一种使小繁缕在培养瓶内结籽的方法 【技术领域】
本发明涉及植物育种领域，更特别的，本发明是一种使小繁缕在培养瓶内结籽的方法。
背景技术
在现有技术中，单倍体育种技术主要是以小孢子处于单核期的花药为材料接种到诱导培养基上，使小孢子细胞分化后分裂形成愈伤组织或胚状体，再转入分化培养基诱导成苗，然后转至生根培养基诱导生根，形成完整植株，再移栽到田间育种。移栽前后可进行加倍处理，以获得纯合二倍体植株后代。
然而，由于现有的单倍体育种技术要将植株移栽到田间才能结出种子，这就在一定程度上造成以下的缺陷：(1)所需时间较长；(2)需要相当面积的试验田来移栽植株；(3)在试验田培育将会受到自然条件的影响，如果移栽到温室则育种成本非常的高。
因此，如果可以使植物在培养瓶内直接结出种子，这样就不必再移栽到田间去育种了，从而不仅不需要试验田用地、节省了人力物力，还使植株的培育不受到不可预测环境因素的影响，并且很大程度降低了育种所需成本。
小繁缕属于石竹科，繁缕属，为二年生草本，苗期10-11月，花期3-4月，果期4-5月。二歧聚伞状花序，无花瓣，果实成熟后开裂，种子散落土壤，种子细小，径约0.55mm，红褐色，圆肾形。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题在于提供一种使小繁缕在培养瓶内结籽的方法，在本发明的使小繁缕在培养瓶内结籽的方法包括：
(1)配制适合小繁缕生长的培养基；
(2)将小繁缕植株组织栽种在含有(1)所述培养基的培养瓶中；
(3)将(2)所述的包含植株组织和培养基的培养瓶置于一定的温度和光照条件下，使植株生长；
(4)观察生长情况，直至植株结籽。
本发明使用的小繁缕无菌苗可以通过外植体灭菌培养而成，将小繁缕无菌苗分割成一段茎带一片叶子的小段。
在本发明中，培养基可以选择适合所培养植物生长的成分作为配制原料，培养基内还可以加入诸如生长素(如IBA、NAA、6-BA)、细胞分裂素等有利于植物生长发育的成分。经过发明人多种条件多次试验，结果发现，在培养小繁缕时，培养基可以选用MS培养基(配方参照《植物组织培养技术》32页，其中蔗糖和琼脂另加，上海科学技术文献出版社，1995)，在所述的培养基还添加IBA、NAA、6-BA、蔗糖和琼脂。
在本发明中，培养小繁缕地光照条件可以为210-4500LX，作为本发明的一种优选方式，培养小繁缕的光照条件选择2400LX-2600LX。
在本发明中，培养小繁缕较适宜的温度为16-28℃，作为本发明的一种优选方式，培养小繁缕的温度条件选择20-24℃(即22±2℃)。
本发明所述的方法使小繁缕植物在培养瓶内直接结出种子，这样就不必再移栽到田间去育种。使用本发明的方法，不仅不需要试验田用地、节省了人力，还使植株的培育不受到不可预测环境因素的影响，并且很大程度降低了育种所需成本。
【附图说明】
图1显示了实施例1中培养架1小繁缕的平均每瓶结籽数；
图2显示了实施例1中培养架1小繁缕的结籽比率；
图3显示了实施例2中小繁缕的平均每瓶结籽数；
图4显示了实施例2中小繁缕的结籽比率。
【具体实施方式】
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 不同条件下小繁缕植株的培育试验
1.设计并配制F系列培养基，每种培养基各分装20瓶备用。培养基的配
方如下表(表1)：
表1
F1 MS+IBA(1.0mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(4g/L)
F2 MS+IBA(0.5mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(4g/L)
F3 MS+IBA(0.1mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(4g/L)
F4 MS+IBA(0.02mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(4g/L)
F5 MS+NAA(0.5mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(4g/L)
F6 MS+NAA(0.1mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(4g/L)
F7 MS+NAA(0.02mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(4g/L)
F8 MS+6-BA(2.0mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(4g/L)
F9 MS+6-BA(1.0mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(4g/L)
F10 MS+6-BA(0.5mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(4g/L)
F11 MS+蔗糖(30g/L)+琼脂(4g/L)
2.将小繁缕无菌苗分成一段茎带一片叶子的小段，每瓶培养基中接3段，分别放在4个区域培养(表2)，光照时间都为12个小时。
表2
区域 每一种培总瓶数 光照强度(LX) 温度(℃)
养基瓶数
培养架1 5 55 2500 22±2
培养架2 5 55 210 22±2
培养箱1 5 55 4500 22±2
培养箱2 5 55 4500 16±2
根据表2，培养架1、培养架2和培养箱1可以比较相同温度不同光照强度的生长情况，培养箱1和培养箱2可以比较相同光照强度不同温度的生长情况，而相同的光照和温度下就可以比较不同培养基内的生长情况。每隔7天对每一瓶小繁缕做一次观察记录。
结果发现，培养架1中的F2(1瓶)有一透明桃形囊，内有籽数粒；F4(3瓶)其中一瓶有桃形囊2个，内有籽数粒，另有籽6粒在培养瓶内，红褐色，一瓶有籽1粒在培养基上，一瓶，有桃形囊1个，内有籽数粒，有1粒籽落在培养基上；F7(1瓶)有籽一粒在培养基上；F11(2瓶)其中一瓶有籽3粒落在培养基上，另一瓶有籽6粒落在培养基上；
在F1，F5，F6，F8，F9，F10内培养的小繁缕，无论是在培养架还是培养箱处的，不但没有结籽，而且都表现为植株矮小，叶片也很小，甚至有的植株发黄，濒临死亡。
清点各瓶内籽的数目见下表(表3)：
表3
培养架 培养架 培养架 培养架 培养箱 培养箱 培养箱 培养箱
1平均 1结籽 2平均 2结籽 1平均 1结籽 2平均 2结籽
每瓶结 比 率 每瓶结 比 率 每瓶结 比 率 每瓶结 比 率
籽 数 (％) 籽 数 (％) 籽 数 (％) 籽 数 (％)
(粒) (粒) (粒) (粒)
F1 0 0 0 0 0 0 0 0
F2 26/5 20 0 0 0 0 0 0
F3 0 0 0 0 0 0 0 0
F4 21/5 60 0 0 0 0 0 0
F5 0 0 0 0 0 0 0 0
F6 0 0 0 0 0 0 0 0
F7 1/5 20 0 0 0 0 0 0
F8 0 0 0 0 0 0 0 0
F9 0 0 0 0 0 0 0 0
F10 0 0 0 0 0 0 0 0
F11 9/5 40 0 0 0 0 0 0
培养架1上各培养基的结籽情况图见图1和图2。很明显，培养架1的培养条件(2500LX，22±2℃)是较适合小繁缕在培养瓶内结籽的。可以看出太低的光照强度(210LX)和太高的光照强度(4500LX)都不利于小繁缕的结籽，而对于温度来讲，由于培养箱1和培养箱2的结籽情况都不好所以不能比较，但根据培养架1的情况，22±2℃适合于小繁缕的结籽。所以在下述的实施例2中使用了(2500LX，22±2℃)的培养条件。
可见，在2500LX，22±2℃的培养条件下，F2，F4，F11培养基较适合小繁缕的结籽，其中F11是MS培养基，说明不加任何植物生长素和细胞分裂素也能使小繁缕在培养瓶内结籽。另外F2、F4的结籽情况都较好，但F3所含的IBA浓度(0.1mg/L)是界于F2(0.5mg/L)和F4(0.02mg/L)之间的，而F3没有一瓶结籽，这可能是由实验失误造成。
在F7内培养的小繁缕有一瓶结了一粒籽，说明NAA浓度较低(0.02mg/L)时，小繁缕是可以正常生长并结籽的。在F1，F5，F6，F8，F9，F10内培养的小繁缕，不但没有结籽，而且都表现为植株矮小，叶片也很小，甚至有的植株发黄，濒临死亡，这说明生长素的浓度太高(NAA：0.1mg/L以上，IBA：1.0mg/L以上)会抑制小繁缕的生长，使之不能结籽，甚至使其死亡；同样的细胞分裂素的浓度太高(6-BA：0.5mg/L以上)也会抑制小繁缕的生长使之不能结籽，甚至使其死亡。
实施例2 小繁缕在培养瓶内生长的验证试验
为了确证实施例1的初步结果不是纯属偶然的，发明人又进一步做了以下的验证实验。
1.配制R系列培养基，配方如下(表4)：
表4
R1 MS+IBA(1.0mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(4g/L)
R2 MS+IBA(0.75mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(4g/L)
R3 MS+IBA(0.5mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(4g/L)
R4 MS+IBA(0.1mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(4g/L)
R5 MS+IBA(0.02mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(4g/L)
R6 MS+NAA(0.02mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(4g/L)
R7 MS+蔗糖(30g/L)+琼脂(4g/L)
2.将小繁缕无菌苗分成一段茎带一片叶子的小段，每瓶培养基中接3段，每一种培养基接5瓶，并标上序号，放在2500LX，22±2℃条件下培养。每隔7天对每一瓶小繁缕做一次观察记录。
91天后，结籽情况如下(表5、表6)：
表5
第一瓶结 第二瓶结 第三瓶结 第四瓶 第五瓶结
籽数(粒) 籽数(粒) 籽数(粒) 结籽数 籽数(粒)
(粒)
R1 0 0 0 0 0
R2 0 0 0 0 0
R3 0 9 0 13 0
R4 7 0 9 1 21
R5 8 0 17 2 0
R6 0 2 0 0 0
R7 11 6 0 0 9
表6
平均每瓶结籽数＝ 结籽比率＝
总粒数/总瓶数 结籽瓶数/总瓶数(％)
R1 0 0
R2 0 0
R3 22/5 40
R4 38/5 80
R5 27/5 60
R6 2/5 20
R7 26/5 60
结籽情况图见图3和图4。可见R3(原来的F2)、R5(原来的F4)、R7(原来的F11)结籽情况较好，这与我们的第一次实验结果是一致的，说明我们第一次的实验结果并不是偶然现象；其中R4(原来的F3)结籽情况也较好说明第一次实验F3没有结籽可能是实验失误造成的；R6(原来的F7)虽然也有结籽但只有一瓶结了2粒。R1(原来的F1)不但没有结籽，而且都表现为植株矮小，叶片也很小，甚至有的植株发黄，濒临死亡，这与我们的第一次实验结果也是一致的。
R2也不但没有结籽，而且都表现为植株矮小，叶片也很小说明生长素IBA：0.75mg/L的浓度会抑制小繁缕的生长。
综合实施例1以及实施例2的结果可发现：
1.小繁缕在MS或者MS加生长素(IBA：0.5mg/L)以下的培养基里，在光照2500LX，温度22±2℃的培养条件下是可以结籽的。
2.生长素的浓度太高(NAA：0.1mg/L以上，IBA：0.75mg/L以上)会抑制小繁缕的生长，使之不能结籽，甚至使其死亡；同样的细胞分裂素的浓度太高(6-BA：0.5mg/L以上)也会抑制小繁缕的生长使之不能结籽，甚至使其死亡。
3.在MS+NAA(0.02mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(4g/L)培养基内，小繁缕两次都结籽了，但结籽数分别只有1粒和2粒，即可能NAA(0.02mg/L)的浓度适合小繁缕的生长，但不太适合小繁缕的结籽。
4.本实施例中，把实施例1中结的籽移入MS培养基，在光照2500LX，温度22±2℃的培养条件下培养。结果发现这些籽能在培养瓶内发芽，并长大，并且同样能在培养瓶内结籽。这说明单倍体育种是可以完全在培养瓶内进行的，如果在培养瓶内进行单倍体育种，就不用将植物移栽到大田里受自然条件的影响，同时可以大大的缩短单倍体育种的时间。