高维生素BSUB2/SUB降胆固醇酸奶的生产方法.pdf

本发明涉及一种高维生素B2降胆固醇酸奶的生产方法。本发明的技术方案包括以下步骤：将瑞士乳杆菌和乳酸乳球菌亚种接种于含乳或豆乳的混合料中，在35－38℃下培养3－6小时，冷却，即制成产品。依据本发明方法制得的酸奶，维生素B2含量比普通酸奶高80％，并且能显著降低其血清总胆固醇、血清甘油三酯、血清高密度脂蛋白、血清总胆酸、肝脏总胆固醇水平。

1、  一种高维生素B₂降胆固醇酸奶的生产方法，包括以下步骤：
a.将瑞士乳杆菌JCM1004和乳酸乳球菌亚种接种于含乳或豆乳的混合料中；
b.在35-38℃下培养3-6小时；
e.冷却，即制成产品。

2、  根据权利要求1所述的高维生素B₂降胆固醇酸奶的生产方法，其特征在于，步骤b后还有步骤
c：将嗜热链球菌接种于步骤b得到的发酵液中；
d.升温至40-43℃，培养2-5小时；
所述步骤e为：待滴定酸度达到80-100吉尔涅尔度后，冷却，即制成产品。

3、  根据权利要求1或2所述的高维生素B₂降胆固醇酸奶的生产方法，其特征在于，步骤a中所述的混合料按重量比含脱脂乳10-12％、白糖5-8％。

4、  根据权利要求3所述的高维生素B₂降胆固醇酸奶的生产方法，其特征在于，所述步骤c中还接种了保加利亚杆菌。

5、  根据权利要求4所述的高维生素B₂降胆固醇酸奶的生产方法，其特征在于，在步骤a或步骤c中添加稳定剂。

6、  根据权利要求5所述的高维生素B₂降胆固醇酸奶的生产方法，其特征在于，所述各步骤具体如下：
a.将瑞士乳杆菌JCM1004和乳酸乳球菌亚种接种于含脱脂乳11％、白糖6.5％、耐酸性羧甲基纤维素钠0.09％的混合料中；
b.在37℃下培养4小时；
c.将嗜热链球菌与保加利亚杆菌混合菌种按1-3％比例添加到步骤b得到的发酵液中；
d.升温至41-43℃，培养3-4小时；
e.待滴定酸度达到90吉尔涅尔度后，冷却，即制成产品。

7、  根据权利要求6所述的高维生素B₂降胆固醇酸奶的生产方法，其特征在于，步骤b中嗜热链球菌与保加利亚杆菌的比例为2-5∶1-3。

高维生素B₂降胆固醇酸奶的生产方法
技术领域
本发明涉及酸乳制品加工领域，具体地说，涉及一种高维生素B₂含量、降胆固醇酸奶的生产方法。
背景技术
胆固醇是人体内重要的固醇类物质。但是，围绕着胆固醇与人体健康的关系，在世界范围内食品学界和食品工业界一直存在很大争议。自上世纪30年代有国外研究者得出“血管壁增厚即动脉粥样硬化症是不正常胆固醇代谢的结果”这一结论以来，已有越来越多的实验和研究表明胆固醇与动脉粥样硬化，冠心病，脑中风等心脑血管疾病间的关系。美国和国内的营养和医学专家推荐食物胆固醇的摄入量标准为不超过250-300mg/d·人。但随着人民生活水平的提高和膳食营养的增加，胆固醇的摄入量很容易超标。因此研究不限饮食，不影响食品风味，经济实用的降低食品及人体血清胆固醇水平的方法已成为当前重要的研究课题]。乳酸菌大量存在于酸乳及其它相关发酵乳制品中。20世纪70年代，科学家先后通过对大量饮用酸乳等发酵乳制品的非洲Massai人血清胆固醇的研究，对新生儿的研究，对常饮酸乳的美国人的调查]以及直接对酸乳的研究等，均发现乳酸菌具有降低人体血清胆固醇的作用。
普通的酸奶无显著的降胆固醇功能而且其维生素B₂的含量也低，如由嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)ATCC14485和保加利亚杆菌(Lactobacillusdelbrueckii subsp.Bulgaricus)ATCC11842发酵的酸奶风味比较好，但无显著的降胆固醇活性，而且其维生素B₂的含量也相对较低；具有降胆固醇功能，又富含维生素B₂的酸奶及生产方法，目前尚无报道。
瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)JCM1004(购于日本群马县351-0198，日本物理化学研究所微生物保藏中心。Japan Collection of Microorganisms RIKEN(The Institute of Physical and Chemical Research)，2-1 Hirosawa，Wako，Saitama351-0198，Japan)能发酵牛奶产生较多维生素B₂，它发酵牛奶产生维生素B₂的最适温度为37℃；乳酸乳球菌亚种(Lactococcus lactis subsp.Lactis)ATCC 15577具有较强的降胆固醇功能，体外培养降胆固醇能力为40-45％，用该乳酸菌发酵酸奶饲喂高脂模型大鼠，对血清总胆固醇、血清甘油三酯、血清高密度脂蛋白、血清总胆酸、肝脏总胆固醇有显著的降低作用，它发酵牛奶产生降胆固醇活性物质的最适温度为37-40℃。
发明内容
本发明将提供一种利用不同的乳酸菌组合发酵生产有降胆固醇能力又富含维生素B₂的酸奶的生产方法；本发明进一步的目的是提供一种具有降胆固醇能力又有比较好的风味和高维生素B₂含量的酸奶生产工艺。
本发明高维生素B₂降胆固醇酸奶的生产方法，包括以下步骤：
a.将瑞士乳杆菌JCM1004和乳酸乳球菌亚种接种于含乳或豆乳的混合料中；
b.在35-38℃下培养3-6小时；
e.冷却，即制成产品。
本发明的优化方案是：步骤b后还有步骤
c.将嗜热链球菌接种于步骤b得到的发酵液中；
d.升温至40-43℃，培养2-5小时；
上述步骤e为：待滴定酸度达到80-100吉尔涅尔度后，冷却，即制成产品。
本发明的酸奶生产方法，其特征在于，上述步骤a中所述的混合料按重量比含脱脂乳10-12％、白糖5-8％。
本发明的酸奶生产方法，其特征在于，上述步骤c中还接种了保加利亚杆菌。
本发明的酸奶生产方法，其特征在于，在步骤a或步骤c中添加稳定剂。
本发明的酸奶生产方法，其特征在于，所述各步骤具体如下：
a.将瑞士乳杆菌JCM1004和乳酸乳球菌亚种接种于含脱脂乳11％、白糖6.5％、耐酸性羧甲基纤维素钠0.09％的混合料中；
b.在37℃下培养4小时；
c.将嗜热链球菌与保加利亚杆菌混合菌种按1-3％比例添加到步骤b得到的发酵液中；
d.升温至41-43℃，培养3-4小时；
e.待滴定酸度达到90吉尔涅尔度后，冷却，即制成产品。
本发明的酸奶生产方法，其特征在于，步骤b中嗜热链球菌与保加利亚杆菌的比例为2-5∶1-3。
本发明的方法，将能发酵牛奶产生较强降胆固醇活性的乳酸乳球菌亚种和能产生较多维生素B₂的瑞士乳杆菌JCM1004接种于含乳或豆乳的混合料中培养，即可得到有较强降胆固醇能力又富含维生素B₂的酸奶，结合生产成本及产品质量考虑，在此步骤中，接种比例按重量比推荐1-5％，优选3.0％；所述的乳是全脂乳或脱脂乳，优选脱脂乳；混合料的组成按重量比推荐：脱脂乳10-13％、白糖5-8％、稳定剂0.07-0.15％、其余为水，优选脱脂乳11％、白糖6.5％、稳定剂0.09％、其余为水；所述的稳定剂优选耐酸性羧甲基纤维素钠、黄原胶、藻酸丙二醇酯；本步骤中的发酵温度推荐35-38℃，优选37℃；本步骤中培养时间推荐3-6小时，优选项4小时。经此步骤得到的发酵液，即是有较强降胆固醇功能且富含维生素B₂的酸奶，冷却分装便可销售。
由于瑞士乳杆菌和乳酸乳球菌亚种发酵生产的酸奶风味不是非常好，因此，作为本发明的优选方案是：在无菌操作的条件下，再将活化好的嗜热链球菌添加到上述发酵液中，混匀后升温至40-43℃，保温培养，待滴定酸度达到80-100吉尔涅尔度(°T)后，冷却得到有较强降胆固醇能力又有比较好的风味和高维生素B₂含量的酸奶。此步骤中具体的发酵培养时间可视生产规模和接种比例而定，本发明推荐接种比例为1-3％，优选1％；发酵温度推荐41-43℃，优选42℃；培养时间推荐2-5小时，优选3-4小时；滴定酸度优选90吉尔涅尔度。
为了提高生产效率，还可在上述步骤中接种保加利亚杆菌。嗜热链球菌与保加利亚杆菌的比例推荐2-5∶1-3，优选2∶1。
本发明酸奶的生产方法中，可参照普通酸奶的生产工艺添加稳定剂。稳定剂可添加在混合料中，也可在接种菌种时添加；在生产全过程中也可不添加稳定剂。
本发明各步骤的发酵培养时间，不限于推荐的范围，选用范围外地数值仍能实现本发明目的，只不过质量和效益受到影响。
依据本发明方法制得的酸奶，有以下有益效果：
1、维生素B₂含量比普通酸奶高80％。
维生素B₂含量测定方法如下：
(1)制定标准曲线
实验所选用的激发波长为435nm，发射波长为535nm。具体步骤为：精密称取真空干燥过的维生素B₂对照品10mg，置200ml容量瓶中，加水后置60度水浴温热，溶解，然后放冷，加水稀释至刻度，然后摇匀；精密吸取2ml，置于100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；精密吸取稀释液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml，分别置于10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；在激发波长为435nm，发射波长为535nm，狭缝宽EX＝2.5nm，EM＝5.0nm，选择515nm滤光片的条件下分别测定荧光浓度。以浓度为横坐标、荧光强度为纵坐标绘图即得维生素B₂的荧光分光光度标准曲线，维生素B₂在0.1ug/ml-0.6ug/ml范围内呈良好的线性关系，其回归方程为
          F＝160.01C+1.02，拟合度超过0.99。
(2)样品测量
培养发酵结束后用50％的乳酸将酸乳的pH调节到3.4-3.6，在4000rpm下离心20分钟，收集上清液，再用10N的氢氧化钠溶液将其pH调节至8.3，继续在4000rpm下离心20分钟，收集上清液，吸取一定量的上清液，加入等量的水(即将上清液稀释一倍)后得处理液，测定处理液的荧光强度后代入回归方程即可得到该酸奶的维生素B₂的含量为0.75-1.10μg/ml。
用上述方法测得普通酸奶的维生素B₂含量为0.40-0.60μg/ml，由此可见，采用本发明制得的酸奶，其维生素含量明显高于普通酸奶。
2、用通过本发明方法制得的酸奶饲喂高脂模型大鼠，能显著降低其血清总胆固醇、血清甘油三酯、血清高密度脂蛋白、血清总胆酸、肝脏总胆固醇水平。
降胆固醇动物试验如下：
(1)高脂饲料配方
猪油8％(w/w)，胆固醇1％(w/w)，牛胆盐0.5％(w/w)，基础饲料90.5％(w/w)。
(2)实验动物和分组
清洁级雄性SD大鼠40只，体重180-220g，由南京医科大学实验动物中心提供。自由饮水进食，普通饲料正常饲养一周后，随机分为A、B、C、D四组，每组10只：A基础日粮组，饲喂普通饲料；B高脂模型组，饲喂高脂饲料；C奶粉对照组，高脂饲料中添加与D组中等量的脱脂奶粉和绵白糖；D酸奶试验组，在高脂饲料中按1ml/g饲料添加酸奶，以上各组配料均制成颗粒饲料。
(3)模型建立及标本制作
按(2)中饲料要求饲喂大鼠。每周称一次体重，分别于0d和28d禁食12h，眼眶采血，低温离心，分离血清，4℃冷贮，一周内测定血脂(TC、TG、HDL-C)，28d血清测定血脂(TC、TG、HDL-C)和血清总胆酸(TBA)。第28d采血后，大鼠断颈处死，解剖后分别取肝肾脾称重，并留取肝脏最大叶-20℃冷冻贮备测肝脏胆固醇含量。第28d采血前2天收集粪便，冷冻干燥后于研钵中磨细混匀，干燥器中保存待测。
(4)检测方法
取血清适量，分别依试剂盒的操作要求采用比色法。用722型光栅分光光度计测定TC、TG、HDL-C和TBA的含量。取肝脏1cm3左右精确称重，自然解冻，加适量石英砂研磨，8ml甲醇-氯仿(2∶1)混合液混匀后45℃水浴提取1小时过滤，滤液稀释5倍用邻苯二甲醛比色法测定胆固醇含量。称取大鼠粪便粉末0.1g左右，加2.5ml无水乙醇80℃水浴提取1小时，中间不断振荡混匀。5000rpm离心5min，倒出上清液保存，再用2.5ml无水乙醇提取一次，合并提取液，50℃下氮气吹干，用2ml无水乙醇溶解[8]，用TBA测定试剂盒测定胆酸含量。取大鼠粪便粉末0.1g左右，用甲醇-氯仿混合液45℃水浴提取1小时，邻苯二甲醛比色法测定粪便中胆固醇含量。
(5)结果与分析
A酸奶对大鼠血脂的影响
按照(2)分组进行动物实验。28天后，B组血清TC含量显著高于A组(P＜0.05)，说明饲喂高脂饲料28d高脂模型已成功建立。D组的血清TC和TG含量比B组显著降低(P＜0.05)。而C组与B组相比TC有所升高但差异不显著(P＞0.05)，说明未发酵牛奶本身并没有降胆固醇的作用。各种饲料配方对大鼠HDL-C的含量影响不大，与B组相比，D组大鼠的HDL-C虽然上升但差异不显著。
B、酸乳对大鼠血清TBA、肝脏TC及粪便中TC和TBA含量的影响
饲喂试验组D组大鼠的血清胆固醇显著低于高脂对照组B组，D组大鼠血清TBA含量显著低于B组(P＜0.05)，肝脏中总胆固醇的含量也显著低于B组(P＜0.05)，说明与B组相比，D组大鼠饮食来源的胆固醇在肝脏中积存较少.
    组别      血清TBA(μmol/L)    肝脏TC(mg/g)
B.高脂模型组    13.98±6.77        30.57±5.25
D.酸奶试验组    8.37±3.70^*       25.76±4.00^*
*与高脂模型组比较差异显著(p＜0.05)
由常用酸奶菌种发酵生产的酸奶其维生素B₂含量不高，而且其降胆固醇活性也比较低，而由瑞士乳杆菌发酵生产的酸奶其维生素B₂含量比较高，由乳酸乳球菌亚种发酵生产的酸奶具有较强的降胆固醇活性，故用两个菌一起发酵生产的酸奶，其维生素B₂含量比较高而且具有较强的降胆固醇活性。
但由瑞士乳杆菌和乳酸乳球菌亚种发酵生产的酸奶风味不是很好，由嗜热链球菌发酵生产的酸奶风味比较好，故添加嗜热链球菌可以生产出风味比较好的富含维生素B₂且具有较强的降胆固醇活性酸奶。本发明中所述的嗜热链球菌可以用其它一种或多种常用酸奶菌种替代，如丁二酮链球菌；在发酵液中接种保加利亚杆菌还可缩短发酵时间。
具体实施方式
实施例1：将乳酸乳球菌亚种和瑞士乳杆菌JCM1004按3.0％的比例接种于由11.0％的脱脂乳、6.5％白糖和0.09％耐酸性羧甲基纤维素钠组成的混合料中，先在37℃下培养4小时，然后在无菌操作的条件下，再将活化好的嗜热链球菌与保加利亚杆菌混合发酵剂{嗜热链球菌∶保加利亚杆菌＝2∶1}按1％比例添加到上述发酵液中，混匀后升温至42℃，保温培养3小时，待滴定酸度达到90吉尔涅尔度后，将上述酸奶冷却后，灌装于容器中冷藏。
实施例2：将乳酸乳球菌亚种和瑞士乳杆菌JCM1004按1.0％的比例接种于由10.0％的脱脂乳、5％白糖和0.07％黄原胶组成的混合料中，先在35℃下培养3小时，然后在无菌操作的条件下，再将活化好的嗜热链球菌与保加利亚杆菌混合发酵剂{嗜热链球菌∶保加利亚杆菌＝1∶1.5}按2％比例添加到上述发酵液中，混匀后升温至40℃，保温培养2小时，待滴定酸度达到80吉尔涅尔度后，将上述酸奶冷却后，灌装于容器中冷藏。
实施例3：将乳酸乳球菌亚种和瑞士乳杆菌JCM1004按5.0％的比例接种于由13.0％的脱脂乳、8％白糖和0.15％藻酸丙二醇酯组成的混合料中，先在38℃下培养7小时，然后在无菌操作的条件下，再将活化好的嗜热链球菌与保加利亚杆菌混合发酵剂{嗜热链球菌∶保加利亚杆菌＝2.5∶0.5}按3％比例添加到上述发酵液中，混匀后升温至41℃，保温培养6小时，待滴定酸度达到100吉尔涅尔度后，将上述酸奶冷却后，灌装于容器中冷藏。
实施例4：将乳酸乳球菌亚种和瑞士乳杆菌JCM1004按0.5％的比例接种于15.0％的脱脂乳中，在37℃下培养6小时，将上述酸奶冷却后，灌装于容器中冷藏。
实施例5：将乳酸乳球菌亚种和瑞士乳杆菌JCM1004按7％的比例接种于9.0％的脱脂乳中，在36℃下培养5小时，将上述酸奶冷却后，灌装于容器中冷藏。
实施例6：与实施例1基本相同，不同之处在于混合料的组成为：14.0％的脱脂乳、4％白糖，其余为水。
实施例7：将乳酸乳球菌亚种和瑞士乳杆菌JCM1004按6.0％的比例接种于由16.0％的脱脂乳、9％白糖、其余为水的混合料中，先在38℃下培养5小时，然后在无菌操作的条件下，再将活化好的丁二酮链球菌按3％比例添加到上述发酵液中，并添加0.05％的耐酸性羧甲基纤维素钠，混匀后升温至41℃，保温培养6小时，待滴定酸度达到95吉尔涅尔度后，将上述酸奶冷却后，灌装于容器中冷藏。
实施例8：将乳酸乳球菌亚种和瑞士乳杆菌JCM1004按5.5％的比例接种于由16.0％的脱脂乳、9％白糖、其余为水的混合料中，先在38℃下培养5小时，然后在无菌操作的条件下，再将活化好的嗜热链球菌和丁二酮链球菌按4％比例添加到上述发酵液中，并添加0.05％的耐酸性羧甲基纤维素钠，混匀后升温至41℃，保温培养6小时，待滴定酸度达到95吉尔涅尔度后，将上述酸奶冷却后，灌装于容器中冷藏。
实施9：与实施1基本相同，不同之处在于，将所述的脱脂乳用全脂乳替代。
实施10：与实施2基本相同，不同之处在于，将所述的脱脂乳用豆乳替代。