蚕沙总生物碱及其制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种中药总生物碱，其制备方法，和以该生物碱为活性成分的药物组合物，以及它们在制备预防治疗糖尿病、肥胖症、高血脂及病毒感染性疾病的药物中的应用。
背景技术
蚕沙作为传统中药，又称晚蚕沙、蚕屎、马鸣肝、晚蚕矢、二蚕沙等，为蚕蛾科昆虫家蚕蛾(Bombyx mon L.)幼虫的干燥粪便。干燥的蚕沙呈圆柱型小粒，微有青草气，色黑，坚实，均匀。蚕性燥，无毒，燥能胜风去湿，故蚕沙主治风湿之病，因此临床上具有祛风除湿、活血定痛之功能，治风湿痹痛、风疹瘙痒、头风头痛、皮肤不仁、关节不遂、急剧吐泻转筋、腰脚冷涌、烂弦风眼等症。此外，蚕沙还含有单宁和维生素C，在医药上用作收敛剂，对腹泻、鼻血、牙龈出血及痔出血等均有良好的疗效；蚕沙中的果胶活性高于其他植物性果胶(如苹果果胶、柑橘果胶等)，对各种致病菌有较强抑制和杀灭作用，能防治肠道失常症，对便秘有显著的疗效。
经风干后的蚕沙中除含有9.9％的水份，90.1％的干物质(粗蛋白13.6％，粗脂肪3.7％，粗纤维12.5％，无氮浸出物48.7％，灰份12.6％)外，还含有丰富的营养物质，其中铜、铁、磷、锌及其他微量元素含量均较高；含有18种氨基酸，包括人体必需的8种，另外还含有丰富的叶绿素及其衍生物、β-胡萝卜素、植物醇、低甲氧基果胶以及黄酮类化合物。
蚕食桑叶后消耗了桑叶中的部份蛋白质、糖类和脂肪类物质，而大部分有效成份随粪便排泄到体外，因此蚕沙的主要成分来自于桑叶。蚕沙中含有的粗蛋白高于谷类植物，而叶绿素、胡萝卜素为其它绿色植物数倍，甚至数十倍。
中国专利申请号99109111.6公开了一种采用连续或间歇提取法提取蚕沙，经过滤除去不溶物，将滤液合并进一步浓缩成膏状并进行制剂成型地方法，用于治疗和预防糖尿病。此外，桑叶中含有1-脱氧野尻霉素(deoxynojirimycin，DNJ)，其化学名为2R，3R，4R，5S-2-羟甲基-3，4，5-三羟基哌啶，这种生物碱是一种天然糖的结构类似物，具有很高的α-葡萄糖苷酶的抑制活性，可用于治疗糖尿病、肥胖症、病毒感染等疾病。中国专利申请号01113191.8公开了“一种具有α-糖苷酶抑制剂活性的中药提取物、其制备方法及用途”，该项发明涉及了由中药桑白皮、桑叶和桑椹制备总生物碱。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种具有α-糖苷酶抑制剂活性的蚕沙总生物碱。
本发明的第二个目的是提供一种具有α-糖苷酶抑制剂活性的蚕沙总生物碱的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种用于预防和治疗糖尿病、肥胖症、高血脂及病毒感染性疾病的药物组合物。
本发明的第四个目的是提供一种蚕沙总生物碱在制备预防和治疗糖尿病、肥胖症、高血脂及病毒感染性疾病的药物方面的应用。
本发明的技术方案概述如下：
一种蚕沙总生物碱的制备方法，它包括如下步骤：
(1)以水或甲醇或乙醇或含水醇类为提取溶剂，对蚕沙进行冷浸提取或加热提取或回流提取，所述提取溶剂的用量为蚕沙重量的5～15倍；提取次数为1～4次，合并提取液，过滤，除去药渣；
(2)加热减压浓缩提取液，至原蚕沙体积的1～2倍；
(3)加入体积百分含量为75％～100％的甲醇或乙醇，加入的量为浓缩提取液的3～5倍，在4℃～30℃进行醇沉淀；离心或过滤，除去残渣和不溶物；
(4)取醇沉淀后的上清液经阳离子交换树脂柱进行纯化，用去离子水洗去不吸附的杂质，再用0.2～1N氨水洗脱，洗脱液经减压浓缩除去氨水；
(5)用用量为蚕沙重量的1/10～1/100的活性炭进行脱色，收集脱色液，经浓缩、经真空干燥或冷冻干燥成干粉，或将收集液直接喷雾干燥成型制成干粉，即得淡黄色的蚕沙总生物碱。
提取溶剂以体积百分含量为25～75％的含水醇类为佳。
提取方法优选加热提取或回流提取，提取温度为60～100℃。
提取溶剂的用量为蚕沙重量的10倍为宜。
提取次数最好是2次。
洗脱液氨水的浓度最好是0.5N。
阳离子交换树脂最好是交联聚苯乙烯系的强酸型树脂，其型号为001×1.1或001×4或001×7或001×14.5或Amberlite IR120或Dowex 50或Zerolit 225。
一种蚕沙总生物碱，它是用下述方法制备的：
(1)以水或甲醇或乙醇或含水醇类为提取溶剂，对蚕沙进行冷浸提取或加热提取或回流提取，所述提取溶剂的体积用量为蚕沙重量的5～15倍；提取次数为1～4次，合并提取液，过滤，除去药渣；
(2)加热减压浓缩提取液，至原蚕沙体积的1～2倍；
(3)加入体积百分含量为75％～100％的甲醇或乙醇，加入的量为浓缩提取液的3～5倍，在4℃～30℃进行醇沉淀；离心或过滤，除去残渣和不溶物；
(4)取醇沉淀后的上清液经阳离子交换树脂柱进行纯化，用去离子水洗去不吸附的杂质，再用0.2～1N氨水洗脱，洗脱液经减压浓缩除去氨水；
(5)用用量为蚕沙重量的1/10～1/100的活性炭进行脱色，收集脱色液，经浓缩、真空干燥或冷冻干燥成干粉，或将收集液直接喷雾干燥成型制成干粉，即得淡黄色的蚕沙总生物碱。
提取溶剂以体积百分含量为25～75％的含水醇类为佳。
提取方法优选加热提取或回流提取，提取温度为60～100℃。
提取溶剂的用量为蚕沙重量的10倍为宜。
提取次数最好是2次。
洗脱液氨水的浓度最好是0.5N。
阳离子交换树脂最好是交联聚苯乙烯系的强酸型树脂，其型号为001×1.1或001×4或001×7或001×14.5或Amberlite IR120或Dowex 50或Zerolit 225。
用于预防和治疗糖尿病、肥胖症、高血脂、及病毒感染性疾病的药物组合物，其中含有治疗有效量的活性成分，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。
本发明的一种蚕沙总生物碱和药物组合物，可用于制备预防和治疗糖尿病、肥胖症、高血脂及病毒感染性疾病的药物中。
上面所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂如乳糖、淀粉、糊精、微晶纤维；填充剂如淀粉；粘合剂如纤维素衍生物、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如干淀粉、羧甲基淀粉钠、海藻酸钠、碳酸氢钠及碳化钙等；矫味剂如乳糖、甜叶菊素、D-木糖、木糖醇等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙及硬脂酸镁等；防腐剂如苯甲酸、苯甲醇等。
本发明的一种蚕沙总生物碱可以组合物的形式通过口服给药的方式施用于需要这种治疗的患者。可将组合物制成常规的固体制剂如片剂、散剂、胶囊、滴丸剂等，制成液体制剂如糖浆剂。
本发明的药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如将一种蚕沙总生物碱与一种或多种药物载体混合，然后将其制成所需的剂型。
本发明的药物组合物优选含有重量比为1～99％的一种蚕沙总生物碱，最优选含有重量比为10～80％的一种蚕沙总生物碱。
本发明的一种蚕沙总生物碱的使用量可根据患者年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度情况，其24小时剂量可以是0.1～10mg/kg体重。
本发明的一种蚕沙总生物碱是从蚕沙中提取的，蚕食桑叶后浓缩了桑叶中的一些有效成份，蚕沙的粒径处于萃取过程最宜粒径范围内、因此，可以方便地对提取原料进行提取、分离及纯化，而得到桑叶中的各种有效成份；蚕沙的价格低廉，其中总生物碱的含量较高，主要为具有α-糖苷酶抑制剂活性的DNJ类生物碱。蚕沙总生物碱及其组合物，全部采用天然成分作为α-糖苷酶抑制剂，具有作用机理清晰、疗效确切、成本低等特点，可用于糖尿病、肥胖症、高血脂以及病毒感染等疾病的预防和治疗。
【附图说明】
图1为本发明一种蚕沙总生物碱抑制曲线图；
图2为本发明一种蚕沙总生物碱的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
一种蚕沙总生物碱的制备方法：(1)取蚕沙1kg，加体积百分含量为50％的乙醇10L，75℃保温5小时，过滤，滤渣再加50％乙醇10L，75℃保温5小时，过滤，合并两次滤液，离心除去药渣；(2)加热减压浓缩提取液，至2L；(3)加入体积百分含量为95％的甲醇，加入的量6L，在4℃～10℃进行醇沉淀，抽滤；(4)取醇沉淀后的上清液经阳离子交换树脂柱交联聚苯乙烯系的强酸型树脂，其型号为001×1.1进行纯化，用去离子水洗去不吸附的杂质，以0.5N氨水溶液洗脱，收集生物碱阳性部分洗脱峰，再经10g活性炭吸附脱色，减压浓缩，离心，冷冻干燥，得7.86g淡黄色提取物粉末，采用酸碱滴定法测定总生物碱含量为64％。
生物碱的酸碱滴定法：取上述干粉0.5克，溶于20ml冰乙酸中，以0.1N高氯酸为滴定液，以结晶紫为指示剂，测得其中N原子当量数。再取上述干粉0.5克，溶于20ml水中，以0.1N NaOH为滴定液，测得其中羧酸根当量数。N原子当量数减去羧酸根当量数应为生物碱的摩尔数，生物碱分子量以180计，所算得的生物碱重量应不低于总重量的30％。
公式：生物碱含量＝[高氯酸体积(mL)-NaOH体积(mL)]×0.036×100％
实施例2
一种蚕沙总生物碱的制备方法：(1)取蚕沙1kg，加体积百分含量为75％乙醇10L，100℃加热回流2小时，过滤，滤渣再加75％乙醇10L，继续回流2小时，过滤，合并两次滤液，离心除去药渣；(2)加热减压浓缩提取液，至2L；(3)加入8L体积百分含量为75％的乙醇，在20℃～30℃进行醇沉淀；离心或过滤，除去残渣和不溶物；(4)取醇沉淀后的上清液经阳离子交换树脂柱交联聚苯乙烯系的强酸型树脂，其型号001×7进行纯化，用去离子水洗去不吸附的杂质，再用0.5N氨水洗脱，洗脱液经减压浓缩除去氨水；(5)用20g活性炭进行脱色，将收集液喷雾干燥成型制成干粉，即得淡黄色的蚕沙总生物碱。
实施例3
一种蚕沙总生物碱的制备方法：(1)取蚕沙1kg，加体积百分含量为25％甲醇25L，60℃保温5小时，过滤，滤渣再重复提取2次，过滤，合并滤液，离心除去药渣；(2)加热减压浓缩提取液，至2L；(3)加入10L的乙醇，在25℃～30℃进行醇沉淀；离心或过滤，除去残渣和不溶物；(4)取醇沉淀后的上清液经阳离子交换树脂柱苯乙烯系的树脂Dowex 50进行纯化，用去离子水洗去不吸附的杂质，再用1N氨水洗脱，洗脱液经减压浓缩除去氨水；(5)用50g活性炭进行脱色，经浓缩、经冷冻干燥成干粉，即得淡黄色的蚕沙总生物碱。
实施例4
一种蚕沙总生物碱的制备方：(1)取蚕沙1kg，加13L水，常温浸泡提取2次，每次24小时，过滤，合并滤液，离心除去药渣；(2)加热减压浓缩提取液至3L；(3)12L甲醇，在25℃～28℃进行醇沉淀；离心或过滤，除去残渣和不溶物；(4)取醇沉淀后的上清液经阳离子交换树脂柱交联聚苯乙烯系的强酸型树脂，其型号为001×4进行纯化，用去离子水洗去不吸附的杂质，再用0.5N氨水洗脱，洗脱液经减压浓缩除去氨水；(5)用10g活性炭进行脱色，经浓缩、经冷冻干燥成干粉，即得淡黄色的蚕沙总生物碱。
实施例5
一种蚕沙总生物碱的制备方法：(1)取蚕沙1kg，加5L甲醇，80℃加热回流提取4次，每次5小时，过滤，合并滤液，离心除去药渣；(2)加热减压浓缩提取液，至3L；离心或过滤，除去残渣和不溶物；(3)取上清液经阳离子交换树脂柱交联聚苯乙烯系的强酸型树脂，Amberlite IR120进行纯化，用去离子水洗去不吸附的杂质，再用0.5N氨水洗脱，洗脱液经减压浓缩除去氨水；(5)用100g的活性炭进行脱色，经浓缩、经冷冻干燥成干粉，即得淡黄色的蚕沙总生物碱。
实施例6
一种蚕沙总生物碱的制备方法：实施步骤同实施例5，其中的树脂柱是交联聚苯乙烯系的强酸型树脂，其型号为001×14.5。
实施例7
一种蚕沙总生物碱的制备方法：实施步骤同实施例5，其中的树脂柱是交联聚苯乙烯系的强酸型树脂，其型号为Zerolit 225。
实施例8
一种蚕沙总生物碱的α-糖苷酶抑制实验：
取体重120～140g的雄性Wister大鼠(1只)，处死后取小肠，剥离肠系膜，用预冷的生理缓冲液(PBS)冲洗肠内内容物。剪碎后至于匀浆器中，加30ml PBS研磨，4℃，10,000转/分、离心10分钟，取上清液得大鼠小肠α-糖苷酶粗酶液。
分别取10ng～1mg/ml不同浓度的阿卡波糖、DNJ标准品、以及由实验例1所制备的蚕沙总生物碱的PBS溶液各200μl，加入上述α-糖苷酶粗酶液100μl，10mg/ml麦芽糖溶液100μl，混均，37℃温育20分钟，沸水浴2分钟终止反应。冷却后用葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖的释放量。以样品浓度(mg/ml)为横坐标，490nm的吸光度(OD490nm)为纵坐标作图绘制糖苷酶的抑制曲线。如图1所示，以该方法制备的蚕沙总生物碱的α-糖苷酶抑制活性IC50为10～30μg/ml。
葡萄糖的含量测定法(葡萄糖氧化酶法)：取待测样品10μl于200μl葡萄糖测定用工作液中(葡萄糖氧化酶试剂盒，用时制备)，37℃反应15分钟，于490nm处测定其吸光度。(在葡萄糖氧化酶的作用下，葡萄糖首先被氧化成葡萄糖酸和H2O2，H2O2催化过氧化物酶将4-氨基安替比林和酚合成红色的醌亚胺，并在490nm处有最大吸收。)
实施例9
用高效液相色谱法对一种蚕沙总生物碱的测定：
取DNJ标准品或实施例制取的一种蚕沙总生物碱1mg，分别溶于20mmol/L NaOH溶液中，采用岛津LC-10AT高效液相色谱仪进行分析。色谱条件：CarboPac PAl(250×4mm)柱；流动相，20mmol/L NaOH；流速，0.5ml/分钟；采用ED40检测器；进样量10μl。分析结果表明，蚕沙总生物碱同DNJ标准品在相同的保留时间内3.3分钟，出现洗脱峰，证明蚕沙总生物碱中含有DNJ成分(图2)。
实施例10：
一种蚕沙总生物碱对正常小鼠餐后血糖的影响
选取18～22g雄性昆明种小鼠，将其按体重随机分为正对照组(阿卡波糖)、空白对照组(生理盐水)和给药组(蚕沙总生物碱)，每组各9只，恒温条件下(24±1℃)喂养，饲以标准饲料，自由饮水。试验前16h禁食不禁水，分别取一定浓度的蚕沙总生物碱、阿卡波糖，以及生理盐水给正常小鼠灌胃，同时灌胃淀粉(3g/kg)。在给药后0，30，60，90，120分钟尾静脉采血，并收集于含有一定量肝素钠的离心管中，3000rpm离心10分钟，取上清，以葡萄糖氧化酶法测定血浆葡萄糖水平，考察蚕沙总生物碱对正常小鼠糖耐量的影响。结果如表1所示，蚕沙总生物碱在0.5～2.0mg/kg的水平上可以明显降低正常小鼠的餐后血糖水平，并可延缓血糖高峰的时间。给药30，60分钟时，给药组与对照组相比，血糖值有显著差异(p＜0.01)。
表1 蚕沙总生物碱对正常小鼠糖耐量的影响
(单位：mmol/L)给药时间 min0 30 60 90 120给药剂量 mg/kg空白对照组阿卡波糖蚕沙总生物碱 0.0 3.0 2.0 1.0 0.58.20±1.75 14.07±1.89 13.51±3.13 11.62±2.3 9.86±2.236.90±2.15 9.86±1.68** 10.32±3.12** 8.17±1.56** 6.93±2.14**7.00±l.25 9.464±2.20** 8.19±1.96** 7.85±1.24** 6.58±1.09**7.79±0.93 10.50±2.35** 9.76±2.80** 8.44±1.05** 7.55±0.79**8.13±1.79 11.50±3.06** 11.40±3.00** 9.87±1.68* 8.32±1.58*
与阴性对照组相比，*，p＜0.05；**，p＜0.01；(n＝9)
实施例11
一种蚕沙总生物碱对实验性糖尿病小鼠餐后血糖的影响
选取18～22g雄性昆明种小鼠，恒温条件下(24±1℃)，饲以标准饲料，自由饮水。18h禁食不禁水后，按200mg/kg体重腹腔注射四氧嘧啶(2.5％生理盐水溶液)，对照组腹腔注射生理盐水。48h后尾静脉取血，测定禁食12h后的血浆葡萄糖水平，将血糖值在11mmol/L以上的小鼠定为糖尿病模型鼠。将糖尿病模型小鼠随机分为3组，每组各7只，各组动物平均血糖值之差不大于0.5mmol/L，分别设糖尿病模型的阴性对照组、阳性对照组(阿卡波糖)、实验组。另取正常小鼠7只，设为正常空白对照组。试验前16h禁食不禁水，取阿卡波糖对照溶液(3mg/kg)或蚕沙生物碱(2mg/kg)和一定量的淀粉(3g/kg)同时给四氧嘧啶诱导的实验性糖尿病小鼠灌胃。分别在给药后0，30，60，90，120分钟尾静脉采血，以葡萄糖氧化酶法测定血浆葡萄糖水平，考察蚕沙生物碱对糖尿病小鼠糖耐量的影响。结果如表2所示，蚕沙总生物碱可以显著延缓血糖高峰的时间，并且降低糖尿病小鼠的餐后高血糖水平，给药30分钟后，给药组与糖尿病阴性对照组相比，血糖值有显著差异(p＜0.01)。
表2 蚕沙总生物碱对实验性糖尿病小鼠餐后血糖的影响
(单位：mmol/L)给药时间 min 0 30 60 90 120给药剂量 mg/kg空白对照组阴性对照组阿卡波糖蚕沙总生物碱 0.0 0.0 3.0 2.0 8.20±1.75 14.07±1.89 13.51±3.13 11.62±2.3 9.86±2.23 14.52±3.39 23.41±4.17 19.53±3.34 16.60±2.28 15.12±2.89 13.99±3.53 17.31±3.38** 20.48±4.14 16.52±3.48 15.60±2.95 14.49±2.93 17.93±4.43** 21.34±3.37 17.52±3.53 15.61±3.72
与阴性对照组相比，*，p＜0.05；**，p＜0.01；(n＝7)
实施例12
片剂：一种蚕沙总生物碱 100mg
乳糖 1800mg
玉米淀粉 580mg
硬脂酸镁 20mg
制备方法：将一种蚕沙总生物碱、乳糖和淀粉混合均匀，用水均匀湿润，把湿润后的混合物过筛、干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，片重250mg，活性成分含量为10mg。
实施例13
胶囊剂：一种蚕沙总生物碱 100mg
乳糖 1870mg
硬脂酸镁 30mg
制备方法：将一种蚕沙总生物碱、乳糖和硬脂酸镁混合均匀，过筛，把混合物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，活性成分含量为10mg。