CN200310100257.6
2003.10.15
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A61K35/78; A61K9/14; A61P7/04
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彭师奇; 赵明; 王超; 戚颍玫
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孙皓晨
本发明涉及以江南卷柏水浸膏为原料,经乙醇水溶液提取去除杂质的工艺,本发明还涉及30%、50%、70%及95%的乙醇水溶液提取的江南卷柏干粉作为止血药的应用,本发明进一步涉及30%、50%、70%及95%的乙醇水溶液提取的江南卷柏干粉的HPLC指纹图谱。
1、 卷柏醇提干粉的制备方法,包括以下步骤:A、以江南卷柏水浸膏为原料,在乙醇水溶液中回流提取(例如达1-5小时),滤去残渣,获得滤液;B、步骤A的残渣在乙醇水溶液中回流提取(例如达1-5小时),滤去残渣,获得滤液;C、将步骤A和B的滤液合并,减压浓缩去醇,干燥或冻干,获得江南卷柏醇提干粉。2、 根据权利要求1的制备方法,其中江南卷柏水浸膏是江南卷柏的水提物或醇提物。3、 根据权利要求1的制备方法,其中步骤A和B的乙醇水溶液的浓度例如是1-99%,优选10-95%,更优选10-40%,最优选约30%。4、 根据权利要求1的制备方法,其中江南卷柏水浸膏是江南卷柏叶用水煎煮一次、二次或多次后获得的滤液浓缩干燥后的产品。5、 根据权利要求1的制备方法,其中江南卷柏水浸膏是江南卷柏叶用醇溶液(例如1-95%的醇水溶液)煎煮一次、二次或多次后获得的滤液浓缩干燥后的产品。6、 根据权利要求1-5的任一项的制备方法获得的卷柏醇提干粉。7、 根据权利要求6的卷柏醇提干粉作为治疗各种内出血和外伤出血的止血药物的应用。
江南卷柏醇提干粉及其制备方法 技术领域 本发明涉及江南卷柏醇提干粉,及其制备方法和作为治疗各种内出血和外伤出血的止血药物的应用。 背景技术 各种形式的内出血和外伤性出血导致的失血可造成机体急性、慢性缺血或各种继发性疾病,严重时可危及生命。发展优秀止血药一直被关注。江南卷柏(Selaginella moellendorfii Hieron),又名地柏枝、摩来卷柏、鹿茸草,全草入药,是江南一带民间常用来治疗肝炎、各种内出血和外伤出血的止血药物。广州白云山制药总厂生产的江南卷柏片的主成分就是江南卷柏。江南卷柏片在临床被用于清热凉血,适用于治疗皮下散在紫癜、出血点,舌质红,脉细数等血热症候。江南卷柏片口服给药,一天3次,一次5-6片,是治疗原发性血小板减少性紫癜和其它各种出血性疾病理想的中成药。江南卷柏片能明显升高兔血小板数,在体内外均能促进家兔血小板的聚集功能,能明显降低CRBC致敏状态下小白鼠血清IgG的含量及特异性抗CRBC抗体(IgM溶血素)的含量。 与别的中成药一样,江南卷柏片也存在服药剂量大和病人负担重的弊病。改进工艺,除去江南卷柏片中无用的杂质一直是改进江南卷柏片生产和提高江南卷柏片疗效的关键。 发明内容 本发明的目的是提供一种高纯度的江南卷柏干粉的制备方法及所得高纯度的江南卷柏干粉。 本发明的高纯度的江南卷柏干粉的制备方法包括: A、以江南卷柏水浸膏为原料,在乙醇水溶液中回流提取(例如达1-5小时),滤去残渣,获得滤液; B、步骤A的残渣在乙醇水溶液中回流提取(例如达1-5小时),滤去残渣,获得滤液; C、将步骤A和B的滤液合并,减压浓缩去醇,干燥或冻干,获得江南卷柏醇提干粉。 其中江南卷柏水浸膏是江南卷柏的水提物或醇提物。 其中步骤A和B的乙醇水溶液的浓度例如是1-99%,优选10-95%,更优选10-40%,最优选约30%。 在一个实施方案中,江南卷柏水浸膏是江南卷柏叶用水煎煮一次、二次或多次后获得的滤液浓缩干燥后的产品。 在另一个实施方案中,江南卷柏水浸膏是江南卷柏叶用醇溶液(例如1-95%的醇水溶液)煎煮一次、二次或多次后获得的滤液浓缩干燥后的产品。 本发明还涉及由上述方法获得的产品。 本发明还涉及上述卷柏醇提干粉作为治疗各种内出血和外伤出血的止血药物的应用。 本发明人出乎意料地发现,用低浓度,例如10-40%,尤其30%的乙醇水溶液回流提取卷柏水浸膏,获得了疗效显著优于该卷柏水浸膏的卷柏醇提干粉。 在以下实施例中,本发明以江南卷柏水浸膏为原料,用不同浓度的乙醇水溶液平行提取。提取时,将50g江南卷柏水浸膏分别在600ml 30%、50%、70%及95%的乙醇水溶液中搅拌并回流1.5h,离心沉去残渣后,减压过滤。残渣再用600ml 30%、50%、70%及95%的乙醇水溶液平行重复提取分离一次,所得滤液减压浓缩除去醇,残留物加水溶解并冻干,得江南卷柏干粉。收率见表1。 表1.江南卷柏水浸膏醇提取收率水浸膏量(g)乙醇浓度(%)冻干粉重(g)收率(%) 50 30 30.0200 60.0 50 50 32.6252 65.2 50 70 25.0158 50.0 50 95 29.3496 58.7具体实施方式 为了解释本发明,下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的,它们仅用来对本发明进行具体描述,不应当理解为对本发明的限制。 实施例1.江南卷柏水浸膏的制备 500g江南卷柏干叶用清水洗净,加入2L清水煎煮30分钟。滤出煎煮液,滤渣加1.5L清水煎煮50分钟。滤出煎煮液。两次煎煮液合并,减压浓缩,残留物干燥,粉碎,得50g江南卷柏水浸膏干粉,收率10%。 实施例2.江南卷柏30%乙醇浸膏的制备 500g江南卷柏干叶用清水洗净,加入2 L30%的乙醇水溶液煎煮90分钟。滤出煎煮液,滤渣加1.5L30%的乙醇水溶液煎煮60分钟。滤出煎煮液。两次煎煮液合并,减压浓缩,残留物干燥,粉碎,得30g江南卷柏水浸膏干粉,收率6%。实施例3.30%的乙醇提取物的制备 50g江南卷柏水浸膏与200ml浓度为30%的乙醇水溶液混合,搅拌下回流2h。混合物在1000g下离心,减压过滤,滤出残渣。残渣再与200ml浓度为30%的乙醇水溶液混合,搅拌下回流2h。混合物在1000g下离心,减压过滤,除去残渣。滤液减压浓缩,残留物加水20ml水溶解,冷冻干燥,得30%的乙醇提取物。 实施例3.50%的乙醇提取物的制备 50g江南卷柏水浸膏与200ml浓度为50%的乙醇水溶液混合,搅拌下回流2h。混合物在1000g下离心,减压过滤,滤出残渣。残渣再与200ml浓度为50%的乙醇水溶液混合,搅拌下回流2h。混合物在1000g下离心,减压过滤,除去残渣。滤液减压浓缩,残留物加水20ml水溶解,冷冻干燥,得50%的乙醇提取物。 实施例4.70%的乙醇提取物的制备 50g江南卷柏水浸膏与200ml浓度为70%的乙醇水溶液混合,搅拌下回流2h。混合物在1000g下离心,减压过滤,滤出残渣。残渣再与200ml浓度为70%的乙醇水溶液混合,搅拌下回流2h。混合物在1000g下离心,减压过滤,除去残渣。滤液减压浓缩,残留物加水20ml水溶解,冷冻干燥,得70%的乙醇提取物。 实施例5.95%的乙醇提取物的制备 50g江南卷柏水浸膏与200ml浓度为95%的乙醇水溶液混合,搅拌下回流2h。混合物在1000g下离心,减压过滤,滤出残渣。残渣再与200ml浓度为95%的乙醇水溶液混合,搅拌下回流2h。混合物在1000g下离心,减压过滤,除去残渣。滤液减压浓缩,残留物加水20ml水溶解,冷冻干燥,得95%的乙醇提取物。 实施例6.小鼠出血时间测定 取体重为18-22g的ICR雄性小鼠92只(来自北京大学医学部实验动物部),随机分为5组,每天给药一次。最后一次给药1h后,将小鼠装入透气的瓶中,仅露出尾巴,然后以利剪将小尾尖3mm处横断,待血液自行溢出开始计时,每隔30s用滤纸吸去血滴一次,直至血液自行停止(滤纸吸时无血为止)。计算出血时间。 实施例7.指纹图谱测定 仪器和试剂 Waters600泵,Waters2996双波长紫外检测器,Millennium色谱工作站;甲醇(北京化工厂)为分析纯。 供试品溶液 江南卷柏水浸膏、50%、70%或95%的乙醇水溶液提取的江南卷柏干粉与蒸馏水配成溶液(1g/ml)。得到的溶液超声震荡30min后于1000g离心,滤去残渣,滤液经0.45μm微孔滤膜过滤后直接进样分析,记录色谱。 色谱条件 色谱柱为Kromasil KR100-5C18分析柱150mm×4.6mm;进样量为10μL;流动相为甲醇-水,按表2所示的二元梯度洗脱,流速1.0mL/min,检测波长215nm、280nm及300nm。 表2使用甲醇-水体系的流动相梯度 t/min (甲醇)/% (水)/% 0 20 80 10 40 60 50 100 0 75 100 0 77 20 80本发明对不同浓度地乙醇水溶液提取得到的江南卷柏干粉进行了止血作用评价。生理止血主要有血小板和某些血浆成分参与。血小板在生理止血过程中有重要作用。正常情况下,血小板有保护血管壁完整性的功能。血管创伤出血时,血小板在生理止血中的功能活动大致可以分为两段。创伤发生后的第一阶段,血小板迅速粘附于创伤处并聚集成团,形成较松软的止血栓子。创伤发生后的第二阶段,血小板促进血凝并形成坚实的止血栓子。此外,血小板对于血液凝固也有重要的促进作用。常用的止血药作用评价有凝血时间测定法,凝血因子活力或含量测定法,血管收缩作用的测定法,血小板粘附性测定法和血小板聚集性测定法。在比较了所有的评价模型之后,本发明评价了本发明的江南卷柏干粉对小鼠出血时间的影响。结果见表3。 表3.江南卷柏对小鼠尾出血时间的影响组别剂量(mg/kg·d)凝血时间(S)NS- 1385±206止血敏26.8 931±229江南卷柏水浸膏26.8 932±25430%乙醇提取物26.8 488±161a50%乙醇提取物26.8 944±20470%乙醇提取物26.8 944±35895%乙醇提取物26.8 856±138n=13;与NS组比较,a)P<0.01 接受本发明的江南卷柏干粉的小鼠尾出血时间均值与接受江南卷柏水浸膏的小鼠尾出血时间均值比较并进行t检验,结果仅有接受30%的乙醇提取的江南卷柏干粉的小鼠尾出血时间均值与接受止血敏及江南卷柏水浸膏的小鼠尾出血时间均值有显著性差异(P<0.01)。本发明观察了用30%的乙醇提取的江南卷柏干粉的量效关系,结果见表4。用30%的乙醇提取的江南卷柏干粉显示比较明确的量效关系。 表4.30%的乙醇提取的江南卷柏干粉对小鼠出血时间的影响组别剂量(mg/kg·d)凝血时间(s)NS- 1287±269低剂量组0.067 1266±126中剂量组0.134 725±311a高剂量组0.268 447±218bN=13,a)与NS组及低剂量组及比较,P<0.001;b)与低剂量组及比较,P<0.01。 本发明测定了江南卷柏水浸膏,30%、50%、70%及95%的乙醇水溶液提取的江南卷柏干粉的指纹图谱。本发明采用配有Waters600泵,Waters2996双波长紫外检测器和Millennium色谱工作站的HPLC系统,甲醇-水二元梯度洗脱溶剂,获得了表5-表7的指纹图谱。 表5.检测波长为215nm时指纹峰的保留时间及峰面积峰号 保留 时间 (min)峰面积江南卷柏水浸膏30%乙醇提取物50%乙醇提取物70%乙醇提取物 95%乙醇提 取物 1 1.490 58964 2 1.491 76423 3 1.570 10517 101438 4 1.588 80273* 5 1.674 78565 6 1.722 79934 109995 7 1.724 22666 45748 8 2.010 56119 68741 9 2.050 587076 494463 10 2.072 530903 11 2.215 246816 12 2.227 387016 13 2.248 276483 14 2.263 293464* 15 2.427 513997 16 2.468 37089 17 2.495 125367*峰4及14为30%乙醇提取物区别于江南卷柏水浸膏,50%、70%及95%的乙醇水溶液提取的江南卷柏干粉的色谱峰。峰4及14的峰面积分别占总峰面积的7.97%及29.16%。 表6.检测波长为280nm时指纹峰的保留时间及峰面积峰号保留时间 (min)峰面积江南卷柏水浸膏30%乙醇提取物50%乙醇提取物70%乙醇提取物95%乙醇提取物 1 1.524 13264 2 1.541 12411 3 1.591 17369 4 1.591 15617 5 1.613 13624* 6 1.670 23166 7 1.704 22039 8 1.724 31527* 9 1.73 42298 55907 10 1.82 17536 27008 26415 11 2.01 17750 20494 20176 12 2.02 25319 27345 13 2.199 106804 14 2.211 162800 15 2.234 105310 16 2.249 124770* 17 2.261 64507 18 2.934 15693 19 3.46 22225 32328 29116 24321 53567 20 4.04 22535 36026 33041 24942 32758 21 7.9 2465 9860 8949 11692 10735 22 11.7 1935 3454 4972 8203 9173 23 12.7 8181 17004 24 13.05 7852 10999 9047 25 13.23 9152 13631 26 13.78 2177 2390 2543 27 15.3 7258 4315 5923 4737 13064 28 27.4 1890 5375 6176 29 28.6 1508 4367 12632 30 30.441 10080 31 30.519 26081 32 30.569 81951**峰5、8、16及32为30%乙醇提取物区别于江南卷柏水浸膏,50%、70%及95%的乙醇水溶液提取的江南卷柏干粉的色谱峰。峰5、8、16及32的峰面积分别占总峰面积的3.42%、7.91%、31.29%及20.55%。 表7.检测波长为300nm时指纹峰的保留时间及峰面积峰号保留时间 (min)峰面积江南卷柏水浸膏30%乙醇提取物50%乙醇提取物70%乙醇提取物95%乙醇提取物 1 1.591 10374 2 1.597 10902 3 1.617 9624 4 1.684 16561 5 1.794 38822 6 1.805 26317 7 1.810 44903 8 1.873 42753* 9 1.875 20389 10 2.057 10797 11 2.120 13684 12 2.214 19098 13 2.228 21187 14 2.244 17011 15 2.265 24244* 16 2.266 8463 17 2.326 53335 18 2.342 39704 19 2.364 37496 20 2.370 46367* 21 2.512 19492 22 2.944 12900 23 3.4 22852 31970 27147 30789 71659 24 4.0 22640 31589 22794 20223 40172 25 6.4 2119 2377 2704 26 7.9 11302 15625 14417 6253 19714 27 8.007 2672 28 8.8 5318 4374 2363 5091 29 10.29 9980 5153 2664 30 11.6 5507 1899 2042 9292 13707 31 12.67 11629 23734 32 13.03 17112 15861 33 13.046 14730 34 13.202 9342 23086 35 13.7 2849 2977 36 13.847 3262 37 14.35 3507 2840 38 14.174 1559 39 14.231 4580 40 14.313 1390 41 14.977 725 42 15.065 2459 43 15.145 10800 44 15.285 6338 45 15.342 4814 46 15.362 6070 47 16.7 398 6740 5254 8644 48 16.903 3885 49 17.8 901 1809 1165 2240 50 18.6 3471 4841 3010 12204 51 18.851 4942 52 19.531 398 53 20.350 21257 54 20.657 8639 55 20.762 7472 56 20.813 22643 57 20.4 25851 31522 58 22.222 27765 59 22.3 22383 48481 60 22.486 22679 61 22.700 21520* 62 23.543 10276 63 23.736 6351 64 24.524 5103 65 24.869 5314 66 25.137 2199 67 26.350 1627 68 27.5 2384 2098 69 27.734 2929 70 28.5 11030 14975 71 28.845 4460 72 29.9 7644 9799 73 30.603 5964 74 31.455 1145 1494 2726 75 38.3 2668 1145 2154 76 53.72 1908 1294 2081 77 54.88 4444 3918 3758 78 55.74 2539 2731 3095峰8、15、20及61为30%乙醇提取的江南卷柏干粉区别于江南卷柏水浸膏,50%、70%及95%的乙醇水溶液提取的江南卷柏干粉的色谱峰。峰号8、15、20及61的峰面积分别占总峰面积的13.55%、7.68%、14.70%及6.82%。
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本发明涉及以江南卷柏水浸膏为原料,经乙醇水溶液提取去除杂质的工艺,本发明还涉及30、50、70及95的乙醇水溶液提取的江南卷柏干粉作为止血药的应用,本发明进一步涉及30、50、70及95的乙醇水溶液提取的江南卷柏干粉的HPLC指纹图谱。。
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