聚乳酸/甲壳素类多孔支架材料及其制备方法 本发明涉及生物降解类医用材料，更详细地是涉及聚乳酸/甲壳素及其衍生物共混、接枝共聚多孔支架材料及其制备方法。
生物可降解材料是组织工程支架材料中目前研究较多的一类材料，它具有良好生物相容性，而且在植入体内后，细胞在其表面粘附、增殖形成组织的过程中的同时，在体液、酶、细胞等的作用下发生降解，变成小分子物质被吸收或通过新陈代谢排出体外。现有生物降解材料有天然材料，如胶原、天然珊瑚、纤维蛋白、甲壳素及其衍生物，还包括高分子材料、陶瓷材料和复合材料等。应用较多的天然材料有甲壳素及其衍生物、胶原及其它蛋白质类物质，前者由于溶解性差加工困难，而后者的强度又难以达到理想要求。陶瓷材料中应用较多的是羟基磷灰石、磷酸三钙及其它生物医学多孔陶瓷材料，羟基磷灰石强度较好但降解性能较差，而磷酸三钙降解性能较好但力学性能又很差，特别是在张力方面表现出脆性，所以陶瓷材料作为生物降解材料使用还有较大的困难。具有生物降解和吸收性能的生物医用材料主要是高分子材料及其与其它材料形成的复合材料。生物降解高分子材料主要是脂肪族聚酯类如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、PLA/PGA共聚物等。但在临床过程中发现上述材料的降解速度过快，而且患者出现非特异性无菌性炎症反应率较高，目前认为出现无菌性炎症的原因可能与聚合物降解过程中酸性降解产物引起局部pH值下降有关。现有生物降解材料存在如下缺点：
1．生物降解材料的降解速率无法控制。
2．生物降解材料降解产物的毒副作用，尤其是聚乳酸类降解材料的降解产品的毒副作用更加明显。
3．有些天然材料虽然有较好的生物相容性，但降解性能很难适应实际需要，例如甲壳素最明显的缺点是加工困难且降解速率太慢以至。难以开发利用。
4．作为组织工程用支架材料，聚乳酸和甲壳素最大的缺点是降解产物的酸碱性会对细胞有一定的毒性，同时材料的降解速率与组织的形成速率难以匹配也是此两类材料地最明显的不足。
简而言之，到目前为止生物降解材料的最明显的缺点就是降解速率难以控制，降解产物的副作用难以消除。
一般而言，作为细胞外支架的理想生物降解材料，应具备下列条件：(1)良好的生物相容性；(2)良好的生物降解性，材料可最终被受植床组织完全替代；(3)易加工成型，并具一定的强度，移植后能保持原状；(4)材料表面易于细胞粘附且不影响其增殖分化(5)可与其它活性分子如骨形态发生蛋白(BMP)等复合，共同诱导骨的形成等。材料应能提供最大限度的空间和面积以利于容纳最大限度的细胞贴附，这就需要材料有高度的多孔率，应达到90％以上，同时又保证材料的强度。此外，植入体内的血管长入也与材料的孔径、多孔率相关。
本发明的目的在于提供一种聚乳酸/甲壳素多孔支架材料的制备方法，对聚乳酸进行改性，制备能够使细胞贴附生长，不引发炎症反应，而且材料的降解速率可调节且与组织的生长速率相匹配的支架材料。
本发明的目的还在于提供一种本发明方法制备的聚乳酸/甲壳素类多孔支架材料。
对聚乳酸(PLA)是一种具有优良生物相容性的生物降解聚合物，经FDA批准可用作医用手术缝合线和注射用微胶囊、微球及埋植剂等制剂的材料。PLA在体内代谢最终产物是CO2和H2O，中间产物乳酸也是体内正常糖代谢的产物，所以不会在重要器官聚集。当PLA植入体内以后，降解反应也同时进行，但在最初阶段降解反应进行比较缓慢，产生的酸性小分子可以被代谢而排出体外，随着时间的推移，降解反应逐步加速，产生的小分子来不及被代谢而积累，造成局部酸浓度过大，它们又会加速催化材料的降解，即发生自催化效应。
甲壳素(chitin)又名几丁质，是一种氨基多糖聚合物，是生物学上仅次于蛋白质骨胶的最重要的动物结构材料。它是许多甲壳类动物如虾、蟹以及昆虫等外壳的重要成分；壳聚糖(chitosan)是甲壳素最重要的衍生物，是甲壳素脱乙酰化的产物。甲壳素、壳聚糖及两者的衍生物也是应用比较广泛的生物材料，我们将其与聚乳酸共混、接枝共聚，既保留了两者良好的生物相容性、生物活性和力学性能，又改善了聚乳酸和甲壳素的加工性能。甲壳素类在体内是溶菌酶催化水解，与聚乳酸的本体水解机理不同，而且甲壳素具有较多的-OH和-NH基，从而存在强大的分子内和分子间氢键，这样在发生水解时可以抑制水的渗透和扩散，会降低聚乳酸的降解速率。同时，甲壳素的降解产物呈碱性，可以中和聚乳酸降解产物的酸性，从而消除了由于PH值引起的炎症反应，同时抑制了聚乳酸的自催化效应。甲壳素类尤其是羟乙基壳聚糖、羧甲基壳聚糖亲水性很强，更有利于细胞的粘附生长。
本发明的聚乳酸/甲壳素类多孔支架材料包括聚乳酸/甲壳素类熔融多孔支架材料、聚乳酸/甲壳素溶液多孔支架、聚乳酸/壳聚糖类接枝共聚多孔支架材料三种。
本发明的聚乳酸/甲壳素类熔融多孔支架材料的制备方法是：
1．将聚乳酸、甲壳素类按聚乳酸∶甲壳素类=10∶0.1~10∶4重量混合，加入其2倍重量的40~60目的致孔剂颗粒；
2．在4.00-8.65Pa真空条件下升高温度至熔融状态，搅拌混匀；
3．置于粗糙的聚四氟乙烯板上成型冷却；
4．投入蒸馏水中，浸出致孔剂，真空干燥，得产品。
所述熔融状态一般在155-165℃范围。
本发明所使用的甲壳素类包括：甲壳素、壳聚糖及其两者的衍生物。材料的形状可以制备成膜、片、块、棒、筒状及其它所需形状，材料的孔径和孔率可由致孔剂的粒度和用量控制。所使用的致孔剂包括：NaCl、聚氧乙烯(PEO)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PNVP)和聚丙烯酸(PA)等。
本发明的聚乳酸/甲壳素类溶液多孔支架材料的制备方法是：
1．将甲壳素类溶解在溶剂中；
2．将聚乳酸、甲壳素类按聚乳酸∶甲壳素类=10∶0.1~10∶4重量混合，加入其2倍重量的40-60目的致孔剂，搅拌混匀；
3．真空干燥除去溶剂至可塑程度后，倒入粗糙聚四氟乙烯板上成型：
4．真空干燥后投入蒸馏水中，浸出致孔剂，真空干燥得产品。
所用溶剂为六氟异丙醇、六氟丙酮、二氯乙酸、或1,2二氯乙酸/三氯乙酸(w/w6.5∶3.6)等。
本发明的聚乳酸/壳聚糖类接枝共聚多孔支架材料的制备方法是：
1．壳聚糖在NaOH溶液中进行钠壳质化后，与氯乙醇反应制备醚羟基化壳聚糖；
2．将醚羟基化壳聚糖与丙交酯按丙交酯∶壳聚糖=10∶0.1~10∶4重量比置于反应器内，在催化剂存在下，通入N2保护，加热沸腾；
3．反应结束后，用丙酮溶解产物，然后在蒸馏水中沉淀，过滤；
4．真空干燥一定程度后，加入其总重量2倍的40~60目致孔剂颗粒混匀，在粗糙的聚四氟乙烯板上成型。
5．真空干燥后投入蒸馏水中，浸出致孔剂，真空干燥的产品。
反应方程式：
三种方法制备过程中所使用的粗糙聚四氟乙烯板均可用普通硬质板材来代替，但表面要垫一层干洁滤纸，待成型后在蒸馏水中浸泡可将滤纸除去。
上述反应主要是聚乳酸与壳聚糖类的反应，在制备醚羟基化壳聚糖时发现，进行2次钠壳质化后，醚羟基取代的程度较高，而且随着反应时间的增长，产物的水溶性增大，2h时最大。醚羟基化壳聚糖与丙交酯聚合反应的催化剂有多种，例如对甲苯磺酸、AlCl3、稀土类化合物、锡类化合物等，但以辛酸亚锡为最佳。
本发明方法制备的聚乳酸/甲壳素类多孔支架材料呈白色，其强度与原材料的种类和性质有关，孔隙率90％以上，具有适宜的三维立体孔洞结构，孔洞大小可由适当的加工方法控制在100μ-300μ，孔洞内部相通，这样的微孔结构给种植细胞提供了较大的粘附面并有利于粘附的细胞与周围环境交换营养、气体和废物排泄，促进了成骨细胞的增殖和分化。聚乳酸分子量在1万-50万之间，聚乳酸与甲壳素类的重量比例为10∶0.5-10∶4。
试验结果表明比例相同的材料中，接枝共聚所得到的多孔支架材料的力学性能最佳，溶液共混法所制备的次之。但是熔融法操作最简单，可以作为非承重或抗压强度在100MPa左右的支架材料。
多孔支架材料中，随着甲壳素类比例的增大，降解速率减慢，重量比例为10∶4的材料降解速度最慢，降解产物的PH值接近生理盐水，且变化缓慢。降解过程中仍保持一定的强度，但10∶3比例的材料力学性能最好。孔径率在90％以上，孔洞大小在100μ以上最有利于细胞的生长。通过皮肤致敏试验、皮内刺激试验、热原试验及细胞培养试验表明，上述所以材料均对生物体表现出较佳的生物相容性相容性，可作为体内植入材料使用。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点：
1．采用聚乳酸/甲壳素类材料，制备工序简单，条件易于控制，聚乳酸/壳聚糖类接枝共聚材料，力学性能优良。
2．具有更好的生物相容性，亲水性强，有利于细胞的粘附、生长和繁殖。
3．降解速度缓慢，与组织的成长相协调，而且能够保持一定的力学强度。
4．降解产物呈中性，消除了传统材料存在的细菌性和无菌性反应。
下面通过实施实例对本发明作进一步的叙述。
实施例1
将3g甲壳素溶于六氟异丙醇后，加入10g聚乳酸(Mw:1.0×105)和20g40-60目NaCl，磁力搅拌12h，倒于干净、无菌、粗糙的聚四氟乙烯板，在通风橱中等溶剂挥发后成管状材料，真空干燥。投入蒸馏水中，搅拌，浸出NaCl。真空干燥得白色聚乳酸/甲壳素多孔管状材料，内外直径分别为10mm、12mm，长20mm，压缩强度为208.55MPa。孔隙率为90％。
实施例2
1g聚乳酸(Mw:3.0×105)、0.2g 300目羟乙基壳聚糖和2g 40-60目PEO颗粒置于真空密闭系统中，在150℃下强力搅拌30min后，置于干净、无菌、粗糙的四氟乙烯板成型，投入蒸馏水中，搅拌，浸出PEO。真空干燥得白色管状多孔材料，内外直径分别为10mm、12mm，长20mm，压缩强度为136.50MPa，表面接触角为50。孔隙率为91％。
实施例3
将1g聚乳酸(Mw:3.0×105)、0.3g 300目甲壳素和2g 40-60目NaCl颗粒置于真空密闭系统中，在150℃下强力搅拌30min后，置于干净、无菌、粗糙的四氟乙烯板成板型，投入蒸馏水中，搅拌，浸出NaCl。真空干燥得白色板型多孔支架材料，长宽厚分别为15mm、20mm、1.5mm弯曲强度为192.33Mpa，孔隙率为91％。
实施例4
将1g聚乳酸(Mw:2.0×105)、0.3g 300目甲壳素和2g 40-60目PEO颗粒颗粒置于真空密闭系统中，在150℃下强力搅拌30min后，置于干净、无菌、粗糙的四氟乙烯板制备板型材料，投入蒸馏水中，搅拌，浸出PEO。真空干燥得白色板型多孔支架材料，长宽厚分别为15mm、20mm、1.5mm弯曲强度为200.03MPa。孔隙率为90％。
实施例5
将1g聚乳酸(Mw:3.0×105)用二氯甲烷溶解至凝胶状，加入0.2g 300目羧甲基壳聚糖和2g 40-60目PEO，充分搅拌后，在通风橱中等溶剂挥发后制备棒状材料，真空干燥。投入蒸馏水中，搅拌，浸出PEO。真空干燥得白色板型多孔支架材料，直径为8mm，长度为15mm，弯曲强度为198.20MPa。孔隙率为92％。
实施例6
在三口烧瓶中分别投入10g壳聚糖，120ml异丙醇，40g50％NaOH溶液，在室温下减压(0.533KPa)反应0.5h，密封后过夜，进行钠壳质化，然后加热到70℃，在搅拌下滴加氯乙醇20ml，恒温反应2h，反应后倾去上层清夜，再加入20ml异丙醇，40g50％NaOH溶液，按上述条件重复反应一次得到羟乙基壳聚糖。将10g丙交酯和3g羟乙基壳聚糖投入干燥的反应瓶内，加入一定量的辛酸亚锡，通入N2，加热至沸腾。24h后将产物倒入丙酮中溶解，加水沉淀，过滤。加入15g 40-60目NaCl颗粒，强力搅拌混匀，置于粗糙的四氟乙烯板成型，真空干燥后，浸入蒸馏水中，浸出NaCl。真空干燥得白色板型多孔支架材料，直径为8mm，长度为15mm，弯曲强度为213.50MPa。孔隙率为92％。