以酰胺键连接的聚乙二醇-干扰素及其制法和用途 【发明领域】
本发明涉及用聚乙二醇(简称PEG)对干扰素进行化学修饰的PEG-干扰素复合物及其制法。
背景技术
各种天然和重组蛋白质具有治疗作用，一旦将他们纯化、分离并制备成药物，就可以将它们经非肠道途径进行给药，而用于不同的医疗适应症。然而，非肠道途径给药的蛋白质具有免疫原性，且血浆半衰期较短，因此，难以使药用蛋白质在患者体内保持有治疗作用的血药浓度。
通过将蛋白质与高分子聚合物结合成复合物，可以有效的克服这些难题。现已公认，聚乙二醇是对人体安全的高分子聚合物。Davis等在美国专利4,179,337中公开了将聚乙二醇(PEG)与蛋白质诸如酶和胰岛素结合以获得具有生理活性的复合物的技术方案。Veronese等(《实用生物化学和生物技术(AppliedBiochem and Biotech)》11：141-152，1985)公开了用氯甲酸苯酯使聚乙二醇活化以修饰核糖核酸酶和超氧化物歧化酶的技术方案。Katre等在美国专利4,766,106和4,917,888中还公开了通过聚合物结合重组蛋白质使蛋白质增溶的技术方案。同样，可以将PEG和其他聚合物与重组蛋白质结合以便降低免疫原性并延长半衰期(参见：Nitecki等，美国专利4,902,502，；Enzon，国际专利申请PCT/US 990/02133；Nishimur等，欧洲专利申请154,316和Tomasi，国际专利申请PCT/US85/02572)。众所周知，α干扰素可有效的治疗急性和慢性乙型肝炎，卡波西肉瘤，黑色素瘤等疾病，提高α干扰素的血浆半衰期可以提高对这些疾病的治疗作用。
以往公开的PEG-干扰素复合物存在几个问题，其一是PEG地结合使干扰素的生物活性降低，在使用中必须提高干扰素的剂量。另外，在形成PEG-干扰素复合物时所用的某些连接键可能在体内水解断裂，使复合物失去了由PEG带来的优点。据文献报道，PEG修饰的干扰素在小鼠体内的清除半衰期为2-3小时。
【发明内容】
本发明的PEG-干扰素是以酰胺键与PEG分子连接的干扰素。干扰素α家族包括天然的干扰素α1b、干扰素α2a和干扰素α2b以及集成干扰素。集成干扰素是通过测定天然干扰素分子的共有序列而确定的重组干扰素分子，又称复合干扰素(consensus IFN或IFN-con)。集成干扰素的突变体包括：第6位氨基酸突变为谷氨酸；第11为氨基酸突变为天冬氨酸；第162位氨基酸突变为丝氨酸；第165位氨基酸突变为丝氨酸以及上述4个突变位点的组合突变情况。
由于PEG是以带有链长分布的混合物的形式制备的，因此，通常不能得到有精确和单一分子量的聚合物，对其分子量的描述一般是指其平均分子量。这种聚合物的制备方法在本研究领域内是众所周知的。
本发明的技术方案如下：
一种以酰胺键连接的聚乙二醇-干扰素，它是分子量为5000-30000的聚乙二醇以酰胺键修饰的干扰素，具有如下结构式：
式中，mPEG为聚乙二醇链，interferon为干扰素。
上述的聚乙二醇—干扰素中，干扰素可以是干扰素α1b、干扰素α2a、干扰素α2b或集成干扰素。
上述的聚乙二醇—干扰素的制法由下列步骤组成：
步骤1.将干扰素以5mM pH3.0～5.0的醋酸钠缓冲液溶解，配制成浓度为1～10mg/ml的溶液，
步骤2.按干扰素：PEG为1∶0.5～10的物质的量之比加入mPEG-SBA，以氢氧化钠溶液调节pH到7.0～9.0，在0～25℃条件下反应0.5～4小时，mPEG-SBA有如下结构：
式中mPEG为聚乙二醇链，
步骤3.加入1M甘氨酸终止反应，
步骤4.待3～5分钟后，加入10倍体积的50mM pH4.5的醋酸钠缓冲液，将反应混合物上羧甲基纤维素柱(Waterman CM-52，)，以5倍体积的pH4.5的醋酸钠缓冲液洗涤柱子后，PEG-干扰素和未结合PEG的干扰素分别用含0.2M氯化钠和0.4M氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱，用波长280nm紫外光吸收检测，收集含PEG-干扰素的洗脱液，
步骤5.以Sephacryl S-200分子排阻色谱对PEG-干扰素进一步纯化，洗脱液为pH＝7.0的磷酸缓冲液(含0.15M NaCl)；用波长280nm紫外光吸收检测，收集含PEG-干扰素的洗脱液。
本发明的聚乙二醇-干扰素的抗病毒活性高，达到7.2×107～7.6×108IU/mg，在体内的保留时间长，达到2.0～8.6小时，可以应用于制备抗病毒的药物。
由于反应混合物中不同的产物具有不同的分子量及等电点，这些产物可用传统的分离方法如色谱法进行分离。同一个自由氨基结合形成的单PEG化的复合物是本发明的优选方案。尽管干扰素有多个自由氨基，但可以通过控制试剂比例和反应条件主要得到单PEG化的产物。
当将单一干扰素分子与单一PEG结合时，所得的产物可以是位点异构物的混合物。“位点异构物的混合物”是指可以在不同干扰素分子的不同氨基酸位点连接的各个PEG-干扰素的混合物。例如：在本发明的一个实施方案中，PEG-干扰素混合物含有至少一种在干扰素分子的组氨酸残基上连接有PEG链的PEG-干扰素，同时含有PEG链被连接在干扰素分子的另一个位点(如：赖氨酸残基)的PEG-干扰素。
本发明的聚乙二醇-干扰素抗病毒活性高，由于聚乙二醇以酰胺键与干扰素连接，血浆半衰期长，作为抗病毒药物效果更好。本发明的制备方法简单易行。
【附图说明】
图1为实施例5的SDS-PAGE电泳检测的图谱，其中：
A条带：PEG(30000)-IFNα2a； B条带：PEG(20000)-IFNcon；
C条带：PEG(10000)-IFNα1b； D条带：PEG(5000)-IFNα2b；
E条带：IFNα2b； F条带：标准分子量蛋白。
图2为修饰后干扰素药代动力学研究(125I标记法)的步骤示意图。
【具体实施方式】
实施例1.聚乙二醇-干扰素α2b的制备
将干扰素α2b以5mM pH3.0的醋酸钠缓冲液溶解，配制成浓度为1mg/ml的溶液10ml。按干扰素：PEG为1∶0.5的物质的量之比加入mPEG-SBA(Mw＝5000，由美国Shearwater公司提供，下同)，以氢氧化钠溶液调节pH到7.0，在0℃条件下反应4小时，加入1M甘氨酸0.5ml终止反应。3～5分钟后，加入10倍体积的50mM pH4.5的醋酸钠缓冲液。将反应混合物上羧甲基纤维素柱(Waterman CM-52，)，以5倍体积pH4.5的醋酸钠缓冲液洗涤柱子后，PEG-干扰素α2b和未结合PEG的干扰素分别用含0.2M氯化钠和0.4M氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱。用波长280nm紫外光吸收检测，收集含PEG-干扰素α2b的洗脱液，得PEG-IFNα2b混合物。
以Sephacryl S-200分子排阻色谱对PEG-干扰素α2b进一步纯化，以pH7.0的磷酸缓冲液(含0.15M NaCl)洗脱，以波长280nm紫外光吸收检测，收集含PEG-干扰素α2b的洗脱液，以SDS-PAGE检测(见图1)。以波长280nm紫外光吸收法测定蛋白质含量，产物PEG-IFNα2b为0.11mg。
实施例2.聚乙二醇-干扰素α1b的制备
将干扰素α1b以5mM pH4.0的醋酸钠缓冲液溶解，配制成浓度为4mg/ml的溶液10ml。按干扰素：PEG为1∶3的物质的量之比加入mPEG-SBA(Mw＝10000)，以氢氧化钠溶液调节pH到8.0，在10℃条件下反应2小时，加入1M甘氨酸0.5ml终止反应。3～5分钟后，加入10倍体积50mM pH4.5的醋酸钠缓冲液。将反应混合物上羧甲基纤维素柱(Waterman CM-52，)，以5倍体积pH4.5的醋酸钠缓冲液洗涤柱子后，PEG-干扰素和未结合PEG的干扰素分别用含0.2M氯化钠和0.4M氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱。用波长280nm紫外光吸收检测，收集含PEG-干扰素的洗脱液，以Sephacryl S-200分子排阻色谱对PEG-集成干扰素进一步纯化，以pH7.0的磷酸缓冲液(含0.15MNaCl)洗脱，以波长280nm紫外光吸收检测，收集含PEG-干扰素的洗脱液，以SDS-PAGE检测(见图1)。以280nm紫外吸收法测定蛋白质含量，产物PEG-IFNα1b为0.25mg。
实施例3.聚乙二醇-集成干扰素的制备
将集成干扰素以5mM pH5.0的醋酸钠缓冲液溶解，配制成浓度为7mg/ml的溶液10ml。按干扰素：PEG为1∶6的物质的量之比加入mPEG-SBA(Mw＝20000)，以氢氧化钠溶液调节pH到8.5，在15℃条件下反应1小时，加入1M甘氨酸0.5ml终止反应。3～5分钟后，加入10倍体积50mM pH4.5的醋酸钠缓冲液。将反应混合物上羧甲基纤维素柱(Waterman CM-52，)，以5倍体积pH4.5的醋酸钠缓冲液洗涤柱子后，PEG-集成干扰素和未结合PEG的干扰素分别用含0.2M氯化钠和0.4M氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱。用波长280nm紫外光吸收检测，收集含PEG-集成干扰素的洗脱液，以Sephacryl S-200分子排阻色谱对PEG-集成干扰素进一步纯化，以pH7.0的磷酸缓冲液(含0.15M NaCl)洗脱，以波长280nm紫外光吸收检测，收集含PEG-集成干扰素的洗脱液，以SDS-PAGE检测(见图1)。以波长280nm紫外光吸收法测定蛋白质含量，产物PEG-IFNcon为0.48mg。
实施例4.聚乙二醇-干扰素α2a的制备
将干扰素α2a以5mM pH5.0的醋酸钠缓冲液溶解，配制成浓度为6mg/ml的溶液10ml。按干扰素∶PEG为1∶10的物质的量之比加入mPEG-SB(Mw＝30000)，以氢氧化钠溶液调节pH到9.0，在25℃条件下反应0.5小时，加入1M甘氨酸0.5ml终止反应。3～5分钟后，加入10倍体积50mM pH4.5的醋酸钠缓冲液。将反应混合物上羧甲基纤维素柱(Waterman CM-52，)，以5倍体积pH4.5的醋酸钠缓冲液洗涤柱子后，PEG-干扰素和未结合PEG的干扰素分别用含0.2M氯化钠和0.4M氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱。用波长280nm紫外光吸收检测，收集含PEG-干扰素的洗脱液，以Sephacryl S-200分子排阻色谱对PEG-干扰素进一步纯化，以pH7.0的磷酸缓冲液(含0.15M NaCl)洗脱，以波长280nm紫外光吸收检测，收集含PEG-干扰素的洗脱液，以SDS-PAGE检测(见图1)。以波长280nm紫外光吸收法测定蛋白质含量，产物PEG-IFNα2a为1.2mg。
实施例5 SDS-PAGE电泳法对产物的检测
将各洗脱峰适当浓缩，采用SDS-PAGE电泳检测，分离胶12％，浓缩胶5％。电泳完毕后，将胶体浸入固定液中(30％的乙醇、5％的乙酸)室温振摇浸泡4分钟；取出胶体，浸入染色剂中室温振摇浸泡40分钟(染色剂：0.05％考马斯亮蓝G-250、0.2M碘、30％乙醇、5％乙酸)；再将胶体转移入脱色剂(1％戊二醛、30％乙醇、5％乙酸)中室温振摇浸泡至标本条带清晰即可(见图1)。
实施例6：修饰后各组分的抗病毒活性测定
用Wish细胞(人羊膜传代细胞)-VSV病毒(滤泡性口腔炎病毒)系统测定各干扰素的抗病毒活性。采用CPE(细胞致病效应)抑制为基础的抑制微量测定法，以每ml干扰素检品的最高稀释度仍能保护半数细胞(50％)免受病毒攻击的稀释度的倒数为干扰素单位。以国际单位(IU)表示，并用国家IFNα标准品进行校正。
结果见表1。
表1.干扰素及PEG干扰素复合物的抗病毒活性
样品 抗病毒活性(IU/mg)
IFNα2b 4.3×108
PEG-IFNα2b 2.2×108
PEG-IFNα2b混合物 1.8×108
IFNα1b 3.5×108
PEG-IFNα1b 1.2×108
IFNcon 1.8×109
PEG-IFNcon 7.6×108
IFNα2a 4.4×108
PEG-IFNα2a 7.2×107
实施例6.修饰后干扰素药代动力学研究(125I标记法)修饰后干扰素药代动力学研究(125I标记法)的步骤见图2，其结果见表2。
表2.125I-IFN和125I-PEG-IFN给小鼠静脉注射后的血浆半衰期
样品 半衰期(h)
IFNα2b 0.8～1.5
PEG-IFNα2b 2.0～3.9
IFNα1b 0.7～1.2
PEG-IFNα1b 3.2～5.7
IFNcon 0.5～1.9
PEG-IFNcon 4.6～7.5
IFNα2a 0.6～1.4
PEG-IFNα2a 6.5～8.6