通过毛囊祖细胞的注射使头发毛囊再生 相关申请的交互参考
本申请要求2001年1月29日申请的、美国临时专利申请序列号第No.60/264,806号的优先权。
关于联邦政府资助的研究或进展的声明不适用。
【发明领域】
本发明一般涉及通过促进活体皮肤中新头发的生长来治疗男性区域秃发和其它头发损失疾病的方法。更特别地，本发明涉及一种从被注射到活体皮肤内的毛囊祖细胞培养物中生长新头发的方法。
【发明背景】
男性区域秃发是一种常见疾病，其经常是通过头发的移植手术而治疗。在此过程中，来自非秃发区域的头皮内的毛囊被切除下来，并且通过再移植从而实现满头全发的梦想。事实上，在此过程中，由于能够获得用于重新分布的毛囊的数量有限，因此没有形成新头发。
众所周知，在头发毛囊内地特定亚结构中发现的特定类细胞具有促使形成完整的、正常功能的头发毛囊的能力。这些细胞被称为毛囊干细胞或者称为毛囊祖细胞。参见下列文章：R.M.Lavker等，Journal ofInvestigative Dermatology，101(1)，Supplement，July 1993，16S-26S；W.C.Weinberg等，Journal of Investigative Dermatology，100(3)，March 1993，229-235；J.Kamimura等，Journal of Investigative Dermatology，109(4)，October 1997，534-540；Lichti，A.B.等，Journal of InvestigativeDermatology，104(5)，Supplement，May 1995，43S-44S；S.H.Yuspa等，Journal of Investigative Dermatology，101(1)，Supplement，July 1993，27S-32S；和C.A.B.Jahoda等，Journal of Investigative Dermatology，101(1)，Supplement，July 1993，33S-38S。这些著述进行了各种实验工作，通过实验阐述了各种类型毛囊干细胞或祖细胞在体外和在各种生物皮肤组织中的新头发形成中的功能，此处结合这些教导。
以前对使用这一认识的尝试通常是不成功的，例如在国际公布号WO99/01034中公开了将经过培养的乳头细胞通过注射或移植到人的皮肤中的尝试，此处结合这些教导。因而，仍然需要在人的皮肤，例如头皮中，形成新的头发毛囊的方法，该方法不包括诸如皮肤或头发移植等痛苦的过程。
发明概述
一方面，本发明是一种在包括表皮和真皮层的活体皮肤中产生新头发的方法。该方法包括将毛囊祖细胞注射到皮肤中以及使该细胞长成新头发毛囊的步骤。优选的是，毛囊祖细胞以细胞簇的形式输入到皮肤中。也优选以无创伤的方式将祖细胞簇输入到皮肤中，优选输入到真皮和表皮之间的交界面处。已发现通过诸如外科切开或吸引起疱而有创移植细胞的方法，总是干扰所移植细胞的存活和/或正常的功能并且通常不能导致毛囊的诱导和头发的生长。
另一方面，本发明是一种在活体皮肤中产生新头发的方法，该方法包括如下步骤：分离毛囊祖细胞、使细胞在培养液中生长、形成细胞簇、及将该细胞簇注射到皮肤中。如上所表明的，细胞簇优选以无创伤的方式输入，优选输入到皮肤的表皮/真皮交界面处。
另一方面，本发明是一种无创移植细胞的方法，特别是将经过培养的毛囊祖细胞簇无创伤移植的方法。此方法是通过向表皮和真皮之间的交界面处注射一种液体，使表皮与真皮临时分离而产生一个基本上既没有损伤真皮也没有损伤表皮的空间或者包，因而形成了一个隆起的囊疱，及向这个充满液体的空间中注入所述的细胞簇。本领域技术人员会意识到细胞或细胞簇与囊疱生成的同时被移植入皮肤。祖细胞/细胞簇也可以在形成囊疱的真皮/表皮交界面之后被输入到囊疱。
本发明的方法使来源于病人或其它来源的毛囊，例如来源于另一个人的毛囊，经过移植后每一个毛囊能够从一个生成众多的新毛囊。更特别的是，本发明的方法提供了一种治疗男性区域秃发和其它头发损失疾病的方法。
另一方面，本发明是一种装置，该装置既是一种将所述细胞培养到一个足够大细胞簇的便利的腔，也是作为一个将所述细胞簇注射到皮肤中的工具。
通过对下面对包括附图的优选实施例的详细描述和所附的权利要求的研究，将得到本发明其它优点以及对本发明具体特征的较全面认识。
附图描述
图1是表皮(1)和真皮(2)的截面图。在视图A中，通过使用皮下注射针和注射器(4)注射例如透明质酸钠溶液，而在表皮(1)和真皮(2)之间形成一个囊疱(3)。在视图B中，用锐利的器具例如解剖刀(5)刺穿囊疱，而处在金属丝(7)末端的细胞簇(6)通过切口(8)注射到囊疱内。该金属丝(7)上有一个可帮助该细胞簇(6)沉积在该囊疱(3)内的结(9)。在视图C中，该金属丝(7)部分地从切口(8)中拉出，这样金属丝中的结(9)处在切口(8)的外面。金属丝可选择地在伤口内留置几天而作为指引表皮细胞向被注入的细胞方向生长的装置。
图2是一张在直径为0.0035英寸的316-不锈钢金属丝(11)末端的由透明质酸和明胶的交联混合物所成的结构形成赋形剂(10)放大14倍的显微照片。
图3是一张固定在直径为0.0035英寸的金属丝(11)末端的结构形成赋形剂(12)放大14倍的显微照片，其中经过培养的人真皮乳头细胞被种植在该赋形剂上，并且在培养液中生长10天，以产生团块，该团块是细胞和部分降解的赋形剂的混合物。
图4是一张用于注射细胞团块装置的示图，其中，细胞团块/赋形剂结合物(12)固定在金属丝(11)的末端，并且填塞在透皮注射器的针头(13)中。此针头有一个短的、带有特别锋利的尖端(15)的皮内斜面(14)。用此装置穿过囊疱后，在推动金属丝(11)的同时退出针头(13)。金属丝(11)上的结(16)可防止细胞团块随金属丝后退，以确保细胞团块沉积在囊疱内。
定义
本发明使用的术语“注射”定义为使用任何装置，通过破裂、切割、突破、刺破或其它可打开人体皮肤表面的任何方法，在皮内或者在皮下沉积物质的任何过程。破裂所述皮肤和沉积所述物质的步骤可使用相同的装置或不同的装置完成，可同时进行、可在快速的过程中分别进行、或者可在两个步骤之间的时间间隔后进行。
本发明使用的术语“细胞”或“细胞注射”或“部分细胞”，是下列的任何一种：
一种或更多种类型细胞的一种或更多种簇或团块，其基本上在添加或没有添加结构形成赋形剂(q.v)下通过单个细胞互相粘附而形成。
基本上为球形或念珠状的细胞簇或细胞团。
细胞簇，其中在每个细胞簇中两种或更多不同种类的细胞被组织起来以提供由两个或更多部分组成的结构，每一个部分主要由一种类型的细胞构成。
本发明使用的术语“祖细胞”定义为具有可转化成为更高特异性的细胞和/或新的细胞、以及将周围细胞转化成特异性组织的能力的任何种类的细胞。由于在适当条件下真皮乳头细胞能够在以前不存在发囊的地方诱导头发毛囊的形成，因而它们被认为是祖细胞。
本发明使用的术语“头发毛囊再生”或“毛囊再生”被定义为在以前不存在有功能发囊的皮肤中新的、有功能的头发毛囊的生成。
本发明使用的术语“结构形成赋形剂”被定义为任何无毒的、组织相容的、药学上可接受的、可生物吸收的物质，该可生物吸收的物质在与活细胞混合之前、或者在加入到活细胞之前基本上为液体，而在加入到活细胞后、或与活细胞混合后成为凝胶状的、纤维性的、或者基本上是非液体。结构形成赋形剂也指在加入到活细胞前是固体的、凝胶状的、纤维性的、或者基本上是非液体的而随后液化、或者成为可生物吸收的任何物质。结构形成赋形剂的功能通常是通过支持、胶囊包裹、固定或者其它的方式引起或促进细胞的聚集或生长从而使所述细胞聚集或者成簇以便于形成细胞簇或者细胞团块。
这里所使用的术语“囊疱”定义为通过注射一种无毒的、与身体相容的液体而形成的在皮肤表皮和真皮之间充满液体的空间、包、腔、室或者囊。术语“囊疱的形成”在这里是指基本上没有对上面的表皮和下面的真皮造成持续损害即无创伤的良性的、暂时的情况。
发明的详细说明
本发明包括一种诱导新头发毛囊的生长的方法，该方法通过将毛囊祖细胞注射到在希望长出新头发的皮肤中的囊疱内，从而长出正常的、有美容作用的头发。具有这种诱导毛囊能力的细胞可直接注射到皮肤中的囊疱内，例如以细胞与结构形成赋形剂组合的悬液、或者以预形成的细胞团块或凝块的形式使用皮下注射针注射，该预形成的细胞团块或凝块或者不含结构形成赋形剂或者是与结构形成赋形剂结合而成的，当所述细胞在体外培养时，该结构形成赋形剂在一段时间内能够基本溶解或者降解。
在优选的实施例中，本发明包括一种头发毛囊再生的方法，其包括以下步骤：
a)从头发毛囊的活体组织中提供毛囊祖细胞；
b)培养该祖细胞以增加其数量；
c)使经培养的细胞形成细胞簇；
d)在希望有一个或者更多新发囊的皮肤部位的表皮和真皮交界面处形成囊疱；及
e)将细胞簇的一部分注射到该囊疱中。
上述步骤a)中提供的毛囊祖细胞，优选是从人体的发囊活体组织中获得的。提供头发毛囊活体组织的病人优选与步骤e)中接受细胞注射的是同一人。然而，从无论是活体的还是死亡的器官捐赠人或者其他个体中获得毛囊是可能的，由于毛囊祖细胞具有“免疫豁免权”，而且通常不会作为异种组织被排斥，所以这种方法将是可行的。当患有某种头发缺失的疾病时，如果病人剩余的毛囊中没有可以作为活体组织的毛囊，或者如果病人不关心复制的质量或者他或她现有头发的颜色时，特别需要使用器官捐赠人的毛囊。
在本发明的方法中适宜使用的祖细胞位于头发毛囊结构中，例如位于真皮乳头、真皮鞘和膨出区。可以预见到，那些通常不被认为是祖细胞的其它细胞也能够从活体组织标本中被收集、被培养并随着祖细胞培养物注射到人体中。例如，包含表皮干细胞可能对促进更快诱导毛囊再生有用。对本发明中培养祖细胞方法的各种有益的改进是可以预见的。通过使用生长因子、调节介质、遗传工程细胞和添加各种佐剂和活性试剂，也可以提高细胞诱导头发毛囊再生的能力。
关于上述步骤(b)，通常认为毛囊祖细胞重复多次培养能够导致毛囊诱导能力的损失。因此，从每个独立毛囊分离的结构培养物中能够获得的细胞的数量是有限的。然而，对于严重秃发的人来说，有可能获得来自使用本发明的方法后新生头发的毛囊活体组织，从而在过程中继续头发的恢复过程直到获得所需的结果。因而，本身就是前期细胞的祖细胞可以在步骤(b)和(a)中使用。此外，可以预见，用于消除培养细胞发囊诱导能力限制的技术的发展，例如，在细胞的重复传代中使用特异性的发育调节介质。本发明对这种改进是可以预见的。
步骤(c)可能有许多种方式来完成。例如，细胞簇的形成可从基本上为单个细胞悬液通过(1)胶囊包裹而形成；(2)向细胞中加入结构形成赋形剂；(3)存在结构形成赋形剂时，在体外培养细胞一段时间，从而导致细胞之间互相粘附、结构形成赋形剂基本溶解并且被细胞产生的细胞外基质所替代。
对于步骤(d)，在细胞注射前形成囊疱的优选方法是：首先用一个热敷布削弱表皮和真皮之间的可逆性键，接着用标准规格的细针的针头最低限度地刺透皮肤，向皮肤内注射1％(重量/体积)如透明质酸、钠盐、磷酸盐缓冲溶液。透明质酸的优点是它的粘性保护了由于随后的机械创伤所导致的表皮下表面的脆弱，并且其高分子量延缓了液体再吸收过程。其它的高粘性材料如天然的和合成的聚乙二醇、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、和其它多糖、粘多糖、蛋白质、糖蛋白、及类似的聚合物都可以替代透明质酸。
对于上述步骤(e)，注入的细胞团块或者细胞簇的数量、每个簇的大小、以及注射液体的体积和成分需要优化以便获得最好的结果。本方法步骤(e)中注入的细胞部分可与包含结构形成赋形剂的液体组合，以使该液体在注射部位转化成固体。这可用于保护被移植的大部分细胞不被创伤性后的炎症所破坏。由于细胞暂时被人工基质所包围，所以炎症被限制在移植物的表面。这样，越位于中心的细胞，越不会被短时间破坏性的组织反应所破坏。结构形成赋形剂优选药学上可以接受的载体。优选其固体可被生物吸收的结构形成赋形剂，以便于一旦被注射到人体内，在注射部位形成的结构会随时间逐步被吸收。
这种结构形成赋形剂的实例是可注射的胶原(ZydermTM，CollagenAesthetics，Inc.)。将这种产品与经过培养的人纤维细胞结合并且注射到无胸腺的小鼠体内，成功地诱导出可以看见的填满空间的移植物。经过培养的成纤维细胞单独皮下注射能够存活，并且是公认的首选细胞，但是当其没有与胶原赋形剂结合时，会发生中心结节样坏死。胶原基质可提供一种有益于细胞功能和在体内存活的间质组织。
Remmler D，Thomas JR，Mazoujian G，Pentland A，Schechtman K，Favors S，and Bauer E在“Use of Injectable Cultured Human Fibroblasts forPercutaneous Tissue Implantation.An experimental study，Arch OtolaryngolHead Neck Surg 1989 Jul；115：837-44”的文章中公布了这些结果，在此结合这些教导。
其它结构形成赋形剂包括PluronicTM表面活性剂，其是由聚(氧化乙烯-氧化丙稀)的水溶性聚合物，该聚合物具有与体温一致的临界溶液温度。因而细胞团块能够悬浮在冷的Pluronic溶液中，然后被注射。然后，注射的液体被升温而成为水凝胶，从而将细胞团块稳定在基质中以帮助细胞团块在最初的移植创伤中存活。
其它温度可逆性水凝胶是公知的，例如基于N-二甲基异丙基丙烯酰胺所成的水凝胶。这些聚合物经过化学修饰能够被生物吸收，并且具有适当的降解率。
其它在体内注射后能够在原位形成结构的结构形成赋形剂，包括各种两部分交联的液体体系。在这种情况下，注射装置需要将两个注射器连接到一个双管的皮下注射针头上。细胞团块将悬浮在一种组分、A部分(例如，一种含有可交联可生物吸收的聚合物的组分)中，而另一种组分、B部分含有交联剂。聚合物和交联物能够从各种具有生物可容性并可生物吸收的物质中选择。例如，A部分可以是纤维蛋白原而B部分可以是凝血酶。另一对在本发明的实施例中有用的成分是人血清白蛋白和聚(乙二醇)-双琥珀酰亚胺酰基琥珀酸。
另一个选择使用结构形成赋形剂的时机是在体外培养细胞形成指定大小和形状细胞团块的早期。在这种情况下，需要一种固体的、多孔的赋形剂以为细胞粘附提供大表面积。随着细胞的生长、繁殖和细胞通过天然细胞外基质产生的相互附着，起构架作用的赋形剂基本上被生物吸收并且被细胞外基质物质所替代。
由于上述原因，在本发明的方法中使用的任何赋形剂优选选自：胶原、热逆变水凝胶、化学交联的可生物吸收的聚合物、原位交联的水凝胶、纤维蛋白原、凝血酶、糊精、直链淀粉、透明质酸、明胶、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、多糖、粘多糖、蛋白质、糖蛋白、以及上述的任何衍生物、共聚物或其它变体。
对随注射的细胞一起移植的材料的进一步选择涉及与控制毛干出口和皮肤之间角度的方法。众所周知，头皮不同区域的头发的角度是变化的，并且这些角度的一致性和可调控的变异对满头全发的美容外观是很重要的。因此，本发明对因毛囊再生而长出的新发干便于调控其从皮肤中长出的方向和角度的细胞移植方法的改进是可以预见到的。
实施例2中阐述了这样一种方法，即将不锈钢细金属丝在皮肤内留置几天，使表皮向下生长。这种生长不仅保证了表皮细胞与移植的毛囊祖细胞之间相互作用，而且提供通向皮肤表面、作为毛囊的生长方向和发干角度调控的向导的通道。也可以预见到，由于不需要移去，其它如由合成的或天然可被生物吸收的聚合物构成的残留纤维有特殊的作用。
在下面的实例中进一步阐述本发明，但是这些实例不能被认作是对本发明范围的限制。
实施例1：注射装置的制备
在男性区域秃发患者脑后长有头发的头皮处进行4毫米直径、厚度一致的活体组织皮肤钻孔。将毛囊球从毛囊中切下来，并且将真皮乳头分割出来。根据A.G Messenger，British Journal of Dermatology，110，685-689(1984)描述的方法在培养液中将真皮乳头细胞(DP细胞)扩增，这篇文章的教导在此结合起来参考。
本发明的装置在图4中说明了，其制备过程如下：100毫克透明质酸钠和100毫克猪皮明胶溶解在蒸馏水中制成100毫升溶液(HA-明胶溶液)。将低分子量的聚(d，1-丙交酯-50％乙交酯)(PLGA)颗粒研磨，筛选大小在100-200微米范围的颗粒，与HA-明胶溶液混合形成稠糊状物。用一个30摄氏度、包含直径为0.0035英寸的长丝结节的不锈钢金属丝将糊状物填充在18口径皮下注射针头的尖端，并且使其完全干燥。
PLGA颗粒溶于二氯甲烷中，剩余的HA-明胶赋形剂通过浸在0.1％(重量/体积)的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)溶液中交联，EDC溶于丙酮和水分别是90∶10(重量/体积)的混合液中。然后，此装置用丙酮漂洗并浸在70％异丙酮/水溶液中灭菌，再用无菌水漂洗。用针头上暴露的HA-明胶赋形剂将经过培养的融合层的DP细胞刮离培养皿，加入到该装置中。然后，种植细胞的针头置于一瓶培养基中，使要转移的细胞生长和繁殖约一周，在此期间细胞之间互相附着，而HA-明胶赋形剂充分降解和溶解。
实施例2：培养细胞的注射
一小块光秃的头皮首先用温水软化，并用EmiaTM利多卡因乳膏(Astra Pharmaceutical Products，Inc.，Westborough，MA 01581)麻醉，覆盖TegadermTM敷料(3M，St.Paul，MN 55144)约30分钟。然后，将头皮擦干净，接着拭抹70％异丙醇。在首先用热敷布将皮肤变暖后，将透明质酸钠溶液(HealonTM，Pharmacia-Upjohn，Kalamazoo，MI 49001)注射到希望头发生长的地方。然后，用在实施例1中如上描述的含有DP细胞团块的针头刺破形成的囊疱。在退出针头时握住细金属丝确保注入的细胞团块没有随针头退出。然后移走金属丝直至该结在穿孔伤口的外面。移走金属丝，从而完成整个过程，或者可选择地，金属丝用TegadermTM敷料粘牢在皮肤上留置在伤口内，大约5天后将金属丝移走以提供朝向被移入的细胞的表皮生长。在头皮上能够产生多个囊疱，在每个囊疱中多次注射细胞从而获得希望密度的新头发。
注射后的大约8周，头发毛囊的再生就完成了，患者能够开始体验新的、组织工程的头发的生长，该生长的头发完全正常而且与供体部位的头发一样。
虽然现在对本发明已经进行了描述，而且用一些具体的实施方案进行举例，但是本领域的技术人员根据所描述的将会得出包括变化、添加和省略在内的各种改变。因此，这些改变也将被本发明所涵盖，并且本发明的范围仅可依法根据所附的权利要求做最广义的解释所定义。