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1、10申请公布号CN104161037A43申请公布日20141126CN104161037A21申请号201410399002222申请日20140813A01N1/0220060171申请人江苏丘陵地区镇江农业科学研究所地址212400江苏省镇江市句容市宁杭路112号72发明人花卫华刘伟忠孙伟刘泉74专利代理机构北京众合诚成知识产权代理有限公司11246代理人龚燮英54发明名称一种山羊精液玻璃化冷冻和解冻配方与方法57摘要本发明公开了一种山羊精液玻璃化冷冻和解冻配方与方法，其中山羊精液玻璃化冷冻配方包括1基础液含20MG/ML牛血清白蛋白的MEM培养基；2平衡液基础液添加20乙二醇；3玻璃化。
2、冷冻液于基础液中添加70乙二醇、08MOL/ML海藻糖、10聚乙烯吡咯烷酮。解冻配方包括解冻液1TS1基础液添加04MOL/L海藻糖解冻；解冻液2TS2基础液。本发明还选择了合适的冷冻及解冻方法，提高了解冻后精子活力，具有冷冻过程简单易于操作，冷冻效果好的特点。51INTCL权利要求书1页说明书3页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页附图1页10申请公布号CN104161037ACN104161037A1/1页21一种山羊精液玻璃化冷冻配方，其特征在于包括1基础液含20MG/ML牛血清白蛋白的MEM培养基；2平衡液基础液添加20乙二醇；3玻璃化冷冻液。
3、于基础液中添加70乙二醇、08MOL/ML海藻糖、10聚乙烯吡咯烷酮。2一种山羊精液玻璃化冷冻的方法，其特征在于，包括如下步骤1用权利要求1所述的山羊精液玻璃化冷冻配方基础液、平衡液、玻璃化冷冻液在常温下平衡；2按照常规方法获取羊精液，液化后进行CASA分析；3将平衡液与等量的羊精液混合，平衡510分钟；4将等量的玻璃化冷冻液加入到混合液中；5立即将混入了玻璃化冷冻液的精液装入500L冷冻脉管中；6冷冻脉管投入液氮罐中保存；7记录本次冷冻结果，保存位置等信息。3一种山羊精液玻璃化解冻配方，其特征在于，包括解冻液1TS1基础液添加04MOL/L海藻糖解冻；解冻液2TS2基础液。4一种山羊精液玻璃。
4、化解冻方法，其特征在于，包括如下步骤1将权利要求3中的解冻液1和解冻液2常温下平衡；2冷冻脉管从液氮中取出，于37度水浴60SEC；3剪去脉管塞一端，从管中吹出冷冻精液到TS1中，300G混匀离心，去上清；4沉淀用TS2稀释到需要浓度，显微镜分析，备用。权利要求书CN104161037A1/3页3一种山羊精液玻璃化冷冻和解冻配方与方法技术领域0001本发明动物生殖生理与繁殖技术领域，具体涉及一种山羊精液玻璃化冷冻和解冻配方与方法。背景技术0002羊冷冻精液的研究国外起始于20世纪30年代，我国起始于1978年，但到目前为止仍未形成成熟稳定的程序化冷冻技术。羊的精子和鸡、牛精子相比更加脆弱，在冷。
5、冻、解冻过程极易形成损伤，从而失去受精能力；虽然用于冷冻的精液要求冷冻前活率达到08以上，但因不同公羊个体差异所产生的精子活力不同，精子冷冻效果很不稳定。同时，现有羊冷冻精液解冻后活率低于035且存在很多“衰老”精子和弱死精子，有效精子少，活力低，质量差。羊冷冻精液在我国辽宁、贵州有少量生产，2008年山西省岢岚县引进部分羊冷冻精液，人工授精后妊娠率不足30，无法进行批量生产。0003授权公告号为CN102657149B，发明名称为“一种超高活力羊细管精液冷冻方法”的中国专利中公开了其制备方法“吸取羊新鲜精液注入装有清洗液的第一离心管底部，在CO2培养箱中静置3060MIN，高活力精子上游至上。
6、清液，吸取上清液，注入第二离心管中离心，离心管底部获得高浓度、高活力的精液；吸取该浓缩的高活力精液加入冷冻稀释液中，混合均匀后灌装细管，程序冷冻，液氮保存，输精前解冻”，羊细管冷冻精液冷冻前的活率为08以上，解冻后活率为045060。但是这种方法冷冻过程繁琐，冷冻效率还有提升空间。发明内容0004针对这一问题，本发明提供一种山羊精液玻璃化冷冻方法，采用了玻璃化冷冻方法并优化了冷冻液的配方，通过于基础液中添加70乙二醇、08MOL/ML海藻糖、10聚乙烯吡咯烷酮的玻璃化冷冻液进行保存，然后通过解冻液解冻，提高其解冻后的活率，具有冷冻过程简单易于操作，冷冻效果好的特点。0005为解决上述技术问题，。
7、本发明采用的一个技术方案是0006山羊精液的冷冻保存，包括冷冻配方的选择，选择合适的冷冻方法，选择合适的解冻配方及方法。具体如下0007山羊精液玻璃化冷冻配方，包括1基础液含20MG/ML牛血清白蛋白的MEM培养基；2平衡液基础液添加20乙二醇；3玻璃化冷冻液于基础液中添加70乙二醇、08MOL/ML海藻糖、10聚乙烯吡咯烷酮。0008山羊精液玻璃化冷冻的方法，包括如下步骤00091用上述的山羊精液玻璃化冷冻配方基础液、平衡液、玻璃化冷冻液在常温下平衡；00102按照常规方法获取羊精液，液化后进行CASA分析；00113将平衡液与等量的羊精液混合，平衡510分钟；00124将等量的玻璃化冷冻液。
8、加入到混合液中；说明书CN104161037A2/3页400135立即将混入了玻璃化冷冻液的精液装入500L冷冻脉管中；00146冷冻脉管投入液氮罐中保存；00157记录本次冷冻结果，保存位置等信息。0016山羊精液玻璃化解冻配方，其特征在于，包括解冻液1TS1基础液添加04MOL/L海藻糖解冻；解冻液2TS2基础液。0017山羊精液玻璃化解冻方法，包括如下步骤00181将权利要求3中的解冻液1和解冻液2常温下平衡；00192冷冻脉管从液氮中取出，于37度水浴60SEC；00203剪去脉管塞一端，从管中吹出冷冻精液到TS1中，300G混匀离心，去上清；00214沉淀用TS2稀释到需要浓度，显微。
9、镜分析，备用。0022具体步骤见图1。0023有益效果0024减少程序冷冻时间，使冷冻过程简单化，便于在畜牧生产中过程中操作。附图说明0025本发明图1是山羊精液保存过程示意图。具体实施方式0026选择8月龄波杂山羊公作为试验对象，试验前对山羊精液进行常规分析，达到精液质量要求的进入实验，剔除精液质量较差的山羊。对其进行如下处理0027配备好山羊精液玻璃化冷冻配方，包括1基础液含20MG/ML牛血清白蛋白的MEM培养基；2平衡液基础液添加20乙二醇；3玻璃化冷冻液于基础液中添加70乙二醇、08MOL/ML海藻糖、10聚乙烯吡咯烷酮。然后将上述的基础液、平衡液、玻璃化冷冻液在常温下平衡；按照常规。
10、方法获取羊精液，液化后进行CASA分析；将平衡液与等量的羊精液混合，平衡5分钟；将等量的玻璃化冷冻液加入到混合液中；立即将混入了玻璃化冷冻液的精液装入500L冷冻脉管中；然后将冷冻脉管投入液氮罐中保存；记录本次冷冻结果，保存位置等信息。0028在使用时对其进行解冻处理0029首先配制好山羊精液玻璃化解冻配方，包括解冻液1TS1基础液添加04MOL/L海藻糖解冻；解冻液2TS2基础液，然后将解冻液1和解冻液2常温下平衡；再将冷冻脉管从液氮中取出，于37度水浴60SEC；剪去脉管塞一端，从管中吹出冷冻精液到TS1中，300G混匀离心，去上清；沉淀用TS2稀释到需要浓度，冻后活力检查，精子图像计算机辅助分析仪进行活力的检查，重复检查两次结果取平均值。0030本实验共采用10只山羊进行实验，玻璃化冷冻组实验组和常程序冷冻组对照组各5只，每只羊进行3次取精、冷冻，取平均值，其比较结果见表1。0031表1玻璃化冷冻与程序冷冻对于山羊精液保存效果的影响0032说明书CN104161037A3/3页50033试验组与对照组在冷冻前精子活率差异不显著P05，解冻后在精子活率、顶体完整率、情期受胎率三个衡量指标上，试验组与对照组差异不显著P05。但试验组花时间少，使用方便。说明书CN104161037A1/1页6图1说明书附图CN104161037A。