高活性纤维素酶组合物及其制备方法 技术领域
本实用新型涉及一种酶，尤其是利用遗传工程技术得到的纤维素酶组合物。
背景技术
纤维素酶已大量用于纺织、酿酒、饲料、中药提取和果汁生产等行业。Wood等在《酶学方法》(Methodsin Enzymology)，160,25,234页(1986)中公开了完整的真菌纤维素酶系统包括几个不同的酶种类，包括那些被鉴定为外切纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)(“CBH”)，内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)(“EG”)和β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)(“BG”)的酶。CBH、EG和BG真菌纤维素酶分类可进一步扩展到包括每种类型之中的多重成份，已从多种真菌资源中分离到CBH和EG。现有的生产纤维素酶的菌种多为绿色木霉菌，这些菌种通过化学与物理诱变然后筛选而得到，绿色木霉菌虽然能在大罐生产时分泌10-20克/升蛋白质，而且大部分为纤维素酶，但由于绿色木霉本身产的酶特异活性较低，一般在200,000国际单位/升(余晓斌，2000，ChinaEnzyme)。厌氧真菌是近二十年来从草食动物胃肠道分离出来的新型微生物菌种，大部分具有分泌植物细胞壁降解的酶活性，而且这些酶的特异活性特别高(Wood et al.1986)。单位重量的酶对纤维素降解的能力比绿色木霉产的酶高出许多倍(Gilbert et al.1992)，但厌氧真菌生长速度慢，不适合于工业化生产。一种有效的方法为将厌氧真菌编码纤维素酶的基因转入绿色木霉，这样既能分泌大量酶，而且这些酶的活性高，例如厌氧真菌Orpinomyces的Cellulase B(CelB)(Lietal，1997)的特异酶活性为220,000国际单位/克，比绿色木霉的酶的特异活性高出十倍以上。如何将高特异活性的厌氧真菌的CelB基因转入绿色木霉生产菌中，从而提高纤维酶素的产量，达到400,000-1200,000国际单位/升，而β-葡聚糖酶活性可达到1000,000-3000,000国际单位，是本领域需解决地技术难题。酶制剂的生产关键技术为大罐发酵液每升的活性单位，单位体积生产的活性水平直接制约生产成本，能耗及能否用于工农业的各种领域。
【发明内容】
本发明的目的为提高纤维素酶的活性产量，生产出一种活性高、能广泛应用于上述行业的产品。其原理是将编码高特异活性的纤维素酶Cellulase B基因用转基因方法植入现有生产菌珠HypocreaiecorinaMGG80，同时通过重组DNA技术，将生产菌珠在生产条件下受到诱导的启动子(Promoter)加入该基因位点，从而指导植入基因的高效表达，获得一种新的纤维素酶组合物。
本发明采用基因重组技术制造出一种高活性纤维素酶组合物，其特征在于：它是由下述重量百分比的纤维素酶构成：由木霉菌株产生的纤维素酶CBH I 30～40％、CBH II 10～25％、EG I 10～15％、EG II 6～10％、EG III 1～4％、EG IV 0.5～2％、EG V 0.5～1.0％，和厌氧真菌产生的纤维素酶CelB10～30％，其中，CelB基因为CBH I基因的启动子和终止信号(Terminater)，分泌信号(Secretion Signal)是CBHI编码的前28个氨基酸编码。
所述CBHI编码的前28个氨基酸详细编码为MYRKLAVISAFLATARAQSACTLQSETH。
高活性纤维素酶组合物的制备方法，是采用DNA重组技术，包括质粒的构建、里氏木霉菌的转化、高产菌株的筛选、菌种发酵表达，其特征在于：
(1)质粒的构建
里氏木霉的DNA用Easy-DNA试剂提取，用HindIII限制性内切酶作为部分水解，然后装入用同样酶水解后的PUC18质粒中，用T4连接酶(T4 ligase)连接里氏木霉(T·reesei)和PUC18的DNA片断，连接后的样品用来转化大肠杆菌(E·coli)，转化后的样品均匀地接种在含50微克/克的固体LB培养基上进行菌落筛选；通过筛选，十二个含CBHI基因的菌落被选出，它们所含的质粒DNA被分离出来，然后进行DNA序列测定；CBH I基因5′端1500个碱基对，和3′的1000个碱基对用聚合酶链反应〔Polymerase Chain Reactions(PCR)]进行放大，重新装入PUC18质粒中，5′端片断除含启动子部分外，还含有编码CBHI的前28个氨基酸的序列，而且5′端和3′接合处加入几种限制性内切酶位点，厌氧真菌的CelB基因也是通过PCR进行放大，只包括编码对羟甲基纤维素CMC有活性的中间部分氨基酸的区间，同时加入了限制性内切酶的位点，以便顺利嵌入CBH I基因5′和3′端的接合处；
(2)里氏木霉的转化
里氏木霉的转化采用Penttila的方法，在双层琼脂糖培养基上，获得大约120个转化菌落，对转化菌落进行了选择和非选择培养交替培养三次，再从每个初级转化菌落中任意分离两个单个菌落，接种于土豆琼脂培养基上，于28℃培养5天，记录每株菌种生长速度；
(3)高产菌株的筛选
在上述菌株中挑选生长速度快、形态与转化前接近的菌珠，在无菌条件下取出大约一平方厘米的菌丝体，用于接种50毫升的纤维素酶诱导液体培养基，培养瓶用棉塞封口，接种后于28℃的摇床培养5天，培养结束后，将菌丝体和残留纤维素用离心去掉，得上清液，取上清液测酶活性，对上清液活性比同样条件下未转化菌株高出1.5倍的菌株进行进一步分离培养；
(4)菌种发酵表达
通过上述基因工程所获得高产菌种，以微晶纤维素作为主要碳源和诱导底物，于28℃、PH4.6-4.8、溶氧20％以上条件三级发酵，即可得到高活性纤维素酶组合物的发酵液，其产量可达到300,000-500,000国际单位/升。
获得的高活性纤维素酶发酵液，经板框过滤，得澄明滤液，经0.4um微膜过滤后再经孔径为10000道尔顿超滤膜超滤浓缩3-8倍，得不同活性单位浓缩液后，按蔗糖20％、苯甲酸钠0.2％、山梨酸钾0.2％的比例，检测合格后按规格分装即可。
在同等条件下发酵，本发明的纤维素酶活性提高1-5倍，达到400,000-1200,000国际单位/升，产品价格较国外进口同类品种下降33％以上，且产品质量稳定，使用效果良好，通过此种方法获得的产品因其质优价廉，可广泛应用于纺织、酿酒、食品、饮料、医药、石油开采和饲料行业，产生巨大的经济、社会效益，提升这些行业的产业水平。
【附图说明】
图1是本发明的重组基因设计示意图。
1—CBHI的启动子(CBHI Promoter)
2—厌氧真菌的CelB基因(0rpinomyces CelB Gene)
3—CBHI的终止信号(CBHI Terminater)
4—质粒序列(Plasmid Sequence)
5—CBHI的分泌信号(CBHI Secretion Signal)
具体实施方式
实施例1：如图1所示，含有图1的质粒通过对里氏木霉的转化(Transformation)和筛选，获得带有图1所示遗传信息的菌株，然后用于生产所得产品中保留原生产菌株所产的和加入新来源基因所产的几种纤维素酶，重新组合的产品为复合酶，具体组份为：H.iecorina产生的CBHI36％、CBHII20％、EGI12％、EGII8％、EGIII2％、EGIV1％、EGV1％和厌氧真菌产生的CelB20％，各组分之间有协同促进作用，新加入的CelB基因中为CBHI基因的启动子和终止信号，分泌信号是CBHI编码的前28个氨基酸编码。
其制备方法，是采用DNA重组技术，包括质粒的构建、里氏木霉菌的转化、高产菌株的筛选、菌种发酵表达和产品提取等步骤。具体分别为：
(1)质粒的构建：里氏木霉QM9414的DNA用美国Invitrogen公司的Easy-DNA试剂提取，用HindIII限制性内切酶作为部分水解，然后装入用同样酶水解后的PUC18质粒中，用T4Ligase连接T·reesei和PUC18的DNA片断，连接后的样品用来转化大肠杆菌(E·coli)，转化后的样品均匀地接种在含50微克/克的固体LB培养基上进行菌落筛选；用于筛选的探针为T.reesei的DNA片断(Shoemaker et al.1983)。通过筛选，十二个含CBHI基因的菌落被选出，它们所含的质粒DNA被分离出来，然后进行DNA序列测定，总共测定了大约600个碱基对，而且正反链的序列都进行了测定；CBH I基因5′端1500个碱基对，和3′的1000个碱基对用Polymerase ChainReactions(PCR)进行放大，重新装入PUC18质粒中，5′端片断除含启动子部分外，还含有编码CBHI的前28个氨基酸的序列，而且5′端和3′接合处加入几种限制性内切酶位点。两种片断装入PUC18后，进行DNA测序，以排除在PCR放大时引入突变的可能。厌氧真菌的CelB基因也是通过PCR进行放大，只包括编码对CMC有活性的中间部分氨基酸的区间，同时加入了限制性内切酶的位点，以便顺利嵌入CBH I基因5′和3′端的接合处。嵌入CelB基因后的质粒也进行了测序。
(2)里氏木霉的转化：里氏木霉的转化采用Penttila等(1987)的方法。为了便于选择嵌合了PUC18片断的菌落，含有Aspergillusnidulans的乙酰胺酶(acetamidase)基因的PUC18作为一种co-transfomation的质粒(Penttila等，1987)。转化的方法请参照Penttila等(1987)。在双层琼脂糖培养基上，获得大约120个转化菌落，对转化菌落进行了选择和非选择培养交替培养三次，再从每个初级转化菌落中任意分离两个单个菌落，接种于土豆琼脂培养基上，于28℃培养5天，记录每株菌种生长速度；
(3)高产菌株的筛选：在上述菌株中挑选生长速度快、形态与转化前接近的菌珠，在无菌条件下取出大约一平方厘米的菌丝体，用于接种50毫升的纤维素酶诱导液体培养基，培养瓶为250毫升三角瓶，用棉塞封口，接种后于28℃的摇床培养5天，培养结束后，将菌丝体和残留纤维素用离心去掉(5000rpm，15min)，取上清液测酶活性(1％CMC，50℃，PH4.8)，对上清液活性比同样条件下未转化菌株高出1.5倍的菌株进行进一步分离培养；
(4)菌种发酵表达：通过上述基因工程所获得高产菌种，以微晶纤维素作为主要碳源和诱导底物，于28℃、PH4.6-4.8、溶氧20％以上条件三级发酵，即可得到高活性纤维素酶组合物的发酵液，其产量可达到300,000-500,000国际单位/升。
(5)产品提取：取上述发酵液，经板框过滤，得澄明滤液，经0.4um微膜过滤后再经孔径为10000道尔顿超滤膜超滤浓缩3-8倍，得不同活性单位浓缩液后，按蔗糖20％、苯甲酸钠0.2％、山梨酸钾0.2％的比例，检测合格后按规格分装即可。