玻璃微纤维柱及用其制备和纯化质粒DNA的方法 【技术领域】
本发明涉及玻璃微纤维(GF)柱和用其制备和纯化质粒DNA的方法。更具体的是，本发明涉及将硼硅酸盐或硅酸盐玻璃微纤维与盐酸胍联合物用作DNA结合材料，从而在短时间内制备和纯化大量高纯度DNA。
背景技术
质粒DNA是分子生物学中最基本的材料之一。因此，纯化的质粒DNA的制备是分子生物学研究中最常用的技术。本领域中已知许多质粒DNA的手工制备方法，而且现在已在许多实验室中被使用。然而，这些手工方法太耗时，且不可靠。另一方面，经费富裕的实验室购买DNA制备试剂盒，例如Qiagen,Germany和Promega,U.S.A.出售的那些。通常，这些产品利用了质粒DNA可结合硅胶的优点。
Volgelstein和Gillespie在他们的文章中公开了一种从琼脂糖凝胶中分离DNA的方法(1977)。根据该方法，DNA结合在燧石玻璃上，该玻璃形式为大燧石玻璃颗粒，中等燧石玻璃颗粒或燧石玻璃粉，而且DNA与燧石玻璃的结合可在NaI溶液中鉴定。基于该原理的产品已经投入市场，其品牌名称为玻璃牛奶(glassmilk)，使得从琼脂糖凝胶中分离DNA变得容易。至于DNA分离效果，发现燧石玻璃粉具有最有效的DNA结合能力，而中等燧石玻璃颗粒显示DNA结合能力显著下降。最差的是大燧石玻璃颗粒。换言之，随着燧石玻璃颗粒大小的增加，DNA分离效果降低。
另外，开发了其它材料，包括大硼硅酸盐玻璃颗粒，玻璃纤维滤膜和多孔玻璃珠，根据它们的结合能力可用来分离DNA。然而，这些材料也有它们自己的弱点。例如，大硼硅酸盐玻璃颗粒和大燧石玻璃一样，不能有效结合DNA。玻璃纤维滤膜的DNA结合很弱，因此以小体积制备得到的DNA太少，以致于不能使用。对于多孔玻璃珠，得到卓越的DNA结合力，但结合DNA耗时很长。当要从多孔玻璃珠回收DNA时，发生DNA降解。另外，回收率太低，因此其量不够作定量分析。
当然，硅胶在DNA结合上像燧石玻璃粉一样很有效。然而其在技术操作和DNA制品产量上有问题。无论如何，硅胶现在已用于DNA制备柱试剂盒并被一些公司(例如Qiagen和Promega)商品化。由于产物采用基于重力流动的过柱方式，因此其DNA制备需要很长时间。另外，使用的树脂浆要用额外纯化程序从DNA中除去。此外，采用现有地DNA制备试剂盒获得的DNA溶液不是完全无内切核酸酶的，因此可在长期储藏中发生自身降解。现有产品的另一个显著问题是它们不能保证没有蛋白杂质(例如内毒素)存在于制备的DNA中。如果在制备的DNA溶液中含有内毒素，当DNA载体转染入哺乳动物细胞时会引起细胞毒性，导致细胞死亡和细胞免疫应答。因此需要更纯的DNA制品用于动物转染。制备动物试验用DNA的商品化试剂非常昂贵。因此，对能用于制备高纯度质粒DNA以转染动物，但不昂贵的试剂有强烈需要。
DNA纯化的例子包括分离放射性标记探针，纯化PCR产物，以及从DNA制备物中除去RNA和蛋白杂质例如内切核酸酶和内毒素。另外，DNA纯化可应用于细胞增殖试验。例如，当将在含同位素的培养液中生长的细胞离心沉降加到DNA制备柱中时，未被细胞摄取的同位素通过柱；只有细胞摄取的同位素被柱捕获。因此，不用任何其它昂贵仪器就可定量测定细胞摄取的同位素。
本发明公开内容
记住上述背景，本发明者重复了对DNA制备和纯化的深入细致与广泛的研究，导致发现硼硅酸盐和盐酸胍联合物具有强DNA结合能力。本发明的基础在于硼硅酸盐的各种优点。硼硅酸盐在化学和物理学上是惰性的，在弱酸和弱碱中稳定。它的1.0微米颗粒显示了卓越的吸湿效力。另外，硼硅酸盐具有优良的除去杂质的能力，它即使在长时间内也不会被微生物污染，而且即使吸附容量小也能提供精确的分析结果。通过与硅胶的比较证实了本发明在DNA结合能力上的优越。已发现盐酸胍与硼硅酸盐混合物的DNA结合能力比硅胶高2-4倍。本发明通过使用硼硅酸盐与盐酸胍混合物作为一种DNA制备和纯化试剂盒的树脂而得以实现。
因此，本发明的一个目的是克服现有技术碰到的上述问题，并提供用于质粒DNA制备和纯化的柱试剂盒，用其可在短时间内简便的获得大量高纯度DNA材料。
本发明的另一个目的是提供制备这种用于质粒DNA制备和纯化的柱试剂盒的方法。
本发明的另一个目的是提供一种DNA制备和纯化方法，该方法可应用于从琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中纯化DNA，纯化放射性标记探针，制备PCR产物，纯化制备的质粒DNA，制备基因组DNA，制备RNA，以及对摄取入细胞内的同位素进行定量。
在本发明中，制造了用于微型、中型和大型质粒DNA制备试剂盒的硼硅酸盐玻璃微纤维多层柱，以及用于DNA制备的硼硅酸盐玻璃微纤维膜/颗粒双层柱。使用该试剂盒，制备了高纯度质粒DNA，并用于不同试验，包括将纯化的DNA转染和转导入细胞、35S dATP碱基测序和自动化碱基测序分析、制备的PCR产物的碱基测序分析以及表达纯化的DNA，从而证实了本发明DNA制备试剂盒的优越性。
附图简述
图1a是分解图，显示本发明的硼硅酸盐玻璃微纤维微型柱试剂盒；
图1b是横截面视图，显示图1a的柱试剂盒的已装配状态；
图2是柱状图，其中绘出了相对于硼硅酸盐玻璃微纤维膜厚度的质粒DNA制品产量。
图3a是分解图，显示本发明的硼硅酸盐玻璃微纤维大型柱试剂盒；
图3b是横截面视图，显示图3a的柱试剂盒的已装配状态；
图4a是分解图，显示玻璃微纤维膜/颗粒中型柱试剂盒；
图4b是横截面视图，显示图4a的柱试剂盒的已装配状态；
图5是柱状图，其中绘出了相对于中型柱试剂盒的玻璃微纤维膜/颗粒双层厚度的质粒DNA制品产量。
图6是柱状图，其中绘出了相对于硼硅酸盐和硅酸盐玻璃微纤维滤膜厚度的质粒DNA制品产量；
图7是通过本发明柱试剂盒制备的质粒DNA用限制性酶消化和在琼脂糖凝胶上电泳后拍摄的照片；
图8是通过本发明柱试剂盒制备的DNA的35S dATP测序自显影图；
图9a是显微照片，其中用常规柱试剂盒制备的、含β-半乳糖苷酶基因的质粒转染细胞通过染色鉴定到的β-半乳糖苷酶表达；
图9b是显微照片，其中用本发明柱试剂盒制备的，含β-半乳糖苷酶基因的质粒转染的细胞通过染色鉴定到的β-半乳糖苷酶表达；
图10是自动测序分析照片，从通过本发明柱试剂盒用T7引物制备的pGEM 7Z获得；
图11是自动测序分析照片，从通过本发明柱试剂盒用SP7引物制备的pGEM 7Z获得；
图12是用通过本发明柱试剂盒制备的质粒DNA作为模板，获得的PCR产物，在琼脂糖凝胶上电泳后的照片；
图13是质粒DNA用RNase处理但不用乙醇处理，并通过本发明柱试剂盒，随后电泳得到的照片；以及
图14是从琼脂糖凝胶上切下的DNA条带，通过本发明柱试剂盒纯化，并电泳后的照片。
实施本发明的最佳模式
在本发明中，根据制备能力提供了不同的DNA制备和纯化试剂盒。为此目的，制造了含有硼硅酸盐玻璃微纤维膜或玻璃微纤维膜与颗粒混合物的柱。例如，制造了用于DNA微型和大型制备的硼硅酸盐玻璃微纤维多层柱，以及用于DNA中型制备的硼硅酸盐玻璃微纤维基质柱。用这些柱试剂盒，可高产量制备高纯度质粒DNA。因为本发明的柱试剂盒在结合DNA上非常优秀，它们不仅能用于制备细菌质粒DNA，还能从不同污染物或基质材料中纯化DNA。例如，用常规方法获得的质粒DNA可进一步通过本发明的柱试剂盒纯化。另外，该柱试剂盒可应用于从琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶中纯化DNA。例如对于PCR产物，在它们在琼脂糖凝胶上电泳后，从凝胶上切下所需DNA条带，并通过本发明的柱试剂盒得到。当然，本发明柱试剂盒的纯化能力对聚丙烯酰胺凝胶中的DNA条带也是有效的。
通过本发明柱试剂盒获得的高质量DNA制备物在高级分子生物学研究中是十分有用的，包括基因克隆，转染入哺乳动物细胞和转导，碱基测序分析，PCR，放射性标记DNA探针定量，用放射性标记DNA进行细胞增殖生物试验等。
下列实施例是用来更清楚的对本领域技术人员阐明本发明的原理和实践。同样的，它们不意味限制了本发明，只是说明一些优选例。
实施例Ⅰ
GF柱的制造和质粒DNA的纯化
实验性实施例1：用于DNA微型制备试剂盒的GF多层膜柱的制造及其用途
如图1a所示，首先，将硼硅酸盐玻璃微纤维膜切成直径8毫米的圆，并堆叠在直径为13毫米、深31毫米的旋转微型柱11中，形成高2-10毫米的多层结构13。然后，将直径7.5毫米的环12插入该柱中，以固定多层GF结构，然后将该组合件蒸汽灭菌。为了使用，将制造的GF柱插入收集管10中。图1b显示了柱11在收集管10中的组装情况。
为了检测可获得最高纯度最大量DNA的玻璃微纤维多层膜的最适厚度，制备了不同柱，其多层膜各相差2毫米。使用这些柱制备质粒DNA，结果描述于图2。如该图中所见，当多层膜厚8毫米时，可得到最大量(200微克)。10毫米或厚于10毫米的膜厚度不能使DNA产量进一步提高。
实验性实施例2：用于DNA大型制备试剂盒的GF多层膜柱的制造及其用途
用与实验性实施例1相似方法制造了用于DNA大型制备试剂盒的玻璃微纤维多层膜柱。如图3a所示，在深86毫米，直径22毫米的大柱31中装入大约1克切成直径22毫米圆形的硼硅酸盐玻璃微纤维膜33，圆形膜用十字图案环32固定。为了使用，用50毫升锥形管作为收集管30。图3b显示大GF柱31在收集管30中的组装情况。
使用该大柱，可以从250毫升大肠杆菌培养液中获得大约1.2ml质粒DNA。
实验性实施例3：用于微型和中型试剂盒的GF膜/颗粒柱的制造及其用途
将硼硅酸盐玻璃微纤维与溶于pH7.5、10mM Tris/HCl的lmM EDTA溶液在混合器中混合得到玻璃微纤维颗粒悬液。如图4a所示，在高80毫米，直径15毫米的聚丙烯酰胺柱中，将直径8毫米的玻璃微纤维膜24堆叠至高2毫米，然后在其中装入玻璃微纤维颗粒悬液。该内容物用摇摆转子离心机离心沉降，以形成玻璃微纤维膜/颗粒双层柱，然后用直径8毫米的玻璃环固定，蒸汽灭菌。为了使用，将该柱连接一个Effendorf管21，然后置于收集管20中。图4b显示该柱的组装情况。
检测了相对于玻璃微纤维膜/颗粒双层柱深度的质粒DNA制品产量，结果在图5中给出。如所见，当深度为8毫米时，得到最大产量。
用裁纸刀将硼硅酸盐玻璃微纤维膜切成直径3毫米或更小的颗粒。将这些树脂以大约0.1g装入微型柱中，以0.42g装入中型柱，然后在柱上加上4.2M盐酸胍，离心沉降得到活性柱。微型柱能以大约100微克量制备质粒DNA，而中型柱可制备大约200微克的质粒DNA。在下文表1中，显示了当使用这些柱时获得的质粒DNA制品的产量和纯度。
表1质粒DNA纯度和制品产量 柱大肠杆菌JM109 培养液 OD260/OD280 产量GF基质微型柱 10毫升 1.7-1.9 约100微克GF基质中型柱 100毫升 1.7-1.9 约200微克
实验性实施例4：用硼硅酸盐GF柱和用硅酸盐GF柱制备的DNA制品产量
为了检测硼硅酸盐和硅酸盐吸附力的差异，将硼硅酸盐玻璃微纤维柱的DNA制品产量与硅酸盐玻璃微纤维柱的比较。如实验性实施例1中制造该柱，并用于从大肠杆菌培养液中制备质粒DNA。分析了获得的质粒DNA的产量和纯度，结果描述于图6。如图所见，硅酸盐玻璃微纤维的DNA制品产量比硼硅酸盐玻璃微纤维柱的低约20％。分光光度计测定用硅酸盐玻璃微纤维柱获得的质粒DNA纯度大约为1.5(OD260/OD280)，而用硼硅酸盐玻璃微纤维柱制备的质粒DNA纯度在1.7到1.8范围之间。
实验性实施例5：用硅胶柱和用硅胶/硅酸盐GF双层柱制备的DNA制品产量和纯度
如实验性实施例3中所示，在5根中型柱中每根都形成2毫米厚的硼硅酸盐玻璃微纤维膜/颗粒层，然后在其上形成6毫米厚的硅胶层。通过这些柱的帮助制备了质粒DNA，并如实验性实施例2分析了其纯度和产量。结果在下表2中给出，表明在硅胶上加入硼硅酸盐玻璃微纤维层，与单用硅胶比较，显著了提高DNA制品的产量和纯度。
在下列实施例中，使用的所有质粒DNA是通过硅酸盐玻璃微纤维柱制备的。表2质粒DNA的纯度和制品产量 柱大肠杆菌JMi09 培养液 OD260/OD280 产量 硅胶 10毫升 1.7-1.9 约100微克硅胶/硼硅酸盐GF 100毫升 1.7-1.9 约200微克
实施例Ⅱ
质粒DNA的制备
使用实施例Ⅰ制造的GF微型柱试剂盒、GF中型柱或GF大型柱试剂盒制备了质粒DNA。首先，在肉汤中培养带有某种质粒的大肠杆菌菌株，离心培养液，得到(粒状)沉淀。将该细胞沉淀用缓冲液A(50mM Tris,10mM EDTA pH8.0,100微克/ml RNaseA)悬浮，用缓冲液B(20mM NaOH,1.0％SDS(w/v))裂解，并用缓冲液C(3.2mM醋酸钾，pH5.0)中和。离心该中和裂解液，将上清液加到GF柱试剂盒上(该柱先前用盐酸胍活化)，使DNA结合到柱上。除去核酸酶后，洗涤并洗脱结合的DNA。为了除去核酸酶，使用了4.2M盐酸胍。作为洗涤液，使用了10mMTris/HCl(pH7.5),50mMNaCl,0.1mM EDTA,70％乙醇。
实施例Ⅲ
分子生物学试验和分析
实验性实施例1：用限制性酶消化
用限制性酶EcoRⅠ和HindⅢ处理实施例Ⅱ中制备的质粒DNA，并在琼脂糖凝胶上与完整质粒DNA一起电泳。如图7中所见，制备的质粒DNA清楚的已被内切核酸酶消化。
实验性实施例2:35S dATP测序分析
使实施例Ⅱ中制备的10微克质粒DNA与测序试剂盒(例如United StatesBiochemical出售的试剂盒，称为SequenaseTM2.0版)反应，使用35S dATP作为放射性标记，以及通过Qiagen试剂盒制备的10微克质粒DNA作为对照。通过放射性自显影从测序凝胶上读出测序结果。如在图8中所见，通过本发明的柱制备的质粒DNA的自显影条带已清楚的分开，而通过Qiagen试剂盒获得的条带未能有效的分开。
实验性实施例3：细胞转染和转导
将通过本发明的柱试剂盒制备的质粒DNA转染和转导入哺乳动物细胞，而通过Qiagen试剂盒制备的质粒DNA用作对照。如图9b所示，通过本发明柱试剂盒制备的质粒DNA如用染色蛋白质所鉴定的那样，在细胞中得到有效表达。相反，对照DNA显示微弱表达效率，如图9a所示。
实验性实施例4：自动碱基测序分析
使用ABI PRIMTM染料末端循环测序读取反应试剂盒(商业可得自PerkinElmer)进行了自动碱基测序分析。将通过本发明柱制备的0.4微克模板DNA和3pM引物，以及8微升末端读取反应混合物混合，并调整到总体积20微升。该溶液进行25轮反应，各轮包括在热循环仪(例如Bio Rad出售的，称作Gene CyclerTM)中的96℃/30分钟，50℃/15秒和60℃/4分钟。用乙醇沉淀延伸的DNA产物，在真空离心蒸发浓缩器中干燥，并在自动测序仪(例如Applied Biosystem出售的)中分析。用其中插入了长1.2kbDNA片段的质粒pGEM7z作模板。使用了T7或SP6引物。
实验性实施例5:PCR反应和PCR产物的纯化
使用通过实施例Ⅰ柱制备的CMV-TNF质粒DNA作为模板进行了PCR反应。将含有20纳克CMV-TNF质粒，2微升的1mM dNTP,5微升的10x反应缓冲液，2UTag聚合酶，和启动子近侧有义引物或启动子远侧有义引物联合TNF反义引物的反应混合物95℃预热2分钟，然后进行30轮反应，每轮包括95℃/1分钟，55℃/1分钟和72℃/1分钟，以及最后在72℃延伸反应10分钟。将反应产物分成两等分。一等分与等体积的4.2M盐酸胍混合，通过微量DNA纯化柱并用WA溶液洗涤。在琼脂糖凝胶上电泳该纯化的DNA，而另一等分作为对照。电泳结果显示于图12。如该图所见，在用微量DNA纯化柱纯化的PCR产物泳道中发现了所有的引物条带。
实验性实施例6:DNA纯化
从三个250毫升体积的培养液中，使用实施例Ⅰ制造的GF基质大型柱制备了质粒DNA。首先，对第一个培养物应用了用WA溶液的典型方法。用乙醇沉淀，不用WA溶液洗涤获得了第二个培养物的DNA，然后溶解在500微升去离子水中。对于最后一个培养物，如第二个培养物那样获得了DNA，等分成250微升的体积。在各等分中加入20微升RNaseA(3mg/ml)，37℃反应30分钟，65℃灭活10分钟，并通过微量柱。使如此获得的DNA产物在琼脂糖凝胶上电泳，如图13所示。数据在下面表3中给出。如表3数据所阐明的，当不用乙醇处理时，可获得大量的质粒DNA，但有RNA污染。另一方面，用RNaseA处理并过柱纯化获得的质粒DNA完全无RNA杂质，并显示DNA纯度(OD280/OD260)从1.72提高到1.90。因此，本发明能克服常规DNA制备方法的严重缺点，即，RNA污染和低DNA产量和纯度。表3 OD280/OD260 浓度 总DNA WA洗涤 1.44 7.60 760微克 未洗涤 1.68 10.80 1.08毫克未洗涤/柱纯化 1.90 11.75 1.175毫克
实验性实施例7：从琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶上分离DNA
DNA溶液在琼脂糖凝胶/TAE或TBE上电泳，而从胶上切下一条DNA条带，置于透析袋中，然后在其中装入TAE溶液，并进行电泳从凝胶上分离DNA。在TAE溶液中加入等体积的4.2M盐酸胍，并加到本发明的GF微量柱上。旋转柱并用WA溶液(10mM Tris/HCl pH7.5,30mM EDTA,70％乙醇)洗涤。然后用50微升去离子水旋转洗脱DNA。DNA通过在琼脂糖凝胶上电泳来鉴定并分析，如图14所示。
分析结果总结于下文表4。根据这些结果，本发明具有下列优点。第一，本发明的柱试剂盒使简便快速的制备质粒DNA成为可能。第二，本发明的柱试剂盒显示了极高的DNA制品产量。和常规旋转柱试剂盒比较，本发明GF微型柱试剂盒可得到量高约50到100倍(约200微克)的DNA。使用本发明的GF中型柱试剂盒，能获得多至400微克的DNA，而GF大型柱试剂盒得到2.2mg质粒DNA。第三，通过本发明柱试剂盒得到的质粒DNA的DNA纯度(OD260/OD280)用分光光度计测定范围为1.7到1.9。可有效制备质粒DNA的最大的质粒DNA产量的条件见下文表5。最后，核酸酶(其常出现在大肠杆菌的DNA制备物中)，以及碳水化合物(它是出现于JM109菌株的DNA制备物中的污染物)在用本发明柱试剂盒获得的DNA制备物中从未被发现过。表4用GF中型柱试剂盒制备的质粒DNA 试剂JM109培养液 质粒OD260/OD280最大产量 离液盐 200ml pGEM 7Z 1.7-1.8 50-100微克 盐酸胍 200ml pGEM 7Z 1.7-1.9 200-400微克表5用GF柱试剂盒制备的质粒DNA试剂盒*JM109培养液质粒OD260/OD280 GF树脂 产量小型10ml pGEM 7Z 1.7-1.8 0.1g 约70微克中型100ml pGEM 7Z 1.6-1.9 0.42g 约200微克大型250ml pGEM 7Z 1.7-1.9 1-1.34g 832μg-2.2mg
*GF微型柱和中型柱：基质类型；GF大型柱：多层类型
工业应用性
如本文上文所述，本发明的GF柱试剂盒对从细菌培养液中简便快速的制备大量质粒DNA是有用的。该质粒DNA纯度非常高，因此无需进一步纯化就可应用于各种高级实验，例如碱基测序分析、转染和转导、克隆等。另外，本发明的柱试剂盒可用于从琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中纯化DNA，而且其纯化能力还可应用于分离放射性标记探针，纯化PCR产物，从DNA制备物中除去RNA和蛋白质杂质(例如内切核酸酶和内毒素)，以及细胞增殖试验。因此，本发明在生物医药工业中非常有价值。
虽然本发明参照一些优选例已作了详细描述，但可以理解的是，在本发明的精神和范围内可进行不同的修改。本发明除权利要求的那些外不受限制。