基因的人工合成方法及SARS病毒保护性抗原氨基酸序列.pdf

提供一种建立在DNA分子的化学合成的技术和聚合酶链式扩增反应技术基础上的，可以获得所需要的任何一个基因序列的方法。不论该序列是天然存在或者是人工设计的序列；而且可以对天然序列进行随意修改、组合；甚至完全人工设计全序列。同时提供多种作为严重急性呼吸综合症(severe acute respiratory syndrome，SARS)病毒保护性抗原的特定氨基酸序列，及其在治疗或预防SARS疾病的药物中的应用。

1.  基因的人工合成方法，其特征是应用化学法人工合成基因分子的一条链的多个寡聚核苷酸片段，同时依次交错合成另一条链的寡聚核苷酸片段，第一次将除每条链的最靠近5’端的一个寡聚核苷酸片段以外，所有的寡聚核苷酸片段混合在一起进行PCR扩增、延长，第二次用第一次产物为模板，以保留的每条链的最靠近5’端的一个寡聚核苷酸片段为引物进行PCR扩增、延长，扩增、延长的产物就是需要的基因。

2.  根据权利要求1所述的基因人工合成方法，其特征是基因可以是天然存在的基因，也可以是人工设计的基因序列。

3.  根据权利要求1所述的基因合成方法，其特征是基因可以是一个完整的目的基因，也可以是一个完整的目的基因的多个部分相互重叠的片段，当获得这多个部分相互重叠的片段后，可再一次采用权利要求1所述方法，获得完整的目的基因。

4.  根据权利要求1所述的基因合成方法，其特征是5’端的最后一个序列片段可以包括为便于进行基因重组而加入的酶切位点、起始密码、终止密码碱基序列。

5.  SARS病毒保护性抗原，其特征是选择的蛋白质片段的氨基酸序列是：
氨基酸序列1：
Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser
1                 5                  10                  15
Gly Ile Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala
                 20                  25                  30
Gln Val Lys Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly
                 35                  40                  45
Gly Phe Ash Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr
                 50                  55                  60
Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val
                 65                  70
或氨基酸序列2：
Ile Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala
1                 5                  10
或氨基酸序列3：
Met Ala Asp Asn Gly Thr I1e Thr Val Glu Glu Leu Lys Gln Leu
1                 5                  10                  15
Leu Glu Gln Trp Asn Leu Val I1e Gly Phe Leu Phe Leu Ala Trp
                 20                  25                  30
Ile Met Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ser Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr
                 35                  40                  45

6.  根据权利要求5所述的SARS病毒保护性抗原，其特征是选择的蛋白质片段的氨基酸序列包括与它们实质上的同源的序列。

7.  根据权利要求5所述的SARS病毒保护性抗原，其特征是包括它们部分片段和重新组合的序列。

8.  根据权利要求5所述的SARS病毒保护性抗原，其特征是蛋白质片段的氨基酸序列对应的核酸序列，包括所有密码子简并的碱基序列。

9.  权利要求5所述的SARS病毒保护性抗原，其特征是蛋白质片段的氨基酸序列在制备治疗或预防SARS疾病的药物中的应用。

基因的人工合成方法及SARS病毒保护性抗原氨基酸序列
技术领域
本发明属于基因工程技术领域和免疫学领域，具体地说是基因的合成方法及SARS病毒保护性抗原氨基酸序列。
背景技术
目前基因工程是生物科学最前沿的领域之一，已经体现了巨大的应用价值。但是，目的基因的获得依然是一个重要的瓶颈，我们对一般构成蛋白质大小的基因还不能随心所欲的进行操作。只能从天然的生命体中寻求，进行一些微小的修改都是十分困难的。
冠状病毒的基因组是由3万个碱基组成的具有感染性的正链RNA，是已知的RNA病毒中最大的。基因组的前三分之二中有2个开放阅读框(ORF)1a和1b，编码两组负责转录和转译的蛋白质聚合体。ORF 1b的下游是一些编码结构和几种非结构蛋白的基因。
SARS病毒拥有4种关键的结构蛋白：膜(M)蛋白，小包膜(E)蛋白，突出(S)糖蛋白以及核壳体(N)蛋白。N蛋白将RNA基因组包裹成一个核壳体，其外部被含有S，M，E蛋白的脂膜所围绕。M、E蛋白对于病毒的包膜结构是必不可少的。S蛋白的三聚体组成了病毒脂膜的特殊突起，该突起可与宿主细胞受体连接并使感染细胞融合。
理想的保护性抗原应该能够产生针对SARS病毒表面结构蛋白的抗体，所以突出(S)糖蛋白和膜(M)蛋白是主要的抗原，尤其是S蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以获得所需要的任何一个基因序列(任意序列的DNA分子)的方法。不论该序列是天然存在或者是人工设计的序列。可以对天然序列进行随意修改、组合。甚至完全人工设计全序列。
本发明的另一目的是提供多种作为严重急性呼吸综合症(severe acute respiratorysyndrome，SARS)病毒保护性抗原的特定氨基酸序列。
本发明的进一步目的是提供多种特定的氨基酸序列在制备治疗或预防SARS疾病的药物中的应用。
本发明是建立在DNA分子的化学合成技术和聚合酶链式扩增反应(polymerase chainreaction，PCR)技术基础上的一种新的方法。目前DNA分子的化学合成可以方便地合成50个核苷酸长度以内的单链寡聚核苷酸片段(50核苷酸长度以上的长度得率低、成本高，150个核苷酸长度以上的分子几乎无法合成)，如图1显示，将长的双链DNA分子的一条链分割成多个数十个核苷酸长度的片段；另一条链也分割成多个数十个核苷酸长度的片段，但分割位点与第一条链错开，错开的位置尽可能达到最大值。每一条链的各个片段可以是相互连续的(不缺失任何一个核苷酸)，也可以是不连续的，但如果是不连续的，那么另一条链在此位置的片段必需补齐缺失得核苷酸序列。将这些片段均用化学方法合成，这样获得的一系列单链寡聚核苷酸片段，可以拼接出完整的或基本保持完整的DNA双链分子。
如图1所示，除每条链中最靠近5’端的一个单链寡聚核苷酸片段A1和Bx外，将其他的单链寡聚核苷酸片段全部混合在一起，不加入引物进行PCR扩增。这些单链寡聚核苷酸片段互为引物和模板，被扩增和延长，其中一部分可以构成全长序列(缺最靠近5’端的一段序列)。将反应混合物取出少许为模板，加入每条链中最靠近5’端的一个单链寡聚核苷酸片段A1和Bx为引物，再进行一次PCR反应；在第一次PCR反应混合物中，能够被扩增、延长的只有全长序列(缺最靠近5’端的一段序列)，从而得到真正地全长序列——目的基因。
在每条链中最靠近5’端的一个单链寡聚核苷酸片段A1和Bx上，可以加入进行基因重组所需要酶切位点、起始密码、终止密码等其他必要的碱基序列。这样获得的目的基因就可以直接插入载体中，导入到受体细胞中进行表达。
如果每个相邻片段之间不缺失核苷酸，也可以用DNA连接酶代替第一次PCR反应：除每条链中最靠近5’端的一个单链寡聚核苷酸片段A1和Bx外，将其他的单链寡聚核苷酸片段均用磷酸化酶对5’端磷酸化；然后混合在一起，在一定温度下复性(根据碱基配对的原则形成双链)，生成有多个缺口的双链DNA分子；在DNA连接酶作用下连接所有缺口形成完整的无缺口的双链DNA分子。将反应混合物取出少许为模板，加入最靠近5’端的两个序列片段A1和Bx为引物，进行PCR反应；得到全长序列——目的基因。
如果目的基因非常巨大，可以将其分割为多个部分，相邻的每个部分序列有一定长度的重叠。首先如前所述进行两次PCR反应，完成每个部分；然后将所有部分混合在一起，进行第三次PCR(无引物)，将反应混合物取出少许为模板，加入预先保留的最靠近目的基因5’端的两个单链寡聚核苷酸片段为引物，进行第四次PCR，即可获得非常完整目的基因，如图2所示。对于大多数基因如此进行两轮应该获得足够大的基因长度。必要时可以进行多轮。如此可以获得任意长度的基因。由于所有核苷酸序列是化学合成的，所有碱基序列可以由我们自由确定。所以合成的序列可以是已知的天然序列、可以是根据需要修改的已知天然序列、可以是多种已知序列组合、可以是完全由人工设计的序列。目的基因的获取就有了极大的自由度。
本发明适用于那些基因序列已知，但来源困难的目的基因。
本发明适用于那些基因序列已知，但在特定的生物中表达困难的目的基因，将异源的基因在特定的生物中进行表达是生物工程的主要工作，不同生物对碱基密码子的喜好是有很大的不同的，不同来源的基因天然序列可能不适应在特定的生物中环境，而导致表达异常。应有本发明可以合成符合天然基因序列所表示的蛋白质序列，同时又符合特定的生物对碱基密码子喜好的目的基因，提高表达的效率。
本发明适用于那些天然基因序列已知，需要进行结构与功能的研究和性状改造，需要对天然序列中某些氨基酸进行修改的情况、增加或减少部分氨基酸序列，对天然基因序列进行改造。
本发明适用于那些已知多个相关的天然基因序列，需要对其进行优化组合，获得更优秀的性状，或新的功能。
本发明还适用于根据猜想的结构与功能的关系，设计新的序列，表达这个蛋白质进行验证研究。
本发明还适用于根据已知的关于蛋白质结构与功能的关系设计新的蛋白质结构，实现新的功能。
目前根据基因组学的研究，我们已经知道某些物种的所有基因序列，但是，我们没有获得其中大多数的蛋白质，我们也不知道这些蛋白质的作用和意义，而真核生物的DNA中含有内涵子，不能直接用真核生物的DNA进行PCR获得目的基因，而且真核生物的密码子喜好与表达系统的喜好有差异，直接应用天然的基因可能会导致表达困难。应用本发明可以方便的合成已知基因，并适合于选择的表达系统，通过表达产物，进行性质和功能的研究。
本发明涉及确定的SARS病毒保护性抗原的氨基酸序列、与这个保护性抗原的氨基酸序列对应的核酸碱基序列，包括实质上同源的氨基酸序列、所有密码子简并的核酸碱基序列。
本发明包括应用上述的方法制备严重急性呼吸综合症(severe acute respiratorysyndrome，SARS)病毒的疫苗抗原的人工基因。
SARS病毒极度危险，直接操作SARS病毒获得基因风险非常大；目前SARS的基因全序列已经公布，同时该病毒的基因密码子不适合在大肠杆菌和酵母中表达。同时作为抗原，只需要其中的具有保护性抗原作用的一小部分，将免疫资源集中用于保护性抗体的产生，这种人工抗原优于天然抗原。所以使用该方法极为合适。
严重急性呼吸综合症(severe acute respiratory syndrome，SARS)是新发现的传染性疾病。根据世界卫生组织(WHO)指出，导致此病的主要病源是新变种的冠状病毒(Coronavirus)。该种冠状病毒被命名为SARS冠状病毒，其全基因组序列已很快被测定并公布。
除了需要应用本发明前面所说的方法外，确定SARS病毒中具有保护性作用的抗原部位和氨基酸序列也是本发明的一个关键所在。通过对已知其它种类冠状病毒的基因组比较，SARS病毒的刺突蛋白(spike protein，S蛋白)基因得到确认。S蛋白是冠状病毒表面重要的膜蛋白之一，也是病毒的主要表面抗原。对已知的冠状病毒的研究已经证明，S蛋白和冠状病毒侵入细胞的过程密切相关。在SARS病毒表面的另一个蛋白质是M蛋白(膜蛋白)。我们根据病毒学、基因组学、分子生物学、基因重组、蛋白质结构与功能、生物信息学、生物化学、免疫学、免疫化学研究成果和我们多年从事激素免疫调控的基因工程疫苗和合成肽疫苗研究经验，选择S蛋白和M蛋白中的特异性片段为SARS病毒的保护性抗原。我们选择的SARS病毒S蛋白中的特异性片段为S蛋白第736位氨基酸残基至808位氨基酸残基，即氨基酸序列1：
    Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser
    1                 5                 10                  15
    Gly Ile Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala
                    20                  25                  30
    Gln Val Lys Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly
                    35                  40                  45
    Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr
                    50                  55                  60
    Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val
                    65                  70
其中第752位氨基酸残基至765位氨基酸残基尤为重要，即氨基酸序列2：
    Ile Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala
    1               5                   10
我们选择的SARS病毒M蛋白中的特异性片段为M蛋白第1位氨基酸残基至第46位残基，即氨基酸序列3：
    Met Ala Asp Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Gln Leu
    1                 5                 10                  15
    Leu Glu Gln Trp Asn Leu Val Ile Gly Phe Leu Phe Leu Ala Trp
                    20                  25                  30
    Ile Met Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ser Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr
                    35                  40                  45
上述蛋白质片段中的氨基酸残基使用的是国际通用的氨基酸的三字母代号。
本专利中所述的“实质上的同源的序列”，是与上述片段中的氨基酸序列之间具有至少大约70％的同源性；优选的至少大约80％的同源性；更优选的至少大约90％的同源性。
相对应的人工合成DNA碱基(选择生物体嗜好的密码子)序列为：
大肠杆菌适用：
S蛋白片段(氨基酸序列1)对应的碱基序列
CTG CAG TAC GGT TCT TTC TGC ACC CAG CTG AAC CGT GCT CTG TCT GGT ATC GCT GCT GAA CAG
GAC CGT AAC ACC CGT GAA GTT TTC GCT CAG GTT AAA CAG ATG TAC AAA ACC CCG ACC CTG AAA
TAC TTC GGT GGT TTC AAC TTC TCT CAG ATC CTG CCG GAC CCG CTG AAA CCG ACC AAA CGT TCT
TTC ATC GAA GAC CTG CTG TTC AAC AAA GTT
氨基酸序列2对应的碱基序列
ATC GCT GCT GAA CAG GAC CGT AAC ACC CGT GAA GTT TTC GCT
M蛋白片段(氨基酸序列3)对应的碱基序列
ATG GCT GAC AAC GGT ACC ATC ACC GTT GAA GAA CTG AAA CAG CTG CTG GAA CAG TGG AAC CTG
GTT ATC GGT TTC CTG TTC CTG GCT TGG ATC ATG CTG CTG CAG TTC GCT TAC TCT AAC CGT AAC
CGT TTC CTG TAC
酵母菌适用：
S蛋白片段(氨基酸序列1)对应的碱基序列
TTG CAA TAC GGT TCC TTC TGT ACT CAA TTG AAC AGA GCT TTG TCC GGT ATC GCT GCT GAA CAA
GAC AGA AAC ACT AGA GAA GTT TTC GCT CAA GTT AAG CAA ATG TAC AAG ACT CCA ACT TTG AAG
TAC TTC GGT GGT TTC AAC TTC TCC CAA ATC TTG CCA GAC CCA TTG AAG CCA ACT AAG AGA TCC
TTC ATC GAA GAC TTG TTG TTC AAC AAG GTT
氨基酸序列2对应的碱基序列
ATC GCT GCT GAA CAA GAC AGA AAC ACT AGA GAA GTT TTC GCT
M蛋白片段(氨基酸序列3)对应的碱基序列
ATG GCT GAC AAC GGT ACT ATC ACT GTT GAA GAA TTG AAG CAA TTG TTG GAA CAA TGG AAC TTG
GTT ATC GGT TTC TTG TTC TTG GCT TGG ATC ATG TTG TTG CAA TTC GCT TAC TCC AAC AGA AAC
AGA TTC TTG TAC
氨基酸序列1、氨基酸序列2、氨基酸序列3包括所有实质上的同源序列，对应的碱基序列包括所有简并的序列。
根据抗原最优化结构的原则，我们重新设计几个片段(氨基酸残基使用国际通用的氨基酸的单字母代号表示)：
多肽链片段I：       LQYGSFCTQL NRALSGIAAE QDRNTREVFA QVKQMYKTPT LKYFGGFNFS
                    QILPDPLKPT KRSFIEDLLF NKV。即上述的“氨基酸序列1”。
多肽链片段I’：     IAAEQDRNTREVFA。即上述的“氨基酸序列2”。
多肽链片段II：      MADNGTITVEELKQLLEQWNLVIGFLFLAWIMLLQFAYSNRNR FLY。即上述
                    的“氨基酸序列3”。
多肽链片段II’：    MADNGTITVEELKQLLEQWNLVI。
多肽链片段I’-II’：MADNGTITVEELKQLLEQWNLVIIAAEQDRNTREVFA。
多肽链片段I’-II：  MADNGTITVEELKQLLEQWNLVIGFLFLAWIMLLQFAYSNRNR
                    FLYIAAEQDRNTREVFA
附图说明
图1是基因分割合成示意图。
图2是大基因的合成示意图。
具体实施方式
实施例1
选择pGEX质粒为载体，在大肠杆菌中表达选定的S蛋白中的特异性片段氨基酸序列1作为SARS病毒的保护性抗原，准备用于制备SARS病毒疫苗。
第一部分抗原表达
步骤1.选定的S蛋白中的特异性片段氨基酸序列1共73个氨基酸残基，考虑到大肠
杆菌的密码子喜好，加上酶切位点和终止密码后核酸序列为：

CAAGACAGAA ACACTAGAGA AGTTTTCGCT CAAGTTAAGC AAATGTACAA GACTCCAACT TTGAAGTACT
TCGGTGGTTT CAACTTCTCC CAAATCTTGC CAGACCCATT GAAGCCAACT AAGAGATCCT TCATCGAAGA

其中和是酶切位点和终止密码。
步骤2.将上述核酸序列分割成下列片段：
片断1 GAATTC    CTGCAGTACG GTTCTTTCTG CACCCAGCTG
片断2 GTTCTTTCTG CACCCAGCTG AACCGTGCTC TGTCTGGTAT CGCTGCTGAA CAGGACCGTA
片断3 ACACCCGTGA AGTTTTCGCT CAGGTTAAAC AGATGTACAA AACCC
片断4 CGACCCTGAA ATACTTCGGT GGTTTCAACT TCTCTCAGAT CCTGC
片断5 CGGACCCGCT GAAACCGACC AAACGTTCTT TCATCGAAGA
步骤3.将上述核酸序列的互补链分割成下列片段
片断6  AGCGAAAACT TCACGGGTGT TACGGTCCTG TTCAGCAGCG AT
片断7  AAACCACCGA AGTATTTCAG GGTCGGGGTT TTGTACATCT GTTTAACCTG
片断8  GGTCGGTTTC AGCGGGTCCG GCAGGATCTG AGAGAAGTTG
片断9  AACTTTGTTG AACAGCAGGT CTTCGATGAA AGAACGTTT
片断10 GCGGCCGC TCA TCA AACTTTGTT GAACAGCAGG
步骤4.将片段2-9混合在一起，进行PCR反应。
步骤5.将步骤4的反应产物少许为模板，片段1和片段10为引物，进行PCR反应。
步骤6.测定步骤5产物的序列，显示与设计序列相同。
步骤7.导入感受细胞中，表达重组蛋白。
步骤8.纯化表达产物
第二部分重组蛋白的抗原性分析
步骤1.重组蛋白对康复血清的抗原性。
用酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)检测表达产物与SARS病人康复血清的抗原抗体反应，发现1mg/ml蛋白质浓度的重组蛋白工程菌裂解液，稀释819200倍以后，与SARS病人康复血清的ELISA光密度值依然可以达到0.380；与此同时健康人血清对照光密度值＝0.034，2mg/ml蛋白质浓度的空载菌裂解液稀释200倍光密度值＝0.077。表明康复血清对S蛋白中的特异性的73个氨基酸残基片段有强烈的免疫反应。
步骤2.抗重组蛋白抗体制备
1mg/ml蛋白质浓度的重组蛋白工程菌裂解液加弗氏佐剂皮内注射，免疫新西兰兔；20日后耳缘静脉采血，ELISA法检测血清分别对重组蛋白工程菌裂解液、纯化的S蛋白中的特异性的73个氨基酸残基片段的抗原性；以及用空载菌裂解液中和血清后，检测血清对重组蛋白工程菌裂解液。结果为对10μg/ml蛋白质浓度的重组蛋白工程菌裂解液，血清效价为10000倍；对空载菌裂解液中和血清后10μg/ml蛋白质浓度的重组蛋白工程菌裂解液，血清效价为1000倍。表明重组蛋白有良好的抗原性，能够产生这个针对S蛋白中的特异性的73个氨基酸残基片段的抗体。
实施例2
选择pGEX质粒为载体，在大肠杆菌中表达选定的多肽链片段I’-II：MADNGTITVEELKQLLEQWNLVIGFLFLAWIMLLQFAYSNRNR FLYIAAEQDRNTREVFA，准备用于制备SARS病毒疫苗。
第一部分抗原表达
步骤1.选定的多肽链片段I’-II共43氨基酸残基，考虑到大肠杆菌的密码子喜好，加上酶切位点和终止密码后核酸序列为：

ATC GGT TTC CTG TTC CTG GCT TGG ATC ATG CTG CTG CAG TTC GCT TAC TCT AAC CGT AAC CGT TTC CTG TAC

其中和是酶切位点和终止密码。
步骤2.将上述核酸序列分割成下列片段：
片断11 GAATTC     GCTGACAACG GTACCATCAC
片断12 GCTGACAACG GTACCATCAC CGTTGAAGAA CTGAAACAGC
片断13 TGCTGGAACA GTGGAACCTG GTTATCGGTT TCCTGTTCCT GG
片断14 CTTGGATCAT GCTGCTGCAG TTCGCTTACT CTAACCGT
片断15 AACCGTTTCC TGTACATCGC TGCTGAACAG GACCG
步骤3.将上述核酸序列的互补链分割成下列片段
片断16 GATAACCAGG TTCCACTGTT CCAGCAGCTG TTTCAGTTCT TCAACG
片断17 CTGCAGCAGC ATGATCCAAG CCAGGAACAG GAAACC
片断18 GTACAGGAAA CGGTTACGGT TAGAGTAAGC GAA
片断19 AGCGAAAACT TCACGGGTGT TACGGTCCTG TTCAGCAGCG AT
片断20 GCGGCCGC TCA TCA AGCGAAAACT TCACGGGTGT
步骤4.将片段12-19混合在一起，进行PCR反应。
步骤5.将步骤4的反应产物少许为模板，片段11和片段20为引物，进行PCR反应。
步骤6.测定步骤5产物的序列，显示与设计序列相同。
步骤7.导入感受细胞中，表达重组蛋白。
步骤8.纯化表达产物
第二部分重组蛋白的抗原性分析
步骤3.重组蛋白对康复血清的抗原性。
用酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)检测表达产物与SARS病人康复血清的抗原抗体反应，发现1mg/ml蛋白质浓度的重组蛋白工程菌裂解液，稀释10000倍以后，与SARS病人康复血清的ELISA光密度值依然可以达到0.135；与此同时健康人血清对照光密度值＝0.033，2mg/ml蛋白质浓度的空载菌裂解液稀释200倍光密度值＝0.077。表明康复血清对多肽链片段I’-II有免疫反应。
步骤4.抗重组蛋白抗体制备
1mg/ml蛋白质浓度的重组蛋白工程菌裂解液加弗氏佐剂皮内注射，免疫新西兰兔；20日后耳缘静脉采血，ELISA法检测血清分别对重组蛋白工程菌裂解液、纯化的多肽链片段I’-II的抗原性；以及用空载菌裂解液中和血清后，检测血清对重组蛋白工程菌裂解液。结果为对10μg/ml蛋白质浓度的重组蛋白工程菌裂解液，血清效价为1000倍；对空载菌裂解液中和血清后10μg/ml蛋白质浓度的重组蛋白工程菌裂解液，血清效价为100倍。表明重组蛋白有良好的抗原性，能够产生这个针对多肽链片段I’-II的抗体。
序列表
<110>张益民成都瑞盛高科技有限责任公司
<120>基因的人工合成方法及SARS病毒保护性抗原氨基酸序列
<160>3
<210>1
<211>73
<212>PRT
<213>SARS coronavirus
<400>1
Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser
1                5                  10                  15
Gly Ile Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala
                20                  25                  30
Gln Val Lys Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly
                35                  40                  45
Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr
                50                  55                  60
Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe AsnLys Val
                65                  70
<210>2
<211>14
<212>PRT
<213>SARS coronavirus
<400>2
Ile Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala
1                 5                  10
<210>3
<211>46
<212>PRT
<213>SARS coronavirus
<400>3
Met Ala Asp Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Gln Leu
1                 5                 10                  15
Leu Glu Gln Trp Asn Leu Val Ile Gly Phe Leu Phe Leu Ala Trp
                20                  25                  30
Ile Met Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ser Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr
                35                  40                  45