一种筛选具有抗菌活性的肽类物质的方法.pdf

本发明提供了一种准确、快速从天然产物中筛选具有抑菌生物活性的蛋白质多肽类物质的方法。克服了现有技术不能有效解决筛选速度、通量、准确率三者统一的弱点。该方法包括了等电聚焦,恒压电泳,电印迹,细菌培养及微量鉴定,将高通量的分离方法和高精度的活性锁定方法结合起来,能够在细胞水平上直接筛选出具有抑菌生物活性的蛋白质或多肽,运用该方法每循环的操作时间约为一周。

1.一种筛选具有抗菌活性的肽类物质的方法，该方法的步骤为：
A：将蛋白质组样品经过丙酮预处理以降低杂质含量；
B：将处理过的样品在非变性条件下进行等电聚焦IEF，IEF之后
从凝胶上切下两根宽度相同的IEF胶条，在缓冲液A中平衡后进行
第二向的聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺制备
非变性凝胶，上槽缓冲液的组分为Tris-base，Tricine和SDS，恒压电
泳至溴酚蓝前缘到达底部；
C：将PAGE所得的两块胶分别处理，一块胶用考马斯亮蓝CBB
染色，脱色后用做备份，另一块胶则经电印迹，将蛋白质斑点转移到
NC膜上，使用不含SDS的缓冲液A；
D：经过0.01～0.2M Tris-Cl，pH＝7.5的缓冲液漂洗除去SDS，
将NC膜真空干燥；
E：在NC膜上均匀地分布细菌，使其密度达到1×103～1×
105CFU/mm2后，将膜置于牛肉膏固体培养基上培养，该培养基含显
色剂；同时含有细菌生长所需的底物，该底物经细菌代谢能产生酸性
或碱性产物；在NC膜上正常生长的细菌由于其代谢产物呈酸性因而
在其周围呈亮黄色，而有抗菌肽斑点的地方细菌生长受抑制，故而和
周围呈现出色差，为暗色的斑点；
F：将NC膜上的斑点与双向电泳所得到的凝胶上的斑点相对照，
将凝胶上对应于NC膜上抗菌肽色斑的斑点切下，然后对这些斑点用
质谱指纹图，N端序列分析，氨基酸组成分析进行微量鉴定。
2.按权利要求1所述的筛选具有抗菌活性的肽类物质的方法，其特
征是步骤B的所指的缓冲液A的组分为0.05～0.2M Tris-base，
0.05～0.2M Tricine，3～5mM SDS，pH＝9.0；在缓冲液A中平衡时间
为20～30分钟，非变性凝胶是使用8～16％的丙烯酰胺及3.3％的甲
叉双丙烯酰胺制备，pH＝9.0；上槽缓冲液为0.01～0.2M Tris-base，
0.05～0.2M Tricine，1～2mM SDS，所指的恒压电泳的电压为150V。
3.按权利要求1或2所述的筛选具有抗菌活性的肽类物质的方法，
其特征是步骤C的所指的电印迹的使用电压为50V，电印迹的时间为
1～2小时，缓冲液A的pH＝9.0；
4.按权利要求1或2或3所述的筛选具有抗菌活性的肽类物质的方
法，其特征是步骤E所指的显色剂为0.00025％～0.025％溴百里酚兰，
0.00025％～0.025％酚红，所指的底物为0.5～3％甘露醇。
5.按权利要求1或2或3所述的筛选具有抗菌活性的肽类物质的方
法，其特征是步骤E所指的在牛肉膏固体培养基上培养，其培养温度
为37℃，培养时间为18～48小时；所指的显色剂为0.00025～0.025％
中性红和0.00025～0.025％结晶紫，所指的底物为0.5～3％甘露醇。
6.按权利要求1或2或3所述的筛选具有抗菌活性的肽类物质的方
法，其特征是步骤E所指的显色剂为0.00025～0.025％5-溴-4-氯-3-
吲哚基磷酸盐，所指的底物为0.5～3％甘露醇。
7.按权利要求1或2或3所述的筛选具有抗菌活性的肽类物质的方
法，其特征是步骤E所指的显色剂为0.00025～0.025％四氯化三苯四
氮唑，所指的底物为0.5～3％甘露醇。

一种筛选具有抗菌活性的肽类物质的方法

技术领域

本发明是一种准确、快速筛选具有抗菌活性的肽类物质的方法，
它主要应用于抗菌蛋白、抗菌肽类物质的初期筛选。