GnRH-I和GnRH-II之间的区分 本发明涉及GnRH同种型。
GnRH-I(在文献中一般称为GnRH)是一种来自下丘脑的长度为10个氨基酸的小型肽(十肽)。GnRH-I的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)可以由以下3字母代码表示：
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2或用相应的单字母代码表示，其中pE是焦谷氨酸，#是酰胺：
pEHWSYGLRPG#。
GnRH-I作用于脑垂体，使生物活性的促卵泡激素(FSH)和黄体生成素(LH)释放入血增多，随即刺激生长期雄性动物睾丸发育及雄性类固醇合成。在生长期雌性动物中，刺激卵巢发育，表现为卵巢内卵泡发育，雌性类固醇合成，及排卵。
已知GnRH-I如果与载体蛋白偶联，可以用于免疫动物。这种免疫可以由于各种原因而进行，所有这些免疫均与GnRH-I的自然功能相关联。如所已知的，血液中LH和/或FSH的大幅度降低会抑制雄性类固醇或雄激素及雄性睾丸中精子的产生，及抑制雌性类固醇或孕激素的形成和雌性动物卵巢中卵泡成熟。血液中雄激素，孕激素和雌激素的数量降低至这种可与通过阉割去除睾丸或卵巢而获得的水平相当的水平，可以通过针对GnRH-I有效免疫动物而实现。在雄性动物中，在许多情况中，睾丸随即出现发育缓慢或完全不发育，无雄激素(雄性类固醇激素)合成及无精子形成。在雌性动物中，卵巢的活性下降，无雌激素和孕激素(雌性类固醇激素)合成及卵泡成熟和排卵受抑制。
近来有报道灵长类动物脑中存在另一种形式的GnRH(GnRH-II)(Lescheid等，内分泌学138(1997)5618-5629)，而且从人基因组文库中克隆了这第二种GnRH分子的基因(GnRH-II，(SEQ ID NO：2)(White等，PNAS USA95(1998)305-309)。哺乳动物GnRH-I(SEQID NO1)在脑组织外几乎不表达。这方面有少数例外。GnRH I随着月经周期存在于妇女子宫内膜中(Casan等，Fertil.Steril.1998，70，102-106)，而且在妊娠期人胎盘中表达(Kelly等，DNA细胞生物学1991，10，411-421)。GnRH mRNA在大鼠的卵巢，睾丸，胸腺，胎盘和下丘脑中发现(Oikawa等，内分泌学1990，127，2350-2356)。GnRH的表达在猪的免疫组织(脾，胸腺和淋巴细胞)中检测到(Weesner等，生命科学1997，61，1643-1649)。
GnRH-II在脑组织外的许多组织中表达，并且发现在肾，骨髓和前列腺中的浓度尤其高。GnRH-II在除了脑组织之外的不同组织中地存在提示GnRH-II也许具有多重功能。另外，GnRH-II肽在遍及不同脊椎动物物种中的严格保守结构提示这种神经肽具有重要的生物活性。然而迄今为止，GnRH-II的功能实际上还未知。一些类型的分化的淋巴细胞如T淋巴细胞和B淋巴细胞及肥大细胞，产生GnRH和类GnRH肽。在肾，骨髓和前列腺中存在很多后一类型的细胞，这也许对GnRH-II在这些组织中的高表达起作用。与GnRH-I相比，GnRH II似乎较少参与生殖。在性腺机能减退的小鼠即缺失GnRH-I基因的小鼠中，产生GnRH-II的细胞与在正常小鼠中的分布相同，但这不足以在这些小鼠中产生正常的生殖腺发育(Chen等，FEBS通讯435(1998)199-203)。然而，恒河猴月经周期的黄体期示出在静脉注射GnRH-II后血浆黄体生成素浓度明显提高，但在中间卵泡期期间不能产生这种提高(Lescheid等，内分泌学138(1997)5618-5629)。
本发明提供了适于激发抗各种形式促性腺激素释放激素(GnRH)的免疫应答的一种肽，所述激素也称为促黄体生成素释放激素(LHRH)。本发明还提供了基于这种肽的免疫原性组合物和疫苗，药物，及其它医学制剂。本发明还提供了这种疫苗或医学制剂在哺乳动物抗GnRH免疫方法中的应用，以影响所述哺乳动物的生殖或行为特性，本发明还提供了这种疫苗或医学制剂在改良猪的肉质的方法中的应用。本发明还提供了适于激发抗GnRH-I或GnRH-II的选择性免疫应答的一种肽。例外，本发明提供了抗GnRH-I和/或GnRH-II的抗体，包含这些抗体的组合物及所述肽在治疗前列腺癌症的药物组合物或医学制剂中的应用。
本发明提供了这样的见解，即通过所提供的可以区分不同类型GnRH的肽序列，可以对不同类型GnRH的免疫应答中的变化和不同加以更适当的和有效的利用。更具体地，本发明提供了这样的见解，即可以实现抗GnRH-I疫苗的效力和选择性的改良。抗GnRH-I的免疫能有效中和GnRH-I，并引起促性腺激素水平降低及阻断性腺类固醇合成。然而，关于抗GnRH-I产生的抗体对GnRH-II功能的任何生理学作用还完全未知。因为GnRH-II主要在肾中合成，与GnRH-II交叉反应的抗GnRH-I产生的抗体可能影响肾功能。为排除GnRH-I免疫对肾功能的可能存在的副作用，需要将免疫阉割疫苗的抗原性应答特异性针对GnRH-I并避免由于非性腺GnRH-II的中和而导致的可能存在的有害副作用。
如果只需要废除物种通常与性行为伴随的生殖能力，优选特异性中和GnRH-I的免疫阉割疫苗。因此需要抗促性腺激素释放激素的选择性免疫，优选抗GnRH-I的选择性免疫。
在兽医学中，100％有效的抗GnRH-I免疫可以用于使例如小家畜如雄性和雌性猫和狗绝育，或用于治疗雄性狗和牛的进攻性，其简便地通过免疫代替手术如阉割或卵巢切除术而进行。抗GnRH-I免疫的其它可能原因是防止雌性动物如狗，猫和牛发情，及增肥的用以屠宰的雄性动物躁动。
在人类卫生保健中，抗GnRH-I和/或GnRH-II的免疫可以用于治疗前列腺癌和乳腺癌，而且如果需要，可以用于治疗一些垂体癌。在前列腺癌的情况中，更需要中和GnRH-I和GnRH-II，因为后一同种型也在前列腺组织中高度表达。
抗GnRH-I疫苗的另一应用是在畜牧业领域，特别是用于屠宰的增肥的猪。雄性性成熟猪(公猪)的肉具有典型的气味，即所谓的公猪膻味或公猪气味。在性成熟猪的睾丸中，形成许多C19-δ-16类固醇，其贮存于动物的脂肪组织中(Patterson，食品农业科学杂志19，31-38(1968)；Brooksen Pearson，动物科学杂志62，632-645(1986)；Claus，Zeitschrift.Tierzuchtg.Züchtungsbiol.93，38-47(1976)；Claus，Acta Endocrinol.(Copenh.)91，Suppl.225，432-433(1979))。这些类固醇主要与加热所述肉类时形成讨厌的类尿气味相关(Fuchs，Swedish J.Agric.Res.1，233-237(1971)；Bonneau，Livest.Prod.Sci.9，687-705(1982))。由于这些讨厌的气味，雄性性成熟猪的肉一般不适于消费及不适合出口。由于大约10％的雄性屠宰猪在屠宰之前已经性成熟，这使猪的农业生产潜在地遭受巨大损失。
为控制和防止这些损失，几乎所有的雄性小猪当它们还是幼年时就被阉割，所进行的手术一般不进行任何形式的麻醉。除了这种阉割对动物不利之外，阉割还引起感染，生长抑制，及最后的屠宰后的肉质比完整的动物肉质低劣，至少在完整的动物还未发出公猪膻味的时候(Walstra，Livest.Prod.Sci.1，187-96(1974))。
一种对动物友善的替代方法是通过抗GnRH-I免疫使猪垂体中GnRH-I浓度降低，即所谓的免疫阉割。GnRH-I水平的降低导致生物活性的FSH和LH浓度降低，随即抑制生长动物的睾丸发育，并抑制睾丸类固醇合成，包括雄烯酮，睾酮和雌激素。这种方法防止屠宰时雄性猪的公猪膻味，并且不需要进行手术阉割，因为雄烯酮水平降至低水平或检测不到的水平(Oonk等，1995，家畜生产科学42，63-71)。
抗公猪膻味的可接受的疫苗的严格要求是在几乎所有的猪中，睾丸的发育延迟到这样的程度，即公猪膻味在屠宰时不发生，而且当所述疫苗不降低动物睾丸发育时，其可以通过与成功免疫阉割的猪相比太大的睾丸而简便地检测。
在关于抗GnRH-I疫苗的抗生殖能力的现有文献和先前的专利申请中，免疫的结果通常表现为是可变的。在大多数所述研究中，少量的免疫动物对所述免疫不应答，或者需要大剂量疫苗，多次免疫或商业上不适当的佐剂以产生所需效力(Hoskinson等，1990，澳大利亚生物技术杂志4，166-170；Falvo等(1986)，动物科学杂志63：986-994；Clarke等，1998，内分泌学139，2007-2014；Adams T.E.和B.M.Adams，在饲养场进行小公牛和公牛的抗促性腺激素释放激素活性免疫，动物科学杂志1992，70：1691-1698；Brown等，绵羊在生命早期的抗GnRH-I免疫：公羊的生殖功能和激素的作用，生殖和生育杂志(1994)101，15-21；Ferro等，使用与PPD缀合的促性腺激素释放激素类似物的免疫阉割，食品和农业免疫学1995，7，259-272；美国专利4,608,251；国际专利申请WO88/05308)。
一些研究提示一种抗GnRH-I的疫苗有100％的效力，但所述疫苗在大量动物体内未进行测试(Ladd等(1994)，基于抗促黄体生成素释放激素的活性免疫的一种宠物抗生育疫苗的研制，生殖生物学51，10761083；J.G.Manns和S.R.Robbins(1997)，用基于GnRH疫苗的重组物防止公猪膻味，完整雄性猪中的公猪膻味，EAAP研究组学报“完整雄性猪肉的生产和利用”，EAAP出版物No.92，137-140)；其它研究报道的是所述疫苗对处理的动物的平均效力，因为单独的数值不能示出免疫的和未处理的对照物中间的明显差别(Bonneau等，动物科学杂志72，14-20(1994)；Hennesy等，1997，消除公猪膻味：针对雄性猪的一种商业公猪膻味疫苗，Bonneau，M.，Lundstrm，K.和Malmfors，B.(编辑)，完整雄性猪中的公猪膻味，Wageningen Pers，Wageningen，EAAP出版物No.92.，141-145)。
制备这种疫苗的难处大概是耐受现象所致。自身物质如激素不被识别为外源物，而是免疫系统耐受的。通常没有抗自身物质的抗体被激发。为使一种疫苗成功，其必须是足够外源的。只有当所述疫苗是足够外源的以至于免疫系统不耐受时，才诱导抗体产生。然而，反之，所述抗体必须仍能识别所述激素，并因此所述疫苗不能是太“外源”的。
因为这些条件表现为是互斥的，直到最近也未确定这种物质是否可以制备出。一种产生类GnRH肽疫苗的尝试包括用右旋氨基酸置换GnRH-I十肽第6位的Gly(D-Tryp；Chaffaux等，Recueil deMedicine Vétérinaire161(2)，133-145，1985)。然而，已经证实一种包含这种修饰的GnRH-I肽的疫苗制品的性能甚至比正常的GnRH-I十肽还低(欧洲专利申请464，124A)。
最近，我们已经明确揭示在所有抗GnRH-I免疫的个体中，有可能激发一种有效的抗体应答(Meloen等，疫苗12，741-746(1994))。在这些实验中，将猪用与传统类型的GnRH-I疫苗(GnRH-I偶联于一种载体蛋白，在Freund′s佐剂中)不同的一种GnRH-I疫苗免疫两次，所述疫苗称为串联GnRH-I疫苗(欧洲专利No：0464124)。在这个出版物中，描述了一种肽，其特征在于包含串联的至少2个GnRH-I序列(SEQ ID NO：3)，通式如下：
Z1-Glx-His-Trp1-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro[-Gly-X-Gln-His-Trp2-
Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro]n-Gly-Z2，其中氨基酸是以3个字母代码表示的，Trp1和Trp2是色氨酸(Trp)或甲酰化色氨酸(N(吲哚)-甲酰-色氨酸)，n是一个至少为1的数字，X是氨基酸Gly和Gln之间的一个直接键或是一个间隔基团，Z1-Glx是pGlu(焦谷氨酸)或附着一个包含一或多个额外氨基酸的尾部的Gln，Gly-Z2是Gly-NH2或附着一个包含一或多个额外氨基酸的尾部的Gly。在这个通式中，X可以是甘氨酸和谷氨酰胺之间的直接键，即这些氨基酸是直接相互连接的，没有中间环节(通过正常肽键连接)。本发明串联的GnRH-I疫苗还包含其中GnRH-I序列通过间隔基团相互连接而构成的肽。间隔基团的性质可以是非常不同的，可以是一或多个氨基酸至较短或较长的烃链及其它化合物基团或分子。在上述通式中，Z1-Glx优选代表pGlu(焦谷氨酸)，但也可以代表附着一个包含一或多个额外氨基酸的尾部的Gln，例如用于将所述肽偶联于一种载体蛋白。在上述通式中，Gly-Z2代表例如Gly-NH2，或附着一个包含一或多个额外氨基酸的尾部的Gly，例如用于将所述肽偶联于一种载体蛋白。优选地，Gly-Z2代表Gly-Cys-NH2，加入的C末端半胱氨酸是为了所述肽与一种载体蛋白的可能偶联。
从WO96/40755中得知适用于GnRH-I分子变体的串联二聚体原理产生一种疫苗，其在一些温和的佐剂如Specol和双油乳状液(double oil emulsion)中是高效的，而且在低剂量也是有效的。在这种情况中，GnRH-I分子的变体通过用右旋(D-)氨基酸D-Lys取代所述十肽第6位的Gly而形成，随后将所得肽二聚体化并偶联于一种常用的载体化合物卵清蛋白。因此，尽管使用D-氨基酸取代原始序列第6位Gly的疫苗和具有D-氨基酸的GnRH-I十肽与原始GnRH-I序列相比免疫原性降低(Chaffaux等，Recueil de Medicine Vétérinaire161(2)，133-145，1985)，但用于串联二聚体GnRH-I疫苗的这种D-氨基酸取代能产生更免疫原性的GnRH-I疫苗制品。然而，免疫方法需要重复剂量的疫苗以完全有效。需要额外的激发剂量以达到哺乳动物100％有效抗GnRH-I免疫是已知肽的缺点。我们还发现在一些情况中使用(D-Lys6)GnRH I串联二聚体(即有或无D-Lys6置换的GnRH I串联二聚体)，产生非常低的当仍可测定数量的睾酮，其是不希望的而且是(D-Lys6)GnRH I串联二聚体的一个缺点。
本发明提供了肽序列及提供了串联D-Lys6 GnRH-I的替代形式，当用于疫苗中时其产生一种有效用于免疫阉割的疫苗。
本发明的一方面是确定串联GnRH-I序列中氨基酸可以变化的程度，同时所得取代的串联GnRH-I仍能产生对GnRH-I的免疫原性应答，足以进行免疫阉割。因此，本发明提供了一种可诱导抗GnRH-I抗体产生的肽序列的产生方法，所述抗体在数量和活性方面均有足够的竞争性。本发明不限于这些具体串联肽，应意识到相似的区分性应答可以用单一的十肽变体激发，或者甚至用这样的GnRH序列激发，所述GnRH序列已经截短或已经缺失特定的氨基酸或以任何其它形式修饰或衍生化，如通过添加非天然发生的氨基酸或D-氨基酸，尤其通过导致与GnRH-I或GnRH-II相似之处减少但其免疫原性提高的那些修饰方法进行。
本发明的另一方面是提供了一种肽序列，其选择性诱导抗GnRH-I抗体产生，同时极少或不诱导针对GnRH-I的应答。一个优选的实施方案是一种肽序列，其不仅选择性诱导抗GnRH-I抗体产生，而且在免疫阉割中也是有效的，同时对GnRH-II的免疫应答降低或无应答。
本发明人发现在串联的GnRH-I肽序列中，可以置换各种氨基酸，导致与自身激素的相似之处减少同时保留甚至提高所述肽激发GnRH-I结合抗体的能力。同样，GnRH-I肽序列中的一些氨基酸置换产生对GnRH-I的选择性免疫应答及对GnRH-II的免疫应答降低或无应答。
在本发明的一个方面中，提供了一些修饰的串联GnRH-I肽序列用于疫苗中，其不仅能降低雄性动物睾丸生长，也能实质上降低睾酮水平至通过常规方法不能检测的水平。
例外，从这些肽序列中制备的疫苗表现一种活性，即在大多数情况中不需要第二次加强免疫，就能与使用常规D-Lys6串联GnRH-I一样，达到基本上100％活性。本发明术语100％活性是指在一次免疫后睾酮水平通过常规技术基本上检测不到。
本发明最显著的一个特点是通过这些GnRH疫苗产生的抗体可以区分GnRH-I和GnRH-II。因此本发明的肽表现为提高的或得以保留的抗GnRH-I活性，同时发现对GnRH-II的免疫应答降低或无应答。这可以产生具有相反作用的肽，即它们表现为抗GnRH-II活性提高或得以保留，同时抗GnRH-I的免疫应答降低或无应答。这种GnRH-II特异性应答可以用于帮助抑制不需要或极少需要妊娠的哺乳动物中的胚胎植入。例外，通过使用这种GnRH-II特异性应答，FSH水平可以负调节，使整体生育力降低。
本发明一方面涉及一种肽，其包含一种修饰的串联GnRH-I十肽序列，从而用所述肽以适当剂量免疫可使睾酮水平基本上检测不到。
本发明还涉及一种肽，其包含至少两个偶联的GnRH-I十肽序列，任选地通过间隔序列偶联，其可产生可以有效区分GnRH-I和GnRH-II的免疫原性应答。
本发明的肽与激素足够相似，但同时对免疫系统而言是更“外源”的，而且诱导抗所述激素的抗体产生的能力提高。
本发明的一个特点是各个串联单位可以是二聚体化的，以进一步增强其免疫原性而不丧失将所述肽或肽组合物偶联于一个载体化合物蛋白的可能性。
可以使用与WO96/40755所述相似的二聚体化和将串联序列偶联于载体的方法。本发明中也可以使用只含有GnRH-I或II肽序列一部分的肽，例如九肽和十一肽。
用于本发明肽中的接头可以选自本申请中所述的接头或如SMCC接头或本领域已知的其它接头。
接头用于偶联两或多个二聚体化的肽序列。用于置换串联肽序列中的氨基酸的氨基酸优选是相对简单的氨基酸，如丙氨酸。在一个优选的实施方案中，所述不同的氨基酸是丙氨酸。其它氨基酸也可以用于置换串联十肽序列中的氨基酸。优选地，只进行保守氨基酸置换。保守氨基酸置换是氨基酸取代中大氨基酸由大氨基酸置换，芳香族氨基酸由芳香族氨基酸置换等。这些观点是本领域技术人员熟知的。
在本发明肽中间可以放置间隔基。这样可以形成多聚体。适当的间隔基是本领域熟知的。附图简述
图1：用GnRH(空心圆)，GnRH-II(实心圆)，对照肽(实心方块)和无肽(星号)产生的抗血清与碘化GnRH的结合竞争。将血清稀释为1/10000并在每个孔中加入浓度增加的肽(0.25，2.5和25pmol)。在图A-C中，示出了GnRH-II结合能力提高的血清。水平轴：肽数量(pmol/孔)；垂直轴：结合能力(每分钟计数)。
图2：在用G6k-GnRH串联二聚体肽免疫后，对于各个动物(每个柱代表一个动物)血清，由GnRH-I(图2A)和GnRH-II(图2B)置换的碘化GnRH-I的百分率，丙氨酸置换在每一簇柱下标示。将在加强免疫后(10wpv)3周获得的抗血清稀释为1∶100至1∶10000。将GnRH-I和GnRH-II以250pmol/ml浓度加入进行置换。
图2A：水平轴：用于免疫的肽；垂直轴：由GnRH-I置换的碘化GnRH-I的百分率。
图2B：水平轴：用于免疫的肽；垂直轴：由GnRH-II置换的碘化GnRH-I的百分率。
图3：在用G6k-GnRH-串联二聚体肽免疫后，对于各个动物(每个柱代表一个动物)血清，碘化的GnRH-I由GnRH-I(图3A)和GnRH-II(图3B)置换的百分率，丙氨酸置换在每簇柱下方标示。在加强免疫(7wpv)时获得抗血清，并稀释为1∶100至1∶10000。以250pmol/ml浓度加入GnRH-I和GnRH-II以进行置换。H2A和W3A血清数据未包括，因为抗体效价太低以至于不能测定置换。
图3A：水平轴：用于免疫的肽；垂直轴：碘化的GnRH-I由GnRH-I置换的百分率。
图3B：水平轴：用于免疫的肽；垂直轴：碘化的GnRH-I由GnRH-II置换的百分率。
图4：用缀合于卵清蛋白的GnRH-串联二聚体肽(62μg)免疫的几组猪的免疫阉割效力，用Specol作为佐剂。起始的肽是GnRH串联(Cys-OH)二聚体(缩写为Cys-OH)。在这一肽中，所有丙氨酸扫描肽均用于免疫。免疫阉割效力划分为1-4级(1＝免疫阉割不发生，2＝少数猪被免疫阉割，3＝大多数猪被免疫阉割，4＝所有的猪被免疫阉割)。
图5：在用GnRH-串联二聚体肽免疫后，对于各个动物(每个柱代表一个动物)血清，碘化的GnRH-I由GnRH-I(图5A)和GnRH-II(图5B)置换的百分率，丙氨酸置换在每簇柱下方标示。将在加强免疫(10wpv)3周后获得的抗血清稀释为1∶100至1∶10000。以250pmol/ml浓度加入GnRH-I和GnRH-II以进行置换。
图5A：水平轴：用于免疫的肽；垂直轴：碘化的GnRH-I由GnRH-I置换的百分率。
图5B：水平轴：用于免疫的肽；垂直轴：碘化的GnRH-I由GnRH-II置换的百分率。发明详述
本发明的一个特征是本发明的肽具有SEQ ID NO：4所示通式，或以下单字母代码所示通式：
pEHWSYkLRPGQHWSYkLRPGC#
在这个通式中，Q代表Gln并可以位于X之前，其中X代表一个间隔基。这些氨基酸中有一些已经用其它氨基酸置换。在这个通式中，取代位置用黑体字表示并下划线。大写字母代表左旋氨基酸，小写字母代表右旋氨基酸，例如K：L-Lys；k：D-Lys。随后当偶联于载体时确定其免疫原性应答，所述载体一般是卵清蛋白，但也可以使用其它载体如KLH，BSA。
应该理解，GnRH-II肽序列(SEQ ID NO：2)决定了哪个氨基酸可以以这样的方式被取代，即在GnRH-I和GnRH-II两个序列之间仍可能存在基于免疫应答的有效区分。
为确定通过本发明GnRH疫苗产生的抗体是否可以区分GnRH-I和GnRH-II，进行GnRH抗体结合分析以确定抗GnRH-I-串联二聚体肽或其丙氨酸取代类似物的抗体与GnRH-II是否结合。将血清稀释液与GnRH-I，GnRH-II，对照肽或不用肽预先温育。接着将碘化的GnRH-I加入，以竞争预先温育的肽与抗体的结合。
在加强免疫之前及之后收集血清，因为在加强免疫后抗体的特异性可能提高。
当本发明肽与卵清蛋白缀合(OVA-缀合物)使用并与对照相比较时，均示出在幼猪的免疫阉割中有效。与已知G6k-GnRH串联二聚体OVA缀合物相比较(见表1)，示出本发明肽呈现可比的或相似的效力，即使其与“自身”激素GnRH的相似之处已经降低。本发明的肽提供的免疫原性应答可以有效区分GnRH-I和GnRH-II。这些肽导致睾丸小及睾酮水平低。更具体地，表现为低睾丸重量和低睾酮水平的肽是R8A，G10A和S4A。基于GnRH-I和GnRH-II之间的免疫学选择性，优选的肽是S4A和pE1A。
在一个优选的实施方案中，所述肽选自
pEHWAYkLRPGQHWAYkLRPGC#(SEQ ID NO：5)，
pEHWSYkLAPGQHWSYkLAPGC#(SEQ ID NO：6)和
pEHWSYkLRPAQHWSYkLRPAC#(SEQ ID NO：7)。更优选地选自pEHWSYkLAPGQHWSYkLAPGC#(SEQ ID NO：6)和pEHWSYkLRPAQHWSYkLRPAC#(SEQ ID NO：7)。
在本发明的肽中，串联单位的二聚体化可以例如通过羧基末端或通过氨基末端发生。两个串联单位可例如通过二硫键或硫醚键二聚体化。为二聚体化所述串联序列，可以使用第21位的Cys，或者Cys可以在第1位的谷氨酸之前合成。在现有技术中也可以发现二聚体化或多聚体化GnRH-串联单位的其它方法。如果第21位的Cys参与二聚体化并因此不可用于偶联，可以使用可以偶联串联序列的另一氨基酸。如果二聚体化或多聚体化导致可以偶联载体化合物的可及位点丧失，这足以将置换氨基酸限于具有适当侧链的氨基酸。这种置换氨基酸例如是L-Kys或D-Lys，L-Glu或D-Glu或其它含有侧链可以偶联载体化合物的氨基酸。对L-和D-取代均已经测试并发现具有相同作用。
更具体地，本发明的这种优选的肽例如是D-Lys6-串联-GnRH二聚体(SEQ ID NO：8)，其具有下式：
1 21
#EHWSYkLRPGQHWSYkLRPGC
|
#EHWSYkLRPGQHWSYkLRPGC
22 42
在本发明的一个实施方案的这一实施例中，可以用另一个氨基酸置换串联二聚体的一个氨基酸。
本发明还包括其它的肽或肽序列或偶联的肽序列，其中存在含有氨基酸取代的单体的，二聚体的或多聚体的GnRH串联单位。
本发明还提供了一种组合物，其包含一种免疫原性形式的肽。如本领域技术人员所已知，有产生自身并不是免疫原性的物质的免疫原性形式的不同方法。一种可能是将本发明的肽偶联于一种适当的载体蛋白。一种适当的载体蛋白是卵清蛋白，KLH或BSA。在串联肽中，在C末端的一个半胱氨酸可以适当用于化学偶联。在串联二聚体肽中，偶联也可以使用普通的或修饰的侧链(D-)赖氨酸、(D-)谷氨酰胺或任何其它修饰的氨基酸置换所述肽序列中的氨基酸而进行。适当的偶联方法和载体蛋白是本领域技术人员所熟知的。
根据本发明，有一种优选的组合物，特征在于其包含一种蛋白质如卵清蛋白与一种肽或肽组合物的免疫原性缀合物。
本发明的组合物可以以疫苗形式使用。为此可以生产适于施用形式的组合物。通过施用本发明的疫苗，产生抗GnRH的一种免疫原性应答，优选抗GnRH-I的免疫应答。
本发明因此还提供了一种免疫哺乳动物抗GnRH-I的方法，通过用本发明的疫苗免疫所述哺乳动物而进行。在优选的实施方案中，本发明提供了一种用本发明疫苗选择性免疫哺乳动物抗GnRH-I的方法。
当然，本发明的疫苗制品可以与至少一种免疫佐剂组合。适当的免疫佐剂是本领域技术人员已知的。本发明优选的佐剂是Specol或一种双油乳状液，但也可以使用不引起或只有轻微副作用的其它佐剂。本发明可以用于免疫选自各种脊椎动物尤其是哺乳动物的个体而抗GnRH-I的方法中。在本发明的一个优选实施方案中，所述疫苗可以单次剂量施用，其与必须施用两次的已知疫苗具有相同作用。抗GnRH-I免疫，优选选择性免疫，可例如用于使小家畜如雄性和雌性猫和狗绝育，或用于处理雄性狗和牛的进攻性。本发明的抗GnRH-I免疫还防止雌性动物如狗，猫和牛发情，及防止或处理需要增肥以屠宰的雄性动物躁动。在人类卫生保健中，抗GnRH免疫，优选选择性抗GnRH-I或GnRH-II免疫，可以用于治疗前列腺癌和乳腺癌，而且如果需要，可以治疗一些垂体癌。
本发明一个优选的实施方案是改良猪的肉质的一种方法，其中将猪用本发明的这种疫苗制品免疫。本发明通过以下实验部分得以例证。
I.猪的免疫阉割材料和方法
材料
乙腈(ACN)是HPLC-S梯度级，N-甲基吡咯烷酮(NMP)，二异丙基乙胺(DIEA)，二甲基甲酰胺(DMF)，三氟乙酸(TFA)和哌啶是肽合成级并均得自Biosolve(Valkenswaard，NL)。N-羟基苯并三唑(HOBt)和2-(1H-苯并三唑-1-基-1，1，3，3-四甲基脲(tetramethyluronium)六氟磷酸盐(HBTU)均得自Richelieu生物技术公司(Hamon，加拿大)。苯并三唑-1-基-氧(oxy)-三(tris)-吡咯烷-六氟磷酸鏻(PyBOP)得自Novabiochem(Laufelfingen，瑞士)。苯甲硫醚(TA)，乙二硫醇(ethanedithiol)(EDT)，二甲亚砜(DMSO)，戊烷和二甲基氨基嘧啶(DMAP)是预分析级并得自Merck(Darmstad，德国)。二乙醚在使用之前通过活化的碱性氧化铝柱纯化。氨基酸衍生物和树脂得自Bachem Feinchemicalien AG(Bubendorf，瑞士)。多重肽合成(MPS)
设定Hamilton Microlab 2200程序将洗涤溶剂和试剂加入一排40个带有滤膜的4ml柱中，所述柱中含有30mmol树脂以进行肽合成。将柱在每个步骤之后通过真空排水。偶联循环基于Fmoc化学，使用双偶联步骤：
1.NMP洗涤(1ml)
2.30％(v/v)哌啶/NMP(3分钟，0.5ml)
3.30％(v/v)哌啶/NMP(17分钟，0.5ml)
4.NMP洗涤(5×1ml)
5.双偶联(2×30分钟)
6.NMP洗涤(2×1ml)
偶联步骤：将NMP中的Fmoc-氨基酸(0.4M，0.25ml)，DMF中的HBTU/HOBt(0.45M，0.22ml)，和NMP中的DIEA(2M，0.2ml)移至反应试管中，反应30-50分钟。将反应混合物排水并重复一次偶联步骤。
在最后的氨基酸偶联后，将Fmoc基团用30％哌啶/NMP裂解，洗涤所述肽，使用NMP/乙酐/DIEA 10/1/0.2酰化30分钟，再次洗涤，并干燥。将所述肽在一种混合物中脱保护并裂解2小时，所述混合物是1.5ml的TFA/苯酚/TA/水/EDT 10/0.75/0.5/0.5/0.25(试剂K)。将所述裂解混合物过滤，将树脂用0.5mlTFA洗涤，并将所述肽通过加入13ml戊烷/二乙醚1/1而沉淀。离心后，将沉淀物用戊烷/二乙醚再次提取。将沉淀干燥，溶解于ACN/水1/1中并冻干。根据分子量，这个步骤产生25-70mg的肽。
合成的肽序列以单字母代码示于表1。
表1：以单字母代码表示的合成的肽的氨基酸序列肽 氨基酸序列G6k-GnRH串联 pEHWSYkLRPGQHWSYkLRPGC#(SEQ ID NO：9)pE1A-G6k-GnRH串联 *AHWSYkLRPGAHWSYkLRPGC#(SEQ ID NO：10)S4A-G6k-GnRH串联 pEHWAYkLRPGQHWAYkLRPGC#(SEQ ID NO：5)Y5A-G6k-GnRH串联 pEHWSAkLRPGQHWSAkLRPGC#(SEQ ID NO：11)L7A-G6k-GnRH串联 pEHWSYkARPGQHWSYkARPGC#(SEQ ID NO：12)R8A-G6k-GnRH串联 pEHWSYkLAPGQHWSYkLAPGC#(SEQ ID NO：6)P9A-G6k-GnRH串联 pEHWSYkLRAGQHWSYkLRAGC#(SEQ ID NO：13)G10A-G6k-GnRH串联 pEHWSYkLRPAQHWSYkLRPAC#(SEQ ID NO：7)
pE＝焦谷氨酸；*＝乙酰基；#＝酰胺；k＝d-赖氨酸；G6k＝天然GnRH序列第6位的Gly由d-赖氨酸取代。
分析HPLC
为对肽进行分析，我们使用LC-MS(电喷射)系统，其包括两个Waters泵，型号510，一个Waters梯度控制器，型号680，一个WatersWISP712自动注射器，和一个Waters 991光电二级管阵列检测仪。质谱仪是Micromass Quattro II sq，其在阳离子模式中使用。将产物在含0.05％TFA的10％ACN/水至含0.05％TFA的70％ACN/水的线性梯度中，在Waters Delta Pak C18-100A(3.9×150mm，5mm)柱上以1ml/分钟，在215nm分析30分钟。根据峰面积，所有产物纯度为40-70％。
二聚体化
通过将所述产物溶解于20％ DMSO水溶液中将粗产物二聚体化。用1％NH4HCO3将pH调节为5-6，保持清澈的溶液。用1％乙酸校正pH。在室温搅拌至少5小时后，将产物贮存于-20℃直至进行纯化。
制备HPLC
肽纯化使用Waters Prep 4000液相层析仪进行，所述层析仪装备有Waters RCM模块，具有两个PrepPa柱和一个保护柱(40×210mm或25×210mm)，其中充填有δ-Pak C18-100A(15mm)材料。一般而言，纯化是使用与分析HPLC中相同的洗脱剂进行，但梯度速度为0.5％ACN/min，流速为40或100ml/分钟。用配有制备池的Waters 486分光光度计在215-230nm对肽进行检测。将所述肽冻干并测定其纯度为至少90％。
缀合物制备
为通过N-乙基-N＝-(3′-二甲基氨基丙基)盐酸碳二亚胺(″EDC″)与鸡卵清蛋白(″OVA″)缀合，将等重量的肽和载体蛋白分别溶解于milliQ水中，并将这两种溶液充分混合。接着，基于重量，将10倍过量的EDC溶解于milliQ水中。随后，将此溶液在持续搅拌下缓慢加入到肽/OVA溶液中，最终溶液pH为5。在至少6小时缓慢摇动后，将产物用300倍过量的milli Q水透析(MW cut-off 10,000)两天。一天将水更新两次。载荷是从所述缀合物和载体蛋白的对比氨基酸分析中计算的。在Pico-Tag工作站中使用6N HCl在150℃水解1小时，并用异硫氰酸苯酯衍生化后，使用Waters Pico-Tag系统进行氨基酸分析。
根据氨基酸分析，所述缀合物含有0.3-0.5mg肽/mg载体蛋白，P9A-G6k-GnRH-串联二聚体缀合物除外，其只含有0.16mg肽/mg卵清蛋白。
G6k-GnRH-串联二聚体OVA缀合物以G6k-TD缩写表示。具有丙氨酸取代的缀合物通过天然GnRH序列中被置换的氨基酸、其位置和代表丙氨酸置换的A而缩写表示。例如pE1A-G6k-GnRH-串联二聚体OVA缀合物是pE1A。
乳状液制备
将由在轻矿物油中的两种去污剂组成的Specol(Special Oil Phase，ID-DLO，Lelystad，荷兰)用作油相(Bokhout等，1981)。油包水(WIO)乳状液是使用具有搅拌棒的Ultra Tunax(Janke和Kunkel，Staufen，德国)制备的。将油相Specol(5份v/v)置于25ml玻璃试管中，并将由在milli Q水中的缀合物组成的水相(4份v/v)缓慢加入，同时搅拌所述乳状液。在加入水相后，将乳状液以相同的转速(15000rpm)搅拌半分钟。将乳状液在4℃贮存过夜以检测稳定性，并在第二天施用于动物。
动物
在此实验中使用的是雄性小猪，大约10周龄。将杂种小猪圈在半围栏中，并随意给予饲料和水。
免疫接种
将所述小猪随机进行处理，每次处理6或7只小猪。将所有动物均用含有二聚体化的串联GnRH缀合物(即62ug肽)的2ml所述乳状液注射，或用无抗原的乳状液注射。在开始实验当天(0天)和7周后(7wpv)，在颈部进行肌内注射。在初次免疫后13周(13wpv)后，将所有动物屠宰。
测量和血液取样
将动物在0天及7和13wpv称重。睾丸大小通过用游标卡尺在0天，及7，10和13周后测定睾丸长度而确定。睾丸大小以两侧睾丸的平均值记录。
在测定睾丸大小的同一天通过刺破颈静脉取血样，并在开始免疫后第4周也取血样。将血样在4℃保持过夜，第2天通过离心(1500g，15分钟)获得血清。将血清样品在-20℃贮存直至进行分析。
屠宰后评价
在屠宰后取出睾丸，除去附睾并称重。睾丸的重量以两侧睾丸平均值记录。
肽抗体
用ELISA测定用于免疫的肽抗体。将肽使用戊二醛(GDA)包被在微效价平板孔中。通过与在0.1M磷酸盐缓冲液(pH5)中的0.2％GDA在室温温育4小时，将GDA包被于所述孔的表面。将平板用0.1M磷酸盐缓冲液(pH8)漂洗3次，每次10分钟。将100ml磷酸盐缓冲液(0.1M，pH8)中的1μg肽通过在37℃温育3小时包被于每个孔。将平板贮存在-20℃直至使用。将解冻的平板用每升水含有8.2g NaCl，1.15g Na2HPO4.2H2O，0.20g NaH2PO4.2H2O和5ml10％Tween 80水溶液的milli-Q水漂洗3次，每次10分钟。
使抗肽血清的系列血清稀释液与包被的肽在25℃反应1小时。在洗涤3次、每次10分钟后，将作为二级抗体的偶联于辣根过氧化物酶(Dako，Glastrup，Denmark)的山羊抗猪IgG导入1小时，并将ABTS(Boehringer，德国曼海姆)((250ml(2g/100ml)，在加入20mlH2O2(3％溶液)的10ml底物缓冲液中)用作底物。在405nm测定吸光度。
GnRH抗体
GnRH抗体通过Meloen等(疫苗12，741-746(1994))所述方法测定。使所述猪抗血清的系列稀释液结合125I-GnRH。效价以给定的血清稀释液结合125I-GnRH的百分率表示。
睾酮
血清中睾酮水平使用购自DPC实验室(Los Angeles，CA)的Coat-a-Count试剂盒确定。
结果：睾丸大小和睾丸重量
在第一次免疫7周后，通过测定睾丸大小已经可以观测到免疫阉割作用。3种处理方法(R8A，G10A和G6k-TD)示出在加强免疫时平均睾丸大小几乎没有增加(＜10mm)。这些处理是成功的，睾丸重量在屠宰时为70g或更少。在低睾丸重量方面有效的其它处理是pE1A和S4A，而在Y5A，L7A和P9A组中，分别有2，1和1只动物对免疫无应答(表2)。免疫阉割的动物的个体睾丸重量不超过70g，因此免疫阉割的动物和未免疫阉割的动物之间产生明显不同。
表2：根据睾丸重量(g)评价的不同处理的效力处理 个体睾丸重量(g) 睾丸重量(g) 应答者数目/总数
(中值(范围))G6k-TD 10，10，10，12，16，70 11(10-70) 6/6pE1A 16，18，33，36，53，55，65 36(16-65) 7/7S4A 10，14，15，36，40，43，69 36(10-69) 7/7Y5A 15，19，34，44，69，210，235 44(15-235) 5/7L7A 12，13，15，20，24，29，195 20(12-195) 6/7R8A 10，10，12，15，17，19，19 15(10-19) 7/7P9A 8，9，20，23，31，57，300 23(8-300) 6/7G10A 11，13，14，14，15，30，39 14(11-39) 7/7对照 150，173，204，206，236 204(150-236) 0/5
抗体应答
抗用于免疫的肽的平均抗体效价示于表3。用H2A和P9A处理的猪的平均抗体效价比其它处理的肽抗体效价低。
各个动物的抗不同肽的抗体效价为在2-4之间。在未免疫阉割的处理动物中，示出最低的抗肽效价。用H2A和W3A处理的动物未免疫阉割，但存在明显的抗肽效价。
在H2A和W3A组中，在1/2000血清稀释液中GnRH抗体结合百分率检测不到或较低。然而，在1/200血清稀释液中，在H2A组的所有动物血清和W3A组的3只动物血清中可检测到抗体。
具有低平均GnRH抗体效价的动物未被免疫阉割。高抗体效价总是产生成功阉割的动物。具有中等抗体效价的动物睾丸重量在15-300g之间。
每次处理的平均GnRH抗体效价示出与每次处理的睾丸重量(中值)的明显关联(表3)。
睾酮
所有成功处理的动物的睾酮水平均较低，而且在第二次免疫后降低。然而，多数(n＝31)动物在早如初次免疫后4周就显示出阉割作用，这通过睾酮水平检测不到而示出。这些动物的睾丸重量在8-36g。
大多数动物因此在施用单次剂量后就被有效免疫。
尽管所有免疫阉割的动物在屠宰时睾酮水平较低，但睾丸重量在65和70g的两只动物分别具有3.80和1.18pmol/ml的明显血清睾酮水平。
导致低睾丸重量和检测不到的睾酮水平的肽被认为是对猪进行免疫阉割的最有效肽。这些肽是S4A，R8A和G10A。
未免疫阉割的猪在屠宰时睾酮水平为0.46-48.91pmol/ml。
表3：不同处理对平均睾丸重量、肽抗体效价、GnRH抗体结合百分率和血清中LH和睾酮水平的作用处理 睾丸重量 10wpv时的 GnRH结合 13wpv时睾酮(pmol/ml)
(中值(范围)) 抗肽效价 (平均) (中值(范围))G6k-TD 11(10-70) 3.32 17.2 n.d.(n.d.-1.18)pE1A 36(16-65) 3.24 15.7 n.d.(n.d.-3.80)S4A 36(10-69) 3.19 16.9 n.d.(n.d.)Y5A 44(15-235) 2.92 11.3 n.d.(n.d.-9.44)L7A 20(12-195) 3.52 17.6 n.d.(n.d.-48.91)R8A 15(10-19) 3.34 17.7 n.d.(n.d.)P9A 23(8-300) 2.62 15.68 n.d.(n.d.-11.57)G10A 14(11-39) 3.19 17.6 n.d.(n.d.)
wpv＝免疫后周数，n.d.＝检测不到
II.L-氨基酸对D-氨基酸的置换
在串联二聚体中第6，16，27和37位的D-赖氨酸(k)由L-赖氨酸(K)置换，并对所得肽进行测试(表4)。G6k-GnRH-串联：pEHWSYkLRPGQHWSYkLRPGC#(SEQ ID NO：9)G6K-GnRH-串联：pEHWSYKLRPGQHWSYKLRPGC#(SEQ ID NO：14)
表4：处理 睾丸重量(g) 应答者数 10wpv时的 GnRH结合 13wpv时的睾酮
中值(范围) 目/总数 抗肽效价 (平均) (pmol/ml)
(中值和范围)G6k-TD 11(10-70) 6/6 3.32 17.2 n.d.(n.d.-1.18)G6K-TD 21(9-175) 5/6 2.70 15.6 n.d.(n.d.-5.26)对照 204(150-236) 0/5 n.d. n.d. 2.05(0.65-9.35)n.d.：检测不到
L-赖氨酸对D-赖氨酸的置换不改变疫苗抗原的效力。
III.GnRH-I和GnRH-II之间的区分
进行GnRH抗体结合竞争放射性免疫分析，以确定抗G6k-GnRH-串联(SEQ ID NO：9)二聚体肽或其丙氨酸置换类似物产生的抗体是否结合GnRH-II。将血清稀释液与GnRH-I，GnRH-II，对照肽，或无肽预先温育。接着将碘化的GnRH-I加入以与预先温育的肽竞争结合抗体。
在加强免疫之前和之后收集血清，因为抗体的特异性在加强免疫后会提高，这归因于抗体的成熟。
材料和方法
将在7wpv和10wpv(加强免疫后3周)收集的血清样品在含0.4％BSA的PBS(稀释缓冲液)中稀释1/100-1/10000。将50微升血清稀释液置于微孔平板中，并加入25微升肽溶液(每孔含0，0.25，2.5或25pmol在稀释缓冲液中的肽)。将此混合物在4℃温育24小时。第二天，加入25微升碘化的GnRH(大约13000cpm)，过夜贮存(4℃)后用活性炭从结合肽中分离未结合的肽。离心后，分离上清，计数并计算与抗体结合的碘化的GnRH的百分率。
结果
证实了在7wpv获得的除H2A和W3A之外所有处理的血清的碘化的GnRH-I的抗体结合。与GnRH-I的竞争导致碘化的GnRH-I的结合明显降低(见图1)，而碘化的GnRH-I由GnRH-II的置换是高度可变的。正如所预期的，无一抗血清结合对照肽。
针对10wpv血清：在几乎所有处理的血清中，碘化的GnRH-I由GnRH-I置换的百分率在80％以上(图2A)。GnRH-II对碘化的GnRH-I的抗体结合的竞争导致碘化的GnRH-I在几乎所有R8A，P9A，G10A和G6k-TD处理血清中全部或部分置换，及在半数Y5A和L7A处理的血清中置换(图2B)。然而，pE1A，H2A，W3A和S4A组的所有动物的抗体完全丧失与GnRH-II的结合，并因此特异于GnRH-I。
对加强前(7wpv)血清的置换研究结果与10wpv血清不同。同样，所有处理的血清(除了H2A和W3A之外，归因于低抗体效价)均识别GnRH-I，这通过碘化的GnRH-I由GnRH-I的置换而确定(图3A)。然而，与10wpv血清相反(图2)，所有处理包括pE1A和S4A处理的大多数血清识别GnRH-II(图3B)。因此，pE1A和S4A的7wpv血清不是特异于GnRH I，但针对于GnRH-I而非GnRH-II的特异性在加强免疫3周后(10wpv)充分建立。
用加强前血清获得的抗体结合结果与10wpv血清结果不同。对pE1A和S4A处理的抗血清已经测试其识别GnRH-I或GnRH-II的能力(图3)。针对这两种肽，来自7只动物中的6只动物的10wpv血清不结合GnRH-II。在加强免疫之前获得的pE1A血清中，7只动物有4只示出结合GnRH-II。两个血清不识别GnRH-II及一个血清示出不结合碘化的GnRH。S4A加强前血清结果与10wpv血清相反。S4A组所有动物的加强前血清均识别GnRH-II，而对碘化的GnRH的结合能力的抑制对于GnRH-I和GnRH-II是相似的。
IV.用GnRH-串联二聚体缀合物对猪的免疫阉割
与实施例I所述的丙氨酸扫描相似，合成GnRH-串联肽的丙氨酸置换肽(表5)。如前所述将肽二聚体化，纯化并缀合于OVA。
表5：肽的氨基酸序列肽 氨基酸序列GnRH串联 pEHWSYGLRPGQHWSYGLRPGC#pE1A-GnRH串联 *A---------A----------#H2A-GnRH串联 -A---------A---------#W3A-GnRH串联 --A---------A--------#S4A-GnRH串联 ---A---------A-------#Y5A-GnRH串联 ----A---------A------#G6A-GnRH串联 -----A---------A-----#L7A-GnRH串联 ------A---------A----#R8A-GnRH串联 -------A---------A---#P9A-GnRH串联 --------A---------A--#G10A-GnRH串联 ---------A---------A-#
pE＝焦谷氨酸；*＝乙酰基；#＝酰胺；-＝在此位的氨基酸与GnRH串联相同位置的氨基酸相同。
将每组4或5只猪用相当于62μg肽的缀合物在Specol佐剂中进行免疫。
所述缀合物的免疫阉割效力示于图4。
针对用于免疫的所述肽的抗体效价在pE1A，H2A和R8A处理的猪中较低，而W3A，S4A，Y5A和G10A组抗肽抗体效价较高。抗GnRH-I抗体效价与所述抗肽抗体效价一致，但用W3A处理的猪的抗体效价除外：在这些动物中测得高抗肽抗体，然而发现碘化的GnRH-I的抗体结合能力较低。
V.GnRH-串联二聚体抗血清的GnRH-I和GnRH-II之间的区分
在放射免疫分析中，在用具有丙氨酸置换的GnRH-串联二聚体肽处理的所有动物的100wpv血清(稀释1/100-1/10000)中均观测到碘化的GnRH-I的抗体结合。用GnRH-I的竞争导致碘化的GnRH-I的结合明显降低。在几乎所有处理的血清中，碘化的GnRH-I由GnRH-I置换的百分率在80％以上(图5A)。
碘化的GnRH-I由GnRH-II的置换在不同组中明显不同。在Y5A，L7A，R8A，P9A和TD处理的几乎所有血清中导致碘化的GnRH-I的全部或部分置换(图5B)，而其余处理的大多数血清碘化的GnRH-I只部分由GnRH-II置换，或者甚至根本不置换。