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含有生长素释放肽的药物组合物
技术领域
本发明涉及一种含有稳定态的生长素释放肽或生长素释放肽衍生物的药物组合物，生长素释放肽是生长激素促分泌素受体(GHS-R)的内源性生长激素促分泌剂(GHS)，本发明还涉及一种防止生长素释放肽或其衍生物的修饰性疏水基团在溶解有生长素释放肽或其衍生物的水溶液中发生降解的方法。
背景技术
生长素释放肽(生长素)是一种孤独受体——生长激素促分泌素受体(GHS-R)的内源性生长激素促分泌剂(GHS)，它是最早于1999年由大鼠分离和纯化得到的一种生理活性肽(Kojima等，Nature，402：656-660，1999)。此后，由大鼠以外的其它脊椎动物例如人类、大鼠、猪、鸡、鳗鱼、牛、马、绵羊、蛙、鲑鱼以及狗也分离得到多种具有与大鼠生长素释放肽相同化学结构的生长素释放肽。这些生长素释放肽的化学结构列于下表1中。
表1

  人类  小鼠  大鼠  猪  牛  绵羊  狗  鳗鱼  鲑鱼  鸡  牛蛙  罗非鱼  鲶鱼  马 GSS(正辛酰基)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR GSS(正辛酰基)FLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPR GSS(正辛酰基)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR GSS(正辛酰基)FLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPR GSS(正辛酰基)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR GSS(正辛酰基)FLSPEHQKVQQRKESKKPAAKLKPR GSS(正辛酰基)FLSPEHQKLQRKEAKKPSGRLKPR GSS(正辛酰基)FLSPEHQKLQRKEPKKPSGRLKPR GSS(正辛酰基)FLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPR GSS(正辛酰基)FLSPSQRPQGKDKKPPRV-NH₂ GSS(正辛酰基)FLSPSQKPQVRQGKGKPPRV-NH₂ GSS(正辛酰基)FLSPSQKPQGKGKPPRV-NH₂ GSS(正辛酰基)FLSPTYKNIQQQKGTRKPTAR GSS(正辛酰基)FLSPTYKNIQQQKDTRKPTAR GSS(正辛酰基)FLSPTYKNIQQQKDTRKPTARLH GLT(正辛酰基)FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNM GLT(正辛酰基)FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNM GLT(正辛酰基)FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNMN GSS(正辛酰基)FLSPSQKPQNKVKSSRI-NH₂ GSS(正辛酰基)FLSPTQKPQNRGDRKPPRV-NH₂ GSS(正辛酰基)FLSPTQKPQNRGDRKPPRVG GSS(正辛酰基)FLSPEHHKVQHRKESKKPPAKLKPR
(其中，氨基酸残基是按照IUPAC和IUC所定义的单字母符号书写的)
这些肽的特征在于由于其丝氨酸基团(S)或者苏氨酸基团(T)侧链上的羟基被脂肪酸例如辛酸或癸酸酰化而产生的特定结构，尚未分离出例如生长素释放肽的这种具有修饰性疏水基团的生理活性肽。这些新肽具有有效的促生长激素分泌的效果，已经清楚认识到这些肽可以调节生长激素的分泌。因此，很多研究人员对于生长素释放肽的生理活性形式以及如何将这些多肽开发成为药物相当感兴趣(例如世界专利公开WO 01/07475)。
已知生长素释放肽分子中的修饰性疏水基团对于其具有生理活性是相当重要的(Kojima等，Nature，402：656-660，1999)。然而，由于不存在象生长素释放肽这种在分子中在特殊氨基酸残基侧链上的羟基处具有修饰性疏水基团的肽，因此还从来没有对这些肽的稳定性进行过研究以将其开发成药物。
顺便提及的是，可开发成为药物的化合物具有各种类型的化学结构，并且正是由于这些化学结构使得这类化合物可能在之后的制剂过程中或者在储存过程中很容易发生降解。这类降解反应有化合物的水解裂解、脱水、异构化、消去、氧化、还原或者光降解，以及这些化合物和与其配伍的添加剂发生化学反应。因此，为了将这些化合物开发成药物并随后对其进行质量控制，对由这些化合物的化学结构而引起的降解反应类型以及降解程度进行研究和认识显得非常重要。
众所周知，药物的稳定性在很大程度上受周围环境的影响，例如环境的pH水平。已经研究过溶液pH对于水溶液态药物的降解速度的影响，并且也报道过很多药物的降解速度的pH曲线(例如SumieYoshioka，″Stability of Medicines″，由Nankohdo出版，1995)。
生理活性肽或生理活性蛋白质可被存在于消化器官中的蛋白酶灭活并发生降解，因此很难开发出含有这些肽或蛋白质的口服给药组合物。所以为了临床给药，这些肽或蛋白质被制成注射组合物的形式，然而为了达到该目的，这类物质在水溶液中的稳定性对于将其制成液体药物制剂(不论是何种剂型例如溶液形式或者可在位点处溶解的溶液形式)而言都显得非常重要。
目前，含有各种类型的多肽或蛋白质例如胰岛素、生长激素、降钙素、心房促尿钠排泄肽、LH-RH(促黄体激素-释放激素)衍生物或促肾上腺皮质激素衍生物的药物组合物已经作为药品上市，据报道这些肽类或蛋白质的化学变化有脱酰胺化，异天冬氨酸的形成，水解裂解例如碎裂、外消旋化、形成二硫价键或交换反应，β-消除或者氧化反应。
这些化学变化会影响这类含肽或蛋白质组合物的稳定性，肽类或蛋白质发生降解的程度取决于溶液的pH值。例如，据报道降解产物的化学结构以及降解产物产生的量随含有这些肽类或蛋白质，例如LH-RH衍生物(Strickley等，Pharm.Res.，7，530-536，1990)、人类副甲状腺激素(Nobuchi等，Pharm.Res.，14，1685-1690，1997)、水蛭素(抗血栓形成物质：Gietz等，Pharm.Res.，15，1456-1462，1998)以及人类胰岛淀粉样多肽衍生物(Hekmann等，Pharm.Res.，15，650-659，1998)的溶液的pH值改变而改变。
本发明的生长素释放肽或其衍生物是一种生理活性肽，通常是将含生长素释放肽的水溶液制成用于药品的药物组合物。尽管生长素释放肽在水溶液中的稳定性对于药物组合物的制备非常重要，但是至今尚未对生长素释放肽在水溶液中的稳定性进行过任何研究。在生长素释放肽或其衍生物的分子中具有特殊的修饰性疏水基团，那就是生长素释放肽或其衍生物的某些氨基酸残基地侧链上的羟基被脂肪酸酰化。还从未发现象生长素释放肽这种在分子中具有特殊的修饰性疏水基团的肽，因此也从未报道过有关生长素释放肽稳定性的一般知识。也就是说，目前对于生长素释放肽降解产物的稳定性、降解产物的化学结构以及降解产物降解的机理仍然还不清楚。另外，对于生长素释放肽修饰性疏水基团的降解机理以及生长素释放肽降解产物的二次降解也不清楚。
在这样的背景下，本发明的目的在于提供一种可以稳定地含有生长素释放肽或其衍生物的药物组合物，以及本发明的目的还在于提供一种防止生长素释放肽或其衍生物的修饰性疏水基团在溶解有生长素释放肽或其衍生物的水溶液中发生降解的方法，该方法基于对分子中具有特殊的修饰性疏水基团的生长素释放肽或其衍生物的化学稳定性进行研究所获得的知识。
通过对含生长素释放肽水溶液的pH与生长素释放肽降解产物的化学结构之间的影响关系进行深入研究，本发明者发现，在水溶液中生长素释放肽由于其特殊的修饰性疏水基团发生水解裂解而降解产生脱酰基的化合物，同时它还由于其修饰性疏水基团发生β-消去反应而降解产生脱氢丙氨酸化合物，然后由于脱氢丙氨酸化合物具有挥发性就会产生二级降解产物，所有这些降解反应都受水溶液的pH值的影响。
在上述生长素释放肽降解机理的研究结果基础之上，本发明者进一步发现通过使用pH调节剂或缓冲剂调节溶液的pH可以得到稳定地含有生长素释放肽的药物组合物，并且通过使用不同种类的缓冲剂而不论其浓度或grhelin浓度如何都可以达到这种稳定效果，从而完成了本发明。
发明公开
因此，本发明的一方面在于提供一种含有生长素释放肽或其衍生物(后文以及权利要求书中称作″生长素释放肽″)的药物组合物，其中溶解有该生长素释放肽的水溶液的pH为2-7。
更具体地说，本发明提供了下述方面：
(1)含有生长素释放肽的药物组合物，其中溶解有该生长素释放肽的水溶液的pH为2-7。
(2)根据(1)的药物组合物，其中所述pH为3-6。
(3)根据(1)或(2)的药物组合物，其中还含有pH调节剂或缓冲剂。
(4)根据(3)的药物组合物，其中pH调节剂选自下述的一种或多种：盐酸、硫酸、硝酸、硼酸、碳酸、重碳酸、葡萄糖酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、柠檬酸、单乙醇胺、乳酸、乙酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、磷酸、甲基磺酸、苹果酸、丙酸、三氟乙酸以及它们的盐。(5)根据(3)的药物组合物，其中缓冲剂选自下述的一种或多种：甘氨酸、乙酸、柠檬酸、硼酸、邻苯二甲酸、磷酸、琥珀酸、乳酸、酒石酸、碳酸、盐酸、氢氧化钠以及它们的盐。
(6)根据(3)-(5)之一的一种药物组合物，其中pH调节剂或缓冲剂在溶液中的浓度为0.01mM-1000mM。
(7)根据(1)-(6)之一的一种药物组合物，其中溶液是缓冲溶液。
(8)根据(7)的药物组合物，其中缓冲溶液是甘氨酸盐酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、磷酸盐-醋酸盐-硼酸盐缓冲液或邻苯二甲酸盐缓冲液。
(9)根据(1)-(8)之一的一种药物组合物，其中生长素释放肽在溶液中的浓度是0.03nmol/mL-6μmol/mL。
(10)根据(1)-(9)之一的一种药物组合物，其中生长素释放肽是醋酸盐。
(11)根据(1)-(10)之一的一种药物组合物，其中生长素释放肽是人类生长素释放肽。
(12)根据(1)-(11)之一的一种药物组合物，其中还含有抗吸附剂。
(13)根据(12)的药物组合物，其中抗吸附剂的浓度为0.001％-5％。
(14)根据(12)或(13)的药物组合物，其中抗吸附剂是表面活性剂。
(15)含有生长素释放肽的药物组合物，其中含有由(1)-(14)之一的一种溶液干燥得到的粉末。
(16)根据(15)的药物组合物，其中粉末是冻干粉末。
(17)防止生长素释放肽的疏水基团在含有生长素释放肽的溶液中发生降解的方法，它包括调节溶液的pH为2-7。
(18)根据(17)的方法，其中调节溶液的所述pH为3-6。
(19)根据(17)或(18)的方法，其中包括pH调节剂或缓冲剂。
(20)根据(19)的方法，其中包括选自下述的一种或多种pH调节剂：盐酸、硫酸、硝酸、硼酸、碳酸、重碳酸、葡萄糖酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、柠檬酸、单乙醇胺、乳酸、乙酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、磷酸、甲基磺酸、苹果酸、丙酸、三氟乙酸以及它们的盐。
(21)根据(19)的方法，其中包括选自下述的一种或多种缓冲剂：甘氨酸、乙酸、柠檬酸、硼酸、邻苯二甲酸、磷酸、琥珀酸、乳酸、酒石酸、碳酸、盐酸、氢氧化钠以及它们的盐。
(22)根据(19)-(21)之一的一种方法，pH调节剂或缓冲剂在溶液中的浓度为0.01mM-1000mM。
(23)根据(17)-(22)之一的一种方法，其中溶液是缓冲溶液。
(24)根据(23)的方法，其中缓冲溶液是甘氨酸盐酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、磷酸盐-醋酸盐-硼酸盐缓冲液或邻苯二甲酸盐缓冲液。
(25)根据(17)-(24)之一的一种方法，其中生长素释放肽在溶液中的浓度是0.03nmol/mL-6μmol/mL。
(26)根据(17)-(25)之一的一种方法，其中生长素释放肽是醋酸盐。
(27)根据(17)-(26)的任意一种方法，其中生长素释放肽是人类生长素释放肽。

附图简述
图1显示了有关在实施例1的生长素释放肽水溶液中的脱酰基化合物和Dha化合物的降解方式的HPLC图。
图2是显示生长素释放肽的pH-降解动力学常数曲线的图解图表。
图3是显示在具有不同类型pH的水溶液中的生长素释放肽的降解产物生成量的图解图表。
图4是显示在不同类型的缓冲溶液中的生长素释放肽的pH稳定性的图解图表。
完成本发明的最佳实施方案
下面将更具体地解释本发明的药物组合物。
本发明所使用的生长素释放肽是内源性促生长激素分泌剂，这种肽具有提高细胞内钙离子浓度并诱导生长激素分泌的作用。适宜的生长素释放肽是那些由人类、大鼠、猪、鸡、鳗鱼、牛、马、绵羊、蛙、鲑鱼或者狗获得的。在本发明中，优选使用由人类获得的生长素释放肽，更优选使用由人类获得的并且具有28个氨基酸残基的人类生长素释放肽。
作为生长素释放肽特征之一的修饰性疏水基团并不仅限于辛酰基(C₈)，它可以为具有2-20个，优选4-12个碳原子的脂肪酸残基，例如己酰基(C₆)、癸酰基(C₁₀)或十二烷酰基(C₁₂)。另外，疏水基团可以为饱和或不饱和脂肪酸的支链残基、具有芳基例如苯丙酰基以及金刚烷骨架的脂肪酸残基。
因此，本发明的生长素释放肽衍生物包括列举在上述表1中的多肽，通过插入、增加和删除一种或多种氨基酸和/或通过用其它氨基酸取代所述氨基酸序列可以对其中的氨基酸序列进行修饰，如果需要的话还可以用化学方法修饰。另外，本发明的生长素释放肽衍生物还包括这样的肽类，其中修饰性疏水基团通过酯键与氨基酸链连接并且它也具有与生长素释放肽相同的生理活性。
用于本发明药物组合物中的生长素释放肽包括游离形式的肽类及其盐。游离形式的肽与它的盐之间可以相互转化。游离形式的肽通过与无机或有机酸反应可以转化为药学上可接受盐。这种盐的实例包括无机酸盐例如碳酸盐、重碳酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐或硼酸盐，以及有机酸盐例如琥珀酸盐、醋酸盐、丙酸盐或三氟乙酸盐。另外还包括碱金属盐例如钠盐或钾盐，碱土金属盐例如钙盐或镁盐，有机胺的盐例如三乙胺盐，以及碱性氨基酸的盐例如藻酸盐。本发明的肽类可以以金属配合物例如铜配合物或锌配合物的形式存在。
上述盐的形式对于生长素释放肽的稳定性具有重要作用。也就是说，由于上述盐的水溶液pH值各不相同，因此这些盐对于生长素释放肽的水溶波起着pH调节剂的作用。
生长素释放肽的来源和制备方法不受本发明限制。在本发明中可以使用通过化学方法、半化学方法、遗传方法或这些方法的组合以及由生物体提取得到的生长素释放肽。
用作药品原料的生长素释放肽通常是在经反相液相色谱等纯化之后以冻干粉末的形式提供。
本发明的水溶液或溶液是以水作为溶剂得到的溶液，然而在药学上可接受范围之内也可以使用其它的溶剂例如乙醇、2-丙醇等。
生长素释放肽在本发明药物组合物中的浓度并不受限制，优选在药学上可接受的范围之内。浓度下限为生长素释放肽在该浓度下具有生理活性的浓度，浓度上限为生长素释放肽在该浓度下可以溶解于水溶液中的浓度。用作药品的浓度通常例如优选0.03nmol/mL-6μmol/mL，更优选使用0.03nmol/mL-3μmol/mL的浓度。
在本发明的可以稳定地含有生长素释放肽的生理学上可接受的组合物中，溶液的pH值为2-7，更优选3-6。发现含生长素释放肽的溶液的稳定pH值为2-7。使用pH调节剂或缓冲剂来调节该含生长素释放肽的溶液pH。
pH调节剂的实例包括盐酸、硫酸、硝酸、硼酸、碳酸、重碳酸、葡萄糖酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、柠檬酸、单乙醇胺、乳酸、乙酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、磷酸、甲基磺酸、苹果酸、丙酸、三氟乙酸以及它们的盐。
缓冲剂的实例包括甘氨酸、乙酸、柠檬酸、硼酸、邻苯二甲酸、磷酸、琥珀酸、乳酸、酒石酸、碳酸、盐酸、氢氧化钠以及它们的盐。其中，优选甘氨酸、乙酸或者琥珀酸用作缓冲剂。
考虑到生长素释放肽在水溶液中的稳定性，比较理想的情况是必须减少溶液pH值的波动。因此，本发明的药物组合物是具有缓冲能力的溶液，也就是缓冲溶液。
使用具有在其pH范围下可以抑制生长素释放肽降解的缓冲溶液，因而使用pH为2-7，更优选为3-6的溶液。适宜的缓冲溶液是甘氨酸盐酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液(包括Mcllvaine缓冲液)、磷酸盐-醋酸盐-硼酸盐缓冲液(包括Britton-Robinson缓冲液)以及邻苯二甲酸盐缓冲液。各缓冲液中成分的实例包括上述的缓冲剂。
pH调节剂的浓度不受限制，它可以为通常用于调节溶液得到所需pH范围的浓度，通常使用0.01-100mM的浓度。
另外，缓冲剂的浓度也不受限制，它可以为保持缓冲能力的浓度。一般而言，通常使用0.01-100mM，优选0.1-100mM，更优选1-100mM的浓度。
根据本发明，提供了可以稳定地含有生长素释放肽的水溶液形式的药物组合物。考虑到摩尔渗透压浓度、溶解度、溶液的低刺激性和防腐效果以及防止溶液成分被吸收，该药物组合物还可以含有其它的添加剂。
通常会担心肽类或蛋白质在含有它们的可药用水溶液的制备过程和给药过程中会被吸附在所用容器上从而降低肽类或蛋白质的浓度。在本发明药物组合物的情况中，已经证实生长素释放肽吸附在玻璃容器或聚丙烯容器上的量落入其供药用的浓度范围内。因此，优选加入抗吸附剂以防止生长素释放肽被容器吸附。抗吸附剂的实例包括表面活性剂、糖类、氨基酸以及蛋白质。
本发明的表面活性剂包括在″药物赋形剂手册″中所列举的表面活性剂以及具有表面活性效应的化合物，适宜的表面活性剂选自这些表面活性剂实例，包括季铵盐、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、山梨糖醇脂肪酸酯、对羟基苯甲酸酯、聚乙二醇、磷脂、胆汁酸、聚氧乙烯蓖麻油类、聚氧乙烯、聚氧乙烯聚氧丙烯、多元醇、阴离子表面活性剂、合成或半合成聚合物。其中，优选使用聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯和山梨糖醇脂肪酸酯。
适宜的季铵盐包括苯扎氯铵、氯化苄乙铵和十六碳烷基氯化吡啶鎓。
适宜的聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯包括聚氧乙烯山梨糖醇单月桂酸酯(聚山梨醇酯^20或吐温^20)、聚氧乙烯山梨糖醇单棕榈酸酯(聚山梨醇酯^40或吐温^40)、聚氧乙烯山梨糖醇单硬脂酸酯(聚山梨醇酯^60或吐温^60)、聚氧乙烯山梨糖醇三硬脂酸酯(聚山梨醇酯^65或吐温^65)、聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯(聚山梨醇酯^80或吐温^80)以及聚氧乙烯山梨糖醇三油酸酯(聚山梨醇酯^85或吐温^85)。
适宜的山梨糖醇脂肪酸酯包括山梨糖醇单月桂酸酯(司班^20)、山梨糖醇单棕榈酸酯(司盘^40)、山梨糖醇单硬脂酸酯(司班^60)、山梨糖醇单油酸酯(司班^80)、山梨糖醇三油酸酯(司班^85)以及山梨糖醇倍半油酸酯。
适宜的对羟基苯甲酸酯包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯以及对羟基苯甲酸异丁酯。
适宜的聚乙二醇包括乙二醇糠醛(乙二醇糠醛75)、Mcrogol^400(聚乙二醇400)、Mcrogol^600(聚乙二醇600)以及Mcrogol^4000(聚乙烯乙二醇4000)；适宜的磷脂包括精制的大豆卵磷脂和精制的卵黄卵磷脂；适宜的胆汁酸包括脱氧胆汁酸钠。
适宜的聚氧乙烯蓖麻油类包括聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油50以及聚氧乙烯氢化蓖麻油60。其它的聚氧乙烯实例包括聚氧乙烯油醚、聚氧乙烯十八碳烷基醚、聚氧乙烯十六碳烷基醚以及聚氧乙烯月桂基硫酸盐。
适宜的聚氧乙烯聚氧丙烯包括聚氧乙烯聚氧丙烯乙二醇(pluronic^)和聚氧乙烯聚氧丙烯十六碳烷基醚。
适宜的多元醇包括丙三醇(甘油)、丙二醇、和单甘油基硬脂酸酯；适宜的阴离子表面活性剂包括烷基醚硫酸盐例如十六碳烷基硫酸钠、十二碳烷基硫酸钠和油基硫酸钠；硫代琥珀酸烷基酯盐例如硫代琥珀酸十二烷基酯钠。适宜的合成或半合成聚合物包括聚乙烯醇、羧基乙烯基聚合物、聚乙烯吡咯烷酮和聚丙烯酸钠。
糖类的实例包括单糖例如甘露糖醇、葡萄糖、果糖、肌醇、山梨糖醇以及木糖醇；二糖例如乳糖、蔗糖、麦芽糖以及海藻糖；多糖例如淀粉、葡聚糖、支链淀粉、褐藻酸、透明质酸、果胶酸、肌醇六磷酸、肌醇六磷酸钙镁、壳多糖以及脱乙酰壳多糖。糊精的实例包括α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、糊精、羟丙基淀粉以及羟基淀粉。纤维素的实例包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素以及羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠。
适宜的氨基酸包括甘氨酸和氨基乙磺酸；以及聚氨基酸例如聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚甘氨酸和聚亮氨酸。蛋白质的实例包括白蛋白和明胶。
当本发明的药物组合物被用作检测试剂或兽药时，可以使用非人血清白蛋白作为该组合物的抗吸附剂；然而，当该组合物被用作治疗人类疾病的药品时，优选使用人血清白蛋白。
这些抗吸附剂可以联合使用。抗吸附剂的浓度为这样的范围，其中该抗吸附剂的用量为药学上可接受的用量同时还可以抑制生长素释放肽被容器吸附，并且各种成分在制备过程或长期储存过程中不会发生聚集。例如，抗吸附剂的浓度为0.001-5％，优选为0.01-1％。
本发明的药物组合物还可以含有用于任意目的的添加剂，添加剂的实例选自″药物赋形剂手册2000″(日本药物赋形剂委员会：YakujiNippoh Sha)。这些添加剂包括等渗剂例如氯化钠和甘露糖醇；防腐剂例如苯甲酸钠；抗氧化剂例如亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠和抗坏血酸；安慰剂例如盐酸利多卡因和盐酸甲哌卡因。
本发明的药物组合物可以按照药学领域所用的常规方法进行制备。例如，首先将冻干的生长素释放肽溶解于净化水中，同时也将缓冲剂、抗吸附剂和其它的添加剂溶解于另一份净化水中。然后合并所得到的这些水溶液，如果需要的话可以过滤灭菌，将得到的溶液装于安瓿或小瓶中就得到了含有本发明生长素释放肽的药物组合物。
至于注射制剂的剂型，可以选择该药物组合物的现场制剂。该剂型适合于在长期储存的溶液中不稳定的化合物。因此，用于现场配制这种含有生长素释放肽的溶液的组合物是本发明的注射制剂之一。用于现场配制这种含有生长素释放肽的溶液的组合物可以含有药用生长素释放肽原料以及其它必需量的固体添加剂。另外，该组合物是通过将这种含有生长素释放肽以及其它必需量的添加剂的溶液进行干燥而得到的。溶液的干燥技术可以是冷冻干燥方法或喷雾干燥方法，优选冷冻干燥方法。这样的固体组合物可以现场溶解于水中作为溶液使用。
本发明的药物组合物可以作为药品向哺乳动物(人、猴、狗、大鼠等)给药。该组合物适用的疾病或者可达到的效果包括那些与生长激素(GH)缺乏或降低有关的疾病，例如矮小症、活化正常成人的造骨细胞或骨再生、提高肌肉数量和肌肉力量、改善缺乏GH的成人体能、治疗孩童时期严重的精神分裂症、与促性腺激素联合使用以诱导产卵、预防服用强的松引起的蛋白质代谢失常、加快严重免疫缺陷疾病、高龄失重中的T细胞培养以及预防脂肪过剩和皮肤萎缩。
另外，基于本发明的药物组合物具有提高心率的效果，那些直接与生长激素(GH)缺乏或降低有关的适用症或可预期达到的效果的实例还包括心血管疾病例如心力衰竭。本发明的药物组合物的效果并不限于人，也可以用于促进动物的生长、降低脂肪等，并且这些效果比服用GH获得的效果更明显。由于本发明的药物组合物可以改善食欲，因此通过静脉内或脑心室内给药它可用作治疗厌食或神经性厌食的食欲改善剂。另外，本发明的药物组合物还可以用于治疗胃动力失常例如非溃疡性消化不良、自发性中度胃张力缺乏、动力性消化不良以及逆流性食道炎。
此外，本发明的药物组合物可以加快骨髓、十二指肠内以及空肠内的细胞生长，因此它可用作肠粘膜的保护剂、预防经静脉内供给营养的过程中引起小肠粘膜损伤的药剂以及用于预防骨质疏松症。
另外，本发明的药物组合物可用于治疗下述疾病或者改善下述的身体功能。这些疾病的实例包括刺激老年人生长激素的释放、预防糖皮质激素代谢的副作用、治疗和预防骨质疏松症、刺激免疫系统、促进损伤的治疗、促进骨折的修复、治疗生长迟缓、治疗由生长迟缓引起的肾衰竭或功能不全、治疗生理机能缺失症状包括儿童生长激素不足以及与慢性疾病相关的症状、治疗伴有治疗肥胖症的生长迟缓或与肥胖症有关的生长迟缓、治疗与Prader-Willi综合症和特纳氏综合症相关的生长迟缓、促进烧伤的恢复和减少住院、子宫发育迟缓、骨骼发育异常、治疗肾上腺皮质激素过多症和库欣综合症、诱导心脏收缩性生长激素的释放、紧张患者的生长激素代用品、软骨发育异常、Noonan′s综合症、精神分裂症、抑郁症、早老性痴呆症、治疗延迟损伤和治疗社会心理缺失、治疗肺功能不全和呼吸依赖症、延迟大手术后蛋白质代谢反应衰败、减少由例如癌症或AIDS等慢性疾病引起的蛋白质损失和恶病质、治疗高胰岛血症包括胰岛细胞症、辅助治疗诱发排卵、刺激胸腺发育、预防与年龄相关的胸腺功能衰退、治疗免疫系统受损的患者、提高肌肉强度、改善运动性、使老年人皮肤厚度增大、代谢平衡、维持肾脏平衡、刺激造骨细胞、骨再生以及软骨再生。
另外，本发明的药物组合物在动物中可有效用于促进动物生长、增加动物产奶和产毛、活化宠物动物的免疫系统、治疗宠物动物的与年龄相关的疾病、促进家畜动物的生长以及促进绵羊产毛。
本发明的药物组合物可以以水溶液的形式按照各种类型的给药方式给药。例如，本发明的药物组合物以注射溶液的形式给药例如静脉内注射、皮下注射、肌内注射或静脉内滴注。另外，本发明的药物组合物可以以非肠道方式给药例如经鼻给药、经肺给药、经皮给药或者经粘膜给药。此外，本发明的药物组合物可以以眼药水或装满溶液的胶囊的形式进行肠外给药。
实施例：
通过下面的试验和实施例更详细地描述本发明生长素释放肽的稳定性，但是应该注意本发明并不以任何方式受这些试验和实施例的限制。
除非另外注明，在下面的描述中使用下述具有特定含义的符号以及试验方法和仪器。
[符号]
Dha：     脱氢丙氨酸
TFA：     三氟乙酸
HBTU：    2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓-六氟磷酸盐
HOBt：    1-羟基苯并三唑
TIPS：    三-异丙基硅烷
DIPEA：   二异丙基乙胺
Fmoc：    芴基甲氧羰基
Boc：     叔丁氧羰基
tBu：     叔丁基
Trt：     三苯甲基
DMAP：    4-二甲基氨基吡啶
EDC：     1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺
Pmc：     2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基
[装置]
(A)自动肽合成器
所用的生物系统：自动433A肽合成器
(B)分析用HPLC系统
仪器：岛津LC-10A系统
柱：  YMC-Pack PROTEIN-RP(4.6mmΦ×150mm)或
      YMC-Pack ODS-AM(4.6mmΦ×250mm)
柱温度：40℃
洗脱液：在乙腈0.1％TFA中，最高50％浓度的线性梯度
流速：1mL/min
检测器：UV(210nm)
装填体积：10-500μL
(C)等分HPLC系统
仪器：Waters 600 Multisolvent Delivery System
柱：YMC-Pack ODS-A(20mmΦ×250mm)或
    YMC-Pack PROTEIN-RP(20mmΦ×250mm)
洗脱液：在0.1％TFA或5％乙酸中的乙腈，线性梯度
流速：10mL/min
检测器：UV(210和260nm)
装填体积：1-2mL(大于2mL，用泵装填)
(D)储藏室
恒温恒湿室LH-30
(Nagano Kagaku)5℃/40℃
预制型恒温恒湿室LH-20
(Nagano Kagaku)25℃
(E)质谱
仪器：Finnigan MAT TSQ700
粒子源：ESI
检测粒子方式：正的
喷雾电压：4.5kV
毛细管温度：250℃
流动相：0.2％乙酸的水/甲醇(1/1)溶液
流速：0.2mL/min
扫描区域：m/z 300-1500
(F)氨基酸序列的分析
仪器：Applied Biosystem 477A Sequencer(Perkin-Elmyer)
(G)氨基酸组成的分析
仪器：氨基酸分析仪L-8500(Hitachi)
试样：用含0.1％苯酚的6M-HCl在110℃的密闭试管中水解24小时。
参考实施例：人类生长素释放肽的合成
使用自动肽合成器，由Fmoc-Arg(Pmc)-HMP-树脂(AppliedBiosystems Japan；472mg、0.25mmol)通过HBTU/HOBt反复除去Fmoc和插入Fmoc-氨基酸(条件是，氨基乙酸的N末端使用Boc-氨基乙酸)合成得到Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser(Trt)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OtBu)-His(Boc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Val-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Pro-Pro-Ala-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Pro-Arg(Pmc)-HMP树脂。将所得到的被保护的肽-树脂(1.7g)用1％TFA/5％TIPS/二氯甲烷溶液(15mL)处理30分钟。收集肽树脂用二氯甲烷(30mL)洗涤数次，再依次用1％DIPEA(30mL)和二氯甲烷(30mL)洗涤。将所得到的除去Trt的肽-树脂在N-甲基吡咯烷酮(10mL)中膨胀，将混合物与辛酸(144.2mg，1.0mmol)和EDC-HCl(192mg，1.0mmol)在DNAP(31mg，0.25mmol)存在下反应16小时。过滤收集所得到的树脂，分别用N-甲基吡咯烷酮和二氯甲烷洗涤，真空干燥得到被保护的肽树脂，其丝氨酸侧链的3-位上被辛酰基取代。然后向该树脂中加入由88％TFA/5％苯酚/2％TIPS/5％H₂O(15mL)组成的脱保护试剂，在室温下搅拌混合物2小时。过滤除去树脂，浓缩滤液。将所得到的残余物用乙醚处理得到沉淀，过滤收集沉淀。将沉淀干燥得到900mg粗多肽。将200mg所得到的粗多肽溶解于10mL水中，将溶液加入至YMC-Pack ODS-A柱(20mmΦ×250mm)中用5％TFA和线性梯度为0-60％的乙腈洗脱60分钟(流速：10mL/min)。收集目标洗脱部分并冻干得到60mg目标肽(人类生长素释放肽醋酸盐：乙酸含量：10.9％)。
ESI-MS：3371(计算值：3370.9)
Leu标准氨基酸组成：Ser；3.43(4)，Glx；5.93(6)，Gly；1.01(1)，Ala；1.00(1)，Val；0.98(1)，Leu；2(2)，Phe；1.00(1)，Lys；4.02(4)，His；1.00(1)，Arg；2.98(3)，Pro；3.93(4)(括号内为理论体积)。
氨基酸序列分析：用人类生长素释放肽(3位上的辛酰基-Ser未被保护)鉴定所得到的多肽。
使用与上述相同的步骤得到大鼠或其它的生长素释放肽。
在下面的实施例中，使用参考实施例制备的生长素释放肽。
实施例1：生长素释放肽的降解产物的结构分析
为了保证生长素释放肽在水溶液中的安全性，有必要了解生长素释放肽在水溶液中的降解反应。因此，通过利用一种生长素释放肽一一人类生长素释放肽对生长素释放肽的降解产物进行结构分析从而评估生长素释放肽的降解过程。
通过将大约5.0μmol(17mg)人类生长素释放肽溶解于Britton-Robinson缓冲溶液(pH 7.0：用0.04M磷酸盐/乙酸/硼酸溶液调节)和0.2M氢氧化钠水溶液中，得到含有大约0.15μmol/mL(0.5mg/mL)的人类生长素释放肽水溶液。将所得到的溶液装于褐色玻璃安瓿中，用火密封安瓿。在40±1℃下储存各安瓿4天和14天。储存后通过HPLC方法检测水溶液中的降解产物，其结果如图1(a)和(b)中所示。如图1(a)所示，在于40℃下储存4天后得到的溶液中观察到2个位于24-28分钟的主峰(降解产物B和降解产物C)。收集这两种降解产物B和C，按照下面的方法对这些人类生长素释放肽的降解产物进行结构分析。
降解产物B：
ESI-MS分析仪显示该产物质量为3245，这与由水解裂解人类生长素释放肽的辛酰基得到的脱酰化的人类生长素释放肽(后文称作″脱酰基化合物″)的质量相同。另外，根据对降解产物B的氨基酸序列和氨基酸组成的分析结果，该氨基酸组成和氨基酸序列与脱酰基化合物的理论体积完全相同。因此，这证明该降解产物B就是脱酰基化合物。
降解产物C：
ESI-MS分析仪显示该产物质量为3227，这与由β-消除人类生长素释放肽的辛酰基得到的[3-脱氢丙氨酸]人类生长素释放肽(后文称作″Dha化合物″)的质量相同。另外，通过将降解产物C与过量的经0.05M氢氧化钠水溶液中和的乙硫醇水溶液发生反应，根据对该产物的ESI-MS、氨基酸序列以及氨基酸组成进行分析，确认该产物与[3-乙基半胱氨酸]人类生长素释放肽相同。也就是说，该由ESI-MS测得的质量数3289与将Dha化合物(3227)和乙硫醇(62)进行相加而得到的计算值相同，并且由氨基酸序列和氨基酸组成分析也检测出了乙基半胱氨酸。该产物[3-乙基半胱氨酸]人类生长素释放肽是由Dha化合物与乙硫醇发生亲核反应得到的。因此，这证明该降解产物C就是Dha化合物。
根据上述结果，证明作为生长素释放肽之一的人类生长素释放肽的中性水溶液中的降解产物是由水解分裂人类生长素释放肽的辛酰基得到的脱酰基化合物以及由β-消除人类生长素释放肽的辛酰基得到的Dha化合物。
如图1(b)所示的储存14天后的溶液的HPLC结果，除了降解产物B和C的峰外，还观察到其它几个峰(降解产物D、E等)。因此将脱酰基化合物(降解产物B)和Dha化合物(降解产物C)储存于水溶液中以考察这些降解产物的降解机理。
按照与上述相同的方法，将脱酰基化合物或Dha化合物溶解于Britton-Robinson缓冲溶液(pH 7.0)中得到含有大约0.15μmol/mL(0.5mg/mL)的脱酰基化合物或Dha化合物的水溶液。将所得到的溶液装于褐色玻璃安瓿中，安瓿用火密封。装有脱酰基化合物的安瓿在40±1℃下储存14天，装有Dha化合物的安瓿在40±1℃下储存3天。储存之后通过HPLC方法检测水溶液中的降解产物，其结果如图1(c)和(d)所示。
如图1(c)所示，在含有脱酰基化合物并且于40℃下储存14天之后的溶液中观察到一个与图1(b)中降解产物D的保留时间(26分钟)相同的主峰。收集该峰位置的降解产物并进行ESI-MS、氨基酸序列和氨基酸组成成分分析。根据这些分析结果，该产物被确认为脱酰基人类生长素释放肽(3-28)。
ESI-MS：3101(计算值：3100.5)。
另外，如图1(d)所示，在于40℃下储存3天之后的含有Dha化合物的溶液中观察到一个在与图1(b)中降解产物E的保留时间(36分钟)相同的大峰。收集该峰位置的降解产物并进行ESI-MS、氨基酸序列和氨基酸组成分析。根据这些分析结果，该产物被推断为[N^a-CO-C(＝CH₂)-OH]人类生长素释放肽(4-28)(后文称作″Dha化合物的二次降解产物″)。
ESI-MS：3083(计算值：3083.5)，
氨基酸组成：与所推断的氨基酸组成一致。
氨基酸序列：对第一氨基酸残基无反应。
此外，在图1(d)中还观察到几个位于30-35分钟左右的小峰。在图1(b)中也观察到这些峰，推断这些降解产物是由人类生长素释放肽经Dha化合物产生的。
根据上述结果，证明含有人类生长素释放肽的水溶液的降解过程是这样的：最开始由人类生长素释放肽产生脱酰基化合物或Dha化合物，然后分别通过该脱酰基化合物的裂解产生脱酰基人类生长素释放肽(3-28)以及通过再分别裂解产生脱酰基人类生长素释放肽(3-28)，该脱酰基化合物的裂解产生和Dha化合物的二次降解产物其它的产物。
因此，上述结果证明为了保证生长素释放肽在水溶液中的稳定性，需要防止在作为生长素释放肽的特征结构的疏水性基团位置上发生各种类型的裂解反应。
实施例2：生长素释放肽在具有不同pH值的缓冲溶液中的稳定性(稳定性试验1)
使用一种生长素释放肽——人类生长素释放肽评价含有生长素释放肽溶液的pH值的影响。
将人类生长素释放肽以大约0.15μmol/mL(0.5mg/mL)的浓度溶解于下述水溶液中。
0.1M HCl水溶液(pH：1.1)
Mcllvain缓冲溶液(pH：2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)
用0.1M柠檬酸水溶液和0.2M磷酸氢二钠水溶液调节pH。
将每种溶液在25±2℃下分别储存8、24、48和72小时，通过HPLC分析检测该所得到的溶液与储存之前的溶液比较。计算出人类生长素释放肽、脱酰基化合物以及Dha化合物占总面积的峰面积比例。发现溶液pH在储存之前和之后无明显变化。结果如表2所示。
表2：  观察到的  pH             占总峰面积的峰面积比例(％)  人类生长素释放  肽^a)  脱酰基化合物^b) Dha化合物^b)pH 1  之前  8hr.之后  24hr.之后  48hr.之后  72hr.之后  1.1  1.2  1.2  1.2  1.2  98.8994.4086.0074.6265.04  0.274.8813.3124.6334.17 0.21 0.15 0.09 0.04 0.00pH 2  之前  8hr.之后  24hr.之后  48hr.之后  72hr.之后  2.0  2.0  2.0  2.0  2.0  99.07  98.82  98.2497.3596.46  0.10  0.34  0.891.762.59 0.20 0.20 0.23 0.24 0.25pH 3  之前  8hr.之后  24hr.之后  48hr.之后  72hr.之后  3.0  3.1  3.1  3.1  3.1  99.07  98.98  98.77  98.40  98.03  0.10  0.20  0.38  0.67  0.98 0.20 0.20 0.23 0.24 0.25pH 4  之前  8hr.之后  24hr.之后  48hr.之后  72hr.之后  4.0  4.0  4.0  4.0  4.0  99.07  99.07  98.92  98.69  98.44  0.09  0.12  0.21  0.37  0.51 0.20 0.20 0.21 0.22 0.23pH 5  之前  8hr.之后  24hr.之后  48hr.之后  72hr.之后  5.0  5.0  5.0  5.0  5.0  99.06  99.04  98.91  98.59  98.37  0.10  0.14  0.24  0.45  0.61 0.21 0.21 0.21 0.23 0.24pH 6  之前  8hr.之后  24hr.之后  6.0  6.0  6.0  99.07  98.87  98.28  0.10  0.28  0.70 0.20 0.21 0.26  48hr.之后  72hr.之后    6.0    6.097.6496.921.331.97    0.31    0.35 pH 7  之前  8hr.之后  24hr.之后  48hr.之后  72hr.之后    7.0    7.0    7.0    7.0    7.0    98.97    98.1596.1893.4490.75    0.16    0.922.705.227.67    0.22    0.25    0.43    0.61    0.79 pH 8  之前  8hr.之后  24hr.之后  48hr.之后  72hr.之后    8.0    7.9    7.9    7.9    7.9    98.6194.7387.3276.9568.30    0.473.9210.5719.5427.26    0.24    0.681.392.393.12
a)带下划线的为该位置的人类生长素释放肽峰面积比例小于98％。
b)带下划线的为该位置的脱酰基化合物或Dha化合物的峰面积比例小于1％。
如上述表2所示，人类生长素释放肽水溶液在pH为1.0和8.0时在短时间之内例如储存8个小时之后就产生了超过3％的脱酰基化合物。另外，人类生长素释放肽水溶液在pH为7.0时在储存24小时之后和在pH为2.0和6.0时在储存48小时之后产生了超过1％的脱酰基化合物，并且人类生长素释放肽的比例小于98％。相反，pH范围为3.0-5.0的溶液却抑制了该脱酰基化合物和Dha化合物的产生。
应该理解，pH范围为2-7优选为3-6的溶液适合于抑制脱酰基化合物和Dha化合物的产生。因此，这证明为了保证生长素释放肽在水溶液中的稳定性，需要调节溶液的pH为2-7优选3-6以防止在作为生长素释放肽特征结构的疏水性基团位置上发生各种类型的裂解反应。
实施例3：生长素释放肽在具有不同pH值的缓冲溶液中的稳定性(稳定性试验2)
使用与实施例2的缓冲溶液不同的缓冲溶液，对生长素释放肽在具有不同pH值的缓冲溶液中的稳定性进行测试。
将一种生长素释放肽——人类生长素释放肽溶解于pH为2.1、3.1、4.0、5.0、6.0、7.0以及7.9的Britton-Robinson缓冲溶液中得到含有人类生长素释放肽浓度大约为0.15μmol/mL(0.5mg/mL)的水溶液，其中通过联合使用适宜比例的0.04M磷酸-乙酸-硼酸水溶液和0.2M氢氧化钠水溶液调节该Britton-Robinson缓冲溶液的pH。将所得到的溶液装于褐色玻璃安瓿中并用火密封。为了计算动力学常数以及降解产物在生长素释放肽的水溶液中的存在程度，将安瓿储存于40±1℃的严格储存条件下。通过HPLC利用时间测量人类生长素释放肽的浓度(残余比例)。还测量溶液的pH，发现溶液的pH没有出现明显变化。
根据残余比例的连续变化计算出每种pH溶液的动力学常数，结果如图2所示。
另外，具有不同pH的各溶液在40℃下储存1天后其脱酰基化合物和Dha化合物的峰面积占总面积的比例如图3所示。
如图2所示，证明可以稳定地含有人类生长素释放肽的溶液的pH范围为3-6。在pH为3.1、4.0、5.0和6.0的溶液中生长素释放肽残余比例大于87％，这些值大于目标值(85％)。
另外，如图3所示，pH范围为3-6的溶液可以抑制脱酰基化合物的产生，而pH范围为2-7的溶液可以抑制Dha化合物的产生。
根据上述结果可以这样理解，在使用Britton-Robinson缓冲溶液的情况下，pH范围为2-7优选为3-6的溶液比较适合于抑制脱酰基化合物和Dha化合物的产生。因此，这证明为了保证生长素释放肽在水溶液中的稳定性，需要调节溶液的pH为2-7优选3-6以防止在作为生长素释放肽特征结构的疏水性基团位置上发生各种类型的裂解反应。
实施例4：缓冲溶液的种类对于生长素释放肽稳定性的影响(试验1)
使用柠檬酸盐缓冲溶液测试生长素释放肽的稳定性。
将一种生长素释放肽——人类生长素释放肽溶解于pH为3.6、4.0、4.5和5.0的柠檬酸盐缓冲溶液中，得到含有人类生长素释放肽浓度为大约0.15μmol/mL(0.5mg/mL)的水溶液。将所得到的溶液装于褐色玻璃安瓿中，安瓿用火密封，然后将各安瓿在40±1℃下储存2周。储存2周之后，对溶液进行HPLC分析，根据人类生长素释放肽的浓度计算出残余比例。对pH值的变化也进行了检测。
上述结果汇总在下表3中。
表3： 缓冲溶液的pH 制备之后于40℃下储存2    周之后     3.5残余比例(％)    100      89pH(观测到的)    3.6      3.5     4.0残余比例(％)    100      88pH(观测到的)    4.0      4.0     4.5残余比例(％)    100      86pH(观测到的)    4.5      4.4     5.0残余比例(％)    100      85pH(观测到的)    5.0      4.9
如表3中所示，如果将人类生长素释放肽溶解于pH范围为3.5-5.0的柠檬酸盐缓冲溶液中，则人类生长素释放肽残余比例为85-89％，该值大于目标值(85％)。另外，在储存之前和储存之后观察到pH没有明显变化。因此，这证明在3.5-5.0的pH范围内可以保证生长素释放肽在柠檬酸盐缓冲溶液中的稳定性。
实施例5：缓冲溶液种类对于生长素释放肽稳定性的影响(试验2)
使用甘氨酸盐酸盐缓冲溶液或者醋酸盐缓冲溶液测试生长素释放肽的稳定性。
将一种生长素释放肽——人类生长素释放肽溶解于pH为2.5、3.1、3.6、4.2、4.6和4.8的0.05M甘氨酸盐酸盐缓冲溶液或者pH为3.1、3.5、4.0、4.5和5.0的0.05M醋酸盐缓冲溶液中，得到含有人类生长素释放肽浓度为大约0.15μmol/mL(0.5mg/mL)的水溶液。将所得到的溶液装于褐色玻璃安瓿中，安瓿用火密封，然后各安瓿在40±1℃下储存2周。储存2周之后，对溶液进行HPLC分析以计算纯度。对pH值的变化也进行了检测，证明溶液的pH没有出现明显变化。
将人类生长素释放肽在具有不同pH的各种缓冲溶液中储存2周之后的残余比例汇总在图4中。
如图4所示，如果将人类生长素释放肽溶解于pH范围为2.5-5.0的甘氨酸盐酸盐缓冲溶液或者醋酸盐缓冲溶液中，则人类生长素释放肽的残余比例为87-97％，该值大于目标值(85％)。
根据实施例2(在Mcllvaine缓冲溶液中的稳定性)、实施例3(在Britton-Robinson缓冲溶液中的稳定性)、实施例4(在柠檬酸盐缓冲溶液中的稳定性)以及实施例5(在甘氨酸盐酸盐或者醋酸盐缓冲溶液中的稳定性)的结果证明，为了保证生长素释放肽在水溶液中的稳定性以及保证缓冲溶液的种类不影响生长素释放肽在水溶液中的稳定性，调节溶液的pH是相当重要的。
实施例6：生长素释放肽在具有不同浓度的水溶液中的稳定性
对生长素释放肽在具有不同浓度的水溶液中的稳定性进行测试。
将一种生长素释放肽——人类生长素释放肽溶解于0.05M甘氨酸盐酸盐缓冲溶液(pH 3.5)中得到含有人类生长素释放肽的下面五种浓度的水溶液，其可作为药品使用。
0.03nmol/mL(0.1μg/mL)；0.3nmol/mL(1.0μg/mL)；3.0nmol/mL(10.0μg/mL)；0.3μmol/mL(1.0mg/mL)；3μmol/mL(10mg/mL)。
在25±2℃下储存各溶液24小时，储存后，对各溶液进行HPLC分析，根据人类生长素释放肽浓度计算出残余比例。对pH值的变化也进行了检测，证明溶液的pH没有出现明显变化。
将溶液在储存之前的残余比例定义为100％，各溶液储存之后的残余比例以及各溶液的pH值变化汇总于下面表4中。
表4：  生长素释放肽  浓度  刚刚制备之  后 于40℃下储存2 周之后  0.03nmol/mL  残余比例(％)  100 62  pH  3.4 3.5  0.3nmol/mL  残余比例(％)  100 98  pH  3.5 3.5  3.0nmol/mL  残余比例(％)  100 98  pH  3.5 3.6  0.3μmol/mL  残余比例(％)  100 101  pH  3.4 3.3  3μmol/mL  残余比例(％)  100 101  pH  3.4 3.3
如表4所示，具有高浓度人类生长素释放肽(0.3nmol/mL、3.0nmol/mL、0.3μmol/mL以及3μmol/mL)的溶液在25℃下储存24小时之后仍然保持着人类生长素释放肽在水溶液中的稳定性，没有观察到残余比例的下降和pH值的改变。
相反，在具有低浓度人类生长素释放肽(0.03nmol/mL)的溶液的情况中，溶液储存后的残余比例为62％；然而也没有观察到pH值的明显变化并且在HPLC分析图上也没有出现降解产物例如脱酰基化合物或Dha。因此，这证明溶液中人类生长素释放肽残余比例的降低可能是由于其吸附于容器壁上而导致人类生长素释放肽含量降低。因此推断具有低浓度人类生长素释放肽(0.03nmol/mL)的溶液在25℃下储存24小时之后也可以保持人类生长素释放肽在水溶液中的稳定性。
总之，这证明生长素释放肽可以稳定地存在于经调节pH后的浓度为大约0.03nmol/mL至大约3μmol/mL的缓冲溶液中。
实施例7：生长素释放肽在具有不同pH值的水溶液中的稳定性(试验1)
使用一种生长素释放肽——人类生长素释放肽对生长素释放肽在具有不同pH值的水溶液中的稳定性进行测试。
将人类生长素释放肽溶解于以0.03μmol/mL(0.1mg/mL)的浓度净化水中。该溶液的pH为4.7。将溶液分成4份，一份单独保存，其余三份通过单独加入盐酸或氢氧化钠水溶液分别将其pH值调节至pH1.8(用17mM的盐酸)、pH 3.9(用0.20mM的盐酸)和pH 7.8(用0.24mM的氢氧化钠)。
将这四份溶液在25±2℃下储存1天或者3天，储存之后对各溶液进行HPLC分析，计算出人类生长素释放肽、脱酰基化合物以及Dha化合物占总峰面积的峰面积比例。
上述结果汇总于下面表5中。
表5：         占总峰面积的峰面积比例(％)    人类生长素    释放肽^a)    脱酰基化合    物^b)Dha化合物^b)  pH 1.8  之前  1天后  3天后    99.1697.6895.01    0.121.464.080.200.310.34  pH 3.9  之前  1天后  3天后    99.21    99.19    99.14    0.07    0.09    0.140.200.200.19  pH 4.7  之前  1天后  3天后    99.20    99.12    98.94    0.06    0.15    0.280.200.210.21  pH 7.8  之前  1天后  3天后    98.8594.7887.84    0.333.659.840.240.861.65
a)带下划线的为该位置的人类生长素释放肽峰面积比例小于98％。
b)带下划线的为该位置的脱酰基化合物或Dha化合物的峰面积比例小于1％。
如表5所示，pH 1.8和7.8的水溶液在储存仅1天之后就产生了超过1％的脱酰基化合物，并且人类生长素释放肽的比例低于98％。另外，pH 1.8和7.8的水溶液在储存3天之后其Dha化合物的生成比例超过1％。相反，在pH 3.9和4.7的水溶液中却抑制了脱酰基化合物和Dha化合物的产生。
因此，应该很容易理解具有pH范围为2-7的水溶液比较适合于抑制脱酰基化合物和Dha化合物的产生。因此，这证明为了保证生长素释放肽在水溶液中的稳定性，需要调节溶液的pH为2-7以防止在作为生长素释放肽特征结构的疏水性基团位置上发生各种类型的裂解反应。
实施例8：生长素释放肽在具有不同pH值的水溶液中的稳定性(试验2)
使用一种生长素释放肽——人类生长素释放肽(1-7)酰胺对生长素释放肽在具有不同pH值的水溶液中的稳定性进行测试。
人类生长素释放肽(1-7)酰胺是由哺乳动物、鸟或鱼类(参见表1)得到的生长素释放肽的共同氨基酸序列，它具有与人类生长素释放肽相同的生物活性(国际专利公开WO 01/07475)。
将人类生长素释放肽(1-7)酰胺溶解于以大约0.12μmol/mL(0.1mg/mL)的浓度净化水中。该溶液的pH为5.0。将溶液分成4份，一份单独保存，其余三份通过单独加入盐酸或氢氧化钠水溶液分别将其pH值调节至pH 1.8(用17mM的盐酸)、pH 4.1(用0.05mM的盐酸)和pH 7.9(用0.20mM的氢氧化钠)。
将这四份溶液在25±2℃下储存1天或者3天，储存之后对各溶液进行HPLC分析，计算出人类生长素释放肽(1-7)酰胺、脱酰基人类生长素释放肽(1-7)酰胺和[3-脱氢丙氨酸]-人类生长素释放肽(1-7)酰胺占总峰面积的峰面积比例。
将上述结果汇总于下面表6中。
表6：                  峰面积占总峰面积的比例(％)  人类生长素释放  肽(1-7)酰胺^a)  脱酰基人类生长素释  放肽(1-7)酰胺^b)    [3-脱氢丙氨酸]人类    生长素释放肽(1-7)    酰胺^b)  pH 1.8  之前  1天后  3天后  98.3995.4090.11  0.983.758.89    0.02    0.07    0.10  pH 4.1  之前  1天后  3天后  98.76  98.68  98.60  0.72  0.73  0.77    0.00    0.03    0.01  pH 5.0  之前  1天后  3天后  98.69  98.57  98.51  0.70  0.73  0.79    0.00    0.02    0.06  pH 7.9  之前  1天后  3天后  98.2295.8992.541.123.216.21    0.03    0.23    0.54
a)带下划线的为该位置的人类生长素释放肽(1-7)酰胺峰面积比例小于98％。
b)带下划线的为该位置的人类生长素释放肽(1-7)酰胺或[3-脱氢丙氨酸]-人类生长素释放肽(1-7)酰胺的峰面积比例小于1％。
如表6中所示，人类生长素释放肽(1-7)酰胺在pH 1.8和7.8的水溶液中仅储存1天之后的比例就低于98％。相反，在pH 4.1和5.0的水溶液中却抑制了降解产物的产生。
因此，应该很容易理解具有pH范围为2-7的水溶液是含有一种生长素释放肽——人类生长素释放肽(1-7)酰胺的比较适宜的水溶液。因此，这证明为了保证生长素释放肽在水溶液中的稳定性，需要调节溶液的pH为2-7以防止在作为生长素释放肽特征结构的疏水性基团位置上发生各种类型的裂解反应。
实施例9：抗吸附剂在含有低浓度生长素释放肽的水溶液中的抑制吸附的作用
在实施例6中，表明在具有可供药用浓度的生长素释放肽的溶液中该生长素释放肽可以吸附在容器壁上。因此对抗吸附剂在含有生长素释放肽的溶液中的吸附抑制效果进行了测试。
可以选择表面活性剂也就是聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯(后文称作吐温^80)以及苯扎氯铵作为抗吸附剂。
将人类生长素释放肽以0.3nmol/mL(1.0μg/mL)的浓度溶解于5％甘露醇-0.05M甘氨酸盐酸盐缓冲溶液(pH 3.5)中，该浓度为生长素释放肽可供药用的浓度。以0.01％或0.1％的浓度向溶液中加入抗吸附剂。
制备之后立即通过HPLC方法测量各溶液的人类生长素释放肽浓度，然后将上述溶液置于玻璃试管中。之后，再将各溶液置于一新的玻璃试管中，重复同样的操作5和10次，通过HPLC方法测量各种经处理过的溶液中的人类生长素释放肽浓度。作为对照，对不含抗吸附剂的溶液进行了测试。
使用由聚丙烯制成的试管代替玻璃试管重复同样的步骤。
将上述结果汇总于表7中。
表7：        抗吸附剂  最初浓  度     玻璃试管^a)    聚丙烯试管^b)    种类 浓度    5次    10次    5次    10次    无 -  100    0    0    51    19    吐温80 0.01％  100    17    0    90    90 0.1％  100    20    5    93    91    苯扎氯铵 0.01％  100    81    64    97    96 0.1％  100    99    99    99    101
a)Asahi Techno-glass公司：10mL
b)CORNING公司：15mL
表7清楚表明，溶液不管是经玻璃试管还是聚丙烯试管置换之后其中的人类生长素释放肽浓度均明显降低。特别地，在用玻璃试管置换的情况中该溶液的人类生长素释放肽浓度降至不能被HPLC分析检测出的程度。
相反，如果以0.01％或0.1％的浓度向溶液中加入吐温^80作为抗吸附剂，可以观察到该溶液对聚丙烯试管具有高的吸附抑制效果，另外如果向溶液中以0.01％或0.1％的浓度加入苯扎氯铵作为抗吸附剂，也可以观察到该溶液对玻璃试管和聚丙烯试管均具有高的抑制吸附的效果。
因此应该很容易理解，对于含有可供药用浓度的生长素释放肽的溶液而言，吐温^80和苯扎氯铵可以有效地抑制该生长素释放肽被容器壁吸附。因此，这证明抗吸附剂可以有效地防止生长素释放肽在制备、长期储存以及给药过程中被吸附。
实施例10：糖类在含有低浓度生长素释放肽的水溶液中的吸附抑制效果
在实施例9中，表明通过使用抗吸附剂可以抑制生长素释放肽在溶液的容器壁上的吸附。在本实施例中对糖类的吸附抑制效果进行了测试。
使用5％甘露醇水溶液作为糖水溶液。以大约3nmol/mL(10μg/mL)以及大约30nmol/mL(100μg/mL)的浓度将人类生长素释放肽溶解于5％甘露醇水溶液中，该浓度为生长素释放肽可供药用的浓度。
制备之后立即通过HPLC方法测量各溶液的人类生长素释放肽浓度，然后将上述溶液置于聚丙烯试管中。之后，再将各溶液置于一新的聚丙烯试管中，总共重复同样的操作5次，通过HPLC方法测量各种经处理过的溶液中的人类生长素释放肽浓度。作为对照，对含有人类生长素释放肽浓度大约为3nmol/mL(10μg/mL)和大约30nmol/mL(100μg/mL)的生理盐水溶液进行了测试。
将上述结果汇总于表8中。
表8：          抗吸附剂  最初  浓度  聚丙烯试管^b)种类  人类生长素  释放肽浓度  5次生理盐水  10μg/mL  100  32  100μg/mL  100  895％甘露醇水溶液  10μg/mL  100  98  100μg/mL  100  99
b)CORNING公司：15mL
表8清楚表明，在用聚丙烯试管对生理盐水溶液转移之后其人类生长素释放肽浓度显著降低。特别地，在含有浓度为10μg/mL的生理盐水溶液中，该溶液的人类生长素释放肽浓度降低至32％。
相反，在含有浓度为10μg/mL和100μg/mL的5％甘露醇水溶液中均观察到上述溶液对聚丙烯试管均具有高的吸附抑制效果。
因此应该很容易理解，对于含有可供药用浓度的生长素释放肽的溶液而言，糖类可以有效地抑制该生长素释放肽被容器壁吸附。因此，这证明糖类可以有效地防止生长素释放肽在制备、长期储存以及给药过程中被吸附。
实施例11：溶液的现场制剂的制备及其稳定性
作为本发明药物组合物的现场制剂，下面制备了冻干粉末并对该粉末的溶解性进行了评价。
将人类生长素释放肽以大约0.3nmol/mL(1.0μg/mL)的浓度溶解于5％甘露醇-0.05M甘氨酸盐酸盐缓冲溶液(pH 3.5)中，制备之后立即通过HPLC方法测量该溶液的人类生长素释放肽浓度，还测量了该溶液的pH值。其结果是该人类生长素释放肽浓度为1.0μg/mL，pH为3.5。然后，将该溶液在-25℃下真空冻干24小时，所得到的粉末进一步在20℃下真空干燥24小时。所得到的冻干粉末为具有良好外观的白色固体。
然后，将该冻干粉末溶解于净化水中，其用量与冻干开始减少的量相同，对冻干粉末的溶解性以及所得到溶液的pH进行了检测。
其结果是该冻干粉末的溶解性相当好，看上去溶液中不存在不溶物质，可见这种粉末的溶解性比较适合于溶液现场制剂。该人类生长素释放肽浓度为1.0μg/mL，其与溶液刚刚制备之后或者冻干之前的人类生长素释放肽浓度相同，也就是说观察到经冻干后该制剂的含量并没有降低。另外溶液的pH值为3.5，该值与溶液刚刚制备之后或者冻干之前的pH值相同。因此，由本发明的冻干粉末可以得到稳定地含有人类生长素释放肽的水溶液。
因此，使用溶液的pH经过调节的含生长素释放肽的溶液经冻干法可以得到含有生长素释放肽的冻干粉末，所得到的冻干粉末制剂可用作本发明的药物组合物的现场制剂。
制备实施例1：制备含有pH被调节之后的人类生长素释放肽的药物组合物
将一种生长素释放肽——人类生长素释放肽溶解于净化水中得到含有人类生长素释放肽浓度为大约0.15μmol/mL(0.5mg/mL)的水溶液。通过加入0.1M盐酸溶液调节该溶液的pH至4.0，得到溶液制剂形式的含有人类生长素释放肽的药物组合物。
制备实施例2：制备含有大鼠生长素释放肽的甘氨酸盐酸盐缓冲溶液的药物组合物
将一种生长素释放肽——大鼠生长素释放肽以大约为0.15μmol/mL(0.5mg/mL)的浓度溶解于0.05M甘氨酸盐酸盐缓冲溶液(pH 3.5)中，得到溶液制剂形式的含有大鼠生长素释放肽的药物组合物。该溶液的pH为3.5。
制备实施例3：制备含有[3-丝氨酸(乙酰基)]人类生长素释放肽的甘氨酸盐酸盐缓冲溶液的药物组合物
将一种生长素释放肽——[3-丝氨酸(乙酰基)]人类生长素释放肽以大约为0.15μmol/mL(0.1mg/mL)的浓度溶解于0.05M甘氨酸盐酸盐缓冲溶液(pH 3.5)中，得到溶液制剂形式的含有[3-丝氨酸(乙酰基)]人类生长素释放肽的药物组合物。该溶液的pH为3.5。
制备实施例4：制备含有[3-丝氨酸(苯基丙酰基)]人类生长素释放肽的甘氨酸盐酸盐缓冲溶液的药物组合物
将一种生长素释放肽——[3-丝氨酸(苯基丙酰基)]人类生长素释放肽以大约为0.15μmol/mL(0.5mg/mL)的浓度溶解于0.05M甘氨酸盐酸盐缓冲溶液(pH 3.5)中，得到溶液制剂形式的含有[3-丝氨酸(苯基丙酰基)]人类生长素释放肽的药物组合物。该溶液的pH为3.5。
制备实施例3：制备含有人类生长素释放肽(1-5)酰胺的甘氨酸盐酸盐缓冲溶液的药物组合物
将一种生长素释放肽——人类生长素释放肽(1-5)酰胺以大约为0.15μmol/mL(0.5mg/mL)的浓度溶解于0.05M甘氨酸盐酸盐缓冲溶液(pH 3.5)中，得到溶液制剂形式的含有[3-丝氨酸(苯基丙酰基)]人类生长素释放肽的药物组合物。该溶液的pH为3.5。
工业适用性
如上所述，本发明提供了可以稳定地含有生长素释放肽的药物组合物，并且本发明的这种制剂可以防止生长素释放肽被容器壁吸附。因此，本发明提供了在制备、长期储存或者给药过程中生长素释放肽不会减少的药物组合物。
                 序列表
<110>DAIICHI SUNTORY PHARMA CO.，LTD.
<120>含有生长素释放肽的药物组合物
<130>DSP-78
<150>JP 2002-146155
<151>2002-05-21
<160>21
<170>PatentIn 3.1版
<210>1
<211>28
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>肽
<222>(1)..(28)
<223>促生长激素分泌素的人类内源肽的氨基酸序列
<400>1
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys
1                5                  10                  15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
            20                 25
<210>2
<211>27
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>肽
<222>(1)..(27)
<223>促生长激素分泌素的人类内源肽(27个氨基酸)的氨基酸序列
<400>2
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Arg Lys Glu
1                5                  10                  15
Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
            20                 25
<210>3
<211>28
<212>PRT
<213>褐大鼠
<220>
<221>肽
<222>(1)..(28)
<223>促生长激素分泌素的大鼠内源肽的氨基酸序列
<400>3
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys
1               5                   10                  15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
            20                 25
<210>4
<211>27
<212>PRT
<213>褐大鼠
<220>
<221>肽
<222>(1)..(27)
<223>促生长激素分泌素的大鼠内源肽的氨基酸序列
<400>4
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Arg Lys Glu
1               5                   10                  15
Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
           20                  25
<210>5
<211>28
<212>PRT
<213>小家鼠
<220>
<221>肽
<222>(1)..(28)
<223>促生长激素分泌素的小鼠内源肽的氨基酸序列
<400>5
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys
1               5                   10                  15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
            20                  25
<210>6
<211>28
<212>PRT
<213>猪
<220>
<221>肽
<222>(1)..(28)
<223>促生长激素分泌素的猪内源肽的氨基酸序列
<400>6
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Val Gln Gln Arg Lys
1               5                   10                  15
Glu Ser Lys Lys Pro Ala Ala Lys Leu Lys Pro Arg
           20                  25
<210>7
<211>27
<212>PRT
<213>公牛
<220>
<221>肽
<222>(1)..(27)
<223>促生长激素分泌素的牛内源肽(27个氨基酸)的氨基酸序列
<400>7
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Arg Lys Glu
1               5                    10                 15
Ala Lys Lys Pro Ser Gly Arg Leu Lys Pro Arg
            20                 25
<210>8
<211>27
<212>PRT
<213>绵羊
<220>
<221>肽
<222>(1)..(27)
<223>促生长激素分泌素的绵羊内源肽(27个氨基酸)的氨基酸序列
<400>8
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Arg Lys Glu
1               5                   10                 15
Pro Lys Lys Pro Ser Gly Arg Leu Lys Pro Arg
            20                  25
<210>9
<211>28
<212>PRT
<213>家狗
<220>
<221>肽
<222>(1)..(28)
<223>促生长激素分泌素的狗内源肽的氨基酸序列
<400>9
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Gln Arg Lys
1                5                  10                  15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
            20                 25
<210>10
<211>21
<212>PRT
<213>日本鳗鱼
<220>
<221>肽
<222>(1)..(21)
<223>促生长激素分泌素的鳗鱼内源肽的氨基酸序列。该肽在C-末端被酰胺化。
<400>10
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Arg Pro Gln Gly Lys Asp Lys
1               5                   10                  15
Lys Pro Pro Arg Val
            20
<210>11
<211>23
<212>PRT
<213>虹鳟鱼
<220>
<221>肽
<222>(1)..(23)
<223>促生长激素分泌素的虹鳟鱼内源肽(23个氨基酸)的氨基酸序列。该肽在C-末端被酰胺化。
<400>11
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Lys Pro Gln Val Arg Gln Gly
1               5                   10                  15
Lys Gly Lys Pro Pro Arg Val
            20
<210>12
<211>20
<212>PRT
<213>虹鳟鱼
<220>
<221>肽
<222>(1)..(20)
<223>促生长激素分泌素的虹鳟鱼内源肽(20个氨基酸)的氨基酸序列。该肽在C-末端被酰胺化。
<400>12
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Lys Pro Gln Gly Lys Gly Lys
1               5                   10                  15
Pro Pro Arg Val
            20
<210>13
<211>24
<212>PRT
<213>家鸡
<220>
<221>肽
<222>(1)..(24)
<223>促生长激素分泌素的家鸡内源肽的氨基酸序列
<400>13
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Tyr Lys Asn Ile Gln Gln Gln Lys
1               5                   10                  15
Gly Thr Arg Lys Pro Thr Ala Arg
            20
<210>14
<211>24
<212>PRT
<213>家鸡
<220>
<221>肽
<222>(1)..(24)
<223>促生长激素分泌素的家鸡内源肽的氨基酸序列
<400>14
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Tyr Lys Asn Ile Gln Gln Gln Lys
1               5                   10                  15
Asp Thr Arg Lys Pro Thr Ala Arg
           20
<210>15
<211>26
<212>PRT
<213>家鸡
<220>
<221>肽
<222>(1)..(26)
<223>促生长激素分泌素的家鸡内源肽的氨基酸序列
<400>15
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Tyr Lys Asn Ile Gln Gln Gln Lys
1               5                   10                  15
Asp Thr Arg Lys Pro Thr Ala Arg Leu His
           20                   25
<210>16
<211>27
<212>PRT
<213>蛙
<220>
<221>肽
<222>(1)..(27)
<223>促生长激素分泌素的蛙内源肽的氨基酸序列
<400>16
Gly Leu Thr Phe Leu Ser Pro Ala Asp Met Gln Lys Ile Ala Glu Arg
1               5                   10                 15
Gln Ser Gln Asn Lys Leu Arg His Gly Asn Met
            20                 25
<210>17
<211>28
<212>PRT
<213>蛙
<220>
<221>肽
<222>(1)..(28)
<223>促生长激素分泌素的蛙内源肽的氨基酸序列
<400>17
Gly Leu Thr Phe Leu Ser Pro Ala Asp Met Gln Lys Ile Ala Glu Arg
1               5                   10                  15
Gln Ser Gln Asn Lys Leu Arg His Gly Asn Met Asn
            20                  25
<210>18
<211>20
<212>PRT
<213>罗非鱼
<220>
<221>肽
<222>(1)..(20)
<223>促生长激素分泌素的罗非鱼内源肽的氨基酸序列。酰胺化
<400>18
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Lys Pro Gln Asn Lys Val Lys
1               5                   10                  15
Ser Ser Arg Ile
           20
<210>19
<211>22
<212>PRT
<213>鲶鱼
<220>
<221>肽
<222>(1)..(22)
<223>促生长激素分泌素的鲶鱼内源肽的氨基酸序列。该肽在C-末端被酰胺化。
<400>19
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Gln Lys Pro Gln Asn Arg Gly Asp
1               5                   10                 15
Arg Lys Pro Pro Arg Val
            20
<210>20
<211>23
<212>PRT
<213>鲶鱼
<220>
<221>肽
<222>(1)..(23)
<223>促生长激素分泌素的鲶鱼内源肽的氨基酸序列
<400>20
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Gln Lys Pro Gln Asn Arg Gly Asp
1               5                   10                  15
Arg Lys Pro Pro Arg Val Gly
            20
<210>21
<211>28
<212>PRT
<213>马
<220>
<221>肽
<222>(1)..(28)
<223>促生长激素分泌素的马内源肽的氨基酸序列。
<400>21
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His His Lys Val Gln His Arg Lys
1               5                   10                  15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Lys Pro Arg
            20                 25