一种类人胶原蛋白及其生产方法 本发明涉及一种类人胶原蛋白及通过基因工程菌生产类人胶原蛋白的方法。
胶原蛋白是人体固有蛋白之一，它在皮肤里的含量最多，由于胶原蛋白固有的生物兼容性、生物降解性和吸收性、促新细胞形成及促上皮细胞形成功能，胶原蛋白在医学领域、美容、化妆品、保健品行业的潜在用途不断拓宽，但是，动物体胶原蛋白是一种硬蛋白(水不溶)，并且随着年龄的增长，内部双键越来越多，同时也越来越硬。一般，经酶解获得的胶原蛋白为水不溶性蛋白，也不可能在不改变分子量情况下重溶解。因此，可加工性能很弱，直接限制了许多潜在用途的开发。另外，来自动物体的胶原蛋白不可能排除病毒隐患，同时始终带有牛胶原的特性，为了降低其免疫排异反应，科学家们曾想法从人胎盘中获取胶原蛋白，但是，该研究受到世界人权组织及FDA的阻力，因为，不能确切检测每个胎盘组织的病毒和细菌。
在现有技术中，国内外市场小批量胶原蛋白的生产均来自动物皮、跟腱、软骨和人胎盘的提取物。其提取工艺分三步，一、溶解；二、酶处理；三、纯化。但通过动物皮提取类胶原蛋白可能带有各种病毒，因此动物皮及脏器提取物的各种产品直接用于人体会造成严重隐患。
国外报道用重组技术生产胶原蛋白研究有：重组酵母细胞生产准人胶原蛋白II，重组哺乳动物细胞生产准人胶原蛋白I，II，III型，重组啤酒酵母细胞生产准人胶原蛋白VI，重组昆虫细胞生产准人胶原蛋白II，表达量为50mg/ml，人肿瘤细胞生产准人纤维胶原1A1和1A2，由于动物细胞培养成本昂贵，周期长，一般15天甚至更长，另外培养规模只能限于实验规模，要满足产业化、大批量需求几乎是完全不可能。另外，这些重组类胶原蛋白都必须有后转化酶的参与，必须有一个后转化工艺，到目前为止，用重组动物细胞生产胶原蛋白必须8种后转化酶的参与，转化工艺相当复杂。
本发明目的是提供一种能在单细胞内取得高表达的类人胶原蛋白，其具有优于动物体胶原蛋白地独特的化学结构和性能，同时提供该胶类人原蛋白的生产方法。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种类人胶原蛋白，其特殊之处在于：其序列如下HDP VVL QRR DWE NPG VTQ LNR HLA HAH PPF ASD HPM GAPGPA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSAGAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAPGPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPPGAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAPGPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPAGPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPPGSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAH GPA GAL GAHGPA GPL GPA GPP GSA GAP GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAHGPA GPL GAH GPA GPL GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPAGPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPPGSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSAGAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAPGPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPPGAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAPGPA GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPPGSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSAGAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAPGPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPPGAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAPGPA GPP GSA GAP GPP GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPAGPL GAH GPA GPL GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPPGSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSAGAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GSA GAP GPP GAP GPAGPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPPGSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSAGAP GPP GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAM GAPGAT GLS AGA THG LVT CGL
其结构为三链、三螺旋结构，其核酸长度为1071bp。
一种类人胶原蛋白的生产方法，其特殊之处在于：它包括以下步骤
1)、类人胶原蛋白的工程菌的构建；
2)、工程菌的发酵培养；
3)、类人胶原蛋白的诱导及表达；
4)、类人胶原蛋白的提纯。
一种类人胶原蛋白的生产方法，其特殊之处在于：所述类人胶原蛋白的工程菌的构建如下：
1)、将人体已知胶原蛋白序列的一段基因抽提出来并进行修饰后，再特定重复，然后进行缝合，DNA重组；
2)、将重组DNA转入到大肠杆菌；
一种类人胶原蛋白的生产方法，其特殊之处在于：所述工程菌的发酵培养基为：
酵母粉 10-30g/L 葡萄糖 15-38g/L
NaHPO4 2.5-8.7g/L (NH4)2SO4 3.6-5.6g/L
FeCl3 0.8-1.6g/L CoCl2.6H2O 0.1-0.3g/L
ZnSO4 0.1-0.3g/L
一种类人胶原蛋白的生产方法，其特殊之处在于：所述工程菌的发酵培养条件为
培养温度34℃，PH7.0溶氧DO 20％，空气流量为1VVM-4VVM，搅拌转速450r/min-1000r/min，接种量5％，种子培养基，LB培养基、卡那霉素0.5mg/L、葡萄糖5g/L，以葡萄糖浓度控制1.5％为宜，用DO量控制为40％为宜，当OD600的值为150时收获细胞。
一种类人胶原蛋白的生产方法，其特殊之处在于：所述类人胶原蛋白的提纯如下
细胞经离心收集后经高压细胞匀将，然后用缓冲液抽提，经过第一次甲酸缓冲液盐析后，接着进行离子交换，再经金属离子螯合吸附，精制和除热源，精品去冷冻干燥。
下面结合具体实施例，详细描述本发明如下：
类人胶原蛋白的生产方法包括：类人胶原蛋白的工程菌的构建；工程菌的发酵培养和诱导；胶原蛋白的提纯，获得目的蛋白。
一、类人胶原蛋白的工程菌的构建
(一)、从E.coLi菌株制备质粒DNA：
在小规模制备时：质粒DNA从1.5ml大肠杆菌培养物经酸溶解法制备。
在大规模制备时：载体菌株在含有抗菌素的培养基上培养过夜，离心收集细胞、离心速度10000r/min 5分钟，然后重新悬浮于10ml冰冷的TE缓冲液溶液(10ml EDTA，pH8，)再离心，再悬浮于4ml TES(TE及20％的蔗糖液中)，加入溶解酶培养5分钟后加入2ml0.5M EDTA，培养10分钟后加入蛋白溶解酶及溶解缓冲液，后经培养、离心收集(35000r/min收集2hr)后上清液转入离心管按比例加入CsCl等。
(二)、DNA醇析
在DNA样品中加入10％的醋酸钠(pH7.5)及3倍体积的冷乙醇，-70℃培养30min，此时DNA析出。4℃离心5min后将上清液重新醇析(用80％的冷乙醇)，之后重新溶入DNA缓冲液中。
(三)、DNA限制性内切酶消化
将DNA用限制性内切酶在其相应的缓冲液中用酶消化，DNA浓度维持4％，37℃培养3hr，缓冲液配比(0.37mol/L Tris，0.74mol/L醋酸钾)，0.2mol/L乙酸镁0.05mol/L DTT(二硫苏糖醇)，PH＝8.0
(四)、DNA电泳分析
于DNA样品中加入电泳缓冲液，50V恒压下运行20hr。缓冲液配比同常规电泳缓冲液。
实施例1：D1型胶原蛋白
用限制性内切酶HindIII合成PPD1121质粒进行消化，然后用琼脂糖分离，取胶原蛋白基因片段，纯化后与消化后的质粒PSC101缝合，缝合DNA转入大肠杆菌BL21或HB101中，用卡纳霉素进行克隆选择。将克隆株重新培养，用SDS-Page进行抗性识别和蛋白表达分析。
(五)、DNA缝合
在DNA缝合粘合剂作用下于室温下反应2hr。对钝端反应剂为每微克DNA加入MgCl2 5mmol/μg、Tris-HCl 20-25mmol/μg、DTT 5-10mmol/μg、BSA 180-220mg/μg、ATP 0.5-0.75mmol和400-450单位。T4 DNA链接酶，缝合反应室温下1hr-2hr。
(六)、DNA琼脂糖缝合
将琼脂糖溶解(65℃)，降至37℃时，加入缝合缓冲液，室温缝合1hr.
(七)、DNA纯化及琼脂糖DNA纯化
分别依据Millipore ultrafree-probind filter Unit处理，或用Bio-Spin 6 Column柱处理。
(八)、转细菌方法
1、E.coli细胞的制备
接种大肠杆菌细胞BL21于无菌LB培养基中34℃振荡培养，当OD600为0.5时，置于冰浴中10min，然后离心分离(6000r/min下10min)，细胞收集物重新悬浮于0.1MMgCl2溶液中冰浴40min中，离心收集，于细胞收集物中加入冰浴过的100mM CaCl22ml，无菌条件下，冰浴培养24hr，细胞被分到小离心管内-70℃保存。
2、E.coli转化
将细胞解冻并冰浴，每50μl细胞加1μg DNA，冰浴30分钟，然后42℃水浴2分钟，加入1ml LB培养基，将混合物转入34℃振荡培养2hr。此时10％的转化物含有抗菌素。
(九)、蛋白表达分析
在摇瓶内装入10％LB培养液加入5％的卡那霉素于34℃培养过夜，当OD600达1时，将温度调至42℃培养2hr后冰浴，以备免疫印标实验用。
(十)、免疫印迹实验
依据蛋白电泳实验程序，将凝胶一维电泳转化到二维凝胶电泳，然后经过牛奶培养，用小鼠抗体IgG及磷酸丝氨酸抗体PSR-45进行免疫印迹实验。
(十一)、氨基酸含量分析
使用氨基酸分析仪，样品经6N HCL水解。
(十二)、DNA序列分析
使用DNA序列分析仪
(十三)、氨基酸序列分析
使用氨基酸序列分析仪
二、工程菌的发酵培养和诱导
发酵条件
培养温度34℃，pH7.0溶氧DO 20％，空气流量为1VVM-4VVM，搅拌转速450r/min-1000r/min，接种量5％，种子培养基，LB培养基、卡那霉素0.5mg/L、葡萄糖5g/L。
流加策略：以葡萄糖浓度控制1.5％为宜，用DO量控制为40％为宜。
当OD600的值为100时将培养温度调节到42℃诱导2小时收获细胞。
发酵培养基为：
酵母粉 10-30g/L 葡萄糖 15-38g/L
NaHPO4 2.5-8.7g/L (NH4)2SO4 3.6-5.6g/L
FeCl3 0.8-1.6g/L CoCl2.6H2o 0.1-0.2g/L
ZnSO4 0.1-0.3g/L
发酵培养基的最佳方案为：
酵母粉 20g/L， 葡萄糖 30g/L
NaHPO4 6.7g/L (NH4)2SO4 5.6g/L
微量元素 FeCl3 1.2g/L CoCl2.6H2O 0.2g/L
ZnSO4 0.2g/L
补料培养基：10倍浓缩的发酵培养基
三、类人胶原蛋白的提纯
分离纯化工艺
离心收集→细胞匀浆→缓冲液抽提→盐析→离子交换→柱层析精制→冷冻干燥
细胞经离心后加入缓冲液(Tis pH8.0，10mM EDTA)按5倍于细胞湿重加缓冲液体积。超声破碎20min后，用甲酸缓冲液盐析粗提后，用离子交换树脂吸附以0.5M NaCl、20mM Tris pH8.0洗脱后，再用金离螯合柱吸附、洗脱，收集蛋白冷冻干燥。
本发明将人体已知序列的胶原蛋白的一段基因经修饰后进行特定重复而后克隆到大肠杆菌中，籍细胞的快速繁殖在特定条件下通过诱导获得的，并经过对其水溶性、免疫排异性、稳定性、成胶性、吸收性等特性的改进，使其产品结构及性能在国内、外属首创。该发明取得了胶原蛋白的高表达，其表达量为20-50％，其生成的类人胶原蛋白脯氨酸较动物体胶原蛋白少40％-60％，这给本发明生产的类人胶原蛋白增添了很多动物体胶原蛋白不具备的优势，其化学活性氨基酸部位更多，其衍生物种类将更加多样化，其性能将更能满足不同行业的需求。
该技术所产生的类人胶原蛋白不但具有动物体胶原蛋白固有的生物兼容性及生物重吸收性，而且在特定温度下具有热可逆成胶的特性；具有低免疫排异反应和无病毒隐患的优点，它可以实现高分子胶原蛋白在单细胞内的高表达；它产生的类人胶原蛋白为螺旋结构，具有优于动物体胶原蛋白的独特的化学结构和性能，如热可逆成胶性，水溶性，低免疫排异反应等，例如，为了降低生物体胶原蛋白的免疫排异反应，我们使用的三肽链含有带有简单侧链的甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸等并进行独特的序列重复，这种重复序列来自生物体已知胶原蛋白序列的结构中的一部分，改进了生物体胶原蛋白的——GXY结构(这里的X，Y可以是任何氨基酸，)。动物体胶原蛋白由于旋转、定型等不可能在不减少分子量条件下重溶解，因此类人胶原蛋白便可加工成手术缝合线人工皮肤、胶片涂层，人工器官涂层等，也可与卤化银、染料等结合形成具有优良表面粘性的涂料。