大鼠骨髓MSC体内移植定向分化为视网膜结构的方法.pdf

本发明为大鼠骨髓MSCs体内移植定向分化为视网膜结构的方法。本发明的目的是提供一种将骨髓间充质干细胞移植于视网膜下并在原位分化为视网膜结构的方法。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：分离出的大鼠骨髓间充质干细胞在体内进行定向诱导分化的方案，其特征在于利用特定的细胞密度和注射方式使骨髓间充质干细胞在原位分化为视网膜结构(包括视网膜色素上皮细胞、视锥、视杆细胞、双极细胞及节细胞)。本发明提供了神经细胞缺失后的补充来源，为临床研制视网膜损伤修复供体奠定了基础。

1.  一种富集大鼠骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于培养的骨髓间充质干细胞为原代至2代细胞。

2.  按权利要求1的分离方法分离出的细胞在体内进行定向诱导分化的方案，其特征在于以特定的细胞密度及注射体积进行移植。

3.  按权利要求2的方法将分离出的细胞在体内进行定向诱导分化的方案，其特征在于注射方式为视网膜下注射。

4.  按权利要求3的方法将分离出的细胞在体内进行定向诱导分化的方案，其特征在于使骨髓间充质干细胞在原位分化为视网膜结构(包括视锥、视杆细胞、双极细胞及节细胞)。

大鼠骨髓MSC体内移植定向分化为视网膜结构的方法
技术领域
本发明涉及一种利用骨髓间充质干细胞体内定向分化为视网膜结构的方法。
背景技术
视网膜疾病占重症眼病的一半以上，因而自身修复效果往往不好，对于较轻的视网膜损伤目前主要采取抗炎治疗或营养因子治疗，而对重度损伤迄今尚无很好的治疗方法，主要是玻璃体止血、促进凝血的吸收。许多病例由于未能及时治疗或无药可就而导致视力下降甚至失明，因此寻找更好的治疗方法对于治疗视网膜疾病至关重要。
干细胞工程的研究为视网膜损伤的治疗提供了一种新的途径。骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)，是在骨髓中类似成纤维细胞的一类细胞，具有多方向分化潜能，可以向多种组织细胞转化。自体骨髓间充质干细胞还具有取材方便、无免疫原性、具有多向分化潜能、合乎伦理学要求并且无致瘤性，具有其它干细胞不可比拟的优势。
由于视网膜结构复杂、组成细胞种类多，加之此处为免疫赦免区，血液内的干细胞很难达到。即使骨髓内的干细胞、具有分化为视网膜的能力也很难达到损伤部位。因此，探讨MSCs向视网膜细胞诱导分化条件及细胞移植方式将对损伤视网膜的修复治疗具有深远意义。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种骨髓间充质干细胞体内移植定向分化为视网膜结构的方法。采用以下技术方案：1)从大鼠骨髓中分离出的骨髓间充质干细胞在体内进行定向诱导分化的方案，其特征在于利用特定的细胞密度(2×10⁵/mL)进行体内移植；2)将MSCs移植到大鼠体内，其特征在于移植时使用的体积为10μL/眼，采用单点注射；3)将MSCs移植到大鼠体内，其特征在于注射方式为视网膜下移植；4)将MSCs移植到大鼠体内，其特征在于骨髓间充质干细胞在原位分化成的视网膜结构包括视网膜色素上皮细胞、视锥、视杆细胞、双极细胞及节细胞。
本发明的内容未公开发表，本领域的技术人员如不花费创造性劳动根本不能根据现有地技术推断得到本发明的分离方法。
具体实施方式
1.大鼠MSCs的体外培养(全过程注意无菌操作，戴灭菌手套)：6周龄雄性大鼠断颈处死，75％酒精中浸泡1min，于超净台内消毒腰盘中剥去大鼠皮，做MSCs的分离培养，具体步骤为：①去双侧股骨，剥净上面的肌肉，用D-Hank’s液冲洗；②将两头的关节面小心横断切开，用注射器带9号针头吸取2mL含10％胎牛血清(Hyclone)的低糖DMEM插入骨髓腔冲洗；③如此反复冲洗4-5遍，1500rpm×5min离心收集细胞，用培养液洗涤一次，离心；④现配Percoll将骨髓细胞重悬于2-3mL培养液中，3000rpm×30min离心，吸取界面上的细胞层(其中含有红细胞，界面呈浅红色)，用培养液稀释至5mL，1500rpm×5min离心收集细胞；⑤以2.3×10⁵cell/well接种于Φ30mm的塑料平皿中。
2.视网膜下移植治疗并观察：MSCs移植均采取如下方法：①细胞经0.25％胰酶消化，至终浓度为2×10⁵/mL，用50μL微量注射器吸取10μL备用；②大鼠(♀)于麻醉后即刻沿结膜颞侧边缘1mm处剪开约1/2，以能够暴露颞侧眼球为准；③用6.5号针头斜向插入颞侧巩膜，再将吸取细胞的微量注射器的针头沿外切方向插入此孔，针面对准视网膜，轻轻将细胞液体注入到视网膜下，滴加抗生素类眼药防止外伤感染。
3.大鼠Y染色体sry基因的获得及sry基因探针标记：
①设计针对大鼠sry基因的扩增引物：根据文献确定sry基因两端引物为：
primer 1：5′-AGA TCT TGA TTT TTA GTG TTC-3′
primer 2：5′-TGC AGC TCT ACT CCA GTC TTG-3′
②从雄性大鼠肾脏提取基因组DNA，利用PCR扩增sry基因片段；
③sry探针的DIG标记：应用PCR DIG probc synthesis kit(Rochc，cat#1 636 090)对探针进行PCR方法的DIG标记，利用Roche High Pure PCR product purification kit回收；
④组织切片的检测：将组织切片先行HE染色，观察其结构，进行扫描式的切片进行原位DNA杂交检测。
结果：在正常大鼠注射MSCs组各层均发现sry杂交阳性细胞，细胞形态与各层细胞相符。