一种酵素组合菌种及其生产方法 本发明涉及一种可以广泛应用于肥料、饲料等领域的微生物组合物及其生产方法。具体说是一种酵素组合菌种及其生产方法。
土地是人类赖以生存的基础，祖祖辈辈、年年岁岁，人们春天播种，秋天收获。土地赋予人类取之不尽，用之不竭的财富。然而，长期以来，人们大量使用化肥，给土地带来了严重的负作用。土壤中原有的微生态平衡被打破，土壤硬化板结，保肥保水性大大降低，病虫害不断加剧，合成农药用量剧增，作物品质和产量不断下降。更重要的一点是，我们所食用的蔬菜、水果中化肥农药的有害残留物对人体产生不良后果。酵素菌农法是日本微生物专家岛本在本世纪四十年代发展起来的一项微生物技术，是日本的一项农业高科技专利，广泛用于种植业、养殖业等领域。它不但能够大幅度增加农产品产量，还能够提高品质，达到高产优质，无公害的目的。同时还能够大大减少对自然环境的污染：上海辞书出版社出版的1989年版《辞海》对“酵素”一词的解释是：“酶”的旧称；而对“酶”的解释是：生物体产生的具有催化能力的蛋白质。可见，酵素菌的意思就是：可以产生酶的微生物。酵素菌农法就是指微生物在农业上的应用。微生物及其组合物还可以应用于养殖业，主要是制成各种微生物饲料添加剂。这种添加剂按一定比例加入饲料中可用于各种畜禽和特种动物的饲养。例如申请号为96109854.6的中国专利申请就公开了一种“高效生物复合肥及其制备方法”，该专利申请中所说的复合肥是将数种芽孢杆菌和解磷菌、根际联合固氮菌分别发酵的发酵液混合液，与多种植物微量元素和吸附剂混合制得。又例如：专利申请号为98109527的中国专利申请公开了一种“微生态淡水鱼饲料”，它是由三种微生态饲料为半成品，以正交实验确定的比例加入全价鱼饲料而成产品，这三种微生态饲料原料是：以益生细菌对动物蛋白原料为基料的混合物发酵而成地动物活性蛋白粉；以光合细菌、蜡样芽孢杆菌和某些酵母对植物性蛋白原料发酵而成的光合益生酵母；以及用热带假丝酵母和某些益生细菌的纯净无污染土壤等原料发酵而成的土壤饲料。
上述各种用于肥料和饲料行业的微生物组合物种类单一、作用也比较单一，微生物的培养也比较复杂，价格较高。
本发明的目的是提供一种可广泛用于种植业和养殖业作为肥料和饲料、微生物的培养方法简单、价格便宜的微生物组合物及其生产方法。
为达到上述目的，本发明采用如下的技术方案：
本发明所述的酵素组合菌种至少包括酵母菌、芽孢杆菌、纤维素分解菌、放线菌、乳杆菌和曲霉，其中酵母菌、芽孢杆菌、纤维素分解菌、放线菌、乳杆菌和曲霉的数量比为(10-30)∶(20-40)∶(10-30)∶(10-20)∶(10-15)。
作为对本发明的酵素组合菌种的进一步改进，所述的酵母菌是包括汉森酵母、啤酒酵母的任意比例的混合物；所述的芽孢杆菌是包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的任意比例的混合物；所述的纤维素分解菌是革兰氏阴性纤维素分解小杆菌；所述的放线菌是衣氏放线菌；所述的乳杆菌是发酵乳杆菌；所述的曲霉是黑曲霉。
本发明所述的酵素组合菌种的生产方法至少包括如下步骤：
一、配制培养基
(1)、马铃薯葡萄糖培养基
将马铃薯去皮，切成块，加水煮沸15-45分钟，然后用纱布过滤，将过滤后的马铃薯与葡萄糖和水按照重量比10∶1∶50混合并将其放在压力为0.8-1.5千克/平方厘米、温度为110-150摄氏度的环境中灭菌10-30分钟。
(2)、营养肉汤培养基
将牛肉膏、蛋白胨、氯化钠和水按照重量比3∶10∶5∶1000混合，调PH值为7.0-7.2，并将其放在压力为0.8-1.5千克/平方厘米、温度为110-150摄氏度的环境中灭菌10-30分钟。
(3)、无机盐基础培养基
按照重量比(硝酸铵∶三水磷酸氢二钾∶磷酸二氢钾∶七水硫酸镁∶氯化钠∶氯化钙∶三氯化铁∶酵母膏∶水)为1.0∶0.5∶0.5∶0.5∶1.0∶1.0∶0.02∶0.05∶1000的比例配制好并调PH值为7.0-7.2。将按照上述比例配好的无机盐基础培养基放在压力为0.8-1.5千克/平方厘米、温度为110-150摄氏度的环境中灭菌10-30分钟。
(4)、高氏1号培养基
按照重量比(可溶性淀粉∶硝酸钾∶氯化钠∶磷酸氢二钾∶硫酸镁∶七水硫酸亚铁∶水)为20∶1∶0.5∶0.5∶0.5∶0.01∶1000的比例配制好并调PH值为7.2-7.4。将按照上述比例配好的高氏1号培养基放在压力为0.8-1.5千克/平方厘米、温度为110-150摄氏度的环境中灭菌10-30分钟。
(5)、PYG培养基
按照重量比(蛋白胨∶酵母膏∶葡萄糖∶水)为10∶5∶20∶1000的比例配制好并调PH值为6.5-7.0。将按照上述比例配好的PYG培养基放在压力为0.8-1.5千克/平方厘米、温度为110-150摄氏度的环境中灭菌10-30分钟。
(6)、察氏培养基
按照重量比(硝酸钠∶磷酸氢二钾∶氯化钾∶硫酸镁∶硫酸亚铁∶蔗糖∶水)为2∶1∶0.5∶0.5∶0.01∶30∶1000的比例配制好后将其放在压力为0.8-1.5千克/平方厘米、温度为110-150摄氏度的环境中灭菌10-30分钟。
二、培养菌株
将酵母菌接种在上述马铃薯葡萄糖培养基上并置于33-35摄氏度的培养箱中培养3-5天。
将芽孢杆菌接种在上述营养肉汤培养基上并置于33-35摄氏度的培养箱中培养3-5天。
将纤维素分解菌接种在上述无机盐基础培养基上并置于40-60摄氏度的培养箱中培养5-10天。
将放线菌接种在上述高氏1号培养基上并置于33-35摄氏度的培养箱中培养3-5天。
将乳杆菌接种在上述PYG培养基上并置于33-35摄氏度的培养箱发酵8-12小时。
将曲霉接种在上述察氏培养基上并置于33-35摄氏度的培养箱中培养3-5天。
三、混合制成产品
将上述培养好的各菌种连同培养液按照酵母菌∶芽孢杆菌∶纤维素分解菌∶放线菌∶乳杆菌∶曲霉的数量比为(10-30)∶(20-40)∶(10-30)∶(10-20)∶(10-15)的比例以搅拌方式吸附在固体载体上，然后晾干或在温度不高于70摄氏度的干燥机中烘干。所述的固体载体可以是锯末、稻糠、麸皮、植物秸杆的一种或几种粉碎成的20-50目的颗粒状载体。
采用上述技术方案后，可以有如下的积极效果：
1、酵母菌：有氧条件下产生营养丰富的单细胞蛋白质，在无氧条件下发酵产生各种醇类、有机酸、芳香化合物等小分子易收的营养物质与各种维生素(以B族为主)促进动植物生长。2、芽孢杆菌：具有大量淀粉酶、蛋白酶、核糖核酸酶(DNA酶)、卵磷脂酶、可转化不易吸收利用的大分子物质为易于吸收利用的小分子营养物，促进多种有益微生物的生长繁殖。转化硅酸盐中的钾为可利用态钾。在肠道中需氧芽孢杆菌的繁殖，可以吸收肠道中的残存氧气，形成无氧环境，有利于双歧杆菌等有益菌的生长繁殖。3、纤维素分解菌：具有强力分解作物秸杆，转化为有机小分子营养物的作用。4、放线菌：能够产生抗生素，抑制有害菌的生长，合成能力强。5、乳杆菌：有产生酸与抑制肠道病原菌的作用，也能合成维生素。6、曲霉：含有淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶，转化提供小分子营养物质，促进有益微生物的生长。
经多点试验证明，该微生物组合物除具有功效卓越、高效、抗逆性强，是复合菌剂外还具有以下特点：1、具有极强的分解、发酵转化能力，能将有机物质和无机矿物质变成有效营养，大大提高肥料与饲料的利用率；2、凭借其扩大培养时的高温特性和微生物间的拮抗作用，可对有害微生物起到猎杀作用，有效的减少病虫害的发生；3、该菌种能抑制肠道病原微生物，消解机体中的有害物质，从而消除毒性因子，改善微生态平衡，促进人体与动物的消化吸收功能；4、该菌种能分泌大量生物活性酶，将不易被动植物利用的物质转化为可利用态，建立和维持微生态平衡，并合成生长激素，促进动、植物生长发育，提高作物产量与品质。5、菌种的培养方法简单、可以降低生产成本，便于推广应用。
下面结合具体实施例进一步说明本发明：
实施例一：
一、配制培养基
(1)、马铃薯葡萄糖培养基
将马铃薯去皮，切成块，加水煮沸30分钟，然后用纱布过滤，将过滤后的马铃薯与葡萄糖和水按照重量比10∶1∶50混合并将其放在压力为1.05千克/平方厘米、温度为121.3摄氏度的环境中灭菌20分钟。
(2)、营养肉汤培养基
将牛肉膏、蛋白胨、氯化钠和水按照重量比3∶10∶5∶1000混合，调PH值为7.1，并将其放在压力为1.05千克/平方厘米、温度为121.3摄氏度的环境中灭菌20分钟。
(3)、无机盐基础培养基
按照重量比(硝酸铵∶三水磷酸氢二钾∶磷酸二氢钾∶七水硫酸镁∶氯化钠∶氯化钙∶三氯化铁∶酵母膏∶水)为1.0∶0.5∶0.5∶0.5∶1.0∶1.0∶0.02∶0.05∶1000的比例配制好并调PH值为7.1。将按照上述比例配好的无机盐基础培养基放在压力为1.05千克/平方厘米、温度为121.3摄氏度的环境中灭菌20分钟。
(4)、高氏1号培养基
按照重量比(可溶性淀粉∶硝酸钾∶氯化钠∶磷酸氢二钾∶硫酸镁∶七水硫酸亚铁∶水)为20∶1∶0.5∶0.5∶0.5∶0.01∶1000的比例配制好并调PH值为7.3。将按照上述比例配好的高氏1号培养基放在压力为1.05千克/平方厘米、温度为121.3摄氏度的环境中灭菌20分钟。
(5)、PYG培养基
按照重量比(蛋白胨∶酵母膏∶葡萄糖∶水)为10∶5∶20∶1000的比例配制好并调PH值为6.8。将按照上述比例配好的PYG培养基放在压力为1.05千克/平方厘米、温度为121.3摄氏度的环境中灭菌20分钟。
(6)、察氏培养基
按照重量比(硝酸钠∶磷酸氢二钾∶氯化钾∶硫酸镁∶硫酸亚铁∶蔗糖∶水)为2∶1∶0.5∶0.5∶0.01∶30∶1000的比例配制好后将其放在压力为1.05千克/平方厘米、温度为121.3摄氏度的环境中灭菌20分钟。
二、培养菌株
将酵母菌接种在上述马铃薯葡萄糖培养基上并置于33-35摄氏度的培养箱中培养3天。
将芽孢杆菌接种在上述营养肉汤培养基上并置于33-35摄氏度的培养箱中培养3天。
将纤维素分解菌接种在上述无机盐基础培养基上并置于40-60摄氏度的培养箱中培养7天。
将放线菌接种在上述高氏1号培养基上并置于33-35摄氏度的培养箱中培养3天。
将乳杆菌接种在上述PYG培养基上并置于33-35摄氏度的培养箱发酵8小时。
将曲霉接种在上述察氏培养基上并置于33-35摄氏度的培养箱中培养3天。
调整上述培养基所用的氢氧化钠和盐酸的浓度均为1mol/l。
三、混合制成产品
将上述培养好的各菌种连同培养液按照按照表1所示的比例之一(数量比)以搅拌方式吸附在固体载体上，然后晾干或在温度不高于70摄氏度的干燥机中烘干。所述的固体载体可以是锯末、稻糠、麸皮、植物秸杆的一种或几种粉碎成的20-50目的颗粒状载体。
实施例二：
一、配制培养基
(1)、马铃薯葡萄糖培养基
将马铃薯去皮，切成块，加水煮沸30分钟，然后用纱布过滤，将过滤后的马铃薯与葡萄糖和水按照重量比10∶1∶50混合并将其放在压力为0.8千克/平方厘米、温度为110摄氏度的环境中灭菌40分钟。
(2)、营养肉汤培养基
将牛肉膏、蛋白胨、氯化钠和水按照重量比3∶10∶5∶1000混合，调PH值为7.1，并将其放在压力为0.8千克/平方厘米、温度为110摄氏度的环境中灭菌40分钟。
(3)、无机盐基础培养基
按照重量比(硝酸铵∶三水磷酸氢二钾∶磷酸二氢钾∶七水硫酸镁∶氯化钠∶氯化钙∶三氯化铁∶酵母膏∶水)为1.0∶0.5∶0.5∶0.5∶1.0∶1.0∶0.02∶0.05∶1000的比例配制好并调PH值为7.1。将按照上述比例配好的无机盐基础培养基放在压力为0.8千克/平方厘米、温度为110摄氏度的环境中灭菌40分钟。
(4)、高氏1号培养基
按照重量比(可溶性淀粉∶硝酸钾∶氯化钠∶磷酸氢二钾∶硫酸镁∶七水硫酸亚铁∶水)为20∶1∶0.5∶0.5∶0.5∶0.01∶1000的比例配制好并调PH值为7.3。将按照上述比例配好的高氏1号培养基放在压力为0.8千克/平方厘米、温度为110摄氏度的环境中灭菌40分钟。
(5)、PYG培养基
按照重量比(蛋白胨∶酵母膏∶葡萄糖∶水)为10∶5∶20∶1000的比例配制好并调PH值为6.8。将按照上述比例配好的PYG培养基放在压力为0.8千克/平方厘米、温度为110摄氏度的环境中灭菌40分钟。
(6)、察氏培养基
按照重量比(硝酸钠∶磷酸氢二钾∶氯化钾∶硫酸镁∶硫酸亚铁∶蔗糖∶水)为2∶1∶0.5∶0.5∶0.01∶30∶1000的比例配制好后将其放在压力为0.8千克/平方厘米、温度为110摄氏度的环境中灭菌40分钟。
二、培养菌株
将酵母菌接种在上述马铃薯葡萄糖培养基上并置于33-35摄氏度的培养箱中培养4天。
将芽孢杆菌接种在上述营养肉汤培养基上并置于33-35摄氏度的培养箱中培养4天。
将纤维素分解菌接种在上述无机盐基础培养基上并置于40-60摄氏度的培养箱中培养8天。
将放线菌接种在上述高氏1号培养基上并置于33-35摄氏度的培养箱中培养4天。
将乳杆菌接种在上述PYG培养基上并置于33-35摄氏度的培养箱发酵10小时。
将曲霉接种在上述察氏培养基上并置于33-35摄氏度的培养箱中培养4天。
调整上述培养基所用的氢氧化钠和盐酸的浓度均为1mol/l。
三、混合制成产品
将上述培养好的各菌种连同培养液按照按照表1所示的比例之一(数量比)以搅拌方式吸附在固体载体上，然后晾干或在温度不高于70摄氏度的干燥机中烘干。所述的固体载体可以是锯末、稻糠、麸皮、植物秸杆的一种或几种粉碎成的20-50目的颗粒状载体。
实施例三：
一、配制培养基
(1)、马铃薯葡萄糖培养基
将马铃薯去皮，切成块，加水煮沸30分钟，然后用纱布过滤，将过滤后的马铃薯与葡萄糖和水按照重量比10∶1∶50混合并将其放在压力为1.5千克/平方厘米、温度为150摄氏度的环境中灭菌20分钟。
(2)、营养肉汤培养基
将牛肉膏、蛋白胨、氯化钠和水按照重量比3∶10∶5∶1000混合，调PH值为7.1，并将其放在压力为1.5千克/平方厘米、温度为150摄氏度的环境中灭菌20分钟。
(3)、无机盐基础培养基
按照重量比(硝酸铵∶三水磷酸氢二钾∶磷酸二氢钾∶七水硫酸镁∶氯化钠∶氯化钙∶三氯化铁∶酵母膏∶水)为1.0∶0.5∶0.5∶0.5∶1.0∶1.0∶0.02∶0.05∶1000的比例配制好并调PH值为7.1。将按照上述比例配好的无机盐基础培养基放在压力为1.5千克/平方厘米、温度为150摄氏度的环境中灭菌20分钟。
(4)、高氏1号培养基
按照重量比(可溶性淀粉∶硝酸钾∶氯化钠∶磷酸氢二钾∶硫酸镁∶七水硫酸亚铁∶水)为20∶1∶0.5∶0.5∶0.5∶0.01∶1000的比例配制好并调PH值为7.3。将按照上述比例配好的高氏1号培养基放在压力为1.5千克/平方厘米、温度为150摄氏度的环境中灭菌20分钟。
(5)、PYG培养基
按照重量比(蛋白胨∶酵母膏∶葡萄糖∶水)为10∶5∶20∶1000的比例配制好并调PH值为6.8。将按照上述比例配好的PYG培养基放在压力为1.5千克/平方厘米、温度为150摄氏度的环境中灭菌20分钟。
(6)、察氏培养基
按照重量比(硝酸钠∶磷酸氢二钾∶氯化钾∶硫酸镁∶硫酸亚铁∶蔗糖∶水)为2∶1∶0.5∶0.5∶0.01∶30∶1000的比例配制好后将其放在压力为1.5千克/平方厘米、温度为150摄氏度的环境中灭菌20分钟。
二、培养菌株
将酵母菌接种在上述马铃薯葡萄糖培养基上并置于33-35摄氏度的培养箱中培养5天。
将芽孢杆菌接种在上述营养肉汤培养基上并置于33-35摄氏度的培养箱中培养5天。
将纤维素分解菌接种在上述无机盐基础培养基上并置于40-60摄氏度的培养箱中培养8天。
将放线菌接种在上述高氏1号培养基上并置于33-35摄氏度的培养箱中培养5天。
将乳杆菌接种在上述PYG培养基上并置于33-35摄氏度的培养箱发酵12小时。
将曲霉接种在上述察氏培养基上并置于33-35摄氏度的培养箱中培养5天。
调整上述培养基所用的氢氧化钠和盐酸的浓度均为1mol/l。
三、混合制成产品
将上述培养好的各菌种连同培养液按照按照表1所示的比例之一(数量比)以搅拌方式吸附在固体载体上，然后晾干或在温度不高于70摄氏度的干燥机中烘干。所述的固体载体可以是锯末、稻糠、麸皮、植物秸杆的一种或几种粉碎成的20-50目的颗粒状载体。
表2显示出本发明所述的酵素组合菌种用于蔬菜肥料时对蔬菜幼苗生长发育的影响。
表1酵母菌芽孢杆菌纤维素分解菌 放线 菌 乳杆 菌 曲霉 汉森 酵母 菌 啤酒 酵母 菌 地衣 芽孢 杆菌 枯草 芽孢 杆菌例1 10 10 15 15 15 10 10 15例2 7.5 7.5 20 20 15 10 10 10例3 15 15 10 10 10 15 15 10例4 5 5 15 15 15 10 20 15例5 20 0 30 0 15 10 10 15例6 0 20 0 30 15 10 10 15例7 5 5 15 15 15 20 10 12例8 30 0 40 0 10 20 10 15例9 0 30 0 40 12 18 16 13
表2作物 肥料 株高 (cm) 茎粗 (cm) 茎叶干重 (g) 根干重 (g) 叶绿素含量 (mg/g fw) 壮苗 指数黄瓜 例1 75.3 7.36 8.15 1.31 4.876 化肥 70.6 6.99 7.41 1.04 4.342辣椒 例1 24.6 6.49 5.089 0.0177 化肥 19.6 6.31 4.352 0.0103