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本发明涉及氟尿嘧啶经体外对HIV诱导C8166形成合胞体的抑制活性；以MTT方法测定其对C8166或MT－4细胞存活和增殖的影响；对HIV－1感染细胞死亡的保护作用实验；以定量ELISA检测其对HIV－1p24表达的抑制作用实验等一系列实验，初步证实氟尿嘧啶具有制备治疗艾滋病药物的新用途。

1.  氟尿嘧啶在制备治疗艾滋病药物中的应用。

氟尿嘧啶在制备治疗艾滋病药物中的应用
                       技术领域
本发明涉及氟尿嘧啶在制备治疗艾滋病药物中的应用。
                       背景技术
众所周知：艾滋病是近二十年来全世界流行最快、最广、危害人类生命最严重的传染病。艾滋病全称“获得性免疫缺陷综合症”(acquied immuodeficiency syndrome)，简称AIDS。1981年，首例艾滋病病例在美国同性恋人群中发现。我国自1985年发现第一例艾滋病人以来，每年艾滋病感染人数呈几何级数增长，现已达80万以上。经各国科学家努力，在HIV病毒的生物化学结构和致病作用机制研究方面取得突破性进展，HIV属逆转录病毒(retroviruses)，主要感染T4细胞和巨噬细胞，其繁殖周期包括：1，病毒吸附于细胞表面的受体分子(吸附)；2，病毒的核衣壳侵入宿主细胞(合胞)；3，在逆转录酶作用下，病毒双链DNA的合成(合成)；4，病毒双链DNA及与其相连的病毒蛋白进入细胞核；5，病毒DNA整合于宿主染色体形成前病毒(整合)；6，在宿主RNA聚合酶作用下，合成病毒RNA；7，RNA转录、加工、运输；8，病毒多聚蛋自前体的合成及毒粒的装配；9，病毒出芽及包膜形成；10，毒粒的成熟(张兴权，范江主编.艾滋病毒感染与艾滋病。人民卫生出版社.1999：39)。以上各个环节均可作为抗艾滋病药物研究的作用靶点，至1997年国外共有42种药物被FDA批准用于HIV感染和艾滋病相关疾病的治疗，其中11种为抗艾滋病药物(郑永唐.贲昆龙.大自然探索.1998.17(4)：79-85)，主要为逆转录酶、蛋白酶抑制剂；迄今为止，在我国还没有一种天然或合成化合物被批准用于治疗艾滋病。
由于目前尚无理想的HIV疫苗，所以抗艾滋病药物治疗艾滋病成为目前治疗艾滋病的唯一手段，抗艾滋病药物研究成为药物研究的热点课题。
氟尿嘧啶又称为5-氟尿嘧啶、5-FU、5-Fluorouracil。氟尿嘧啶是临床常用的广谱抗肿瘤药物，对胃肠道、头颈部、肝、乳腺、胰腺、泌尿系统的肿瘤有治疗作用，还对宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、绒毛膜上皮癌有治疗作用。氟尿嘧啶通过抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶而抑制DNA的合成，对RNA的合成也有一定的抑制作用(高恩民主编.临床多用药物手册.郑州大学出版社.2003；534)。
                       技术内容及其它
本发明的目的在于提供氟尿嘧啶在制备治疗艾滋病药物中的新应用。
本发明研究用氟尿嘧啶和世界首选抗艾滋病药物AZT作为阳性对照，测定氟尿嘧啶、AZT体外对HIV诱导C8166形成合胞体的抑制活性；以MTT方法测定氟尿嘧啶、AZT对C8166或MT-4细胞存活和增殖的影响；测定氟尿嘧啶、AZT对HIV-1感染细胞死亡的保护作用；以定量ELISA检测氟尿嘧啶、AZT对HIV-1p24表达的抑制作用。然后用IC₅₀/EC₅₀得到它们的治疗指数TI值，以确定在上述实验条件下它们对HIV病毒的抑制活性。现分述如下：
本发明研究使用：
实验室
中科院昆明动物研究所免疫室的P3实验室。
试剂和溶液
(1)试剂：MTT[3，(4，5-dimethylthiazol-2-y1)-2，5 diphenyl tetrazolium bromide]购自Amresco公司；
SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)为Serva产品；DMF(N，N′-Dimethyl formamine)，分析纯，购自上海化学试剂公司；阳性对照药物AZT购自Sigma公司。
(2)溶液：RPMI-1640完全培养基，含有10％新生小牛血清(NCS)购自Gibco.2m ML-谷氨酰胺(Mr.＝146.015)，10Mm HEPES(Mr.＝238.3)，50μM；2-巯基乙醇，100，000IU青霉素，100μqg/ml硫酸链霉素(Mr.＝1457.38)。
药物
氟尿嘧啶为上海华联制药公司生产。药物溶于去离子水中，过滤除菌，4℃保存，浓度为5mg/ml、2mg/ml。
细胞和病毒
C8166、MT-4和HIV-1 III_B/H9均由英国MRC，AIDS Reagent Project惠赠。按常规方法制备HIV-1 III_B，滴定并计算出病毒的TCID₅₀。病毒贮存液分装后，置-70℃保存。细胞和病毒均按常规方法冻存和复苏。
病毒感染性的滴定
HIV-1按Johnson & Byington(1990)所述方法改良进行滴定，简述如下：将HIV-1贮存液在96孔板上作4倍稀释，10个梯度，每梯度6个重复孔，每孔加入C8166细胞50μl(3×10⁵/ml)，每孔终体积200μl 37℃，5％CO₂培养。第二天补加新鲜RPMI-1640培养基100μl。第七天在倒置显微镜下观察每孔中HIV-1诱导细胞病变效应(Cytopathic effect，CPE)，以每孔是否有合胞体(syncytium)的形成进行判断；按Reed &Muench方法计算病毒的TCID₅₀，(50％Tissue Culture Infection Dose)，及引起细胞出现CPE的病毒上清稀释度。
氟尿嘧啶对C8166的细胞毒性检测
4×10⁵/ml C8166细胞悬液100μl与不同浓度的药物溶液混合，同时设置阳性药物AZT对照孔、不含药物的对照孔和空白对照孔，37℃，5％CO₂培养3天，采用MTT法检测细胞存活率。ELx800 ELISA Reader测定OD_595/630nm值。计算CC₅₀值(50％CytotoxicConcentration)即50％细胞存活时的药物浓度。
氟尿嘧啶对HIV-1诱导C8166细胞形成合胞体的抑制试验
4×10⁵/ml C8166细胞悬液50μl与不同浓度的药物溶液混合，加入50μl HIV-1稀释上清50μl，M.O.I.为0.06，同时设置不含药物的对照孔及阴性对照孔，设置阳性药物AZT对照。37℃，5％CO₂培养二天，倒置显微镜下(100×)计数合胞体个数。计算EC₅₀值(50％Effective Concentration)即抑制合胞体形成50％时的药物浓度。
氟尿嘧啶对HIV-1感染MT-4细胞死亡的保护作用
8×10⁵/ml MT-4细胞悬液50μl与100μl不同浓度的药物溶液混合，培养板的一半孔加入50μl培养基，另一半孔加入50μl HIV-1稀释上清，M.O.I.为0.06，同时设置不含药物的未感染或感染HIV-1的细胞对照孔及空白对照孔，设置阳性药物AZT对照，37℃，5％CO₂培养5天，采用MTT法检测细胞存活率。ELx800ELISA Reader测定OD_595/630nm值。计算药物对正常细胞的存活率和HIV-1感染细胞的保护率。
氟尿嘧啶对HIV-1 III_B在急性感染C8I66细胞中复制的抑制试验
8×10⁵/ml C8166细胞50μl/孔接种到含有100μl/孔倍比稀释化合物的96孔板上，然后加入50μl的HIV-1稀释上清，1300TClD₅₀/孔。同时设置不含化合物的对照孔。37℃，5％CO₂培养二天。培养上清离心后收集，Triton-X 100灭活。检测化合物对HIV-1复制的抑制作用采用捕捉p24抗原ELISA方法。Elx800 ELISA Reader测定490nmOD值，参考波长630nm。
计算
1，细胞生长抑制率(％)＝(1-实验孔OD值/对照孔OD值)×100(样品的毒性)
2，合胞体形成的生长抑制率(％)＝(1-实验孔合胞体数/对照孔合胞体数)×100  (合胞体方法)
3，IC₅₀/CC₅₀为对50％的宿主细胞产毒性的样品的浓度；EC₅₀为保护50％的HIV-1感染细胞存活时的化合物浓度或具有50％合胞体形成抑制率的化合物浓度。治疗指数TI为IC₅₀/EC₅₀的比值，选择指数TI为CC₅₀/EC₅₀的比值。
本发明研究中发现，氟尿嘧啶有较好的抗艾滋病毒活性。分述如下：
首先，阳性对照药物AZT在对C8166的细胞毒性检测和对HIV-1诱导C8166细胞形成合胞体的抑制试验实验中测得的CC₅₀值为3.36μmol/L，EC₅₀值为0.227nmol/L(即0.000679μmol/L)，治疗指数TI值为14798.96。结论：AZT具有很高的HIV病毒抑制活性。氟尿嘧啶在上述实验中测得的CC₅₀值为4.00μg/ml，EC₅₀值为0.005μg/ml，治疗指数TI值为840.05。结论：氟尿嘧啶有较好地抗艾滋病毒活性。
在AZT对HIV-1感染MT-4细胞死亡的保护作用实验中，测得的CC₅₀值为1.00μg/ml，EC₅₀值为0.099μg/ml，治疗指数TI值为10.1。在氟尿嘧啶对HIV-1感染MT-4细胞死亡的保护作用实验中，测得的CC₅₀值为0.08μg/ml，EC₅₀值为107.15μg/ml，治疗指数TI值为0.00054。结论：氟尿嘧啶对HIV-1感染MT-4细胞死亡的保护作用极差。
在对HIV-1 III_B在急性感染C8I66细胞中复制的抑制试验中，测得AZT的EC₅₀值分别为0.008和0.011μg/ml，结论：AZT具有很高的HIV病毒抑制活性。测得氟尿嘧啶的EC₅₀值分别为2.17和2.23μg/ml，结论：氟尿嘧啶具有较好的HIV病毒抑制活性。
本发明的另一个有益效果在于，氟尿嘧啶与AZT相比，价格低廉。每粒含0.1克原料药的AZT价格为1.75美元，而氟尿嘧啶原料药在我国售价仅为0.80元/克。
本发明的最后一个有益效果在于，氟尿嘧啶是临床常用的广谱抗肿瘤药物，所以，在制备治疗艾滋病药物中的新应用研究中，可以节省许多研究时间和经费。