠李糖-葡萄糖聚合物，或由葡萄球菌产生的荚膜多糖。不同于哺乳动物DNA，细菌或其他非哺乳动物的DNA含有高频率的未甲基化的胞嘧啶-鸟苷二聚体(CpGDNA)，已经表明细菌或其他非哺乳动物的DNA也能引发脓毒症状况，包括TNF-α的产生。哺乳动物DNA含有CpG二核苷酸的频率要低得多，它们常常是甲基化的形式。除了在细菌感染过程中它们的自然释放，抗生素治疗也能导致细菌细胞壁组分LPS和LTA的释放，而且也可能导致细菌DNA的释放。这可能阻碍从感染痊愈，或者甚至导致脓毒症。
[0007]人们不断认识到阳离子肽(cationic peptides)可以作为防御感染的一种形式，尽管在科学和专利文献中，它的主要效果被认为是抗微生物的效果(Hancock，R.E.W.，和R.Lehrer.1998 Cationic peptides：anew source of antibiotics.Trends in Biotechnology16：82-88)。具有抗微生物活性的阳离子肽已经从多种生物中分离出来。事实上，这些肽提供了一种防御微生物例如细菌和酵母的机制。一般地，认为这些阳离子肽与细胞质膜相互作用，而且在大多数情况下，会形成通道和损伤，由此对细菌产生抗微生物活性。在革兰氏阴性细菌中，它们和LPS作用，使外膜具有可通透性，由此导致自促式的穿透外膜的吸收，并到达细胞质膜。阳离子抗微生物肽的例子包括indolicidin(来自牛嗜中性细胞的抗微生物多肽)、防御素(defensins)、杀菌肽(cecropins)和爪蟾抗菌肽(magainins)。
[0008]最近，已经逐渐认识到，在先天免疫的其它方面，这些肽可以作为效应物(Hancock，R.E.W.和G.Diamond.2000.The role of cationicpeptides in innate host defenses.Trends in Microbiology8：402-410.；Hancock，R.E.W.2001.Cationic peptides：effectors in innate immunity andnovel antimicrobials.Lancet Infectious Diseases1：156-164)，尽管还不知道该抗微生物功能和效应物功能是否有关。
[0009]一些阳离子肽具有能够结合细菌产物如LPS和LTA的吸附作用。在对LPS的应答中，这些阳离子肽能够抑制细胞因子的产生，因此能够在一定程度上防止致死性休克。然而，还没有证明，这些效果是由于该肽结合到LPS和LTA上，还是由于该肽和宿主细胞的直接作用。在对微生物或微生物信号分子如LPS的攻击产生应答时，阳离子肽通过与由哺乳动物免疫系统使用的调控路径相类似的调控路径被诱导(涉及Toll样受体和转录因子；NFκB)。由此看来，阳离子肽在先天免疫中具有关键的作用。影响抗细菌肽的诱导的突变能够降低对细菌攻击进行应答时的生存者。同样，当果蝇的Toll路径发生可导致抗真菌肽表达降低的突变时，也就增加了对致死性真菌感染的敏感性。对于人类，患有颗粒体缺乏综合症的病人完全缺乏α-防御素，会患上频繁的和严重的细菌感染疾病。其它证据包括一些肽可由传染原(infectious agents)诱导，以及已经发现在炎症发生处这些肽的浓度相当高。阳离子肽也可以调控细胞迁移，以促进白细胞抵抗细菌感染的能力。例如，已经发现，两种人α-防御素多肽，HNP-1和HNP-2，对鼠和人的T细胞和单核细胞具有趋化活性，而且，人β-防御素似乎能够通过和CCR6作用，而对未成熟树突细胞和记忆T细胞起到化学引诱物(chemoattractants)的作用。类似地，发现猪的阳离子肽PR-39对嗜中性粒细胞具有趋化作用。然而，具有不同结构和组成的肽是否共有这些性质仍不清楚。
[00010]LL-37是唯一已知的来自人的cathelicidin(一种具强有力膜活性的抗微生物肽类的前体)，它是由骨髓前体、睾丸、炎症疾病期间的人角化细胞和气道上皮细胞产生。Cathelicidin肽的特征是在称之为cathelin结构域的N端前体区域(prepro region)具有相当高比例的序列同一性。Cathelicidin肽作为未活化的前肽前体被贮存起来，一旦受到刺激，它便被加工成为活性肽(active peptides)。
发明概述
[00011]本发明是基于如下开创性发现：可以基于受内毒性的脂多糖、脂磷壁酸、CpG DNA或其它细胞成分(例如微生物或它们的细胞成分)调节，而又被阳离子肽影响的多聚核苷酸表达谱型，筛选出可阻断或降低个体的脓毒症和/或炎症的新颖化合物。而且，在使用阳离子肽作为工具的基础上，能够鉴定出先天免疫的选择性强化剂，它们不会引起脓毒症反应，却能够阻断/抑止炎症和/或脓毒症应答。
[00012]因此，在一个实施方案中，提供了鉴定多聚核苷酸或多聚核苷酸谱型的方法，这些多聚核苷酸受一种或多种脓毒症或炎症诱导物调节，同时受阳离子肽抑制。本发明的方法包括将一种或多种多聚核苷酸与一种或多种脓毒症或炎症诱导物接触，并同时或随后立即将该种或该多种多聚核苷酸与阳离子肽接触。检测在阳离子肽存在时和阳离子肽不存在时的表达差异，在表达上的变化，或者是增量调节(up-regulation)或者是减量调节(down-regulation)，可以作为受脓毒症或炎症诱导物调节同时又受阳离子肽抑制的多聚核苷酸或多聚核苷酸谱型的标志。在另一个方面，本发明提供了由上述方法鉴定的一种或多种多聚核苷酸。脓毒症或炎症调节物包括LPS、LTA或CpG DNA或微生物成分(或它们的任意组合)，或相关试剂。
[0010]在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定可阻止脓毒症或炎症的试剂的方法，包括将由前述方法鉴定出的多聚核苷酸与一种试剂进行组合，其中，与不存在该试剂时相比较，在存在该试剂时该多聚核苷酸的表达受到了调节，并且在表达上的这种调节影响炎症或脓毒症应答。
[0011]在另一个实施方案中，本发明通过1)在存在或缺乏阳离子肽的情况下，将细胞与LPS、LTA和/或CpG DNA接触，和2)检测在存在或缺乏该肽的情况下的多聚核苷酸表达谱型，提供了一种鉴定在炎症或脓毒症应答受抑制时的多聚核苷酸表达谱型的方法。在该肽存在时获得的谱型代表炎症或脓毒症应答受到抑制。在另一个方面，将该肽存在时获得的谱型与一种受测化合物存在时获得的谱型相比较，从而鉴定出提供类似谱型的化合物。在另一个方面，本发明提供了由前述方法鉴定的化合物。
[0012]在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定可强化先天免疫的试剂的方法，包括将编码涉及先天免疫的多肽的一种或多种多聚核苷酸与感兴趣的试剂接触，其中，与不存在该试剂时相比较，在存在该试剂时该多聚核苷酸的表达被调节，并且该被调节的表达导致先天免疫的强化。优选地，该试剂并不刺激个体内的脓毒症反应。在一个方面，该试剂增加抗炎症的多聚核苷酸的表达。示例性但非限制性的抗炎多聚核苷酸编码的蛋白例如：IL-1 R拮抗剂同源物1(AI167887)、IL-10Rβ(AA486393)、IL-10Rα(U00672)、TNF受体成员1B(AA150416)、TNF受体成员5(H98636)、TNF受体成员11b(AA194983)、HLA II的IK细胞因子减量调节物(R39227)、TGF-B诱导性早期生长应答蛋白2(AI473938)、CD2(AA927710)、IL-19(NM_013371)或IL-10(M57627)。在一个方面，该试剂降低编码涉及NK-κB激活的蛋白酶体亚基例如蛋白酶体亚基26S(NM_013371)的多聚核苷酸的表达。在一个方面，该试剂可以作为蛋白激酶的拮抗剂。在一个方面，该试剂是选自SEQ ID NO：4-54的肽。
[0013]在另一个实施方案中，本发明提供了一种鉴定多聚核苷酸表达谱型以鉴定可选择性地强化先天免疫的化合物的方法。本发明包括检测在有阳离子肽接触时和无阳离子肽接触时细胞的多聚核苷酸表达谱型，其中，在该肽存在时的谱型代表刺激先天免疫；检测在有一种受测化合物接触时细胞的多聚核苷酸表达谱型，其中，如果使用该受测化合物时的谱型与在该阳离子肽存在时观察到的谱型相类似，则表示该受测化合物可强化先天免疫。优选的是，该化合物并不刺激个体内的脓毒症反应。
[0014]在另一个实施方案中，本发明提供了由一哺乳动物个体的核酸样品推断该个体的感染状态的方法，该方法是依靠于确定该核酸样品中的多聚核苷酸表达谱型，例如与未感染的个体相比，表50、51和/或52中的至少两种多聚核苷酸的表达量增加。还包括由上述任一方法获得的多聚核苷酸表达谱型。
[00013]在另一个方面，提供了作为CXCR-4的拮抗剂的阳离子肽。仍然在另一个方面，提供了鉴定作为CXCR-4的拮抗剂的阳离子肽的方法，包括在受测肽存在或不存在的情况下将T细胞和SDF-1接触，并测量趋化性。如果在受测肽存在时趋化性降低，则表明该肽是CXCR-4的拮抗剂。阳离子肽也可以起到降低SDF-1受体多聚核苷酸(NM_013371)的表达的作用。
[0015]在上述所有方法中，本发明的化合物或试剂包括但不限于肽(peptides)、阳离子肽(cationic peptides)、肽模拟物(peptidomimetics)、化学化合物(chemical compounds)、多肽(polypeptides)、核酸分子(nucleicacid molecules)和类似物。
[0016]仍然在另一方面，本发明提供了被分离的阳离子肽。本发明的被分离的阳离子肽可用下列任一通式和单字母氨基酸记号表示：
X₁X₂X₃IX₄PX₄IPX₅X₂X₁(SEQ ID NO：4)，其中X₁是一个或两个R、L或K，X₂是一个C、S或A，X₃是一个R或P，X₄是一个A或V，X₅是一个V或W；
X₁LX₂X₃KX₄X₂X₅X₃PX₃X₁(SEQ ID NO：11)，其中X₁是一个或两个D、E、S、T或N，X₂是一个或两个P、G或D，X₃是一个G、A、V、L、I或Y，X₄是一个R、K或H，X₅是一个S、T、C、M或R；
X₁X₂X₃X₄WX₄WX₄X₅K(SEQ ID NO：18)，其中X₁是一至四个选自A、P或R的氨基酸，X₂是一个或两个芳香氨基酸(F、Y和W)，X₃是一个P或K，X₄是零至两个选自A、P、Y或W的氨基酸，X₅是一至三个选自R或P的氨基酸；
X₁X₂X₃X₄X₁VX₃X₄RGX₄X₃X₄X₁X₃X₁(SEQ ID NO：25)，其中X₁是一个或两个R或K，X₂是一个极性的或带电荷的氨基酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、R和H)，X₃是C、S、M、D或A，X₄是F、I、V、M或R；
X₁X₂X₃X₄X₁VX₅X₄RGX₄X₅X₄X₁X₃X₁(SEQ ID NO：32)，其中X₁是一个或两个R或K，X₂是一个极的性或带电荷的氨基酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、R和H)，X₃是一个C、S、M、D或A，X₄是一个F、I、V、M或R，X₅是一个A、I、S、M、D或R；和
KX₁KX₂FX₂KMLMX₂ALKKX₃(SEQ ID NO：39)，其中，X₁是一个极性氨基酸(C、S、T、M、N和Q)；X₂是一个A、L、S或K，X₃是1至17个选自G、A、V、L、I、P、F、S、T、K和H的氨基酸；
KWKX₂X₁X₁X₂X₂X₁X₂X₂X₁X₁X₂X₂IFHTALKPISS(SEQ ID NO：46)，其中X₁是一个疏水氨基酸，X₂是一个亲水氨基酸。
[0017]此外，在另一方面本发明提供了被分离的阳离子肽KWKSFLRTFKSPVRTVFHTALKPISS(SEQ ID NO：53)和KWKSYAHTIMSPVRLVFHTALKPISS(SEQ ID NO：54)。
[0018]还提供了编码本发明的阳离子肽的核酸序列，包含这些多聚核苷酸的载体和含有这些载体的宿主细胞。
发明详述
[0019]本发明提供了可由一组通式表征的新颖的阳离子多肽，它们能够调节(例如，增量调控和/或减量调控)多聚核苷酸的表达，由此调控和炎症应答和/或先天免疫。
[0020]在此使用的“先天免疫”是指一种生物防御病原体入侵、保护自己的先天具有的能力。在此使用的病原体或微生物可以包括，但不限于细菌、真菌、寄生虫和病毒。先天免疫与获得性/适应性免疫不同，对于后者，生物主要是基于抗体和/或免疫淋巴细胞来发展自己的防御机制，其特征是特异性、可放大性和辨认自身与非自身。先天免疫提供了广泛的非特异性免疫，并且对于以前的暴露没有免疫记忆。先天免疫的特点是能够有效地抵抗广范围的各种潜在病原体，而不依赖于对一种病原体的先前接触，先天免疫的另一个特点是能够快速的生效(与特异性免疫应答相比较而言，特异性免疫应答的激发需要数天到数周的时间)。而且，先天免疫包括影响到其它疾病的免疫应答，这些疾病例如癌症、炎症疾病、多发性硬化症、各种病毒感染，等等。
[0021]正如在此所使用的，术语“阳离子肽”是指约5到约50个氨基酸长的氨基酸序列。在一个方面，本发明的阳离子肽的长度为约10到约35个氨基酸。如果一个肽具有足够的正电荷氨基酸，以致于pKa大于9.0，则认为该肽是“阳离子肽”。通常，该阳离子肽的氨基酸残基中至少有两个是带正电荷的，例如赖氨酸和精氨酸。“具正电荷”是指在pH 7.0时具有净的正电荷的氨基酸残基侧链。自然出现的阳离子抗微生物肽的例子包括防御素、cathelicidins、爪蟾抗菌肽、峰毒肽(melittin)、杀菌肽、bactenecins(来自牛嗜中性粒细胞的抗微生物多肽)、indolicidins、polyphemusins、tachyplesins(来自马蹄蟹血细胞的抗微生物多肽)，以及它们的类似物，这些自然出现的阳离子抗微生物多肽可以依据本发明重组产生。许多生物都制造阳离子肽，把这些分子作为抵抗微生物的非特异性防御机制的一部分来使用。分离出来的这些肽对广范围的各种微生物具有毒性，包括细菌、真菌和某些带被膜的病毒。当阳离子肽对许多病原体发挥抵抗作用时，显著的异常和不同程度的毒性是存在的。然而，本专利揭露了对微生物不具毒性却能够通过刺激先天免疫防御感染的其它阳离子肽，并且本发明并不限于具有抗微生物活性的阳离子肽。事实上，在本发明中使用的许多肽并没有抗微生物活性。
[0022]在本技术领域已知的阳离子肽包括，例如人cathelicindinIL-37、牛嗜中性细胞多肽indolicidin、以及牛bactenecin的变体，Bac2A。
IL-37 LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES(SEQ ID：1)
Indolicidin     ILPWKWPWWPWRR-NH₂(SEQ ID NO：2)
Bac2A           RLARIVVIRVAR-NH₂(SEQ ID NO：3)
[0023]在先天免疫中，免疫应答并不依赖于抗原。先天免疫过程可以包括分泌性分子和前面提出的细胞组分的产生。先天免疫中，病原体由在生殖种系中编码的受体识别。这些Toll样受体具有广泛的特异性，能够识别许多病原体。当阳离子肽出现在免疫应答中时，它们辅助宿主对病原体的应答。在免疫应答中的这种变化诱导趋化因子的释放，趋化因子促使免疫细胞集中到感染发生的部位。
[0024]趋化因子或化学诱导细胞因子属于一类免疫因子，它们介导趋化和其它促炎症现象(参见，Schall，1991，Cytokine 3：165-183)。趋化因子是长度大约70-80残基的小分子，通常被分为两小类，具有由单个氨基酸隔开的N端半胱氨酸(CxC)的α亚类，和在N端具有两个相邻半胱氨酸(CC)的β亚类。RANTES、MIP-1α和MIP-1β属于β亚类(参见综述：Horuk，R.，1994，Trends Pharmacol.Sci，15：159-165；Murphy，P.M.，1994，Annu.Rev.Immunol.，12：593-633)。β型趋化因子RANTES、MCP-1和MCP-3的氨基末端关联到介导细胞迁移和由这些趋化因子诱导的炎症反应的调节。这种关联由实验观察看出，剔除MCP-1氨基末端的8个残基、MCP-3氨基末端的9个残基和RANTES氨基末端的8个残基，以及将一个甲硫氨酸增加到RANTES的氨基末端，会对其趋化性、钙转移和/或由它们的天然相似物刺激的酶释放产生拮抗作用(Gong等，1996 J.Biol.Chem.271：10521-10527；Proudfoot等，1996 J.Biol.Chem.271：2599-2603)。另外，可以通过将Tyr 28和Arg 30通过双突变变为亮氨酸和缬氨酸，将与α型趋化因子类似的趋化活性引入到MCP-1中，这表明该蛋白的内部区域在调控趋化活性时也发挥着作用(Beall等，1992，J.Biol.Chem.267：3455-3459)。
[0025]迄今已获表征的所有趋化因子的单体形式都具有明显的结构同源性，尽管α型和β型的四级结构有所不同。β型和α型趋化因子的单体结构非常类似，但是这两种类型的二聚体结构则完全不同。还鉴别出了另外一种趋化因子，淋巴细胞趋化因子(lymphotactin)，它只有一个N端半胱氨酸，它代表了趋化因子的第三个亚家族(γ)(Yoshida等，1995，FEBS Lett.360：155-159；和Kelner等，1994.Science266：1395-1399)。
[0026]趋化因子的受体属于与G蛋白偶联的具有7个跨膜结构域的受体(GCR’s)大家族(参见综述：Horuk，R.，1994，Trends Pharmacol.Sci.15：159-165；和Murphy，P.M.，1994，Annu.Rev.Immunol.12：593-633)。竞争结合和交互失敏(cross-desensitization)研究已表明趋化因子受体在结合配体时具有明显的混杂性。证明β趋化因子间的混杂性的例子包括：CC CKR-1结合RANTES和MIP-1α(Neote等，1993，Cell 72：415-425)，CC CKR-4结合RNATES、MIP-1α和MCP-1(Power等，1995，J.Biol.Chem.270：19495-19500)，以及CC CKR-5结合RNATES、MIP-1α和MIP-1β(Alkhatib等，1996，Science，in press和Dragic等，1996，Nature 381：667-674)。红细胞具有一种能够结合α和β趋化因子的受体(被称为Duffy antigen(达菲抗原))(Horuk等，1994，J.Biol.Chem.269：17730-17733；Neote等，1994，Blood 84：44-52；和Neote等，1993，J.Biol.Chem.268：12247-12249)。因此，趋化因子以及它们的受体间的明显的序列和结构同源性使得在受体-配体的相互作用中存在着重叠。
[0027]一方面，本发明提供了包括本发明的阳离子肽在内的化合物通过直接作用于宿主细胞而减少脓毒症和炎症应答的应用。在这一方面，一种鉴别被一种或多种脓毒症或炎症诱导物调控的多聚核苷酸的方法被提供，其中该调控被阳离子肽改变。所述的脓毒症或炎症诱导物包括，但不限于内毒性脂多糖(LPS)、脂磷壁酸(LTA)和/或CpG DNA或完整的细菌或其它细菌组分。该鉴别方法是依靠将多聚核苷酸与脓毒症或炎症诱导物接触，并同时或随后立即与阳离子肽接触。在存在阳离子肽和缺少阳离子肽时，对多聚核苷酸的表达进行观察，表达上的变化说明该核苷酸或该类型的核苷酸受脓毒症或炎症诱导物的调控，并受阳离子肽的抑制。在另一个方面，本发明提供了由该方法鉴定的多聚核苷酸。
[0028]这样的多聚核苷酸一旦被鉴定出来，就可用于筛选能够通过影响该多聚核苷酸的表达而阻止脓毒症或炎症的化合物。对表达的这种影响可以是表达的增量调控(up regulation)或减量调控(downregulation)。通过鉴定不激发脓毒症反应的化合物和能够阻止或抑止炎症或脓毒症反应的化合物，本发明还提出了一种鉴别先天免疫强化剂的方法。此外，本发明提供了在上述方法中使用和鉴别出的化合物。
[0029]候选化合物从广泛的来源获得，包括各种合成化合物和天然化合物。例如，可以利用许多方法来随机和定向合成出各种有机化合物和生物分子，包括随机寡聚核苷酸和寡聚多肽的表达。作为选择，以细菌、真菌、植物和动物提取物形式存在的天然化合物的文库(libraries)可被利用或方便地生产。此外，可以通过传统的化学、物理和生化手段方便地修饰天然的或合成产生的文库和化合物，也可利用这些文库和化合物得到组合文库(combinatorial libraries)。已知的药理学的药剂可以作定向或随机的化学修饰，例如酰基化、烷基化、酯化、酰胺化等等，从而得到结构类似物(structural analogs)。候选试剂也可以从生物分子中找到，包括但不限于：肽、肽模拟物(peptidiomimetics)、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、多肽、多聚核苷酸、化合物(chemicalcompounds)、衍生物(derivatives)、结构类似物(structural analogs)或它们的组合(combinations)。
[0030]筛选实验的温育要素(components)包括允许受测化合物与感兴趣的多聚核苷酸相互接触的条件。接触可以是在液相中、固相中，或者在细胞中。为了筛选出多个化合物，受测化合物可以选择为组合文库。依本发明的方法鉴定出的化合物可以通过在检测化合物时通常使用的任何方法，在溶液中或者在结合到固体支持物之后，被进一步评估、检测、克隆、测序等等。
[0031]一般而言，在本发明的方法中，利用阳离子肽来检测和定位在脓毒症和炎症过程中必需的多聚核苷酸。一旦被鉴定出来，就可以通过观察其在阳离子肽存在和缺乏时的表达来获得多聚核苷酸的表达谱型(pattern)。在阳离子肽存在的情况下获得的谱型对于鉴定能够抑制该多聚核苷酸的表达并由此阻止脓毒症或炎症的其它化合物又是很有用的。对于本领域技术人员而言，已熟知的是，非肽类化合物和肽模拟物能够模拟肽结合受体的能力和酶结合位点，并由此可被用来阻断或激发生物反应。当一种感兴趣的另外的化合物提供了与在阳离子肽存在时相类似的多聚核苷酸表达谱型时，也可该应用化合物来调节脓毒症或先天免疫应答。如此讲来，本发明的阳离子肽在作为脓毒症和炎症的已知抑制剂和先天免疫的已知强化剂的同时，也可用作鉴定抑制脓毒症和炎症和强化先天免疫的其它化合物的工具。
[0032]正如在后面的实施例中看到的，本发明的肽具有广泛的减少由LPS调控的多聚核苷酸表达的能力。在严重的感染或炎症期间所看到的许多症状例如发烧和白血细胞数目升高都归咎于血液中的高水平内毒素。内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁的一种组分，它是脓毒症在病理生理学上强有效的引发剂(trigger)。炎症和脓毒症的基本机制是相关联的。在实施例1中，利用多聚核苷酸阵列来确定阳离子肽对上皮细胞的转录应答的影响。特别地，观察了对由LPS诱导的超过14,000个不同的特定多聚核苷酸的影响。表格显示了用肽处理过的细胞与对照细胞相比所见到的变化。得到的数据表明该肽具有降低由LPS诱导的多聚核苷酸表达的能力。
[0033]类似地，实施例2说明了本发明的肽能够中和革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌产物对免疫细胞的刺激。另外，注意到，某些促炎症的多聚核苷酸受阳离子肽的减量调节，这些阳离子肽在表24中写出，例如TLR1(AI339155)、TLR2(T57791)、TLR5(N41021)、TNF受体相关因子2(T55353)、TNF受体相关因子3(AA504259)、TNF受体超家族成员12(W71984)、TNF受体超家族成员17(AA987627)、小分子诱导性细胞因子亚家族B成员6(AI889554)、IL-12Rβ2(AA977194)、IL-18受体1(AA482489)，而抗炎症的多聚核苷酸受阳离子多肽的增量调节，这些阳离子多肽在表25中写出，例如IL-1R拮抗剂同源物1(AI167887)、IL-10Rβ(AA486393)、TNF受体成员1B(AA150416)、TNF受体成员5(H98636)、TNF受体成员11b(AA194983)、HLA II的IK细胞因子减量调节物(R39227)、可由TGF-B诱导的早期生长应答2(AI473938)或CD2(AA927710)。这些结果的适用性和应用通过对鼠的体内应用证实。实施例3证明了这些肽对与之接触的宿主细胞基本上不会产生毒性。
[0034]在实施例4中可以看到，本发明的阳离子肽可改变巨噬细胞和上皮细胞中的多聚核苷酸表达。此实施例的结果说明，促炎症的多聚核苷酸受阳离子肽的减量调节(down-regulated)(表24)，而抗炎症的多聚核苷酸受阳离子肽的增量调节(up-regulated)(表25)。
[0035]在另一个方面，本发明提供了鉴定可强化先天免疫的试剂的方法。在此方法中，将宿主细胞中编码涉及先天免疫的多肽的多聚核苷酸与感兴趣的试剂接触。在存在该试剂和缺少该试剂的情况下，测定该多聚核苷酸的表达。比较表达情况，表达的特异性调节说明先天免疫被强化。在另一方面，该试剂并不激发脓毒症反应，如同缺乏促炎症细胞因子TNF-α的增量调节(upregulation)时所揭示的。仍然在另一个方面，该试剂降低或阻断炎症或脓毒症应答。还是在另一个方面，该试剂降低TNF-α和/或白介素的表达，白介素包括但不限于IL-1β、IL-6、IL-12 p40、IL-12 p70和IL-8。
[0036]在另一方面，本发明提供了利用阳离子肽进行直接的多聚核苷酸调节的方法和包括阳离子肽在内的化合物在激化先天免疫的元素(elements)中的应用。在这一方面，本发明提供了为了鉴定可强化先天免疫的化合物而确定多聚核苷酸表达谱型的方法。在本发明的该方法中，对与阳离子肽接触的和未与阳离子肽接触的细胞作了多聚核苷酸表达谱型的初步检测。在该肽存在的情况下得出的多聚核苷酸表达谱型表明先天免疫受到刺激。然后检测了在受测化合物存在的情况下多聚核苷酸的表达谱型，其中使用受测化合物得到与在阳离子肽存在时相类似的表达谱型，说明这是一个可强化先天免疫的化合物。在另一个方面，本发明提供了在上述方法中确认的化合物。在另一个方面，本发明的化合物刺激趋化因子或趋化因子受体的表达。趋化因子或趋化因子受体可以包括，但不限于CXCR4、CXCR1、CXCR2、CCR2、CCR4、CCR5、CCR6、MIP-1α、MDC、MIP-3α、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5和RANTES。仍然是在另一方面，该化合物是肽、肽模拟物(peptidomimetic)、化合物(chemical compounds)或核酸分子。
[0037]仍然是在另一方面，该多聚核苷酸表达谱型包括促炎症的多聚核苷酸的表达。这些促炎症多聚核苷酸包括，但不限于环指蛋白10(D87451)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶MASK(AB040057)、KIAA0912蛋白(AB020719)、KIAA0239蛋白(D87076)、RAP1、GTP酶激活蛋白1(M64788)、FEM-1样死亡受体结合蛋白(AB007856)、组织蛋白酶S(M90696)、假想蛋白FLJ20308(AK000315)、pim-1癌基因(M54915)、蛋白酶体亚基β型5(D29011)、KIAA0239蛋白(D87076)、气管支气管黏蛋白5亚型B(AJ001403)、cAMP应答元件结合蛋白CREBPa、整连蛋白αM(J03925)、与Rho相关的激酶2(NM_004850)、PTD017蛋白(AL050361)、未知基因(AK001143、AK034348、AL049250、AL16199、AL031983)和它们的任意组合。仍然在另一个方面，该多聚核苷酸表达谱型包括细胞表面受体的表达，细胞表面受体包括但不限于视黄酸受体(X06614)、G蛋白偶联受体(Z94155、X81892、U52219、U22491、AF015257、U66579)、趋化因子(C-C基序)受体7(L31584)、肿瘤坏死因子受体超家族成员17(Z29575)、干扰素γ受体2(U05875)、细胞因子受体样因子1(AF059293)、I类细胞因子受体(AF053004)、凝集因子II(凝血酶)受体样2(U92971)、白血病抑制因子受体(NM_002310)、干扰素γ受体1(AL050337)。
[0038]在后面例如表1-15中将说明，阳离子肽能够中和宿主对感染原的信号分子的应答，还能改变宿主细胞的转录应答，这些主要是通过减量调节促炎应答和/或增量调节抗炎应答来完成。实施例5说明，该阳离子肽能够通过诱导趋化因子的释放来辅助宿主对病原体的应答，趋化因子促使免疫细胞聚集到感染位点。这些结果通过鼠的体内应用被证实。
[0039]从后面的实施例可以看到，阳离子肽明显影响宿主对病原体的应答，原因在于阳离子肽诱导选择性的促炎应答，例如促使免疫细胞聚集到感染位点的应答，但不诱导明显有害的促炎细胞因子，由此辅助宿主免疫应答的调控。脓毒症似乎部分地是由对感染原的过度促炎应答引起的。阳离子肽诱导抗炎应答和抑制某些具有潜在危害的促炎应答，由此帮助宿主对病原体产生一种“平衡”的应答。
[0040]在实施例7中，为了研究阳离子肽与细胞相互作用时产生这些效果的基本机制，对所选择的MAP激酶的活化作了分析。巨噬细胞在应答细菌感染时激活MEK/ERK激酶。MEK是MAP激酶激酶，当它被激活时，便会磷酸化下游的激酶ERK(细胞外调节性激酶)，然后ERK形成二聚体并转移到细胞核，它在那里激活转录因子如ElK-1，由此改变多聚核苷酸的表达。已经表明MEK/ERK激酶可削弱巨噬细胞内沙门氏菌(salmonella)的复制。由MEK激酶和NADPH氧化酶介导的信号传导(signal transduction)在对细胞内病原体的先天性防御中发挥着重要的作用。如下面所示，阳离子肽通过影响MAP激酶，对细菌感染产生影响。这些阳离子肽可以直接影响激酶。表21显示了在肽的应答中MAP激酶多聚核苷酸表达的变化，但是不限于这些。这些激酶包括MAP激酶激酶6(H070920)、MAP激酶激酶5(W69649)、MAP激酶7(H39192)、MAP激酶12(AI936909)和被MAP激酶激活的蛋白激酶3(W68281)。
[0041]在另一方法中，本发明的方法可以被组合使用，以鉴定具有多种特征的试剂，即具有抗炎症/抗脓毒症活性和能够部分地通过体内诱导趋化因子而强化先天免疫的肽。
[0042]在另一个方面，本发明提供了由哺乳动物个体的核酸样品推断该个体的感染状态的方法，该方法是依靠于确定核酸样品中的多聚核苷酸表达谱型，其例证是表55中的至少两个多聚核苷酸与未感染的个体相比，多聚核苷酸表达增加。在另一方面，本发明提供了由哺乳动物个体的核酸样品推断该个体的感染状态的方法，该方法是依靠于确定核酸样品中的多聚核苷酸表达谱型，其例证是表56或表57中的至少两个多聚核苷酸与未感染的个体相比较的多聚核苷酸表达。在本发明的一个方面，感染状态的原因在于感染原或从它们那里得到的信号分子，例如，但不限于革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌、病毒、真菌或寄生虫。在另一个方面，本发明提供了依据上述方法确定的受感染个体的多聚核苷酸表达谱型。一旦经确定，这样的多聚核苷酸将可用于诊断与这些感染原或信号分子的存在或活性相关的症状。
[0043]实施例10显示了本发明的这个方面。特别地，表61证明了MEK和NADPH氧化酶抑制剂都能限制细菌的复制(鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)对由IFN-γ引发的巨噬细胞的感染激化了MEK激酶)。这是通过改变宿主细胞信号分子而如何影响细菌存活的一个例子。
[0044]仍然在本发明的另一个方面，提出了可抑制由基质细胞源性因子1(SDF-1)诱导的T细胞趋化性的化合物。还提出了可降低SDF-1受体表达的化合物。这些化合物也可以用作CXCR-4的拮抗剂或抑制剂。在一个方面，本发明提供了作为CXCR-4拮抗剂的阳离子肽。在另一个方面，本发明提供了鉴定作为CXCR-4拮抗剂的阳离子肽的方法。该方法包括，在存在受测肽和缺少受测肽时，将T细胞与SDF-1接触，并测量趋化性。在受测肽存在的情况下，趋化性的降低表明该肽是CXCR-4的拮抗剂。这些化合物和方法在HIV病人的治疗应用中是有用的。这些类型的化合物及其实用性已经被证明，例如实施例11(也参见表格62，63)。在该实施例中，已经表明阳离子肽可抑制细胞迁移(cell migration)以及抗病毒活性。
[0045]在一个实施方案中，本发明提供了具有下述通式(通式A)的氨基酸序列的被分离的阳离子肽：
X₁X₂X₃IX₄PX₄IPX₅X₂X₁(SEQ ID NO：4)，其中X₁是一个或两个R、L或K，X₂是一个C、S或A，X₃是一个R或P，X₄是一个A或V，X₅是一个V或W。
本发明的肽的例子包括，但不限于：
LLCRIVPVIPWCK(SEQ ID NO：5)，LRCPIAPVIPVCKK(SEQ ID NO：6)，KSRIVPAIPVSLL(SEQ ID NO：7)，KKSPIAPAIPWSR(SEQ ID NO：8)，RRARIVPAIPVARR(SEQ ID NO：9)和LSRIAPAIPWAKL(SEQID NO：10)。
[0046]在另一个实施方案中，本发明提供了具有下述通式(通式B)的氨基酸序列的被分离的线性阳离子肽：
X₁LX₂X₃KX₄X₂X₅X₃PX₃X₁(SEQ ID NO：11)，其中X₁是一个或两个D、E、S、T或N，X₂是一个或两个P、G或D，X₃是一个G、A、V、L、I或Y，X₄是一个R、K或H，X₅是一个S、T、C、M或R。本发明的肽的例子包括，但不限于：DLPAKRGSAPGST(SEQ ID NO：12)，SELPGLKHPCVPGS(SEQ ID NO：13)，TTLGPVKRDSIPGE(SEQ IDNO：14)，SLPIKHDRLPATS(SEQ ID NO：15)，ELPLKRGRVPVE(SEQID NO：16)和NLPDLKKPRVPATS(SEQ ID NO：17)。
[0047]在另一个实施方案中，本发明提供了具有下述通式(通式C)的氨基酸序列的被分离的线性阳离子肽：
X₁X₂X₃X₄WX₄WX₄X₅K(SEQ ID NO：18)(此式包括CP12a和CP12d)，其中X₁是一至四个选自A、P或R的氨基酸，X₂是一个或两个芳香性氨基酸(F、Y和W)，X₃是一个P或K，X₄是零至两个选自A、P、Y或W的氨基酸，X₅是一至三个选自R或P的氨基酸。本发明的肽的例子包括，但不限于：RPRYPWWPWWPYRPRK(SEQ ID NO：19)，RRAWWKAWWARRRK(SEQ ID NO：20)，RAPYWPWAWARPRK(SEQ ID NO：21)，RPAWKYWWPWPWPRRK(SEQ ID NO：22)，RAAFKWAWAWWRRK(SEQ ID NO：23)和RRRWKWAWPRRK(SEQID NO：24)。
[0048]在另一个实施方案中，本发明提供了具有下述通式(通式D)的氨基酸序列的被分离的十六聚体阳离子肽：
X₁X₂X₃X₄X₁VX₃X₄RGX₄X₃X₄X₁X₃X₁(SEQ ID NO：25)，其中X₁是一个或两个R或K，X₂是一个极性或带电荷的氨基酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、R和H)，X₃是C、S、M、D或A，X₄是F、I、V、M或R。本发明的肽的例子包括，但不限于：RRMCIKVCVRGVCRRKCRK(SEQ ID NO：26)，KRSCFKVSMRGVSRRRCK(SEQ ID NO：27)，KKDAIKKVDIRGMDMRRAR(SEQ ID NO：28)，RKMVKVDVRGIMIRKDRR(SEQ ID NO：29)，KQCVKVAMRGMALRRCK(SEQ ID NO：30)和RREAIRRVAMRGRDMKRMRR(SEQ ID NO：31)。
[0049]在另一个实施方案中，本发明提供了具有下述通式(通式E)的氨基酸序列的被分离的十六聚体阳离子肽：
X₁X₂X₃X₄X₁VX₅X₄RGX₄X₅X₄X₁X₃X₁(SEQ ID NO：32)，其中X₁是一个或两个R或K，X₂是一个极性或带电荷的氨基酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、R和H)，X₃是一个C、S、M、D或A，X₄是一个F、I、V、M或R，X₅是一个A、I、S、M、D或R。本发明的肽的例子包括，但不限于：RTCVKRVAMRGIIRKRCR(SEQ ID NO：33)，KKQMMKRVDVRGISVKRKR(SEQ ID NO：34)，KESIKVIIRGMMVRMKK(SEQ ID NO：35)，RRDCRRVMVRGIDIKAK(SEQ ID NO：36)，KRTAIKKVSRRGMSVKARR(SEQ ID NO：37)和RHCIRRVSMRGIIMRRCK(SEQ ID NO：38)。
[0050]在另一个实施方案中，本发明提供了具有下述通式(通式F)的氨基酸序列的被分离的更长的阳离子肽：
KX₁KX₂FX₂KMLMX₂ALKKX₃(SEQ ID NO：39)，其中X₁是一个极性氨基酸(C、S、T、M、N和Q)；X₂是一个A、L、S或K，X₃是1-17个选自G、A、V、L、I、P、F、S、T、K和H的氨基酸。本发明的肽的例子包括，但不限于：KCKLFKKMLMLALKKVLTTGLPALKLTK(SEQ ID NO：40)，KSKSFLKMLMKALKKVLTTGLPALIS(SEQ IDNO：41)，KTKKFAKMLMMALKKVVSTAKPLAILS(SEQ ID NO：42)，KMKSFAKMLMLALKKVLKVLTTALTLKAGLPS(SEQ ID NO：43)，KNKAFAKMLMKALKKVTTAAKPLTG(SEQ ID NO：44)和KQKLFAKMLMSALKKKTLVTTPLAGK(SEQ ID NO：45)。
[0051]在另一个实施方案中，本发明提供了具有下述通式(通式G)的氨基酸序列的被分离的更长的阳离子肽：
KWKX₂X₁X₁X₂X₂X₁X₂X₂X₁X₁X₂X₂IFHTALKPISS(SEQ ID NO：46)，其中，X₁是疏水性氨基酸，X₂是亲水性氨基酸。本发明的肽的例子包括，但不限于：KWKSFLRTFKSPVRTIFHTALKPISS(SEQ ID NO：47)，KWKSYAHTIMSPVRLIFHTALKPISS(SEQ ID NO：48)，KWKRGAHRFMKFLSTIFHTALKPISS(SEQ ID NO：49)，KWKKWAHSPRKVLTRIFHTALKPISS(SEQ ID NO：50)，KWKSLVMMFKKPARRIFHTALKPISS(SEQ ID NO：51)，和KWKHALMKAHMLWHMIFHTALKPISS(SEQ ID NO：52)。
[0052]在另一个实施方案中，本发明提供了具有下述式子的氨基酸序列的被分离的阳离子肽：
KWKSFLRTFKSPVRTVFHTALKPISS(SEQ ID NO：53)  或
KWKSYAHTIMSPVRLVFHTALKPISS(SEQ ID NO：54)。
[0053]在此使用的术语“分离的”是指基本上没有其它蛋白质、脂类和核酸(例如，与体内产生的肽天然联系在一起的细胞组分)的肽。优选地，该肽的纯度依重量来算至少为70％、80％，或者最优选90％。
[0054]本发明还包括被列举的多肽的类似物(analogs)、衍生物(derivatives)、保守变异体(conservative variations)和阳离子肽变体(cationic peptide variants)，只要这些类似物、衍生物、保守变异体或变体具有可检测到的强化先天免疫或抗炎症的活性。肽的类似物、衍生物、保守变异体或变体的活性不一必与该肽的活性完全相同。
[0055]  阳离子肽“变体”是指具有所参照的阳离子肽的变化形式的肽。例如，术语“变体”包括参照肽的至少一个氨基酸在表达文库中被替换而得到的阳离子肽。术语“参照”肽是指本发明的任何阳离子肽(例如，在上面式子中所定义的)，由它们得到变体、衍生物、类似物或保守变异。术语“衍生物”包括杂合肽，它包括两种阳离子肽中的每一种的至少一部分(例如，两种阳离子肽中的每一种的30-80％)。还包括将一个或多个氨基酸从在此列举的肽的序列中删去所得到的肽，只要该衍生物具有强化先天免疫或抗炎症的活性。由此可以开发得到同样具有效用的更小的活性分子。例如，可以移去那些对于强化先天免疫和肽的抗炎活性并不是必要的氨基端氨基酸或羧基端氨基酸。同样，可以将一个或一些(例如，少于5个)氨基酸添加到阳离子肽上而且不会完全抑制该肽的活性，这样便得到另外的衍生物。此外，C端衍生物，例如C端甲基酯，和N端衍生物可以被获得，而且它们被包括在本发明内。本发明的肽包括本发明所公开的肽的任何类似物、同源物(homolog)、突变体(mutant)、异构体(isomer)或衍生物，只要在此所述的生物活性仍然保留着。还包括前面提出的通式所包含的肽的反向序列。此外，可以用“L”构型的氨基酸替代“D”构型的氨基酸，反之亦然。作为选择，可以通过化学方法或者在其序列中增加两个或多个半胱氨酸残基并氧化形成二硫键，将该肽环化。
[0056]本发明还包括作为在此列举的那些肽的保守变异体的肽。在此使用的术语“保守变异体”是指至少一个氨基酸被别的生物活性类似的残基替换所得到的多肽。保守变异体的例子包括用一个疏水性残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸替代另一个疏水性残基，或者用一个极性残基替代另一个极性残基，例如，精氨酸替代赖氨酸，谷氨酸替代天冬氨酸，谷氨酰胺替代天冬酰胺，等等。可以彼此替换的中性亲水性氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸。“保守变异体”还包括用取代的氨基酸替换未取代的原氨基酸(parent amino acids)所得到的肽。这些取代的氨基酸可以包括甲基化的或酰胺化的氨基酸。其它替代对于本领域技术人员是熟知的。在一个方面，由取代的多肽制出的抗体也能够特异地结合未取代的多肽。
[0057]本发明的肽可以用普遍使用的方法合成，例如，该方法包括α氨基的t-BOC或FMOC保护。两种方法都涉及逐步合成步骤，其中从该肽的C末端开始，每一步增加一个氨基酸(参见，Coligan等，CurrentProtocols in Immunology，Wiley Interscience，1991，第9单元)。本发明的肽也可以用已熟知的固相肽合成方法合成，例如由Merrifield(J.Am.Chem.Soc.，85：2149，1962)以及Stewart和Young(Solid PhasePeptides Synthesis，Freeman，San Francisco，1969，第27-62页)描述的方法，其中使用了苯乙烯-二乙烯基苯共聚聚合物，每克聚合物中有0.1-1.0毫摩尔胺。化学合成完成后，用HF-10％苯甲醚在0℃处理1/4-1小时，将该肽脱保护并从聚合物上切割下来。待试剂蒸发后，用1％乙酸溶液将肽从聚合物中提取出来，然后冻干得到粗产物。使用例如凝胶过滤的技术将该肽纯化，例如在Sephadex G-15上使用5％乙酸作为溶剂。将柱洗脱物的合适级分冻干，便可产生匀质的肽，然后用标准的技术例如氨基酸分析、薄层色谱、高效液相色谱、紫外吸收光谱、摩尔旋光或者溶解性测量对它进行表征。如果需要的话，该肽可以使用固相Edman降解定量。
[0058]本发明也包括编码本发明的肽的被分离的核酸(例如，DNA、cDNA或RNA)。编码在此描述的肽的类似物、突变体、保守变异体和变体的核酸也包括在内。在此使用的术语“分离的”是指基本上除去了与体内产生的核酸天然联系着的蛋白、脂和其它核酸所得到的核酸。优选地，该核酸的纯度在重量上为至少70％、80％或优选90％。可以使用体外合成核酸的传统方法替代体内方法。正如在此使用的，“核酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物，它们可以是一个独立的片断，也可以是一个大的遗传构建物(construct)的一部分(例如，将一个启动子连接到编码本发明的肽的核酸上)。大量的遗传构建物(例如，质粒和其它表达载体)在本领域是已知的，它们可被用于在无细胞系统或原核细胞或真核(例如酵母、昆虫或哺乳动物)细胞中制造本发明的肽。考虑到遗传密码的简并性，本领域普通技术人员能够容易地合成编码本发明的多肽的核酸。可以方便地使用传统的分子生物学方法利用本发明的核酸获得本发明的肽。
[0059]可以将编码本发明的阳离子肽的DNA插入到“表达载体”中。术语“表达载体”是指一种遗传构建物例如质粒、病毒或其他本领域已知的载体，它们可以经过设计而含有编码本发明的多肽的核酸。这些表达载体优选为含有启动子序列的质粒，启动子有助于插入的基因序列在宿主细胞中的转录。表达载体通常含有复制起点、启动子和能实现被转化的细胞的表型选择的多聚核苷酸(例如，抗生素抗性多聚核苷酸)。在本发明中可以使用各种启动子，包括诱导型启动子和组成型启动子。通常，该表达载体含有复制子位点和由与宿主细胞相容的物种所获得的控制序列。
[0060]可以使用本领域技术人员已熟知的传统技术，将本发明的核酸转化或转染到受体(recipient)中。例如，当宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)时，可以使用本领域已知的CaCl₂、MgCl₂或RbCl方法制备能够吸收DNA的感受态细胞。作为选择，可以使用物理方法，例如电穿孔或微注射。电击转化是通过高电压脉冲将核酸转移到细胞中。此外，可以使用本领域已熟知的方法，通过原生质体融合将核酸引入宿主细胞中。用于转化真核细胞的合适方法例如电穿孔和脂转染也是已知的。
[0061]本发明所包含的“宿主细胞”或“受体细胞”是指可以在其中用本发明的核酸来表达本发明的多肽的任何细胞。该术语也包括受体细胞或宿主细胞的任何子代。本发明优选的受体细胞或宿主细胞包括大肠杆菌(E.coli)、金黄葡萄球菌(S.aureus)和绿脓杆菌(P.aeruginosa)，尽管其它的革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌、真菌和哺乳动物细胞和本领域已知的其它生物也可以被利用，只要该表达载体含有复制起点以允许其在该宿主中表达。
[0062]根据本发明的方法所使用的阳离子肽多聚核苷酸序列可以从生物体中分离得到，或者在实验室合成。编码感兴趣的阳离子肽的特定DNA序列可以通过如下方法获得：1)从基因组DNA从分离出双链DNA序列；2)化学合成DNA序列以提供感兴趣的阳离子肽所需的密码子；和3)利用从供体细胞分离出的mRNA的反转录在体外合成双链DNA序列。在后一种情况中，可以得到mRNA的双链DNA互补序列，它通常被称之为cDNA。
[0063]当所需要的肽产物的氨基酸残基的整个序列都是已知时，合成其DNA序列通常是被选择的方法。在本发明中，合成DNA序列具有一个优点，即允许整合进最可能被细菌宿主识别的密码子，由此便没有翻译上的困难，可以获得高水平的表达。此外，事实上任何肽都可以被合成，包括那些编码天然阳离子肽的肽、它们的变体或合成的肽。
[0064]当所需要的肽的整个序列是未知的时候，DNA序列的直接合成便不可能，此时可以选择的方法是获得cDNA序列。分离出感兴趣的cDNA序列的标准程序包括构建含有cDNA文库的质粒或噬菌体，cDNA文库是由存在于供体细胞中具有高水平遗传表达的大量mRNA的反转录获得。当同聚合酶链式反应一起被使用时，即使稀有表达产物也能被克隆。当阳离子肽的氨基酸序列的重要部分是已知时，可以制作标记的单链或双链DNA或RNA探针，其序列被认为是存在于目标cDNA中，于是在已变性成为单链形式的cDNA克隆拷贝上进行DNA/DNA杂交实验时就可以应用这些探针(Jay等，Nuc.Acid.Res.，11：2325，1983)。
[0065]可以通过注射或一段时间内的逐渐输注方式不经肠道地施用本发明的肽。该肽可以静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、腔内或透皮施用。传送该肽的优选方法包括通过微球体或类蛋白形式的胶囊进行口服，以气雾剂形式传送至肺，或者利用离子电渗透或电穿孔经皮传送。其它的施用方法对本领域技术人员是已知的。
[0066]本发明的肽的不经肠道施用形式的制备包括无菌的含水或无水溶液、悬浮液和乳液。无水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油，以及可注射用的有机酯例如油酸乙酯。含水载剂包括水、乙醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和含缓冲介质的不经肠道载体，包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖液、葡萄糖和氯化钠、乙酸钠、柠檬酸钠、乳酸化林格氏溶液或非挥发性油。静脉内施用的载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如它们可基于林格氏葡萄糖液)，等等。也可以含有防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物试剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体和类似物。
[0067]现在通过引用下面的非限制性实施例，更详细地描述本发明。通过引用本发明的一些优选实施方案，本发明被更详细地描述，同时，应该理解，修改和变化亦在被描述和要求保护的内容的精神和范围之内。
                       实施例1
                  抗脓毒症/抗炎症活性
[0068]利用多聚核苷酸阵列来确定阳离子肽对上皮细胞转录应答的影响。将A549人上皮细胞系保持在DMEM(Gibco)中，并补充以10％胎牛血清(FBS，Medicorp)。将A549细胞铺在100mm组织培养皿中，每个培养皿含2.5×10₆个细胞，过夜培养，然后和100ng/ml的E.coliO111：B4 LPS(Sigma)共同温育4小时，其中含有50μg/ml的肽及培养基，或者不含有肽而只有培养基，作为对照。经刺激后，用焦碳酸二乙酯处理的磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤细胞一次，再用细胞刷刮下细胞。用RNAquesous(Ambion，Austin，TX)分离总RNA。用含有Superase-In(RNA酶抑制剂；Ambion)的无RNA酶的水重悬RNA沉淀物。用DNA-free试剂盒(Ambion)除掉DNA污染。通过1％琼脂糖凝胶电泳估计RNA的质量。
[0069]所使用的多聚核苷酸阵列是Human Operon阵列(该基因组的识别号(identification number)是PRHU04-S1)，它由双份的14,000个的人寡聚体点组成。用10μg总RNA制备探针，探针用Cy 3或Cy 5标记的dUTP进行标记。该探针经纯化后杂交到印刷玻璃片上，42℃过夜，然后洗涤。洗涤之后，用Perkin Elmer阵列扫描仪获取图象。用图象处理软件(Imapolynucleotide 5.0，Marina Del Rey，CA)确定点的平均强度，中间强度和背景强度。使用“自制的”程序除去背景。该程序计算将每个子小格(subgrid)的底部强度计为10％，并对每个小格(grid)减去此值。使用Genespring软件(Redwood City，CA)进行分析。从一个玻片内的点数值的集合中，获得中间点强度值，并将该值与此实验中所有玻片的数值比较，从而使每个点的强度标准化。肽处理的细胞和对照细胞之间的相对变化可以在表1和表2中看到。表2只显示了那些在受测的14,000个多聚核苷酸中表达发生明显变化的多聚核苷酸。该数据表明，该肽具有广泛地降低由LPS诱导的多聚核苷酸表达的能力。
[0070]在表1中，多聚核苷酸微阵列的研究表明了SEQ ID NO：27的肽有效地降低了由E.coli O111：B4 LPS增量调节的多种多聚核苷酸的表达。肽(50μg/ml)和LPS(0.1μg/ml)与A549细胞一起温育4小时，或者LPS单独与A549细胞温育4小时，然后分离出RNA。利用5μg总RNA制作出Cy 3/Cy 5标记的cDNA探针，并杂交到HumanOperon阵列(PRHU04)上。表1的第三列显示未受刺激的细胞的强度。“比值：LPS/对照”一列是指用LPS刺激的细胞中的多聚核苷酸表达的强度除以未受刺激的细胞的强度所得到的结果。“比值：LPS+ID27/对照”一列是指用LPS和肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达的强度除以未受刺激的细胞的强度所得到的结果。
                   表1：肽SEQ ID 27降低
由E.coli O111：B4 LPS增量调控的A549人上皮细胞多聚核苷酸表达