通过聚合酶链式反应检测血吸虫病的方法和试剂盒本发明涉及通过聚合酶链式反应(PCR)在人样品中诊断血吸虫病的
方法和试剂盒。该方法以寄生虫DNA的检测为基础，在低感染强度的情况
中尤其有用，而寄生虫学大便检验(Kato-Katz)在这种情况中展示低
灵敏度。
发明背景
血吸虫病是由感染血吸虫属(Schistosoma)寄生虫引起的疾病，主
要的感染物种是孟氏血吸虫(Schistosoma mansoni)、日本血吸虫
(Schistosoma japonicum)、和埃及血吸虫(Schistosoma haematobiom)。
这种疾病的记录已经延续了4000年，而且仍然构成公共健康的重要问题，
在不发达国家中受影响的人数超过2亿。孟氏血吸虫流行于54个国家和南
美洲、加勒比海、非洲、和东地中海地区。
这些蠕虫(两性吸虫)通过尾蚴(幼虫期)穿透皮肤感染人类，尾
蚴是由不同物种的软体动物(中间宿主)排泄到水中的。迁移穿过皮肤
后，孟氏血吸虫的幼虫横贯肺到达肝门静脉系，然后在胃肠道静脉和血
管丛中生存，在那里成熟和交配，随后雌虫在静脉血管中每天产下大约
300枚卵。
宿主对进入组织的寄生虫卵的免疫反应在疾病传播中占有重要地
位。在有些情况中，它发展成急性临床形式，具有强烈的血毒症表现；
而在大多数受害者中，是使人虚弱的慢性疾病，有可能具有严重的且常
常是致命的并发症。
在用于控制感染的措施中，治疗被感染者、控制软体动物、改进生
活条件、和对危险人群的鉴定及早期治疗经证明是最持续，但是绝非完
全令人满意。70年代后，随着可大规模使用的药物的出现，特异性治疗
开始在控制该疾病的所有计划中起到至关紧要的作用。
诊断方法构成了控制地方流行病计划的原始手段。非常需要发展比
现有技术更有效的技术。
可以通过显微镜确认粪便或尿中寄生虫卵的存在来进行感染的诊
断，这取决于物种。Kato-Katz法(N.Katz、A.Chaves、J.Pellegrino，
1972，用于孟氏血吸虫定量大便厚涂片技术的简易装置，Rev.Inst.Med.
Trop. Paulo.14：337-340)这一技术提供了效率、成本、和操作
的最好条件；(WHO，1994，血吸虫病的控制，技术报告系列(Technical
Report Series)830，日内瓦，第86页)。然而，当大便中虫卵数量较
少(诸如低流行和低感染强度的条件)时，还有当必须监测治疗时，单
一粪便样品检验的灵敏度降低，从而必须检验较大数量的粪便。即时如
此，有些受害者可能没有得到诊断，也就不会接受治疗。
血清学诊断构成寄生虫学检验的另一方案，是除后者之外最为广泛
应用的方法。通过这种方法，通过诸如间接免疫荧光反应和ELISA(酶联
免疫吸收测定法)等技术检测由感染孟氏血吸虫产生的抗体。然而，这
种技术也有缺点，即不能区分现时感染(active infection)和过时感
染(past infection)。因此，在不存在现时感染时针对孟氏血吸虫抗
体的低特异性可以解释为与其它寄生虫的交叉反应性(R.Corr
a-Oliveira、L.M.S.Dusse、I.R.C.Viana、D.G.Colley、O.S.Carvalho、
G.Gazzinelli，1988，针对血吸虫抗原的人抗体应答，Am J Trop Med Hyg
38：348-355)、单性感染的存在、与其它尾蚴的接触、母体抗体的转
移、和先前成功治疗后抗体的持续存在。
孟氏血吸虫的另一种诊断方案是检测由寄生虫释放的抗原物质，从
而能够区分过时感染和现时感染，并消除抗体诊断的非特异性问题。然
而，寻找循环抗原存在其它缺点，诸如对轻微感染的低灵敏度、高成本、
难以操作、和对单克隆抗体生成的依赖(N.DE Jonge、A.L.T.Rabello、
F.W.Krijger、P.G.Kremsner、R.S.Rocha、N.Katz、和A.M.Deelder，
1991，血吸虫循环阳性和阴性抗原在来自巴西的血吸虫病患者血清中的
水平，Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg.85：756-759)。
随着聚合酶链式反应(PCR)的出现，有可能扩增致病生物体的DNA，
从而能够由最初的微小数量获得足以达到检测点的巨大数量。因此，PCR
已经作为有效的方法用于多种多样的感染诊断中。
EP 550 883描述了使用PCR检测粪便中是否存在原生动物G.lamblia
DNA的实验。该方法使用G.lamblia的18S RNA基因序列作为靶序列。此
外，申请人设计了与G.lamblia的核糖体18S RNA靶序列区充分互补的寡
核苷酸引物。
WO 94/04681涉及作为PCR引物用于检测编码隐孢子虫
(Cryptosporidium sp.)壁(wall)蛋白质的DNA序列以及由此作为试
剂盒用于诊断该属寄生虫的特异寡核苷酸的开发。除上述范例以外，还
可能引用WO 93/03167，它申请的是用于分离、储存、和切割DNA的过程，
能够以适当形式提供DNA用于经特定连续过程的扩增，诸如PCR。该方法
具体用于检测由具有多联体闭合环状动质DNA的微生物引起的寄生虫病，
诸如T.cruzi、利什曼原虫(Leishmania sp.)、P.falciparum、P.vivax、
和P.malariae。
在关于血吸虫的研究中，PCR已经被用于确定尾蚴的性别
(R.B.Gasser、G.Morahan、和G.F.Mitchell，1991，通过聚合酶链式反
应进行孟氏血吸虫幼虫期的性别辨识，分子和生化寄生虫学(Molecular
and Biochemical Parasitology)47：255-258)；用于克隆和测序特
异基因(P.Francis和Q.Bickl，1992，孟氏血吸虫21.7kDa疫苗-显性抗
原基因的克隆揭示了Elf手样基序，分子和生化寄生虫学(Mol.Bioch.
Parasitol.)50：215-224；D.Kiang、A.M.Karim、P.T.LoVerde，1996，
孟氏血吸虫p50(一种亲免素)编码基因的克隆，基因(Gene)170：137
-140)，这是为了确定血吸虫种品系的种群遗传变异性(E.Dias Neto、
C.P.Souza、D.Rollinson、N.Katz、和A.J.G.Simpson，1993，多态DNA
的随机扩增能够鉴定血吸虫属的品系和物种，分子和生化寄生虫学(Mol.
Bioch.Parasitol.)57(1)：83-88；A.J.Simpson、E.Dias Neto、
T.H.Vidigal、H.B.Pena、O.S.Carvalho、和S.D.Pena，1995，血吸虫的
DNA多态性及其蜗牛宿主，Mem.Inst.Oswaldo Cruz.90(2)：211-
213)；以及用于开发和应用产生表达序列标签(EST)的技术(E.Dias
Neto、R.Harrop、R.Correia-Oliveira、S.D.J.Pena、R.A.Wilson、和
A.J.G.Simpson，1996，血吸虫基因组计划：RNA任意引发的PCR能够加速
表达序列标签的生成，Mem.Inst.Oswaldo Cruz.91(5)：655-657；
E.Dias Neto、R.Harrop、R.Corr Oliveira、R.A.Wilson、S.D.J.Pena、
和A.J.G.Simpson，1997，由通过任意引发RT-PCR产生的cDNA构建的小型
文库：用于由纳克量的mRNA有效产生EST的标准化文库的候选方案，基因
(Gene)186：135-142)。最近，Hamburger等人(J.Hamburger、X.Yu-Xin、
R.M.Ramzy、J.Jourdane、和A.Ruppel，1998，聚合酶链式反应用于监测
水的孟氏血吸虫感染情况的开发和评价，Am.J.Trop.Med.Hyg.59
(3)468-473)开发了用于监测天然水的孟氏血吸虫感染情况的基于PCR
检验。
本发明中描述的引物是根据图1所示最初由Hamburger等人
(J.Hamburger、T.Turetski、I.Kapeller、和R.Deresiewicz，1991，
孟氏血吸虫基因组中由物种特异性探针识别的高度重复DNA短序列，分子
和生化寄生虫学(Mol.Bioch.Parasitol.)44：73-80)描述的孟氏
血吸虫序列设计的。在目视检查最初序列后进行引物设计，从而避免在
每种起始物内或在两种引物间存在互补区。为了促进对降解DNA分子的扩
增(粪便或体液中存在的游离DNA预计如此)，选择引物，以使扩增短序
列。同样，对本发明所有阶段严格标准化，以使对化学上复杂的生物学
样品(诸如粪便和血清)发挥令人满意的功能。
至今尚未涉及PCR作为人血吸虫病诊断方法的应用。
同样的，寻找快速且有效、在低感染强度的情况中尤其有效的血吸
虫属之种寄生虫检测方法显然尚未成功。因此，为了达到这一目的，采
用了使用与孟氏血吸虫基因组的特异且高度重复序列互补的引物进行
PCR的策略。
发明概述
本发明的目的是通过PCR检测生物学样品中的血吸虫属之种
(Schistosoma sp.)。
本发明的第一个实施方案涉及用于通过PCR扩增血吸虫种DNA序列来
诊断血吸虫的方法。本发明的方法表征为下列阶段：
(a)收集待测样品；
(b)由阶段(a)中获得的样品提取血吸虫属之种的DNA；
(c)使用由SEQ ID NO：1所示最初序列构建的特异引物扩增阶段(b)
中提取的血吸虫DNA的某一区域；
(d)通过电泳分离阶段(c)的扩增产物，随后使用适当染色方法进行
检测。
在第二个实施方案中，本发明致力于用于检测血吸虫的诊断试剂盒。
基本的试剂盒包含进行PCR技术的所有必需试剂，即用于PCR扩增的特异
引物、核苷酸、和适当缓冲液。试剂盒可以任选的包含数量足以用于扩
增的Taq聚合酶、作为反应阳性对照的标准DNA、制备扩增物用于电泳的
缓冲液、以及为使用者准备的方案和指导手册。
图的简述
图1：显示了孟氏血吸虫重复单元的DNA序列。粗体指示本发明所述
特异引物的位置。
图2：证明了PCR检测孟氏血吸虫DNA的灵敏度。
图3：显示了本发明PCR技术扩增血吸虫多种物种DNA的能力，包括在
世界上具有临床-流行病重要性的3个物种：孟氏血吸虫、日本血吸虫、
和埃及血吸虫。
图4：显示了本发明PCR的特异性。
图5：比较了本发明PCR与寄生虫学检验用于诊断人粪便中孟氏血吸
虫的灵敏度。
图6：显示了通过PCR对受感染患者粪便样品中孟氏血吸虫DNA的检测。
图7：显示了通过PCR对人血清样品中孟氏血吸虫DNA的检测。
发明详述
为了便于对本发明的理解，下文列出了本文中所用一些术语易于接
受的定义：
1.引物：单链合成寡核苷酸，常常成对用于与DNA片段互补链的杂
交。在PCR中，DNA聚合酶使用引物/DNA模板复合物内端作为合成起始点。
2.聚合酶链式反应(PCR)：包括若干循环的变性、与引物一起退
火、和用热稳定DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)延伸的技术，用于扩增DNA
靶序列。US 4 683 195和US 4 683 202描述了用于扩增核酸的PCR方法。
不恰当选择的引物可能产生多种非期望效果，诸如不能扩增、在多
个位点扩增、形成引物二聚体等等，使得扩增反应不提供信息。
本发明的目的是如下实现的：通过PCR扩增血吸虫属之种基因组的特
异区，然后通过电泳分离扩增产物，最后进行适当染色技术使得凝胶中
的DNA适当显影。适当的染色技术包括(但不限于)银染、放射性同位素、
和联合使用酶与底物，从而能够检测却无上述非期望效果。
本发明的方法可用于检测不具有寄生虫而含足够完整可经PCR扩增
的细胞或DNA的任何生物学样品中的血吸虫属DNA。有些样品，诸如粪便
和尿，需要进行某种处理，由此破裂寄生虫细胞中可能包裹DNA的膜或包
膜，将DNA释放到溶液中。其它样品，如受感染人群的血清，早已包含游
离分子，因而不需要这种处理。通常可以通过使用特殊化学物质(诸如
去污剂和离液盐)或者通过使用物理和机械方法(诸如诱导渗透压和超
声波处理)来破裂膜。破裂细胞膜后，必须将DNA与其它细胞分子分开，
这也可以通过物理化学方法来进行，诸如乙醇沉淀或使用硅基质。
一旦游离于溶液，即可以在PCR扩增后检测样品中的DNA。必须优选
采用标准技术纯化DNA，以除去可能抑制扩增反应的物质。
提取后，通过聚合酶链式反应选择性扩增DNA。通过PCR，血吸虫属
之种的基因组的特异序列选择性拷贝了数以百万次，从而能够检测寄生
虫DNA。反应是顺序过程，需要至少两种引物--与寄生虫DNA互补的DNA
短序列，它们通过酶延伸，呈现该DNA的忠实拷贝。加入大量的引物以及
其它必需试剂后，可获得数百万拷贝的寄生虫DNA。此处PCR所用引物是
根据SEQ ID NO：1和图1所示孟氏血吸虫基因组高度重复最初序列特别为
本发明设计的。必须理解，可以构建核苷酸序列与SEQ ID NO：2和SEQ ID
NO：3功能等同的其它引物。若相应的生物聚合物在用法或目的上起着相
同功能，而本身并不相同，则这些序列称为等同(物)。等同序列可以
是变异的结果，同样可以是序列中的任何修饰，无论是自发的还是诱导
的，无论是核苷酸的替换和/或删除和/或插入还是序列一端的延长和/或
缩短。基因工程技术可以产生非天然变异。
构建的引物对中的每一种引物优选与待扩增的血吸虫属之种基因组
特异序列侧翼的不同链序列实质性互补。因此，每对引物中的一种引物
与有义序列部分足够互补从而能与其发生杂交，而每对引物中的另一种
引物与反义的相同序列不同部分足够互补从而能与其发生杂交。尽管引
物序列没必要反映模板的准确序列，但3’端序列与准确序列越接近，则聚
合酶链式反应匹配阶段中的连接就越好。
可以通过本领域技术人员知道的任何适当方法制备引物，包括例如
克隆并消化适当序列和直接化学合成。
PCR的扩增产物是一种DNA片段或不同大小的一系列DNA片段，它们可
以通过电泳分离，随后通过适当染色技术将凝胶中的DNA适当显影。由于
PCR的高度特异性，可以根据特定大小区分扩增的寄生虫DNA与其它扩增
产物。如此，在大多数情况中，可以简单的通过目视分析扩增产物，即
根据是否存在大小符合寄生虫的片段来确定是否存在感染。在本发明中，
PCR被用于扩增并显现孟氏血吸虫中最初描述的特异DNA片段，以及扩增
其它血吸虫物种的特异区，由此得出结论，最初在孟氏血吸虫中查实并
在SEQ ID NO：1中描述的DNA重复和特异区与所有其它血吸虫物种是共有
的。
使用表1所示特别构建用于本发明的引物，或者能够扩增孟氏血吸虫
序列或其它血吸虫物种同源序列的功能等同序列，通过PCR进行血吸虫属
之种基因组特异区的扩增。
表1.用于扩增血吸虫属之种基因组高度重复区的PCR反应的引物
SEQ ID NO：
引物
2
5′-GATCTGAATCCGACCAACCG-3′
3
5′-ATATTAACGCCCACGCTCTC-3′
本发明的试剂盒包含能够检测由血吸虫属蠕虫引起的任何感染的所
有必需试剂。试剂盒包含表1所示针对血吸虫种基因组特异区的特异引物
或功能等同序列，此外，还提供常用于PCR技术的试剂和添加剂，如适当
的核苷酸，诸如dGTP(脱氧鸟苷三磷酸)、dATP(脱氧腺苷三磷酸)、
dCTP(脱氧胞苷三磷酸)、和dTTP(胸苷三磷酸)；适当的缓冲液，如
10-20mM Tris-HCl/50-60mM KCl/1.5-2.0mM MgCl2/pH8.0-8.5；优
选有Taq DNA聚合酶。还提供一定量的DNA作为反应阳性对照，以及包含
检验方案和预期结果示意图的指导手册。
实施例
本发明通过参考下列实施例详细描述。必须理解，本发明不限于这
些实施例，还包括发明功能范围内的变更和修改。
实施例1
破裂孟氏血吸虫卵
由先前感染了100枚孟氏血吸虫尾蚴的小鼠的肝脏提取虫卵，并在
0.9％盐溶液中保存于-20℃直至使用(Pellegrino和Siqueira，1956，
Rev.Bras.Malar.8：589)。为了破裂虫卵，将10μl含100,000枚虫
卵/ml的盐溶液与90μl蒸馏水混和，并将终溶液在机械混和仪中摇动5分
钟。将包含破裂虫卵的这一混和物直接用于提取DNA。
实施例2
通过修改后的Steiner法(J.J.Steiner、C.J.Polkemba、R.G.Fjellstrom、
和L.F.Elliott，1995，用于PCR和RAPD分析的快速单管基因组DNA提取方
法，核酸研究(Nucleic Acids Research)23(13)：2569-2570)提
取DNA
将100μl破裂虫卵溶液用200μl含10mM Tris-碱pH8.0/270mM EDTA
pH8.0/1％十二烷基硫酸钠(SDS)/1％聚乙烯聚聚吡咯烷酮(PVPP)
的缓冲液稀释。将此混和物于95℃温育20分钟，在温育的第一个10分钟
后快速手动摇动一次；然后于室温以8000xg离心10分钟。用乙醇沉淀表
面层中所含DNA，除去上清，并将沉淀于37℃温育15分钟以蒸发残余乙醇，
然后重悬于TE缓冲液(10mM Tris pH8.0/1mM EDTA pH8.0)。通过于260nm
读取的光密度对DNA量化，并保存于-20℃直至用于PCR。
实施例3
通过使用表1所示特异引物的聚合酶链式反应扩增
简而言之，将1μl提取的DNA在含PCR缓冲液(20mM Tris-HCl
pH8.0/50mM KCl/1.5mM MgCl2)、200μM dNTP(脱氧核苷酸)、0.5
μM每种引物、和0.75U Taq聚合酶，总体积10μl的反应管中进行扩
增。扩增反应包括将双链寄生虫DNA于95℃变性45秒钟和于63℃与引物
退火30秒钟。在35个连续循环中依次重复这两步。在第一个循环中，
变性步骤延长5分钟，以确保完全变性；而在最后一个循环时，添加一
步，于72℃温育2分钟，以结束剩余退火引物的延伸。
图2显示了由孟氏血吸虫DNA扩增获得的电泳图型，以及检测这种DNA
所能获得的最大灵敏度。M道是分子量标准；1-5道依次是20、10、5、
1、和0.5fg DNA。PCR反应能够检测少至1fg孟氏血吸虫DNA。图3显示
了用相同引物、在与用于孟氏血吸虫的相同PCR条件中，由其它5种血
吸虫扩增DNA后获得的电泳图型。M道：分子量标准；1道：孟氏血吸虫；
2道：埃及血吸虫；3道：日本血吸虫(来自菲律宾的品系)；4道：日
本血吸虫(来自日本的品系)；5道：羊血吸虫(S.matthei)；6道：
牛血吸虫(S.bovis)；7道：S.leipperi；8道：阴性对照。PCR反
应能够扩增检验的血吸虫所有物种的DNA。图4显示了同样是在用于孟
氏血吸虫的相同条件下扩增其它属蠕虫DNA的尝试。M道：分子量标准；
1道：阳性对照(孟氏血吸虫DNA)；2道，人蛔虫(Ascaris
lumbricoides)；3道：Ancilostoma duodenales；4道：猪带绦虫(Taenia
solium)；5道：Trichiuris trichiuria。当使用其它属蠕虫DNA时，
看不见扩增产物。因此，本发明所述PCR对于血吸虫属是特异的。
实施例4
检测患者粪便样品中的孟氏血吸虫DNA
在这些实验中，以实施例1所述方式破裂受感染粪便(天然或人工)
中包含的虫卵。然后通过实施例2所述用于由纯的孟氏血吸虫卵提取DNA
的相同技术由粪便提取DNA。
提取后，将1μl孟氏血吸虫DNA(稀释100倍)如实施例3所述用相同
引物、在相同条件下进行扩增。图5显示了人工感染了寄生虫卵的粪便中
孟氏血吸虫DNA的扩增产物。简而言之，将100mg患者粪便样品(每克含
216枚虫卵)与900mg阴性粪便混和，形成具有预定浓度(每克大约20枚
虫卵)的样品。将此过程再重复两次，产生每克含大约2和0.2枚虫卵的
粪便样品。然后通过Kato-Katz法对每种样品的一部分进行分析，并通
过本发明PCR对每种样品的一部分检测寄生虫DNA，由此比较两种方法的
灵敏度。M道：分子量标准；1道：阳性对照(0.1ng孟氏血吸虫卵DNA)；
2-5道：依次是每克粪便含200、48、4.8、和0.48枚虫卵的粪便样品的
扩增DNA。PCR能够检测少至每克含大约4.8枚虫卵的样品中的孟氏血吸虫
DNA；而Kato-Katz法的灵敏度是每克48枚虫卵，低10倍。
图6显示了先前通过Kato-Katz法测定具有多种浓度寄生虫的患者
粪便中孟氏血吸虫DNA的扩增结果。M道：分子量标准；1道：阳性对照；
2-9道：依次是每克含0.96、0.168、432、600、96.912、和72枚虫卵的
人粪便样品。PCR结果符合寄生虫学检验在所有样品中获得的结果。
实施例5
检测患者血清中的孟氏血吸虫
对于4份血清样品，每份样品取100μl，采用Glass-maxDNA分离
旋转柱系统(Life Technologies)，参照制造商的说明书，纯化DNA。
然后将2μl此DNA用于上述相同条件的PCR扩增。所用人血清先前通过
Kato-Katz法进行了检验，2份样品阳性，2份样品阴性。
图7显示了扩增结果。M道：分子量标准；1道：阳性对照；2-5道：
依次是每克粪便含0、96、0、和216枚虫卵的人的血清。
序列表
1)一般信息：
I.a)申请人：Fundac Oswaldo Cruz
I.b)地址：Av.Brasil，4365，Castelo Mourisco，
sala 05，Manguinhos-21045-900-
Rio de Janeiro-RJ
II)发明题目：“通过聚合酶链式反应检测血吸虫病的方法和试剂盒”
III)序列数目：3
IV)计算机可读形式：
IV.a)介质类型：磁盘-3.5英寸
IV.b)计算机：IBM兼容机
IV.c)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
2)序列的一般信息：
I.a)序列编号：SEQ ID NO：1
II)序列特征：
II.a)长度：120
II.b)类型：核酸
II.c)链型：双链
II.d)拓扑学：线性
III)基因组定位：
III.a)图谱定位no mapa：...
GATCTGAATC CGACCAACCG TTCTATGAAA ATCGTTGTAT
CTAGACTTAG GCTGGTTGGC AAGATACTTT TAGCAACATA
CTCCGAAACC ACTGGACGGA TTTTTATGAT GTTTGTTTTA
GAGGCTTTGG TGACCTGCCT AAAAATACTA CAAACAAAAT
GATTATTTGC GAGAGCGTGG GCGTTAATAT AAAACAAGAA
CTAATAAACG CTCTCGCACC CGCAATTATA TTTTGTTCTT
I.a)序列编号：SEQ ID NO：2
II)序列特征：
II.a)长度：20
II.b)类型：核酸
II.c)链型：单链
II.d)拓扑学：线性，正向
III)基因组定位：
III.a)图谱定位：...
GATCTGAATCCGACCAACCG
I.a)序列编号：SEQ ID NO：3
II)序列特征：
II.a)长度：20
II.b)类型：核酸
II.c)链型：单链
II.d)拓扑学：线性，反向
III)基因组定位：
III.a)图谱定位：...
ATATTAACGCCCACGCTCTC