IL6/IL2融合蛋白诱导慢性粒细胞白血病分化的方法 本发明涉及一种利用IL6/IL2融合蛋白对慢性粒细胞白血病(CML)肿瘤细胞的诱导和分化作用，以达到治疗慢性粒细胞白血病的方法。涉及逆转录病毒载体LhIL6/IL2的构建，IL6/IL2融合蛋白对肿瘤细胞系增殖，分化调控作用的研究。
目前，在治疗慢性粒细胞白血病中，异基因骨髓移植是最有效的方法，其移植后无病存活率可达70％，复发率较低。但由于存在HLA配型困难，及移植物抗宿主病(GVHD)，老年慢粒患者的GVHD尤为严重，且在进行骨髓移植化疗预处理中耐药现象产生，故寻求一种有效治疗慢性粒细胞白血病的途径十分重要。本发明在构建的人重组IL6/IL2融合蛋白基础上，以IL6/IL2融合基因转染慢性粒细胞白血病以达到对慢性粒细胞白血病细胞增殖抑制及诱导分化作用，以达到治疗慢性粒细胞白血病。
本发明的目的是在国际上首次提出利用IL6/IL2融合蛋白诱导分化CML肿瘤细胞的方法，以达到对CML的治疗的目的。
本发明的目的是通过下述方法实现的：
一.IL6/IL2融合蛋白载体的构建
逆转录病毒载体LhIL6/IL2包含IL6/IL2融合基因和一个新霉新霉素抗性基因，经内切酶EcoRI和BamHI消化pfIL6/2质粒进行回收获得IL6/IL2。后将IL6信号肽结合在IL6/IL2基因上游获得SP-IL6/IL2全序，如图1所示：(其中1：LhIL6/IL2 2：LN6；3：LTR；4：EcoR I；5：BamHI；6：SP-IL6-Linker-IL2；7：SV40；8：Neo)
二.LhIL6/IL2转染建立PA317细胞系
将LhIL6/IL2转染GP+E86细胞通过穿梭方式到PA317细胞中。被转染的PA317细胞在含有20％FCS和1.2mg/mlG418的RPMI中培养，两周后收获单个集落。筛选出地细胞集落进行培养、扩增，以NIH3T3细胞检测PA317-L16/IL2病毒滴度。
三.检测IL6/IL2融合基因对慢性粒细胞白血病(CML)肿瘤细胞增殖抑制的作用情况
以包含LhIL6/IL2培养上清液转染肿瘤细胞，在IMDM中(含10％FCS和1.2mg/mlG培养2周、后筛选稳定转染的阳性细胞集落。
细胞生长分析：培养IL6/IL2融合基因、LN6基因转染慢性粒细胞白血病(CML)肿瘤细胞，计数经1～5天内培养的细胞数。转染LhIL6/IL2载体后的肿瘤细胞SCL和GATA-1基因表达明显降低，而与IL6加IL2培养的肿瘤细胞生长速度轻微降低。
细胞周期分析：以10％乙醇固定细胞，以PI染色，对照分析IL6/IL2融合基因、LN6基因转染慢性粒细胞白血病(CML)肿瘤细胞的G0/G1、S及G2/M期，以FACS仪分析。细胞表面抗原FACS检测结果显示，LhIL6/IL2转染的肿瘤细胞CD15水平较LN6转染的肿瘤细胞明显增高，CD14，CD33，CD34，CD41，CD71和glycophorin A表达未见明显改变。
细胞凋亡分析：培养IL6/IL2融合基因、LN6基因转染慢性粒细胞白血病(CML)肿瘤细胞，检测经1～5天内培养的细胞中凋亡细胞。转染LhIL6/IL2载体后的肿瘤细胞部分阻断在G0/G1期，如图2所示(其中1：INIL6；2：IL6/IL2；3：G0/G1；4：S；5：G2/M；)。经细胞培养后，LhIL6/IL2转染的肿瘤细胞生长明显较LN6转染的肿瘤细胞低，如图3所示[其中1:K562-LNL6；2:K562-IL6/IL2；3:细胞数(×106)]
四.检测IL6/IL2融合基因对慢性粒细胞白血病肿瘤细胞向髓/单核系分化诱导的作用情
况
用联苯胺检测IL6/IL2融合基因、LN6基因转染慢性粒细胞白血病肿瘤细胞血红蛋白阳性细胞，以计数细胞中与联苯胺反应阳性细胞数进行。联苯胺染色结果显示，LhIL6/IL2转染的肿瘤细胞联苯胺染色阳性细胞数与LN6转染的肿瘤细胞联苯胺染色阳性细胞数相似。RT-PCR检测γ_珠蛋白基因表达结果表明，LhIL6/IL2转染的肿瘤细胞和LN6转染的肿瘤细胞其表达水平均较低。
γ_珠蛋白基因表达分析：以RT-PCR检测IL6/IL2融合基因、LN6基因转染肿瘤细胞中γ_珠蛋白mRNA，以β-actinmRNA作检测内参照，进行半定量分析。SCL和GATA-1mRNART-PCR检测结果表明转染LhIL6/IL2载体后的肿瘤细胞上述基因表达明显降低。
GATA-1、SCLmRNA表达RT-PCR检测：以β-actinmRNA作检测内参照。分别检测IL6/IL2转染融合基因、LN6转染基因和加入IL6+IL2进行肿瘤培养后上述基因表达，进行半定量分析。SCL和GATA-1mRNART-PCR检测结果表明转染LhIL6/IL2载体后的肿瘤细胞上述基因表达明显降低。
c-myc基因表达蛋白产物分析：以WesternBlot方法进行，同时检测IL6/IL2融合基因、LN6基因转染肿瘤细胞。以Western-blot检测C-myc蛋白表达结果显示，LhIL6/IL2转染的肿瘤细胞C-myc蛋白表达水平降低，
相关细胞表面分化抗原分析：包括CD15，CD14，CD33，CD41，CD45 and CD71同时检测IL6/IL2融合基因、LN6基因转染肿瘤细胞，以FACS仪分析，细胞表面抗原FACS检测结果显示，LhIL6/IL2转染的肿瘤细胞CD15水平较LN6转染的肿瘤细胞明显增高，CD14，CD33，CD34，CD41，CD71和glycophorin A表达未见明显改变。五.IL6/IL2融合蛋白对慢性粒细胞白血病K562细胞系的诱导和分化作用及其应用的例作
细胞生长分析：培养IL6/IL2融合基因、LN6基因转染慢性粒细胞白血病(CML)肿瘤细胞，计数经1～5天内培养的细胞数。转染LhIL6/IL2载体后的K562细胞SCL和GATA-1基因表达明显降低，而与IL6(10ng-200ng)加IL2(25-50U)培养的K562细胞生长速度轻微降低。所使用PCR引物如表1所示。
表1GATA-1、SCLmRNA表达RT-PCR检测用引物及产物mRNA 引物 PCR产物(bp)GATA-1 5′primer 5′-CAGGTACTCAGTGCACCAAC-3′ 334
3′primer5′-TGGTAGAGATGGGCAGTACC-3′SCL 5′primer 5′-GTTCTTTGGGGAGCCGGATG-3′ 159
3′primer 5′-ACATTCTGCTGCCGCCATCG-3
γ_珠蛋白基因表达分析：以RT-PCR检测IL6/IL2融合基因、LN6基因转染肿瘤细胞中γ_珠蛋白mRNA，以β-actinmRNA作检测内参照，进行半定量分析。SCF和GATA-1mRNART-PCR检测结果表明转染LhIL6/IL2载体后的K562细胞上述基因表达明显降低。
用联苯胺检测IL6/IL2融合基因、LN6基因转染慢性粒细胞白血病肿瘤细胞血红蛋白阳性细胞，以计数细胞中与联苯胺反应阳性细胞数进行联苯胺染色结果显示，记数200个LhIL6/IL2转染的K562细胞，其中联苯胺染色阳性细胞数占5％，LN6转染的K562细胞联苯胺染色阳性细胞数与之相似。RT-PCR检测γ_珠蛋白基因表达结果表明LhIL6/IL2转染的K562细胞和LN6转染的K562细胞其表达水平均较低。
c-myc基因表达蛋白产物分析：以WesternBlot方法进行，同时检测IL6/IL2融合基因、LN6基因转染肿瘤细胞。以Western-blot检测C-myc蛋白表达结果显示，LhIL6/IL2转染的K562细胞C-myc蛋白表达水平降低。
相关细胞表面分化抗原分析：包括CD15，CD14，CD33，CD41，CD45 andCD71同时检测IL6/IL2融合基因、LN6基因转染肿瘤细胞，以FACS仪分析细胞表面抗原FACS检测结果显示，LhIL6/IL2转染的K562细胞CD15水平较LN6转染的K562细胞明显增高，CD14，CD33，CD34，CD41，CD71和glycophorin A表达未见明显改变。结果显示IL6/IL2融合蛋白抑制K562细胞向红系的分化，诱导K562细胞向髓/单核细胞系分化。
IL6/IL2融合蛋白能够增强IL6、IL2和它们受体亚单位间的结合而形成高亲和力结合位点，IL6/IL2能够改变IL6/IL2受体的代谢，且其空间结构较IL6和IL2更有利于加强信号传导，诱导gp130蛋白再通过激活STAT-3酪氨酸残基对细胞的生长抑制，细胞分化发挥作用。
本发明的优点：
1IL6/IL2是受体介导的信号传导并对细胞有调控作用的一种分子量为37Kda的重组细胞因子。
2IL6/IL2融合蛋白能够诱导慢性粒细胞白血病肿瘤细胞分化。
3IL6-IL2融合蛋白能够有效抑制慢性粒细胞白血病肿瘤细胞增殖的作用。