一种Exendin-4多肽的制备方法 所属技术领域
本发明涉及生物工程领域，尤其涉及用基因工程技术制备多肽或蛋白质的方法。背景技术
Exendin-4是从大毒蜥Gila monster，Heloderma horridum或Helodermasuspectum口腔分泌物中分离出来的一种39个氨基酸的多肽，其氨基酸与类胰高血糖素glucagon-like peptide(GLP-1)有约50％的同源性[参见保尔等，生物化学杂志，第9778-9784页，1998年4月版，(Pohl M.& Wank SA.，The Journal ofBiological Chemistry，page 9778-9784，1998年4月版)]，并在多种动物模型中表现出了与GLP-1类似的治疗II型糖尿病的作用。
美国专利(专利号5,424,286)已公开了Exendin-4氨基酸序列及其治疗糖尿病功能，其中公开的Exendin-4多肽全长为：hgegtftsdl skqmeeeavr lfiewlknggpssgappps。
由于Exendin-4多肽在治疗II型糖尿病上有许多优越性：如可经多种给药途径起效，包括口服、舌下、经肺吸入等；主要降低餐后血糖升高，有效作用时间长于GLP-1等，因此，Exendin-4多肽有较大的市场需求。
但是，Exendin-4多肽在动物体内含量极微，提取工艺复杂，难以大量生产以满足医用。目前市场上多采用多肽合成的方法，如Amylin公司。至今尚未见关于应用基因工程技术制备该类多肽的规模生产方法的公开报道。
本发明公开了一种用基因工程技术制备Exendin-4多肽的方法，其与传统的多肽合成方法相比，极大程度地降低了生产成本，并满足规模生产的要求。发明内容
本发明的目的是，提供一种Exendin-4多肽的制备方法。
本发明提供一种Exendin-4多肽的制备方法，其特征在于，该方法包括：
①设计并合成引物；
②用PCR法拼接Exendin-4基因；
③运用适当的表达载体构建重组质粒；
④将重组质粒转入宿主细胞，获得融合表达或非融合表达Exendin-4多肽
的工程菌；
⑤发酵培养融合表达或非融合表达Exendin-4多肽的工程菌；
⑥纯化分离得到Exendin-4多肽。
在所述步骤①中，包括设计并合成引物，且引入酶切位点。
在所述步骤①中，所述引物可用于拼接Exendin-4基因，并引入构建重组质粒所需的酶切位点。所述引物可以是，但不局限于是本发明的实施例中例举的引物，包括引物1(序列编号2)，引物2(序列编号3)，引物3(序列编号4)，引物4(序列编号5)，或引物5(序列编号7)；所述引入的酶切位点为BglII，KpnI，EcoRI，HindIII，XhoI，或酵母α信号肽切割位点(即KEX2酶识别位点)。
在所述步骤③中，所述表达载体可以是原核表达载体，也可以是真核表达载体，包括，但不局限于，pET32a(+)质粒，pBV220质粒，pPIC9质粒，或YESTM载体。
在所述步骤④中，所述宿主细胞可以是原核宿主细胞，包括大肠杆菌，枯草杆菌；也可以是真核宿主细胞，包括酵母细胞，昆虫细胞，或哺乳动物细胞。
本发明中，“一种Exendin-4多肽”是指具有序列编号1所示的氨基酸序列地多肽。
本发明中，“Exendin-4基因”是指含有编码序列编号1所示氨基酸序列的多肽的各种核苷酸序列的组合。在本发明的实施例中提供了序列编号6，序列编号8两种核苷酸序列组合。
本发明中，获得含有Exendin-4基因的重组质粒时，可选用本领域已知的各种表达载体，包括商业化的载体，可以是原核表达载体，也可以是真核表达载体，包括，但不局限于，pET32a(+)质粒，pBV220质粒，pPIC9质粒，或YESTM载体。
本发明中，“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞，常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等，常用的真核宿主细胞包括酵母细胞(例如甲醇酵母、多形汉逊酵母(Hansenula polymorphis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、以及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
本发明中的表达载体在转入宿主细胞后可融合表达Exendin-4或非融合表达Exendin-4。
本发明中，发酵培养融合表达或非融合表达Exendin-4多肽的工程菌包括以下步骤：
经筛选的工程菌株活化后接入培养液(例如LB培养液、BMGY、YPD培养液)中制备种子液，培养过夜后接种至发酵罐中，发酵用培养基为基础培养基(例如M9+LB培养基)，发酵条件控制为pH5-9，温度28℃-37℃，溶氧控制在20％以上。培养一段时间后开始补料或加入甘油，当菌体OD值达到高密度，加入诱导剂(例如IPTG、甲醇)诱导表达，诱导2-84小时。
本发明中，从发酵产物中纯化分离得到Exendin-4多肽包括以下要点：
收集发酵产物，具有Exendin-4蛋白活性的多肽已表达或融合表达，表达产物存在于培养液或菌体中；如表达产物在菌体中，则需破菌，如为融合表达需经肠激酶酶解；经多步纯化获得产物(包括过金属螯合柱层析、离子柱层析、反向层析、透析、超滤或凝胶过滤等)；用SDS-PAGE和RP-HPLC检验纯度大于95％的Exendin-4。
运用本发明的方法获得的Exendin-4多肽，具有较低的毒性(参见Amylin公司I期临床试验结果)。
运用本发明提供的方法获得的Exendin-4多肽，含有或与已知Exendin-4多肽具有相同或类似的氨基酸序列及活性结构。
已有动物试验或人体试验确证，本发明的Exendin-4多肽具有治疗II型糖尿病及减肥的功能(参见Amylin公司II期临床实验结果；Gang Xu等，<糖尿病学>DIABETES，第2270-2276页，1999年10月版；Margarzata Szayna等，<内分泌学>ENDOCRINOLOGY，第1936-1941页，No.6，Vol.141，2000年版)。
与传统的多肽合成方法相比，本发明的制备方法突破了以往仅以氨基酸合成方法获得Exendin-4多肽的禁锢，使得大批量，低成本的规模生产成为可能。是生物技术运用于大规模生产的又一成功范例。附图的简要说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。图1 pET32a(+)载体物理图谱，其中，
T7启动子：764-780；
组氨酸标签2：140-157；
T7转录起始点：763
T7终止子：26-72；
Trx编码序列：366-692；
lacI编码序列：1171-2250；
组氨酸标签1：327-344；pBR322复制子：3684；
多克隆位点：157-217；Amp抗性基因：4445-5302。图2 重组质粒1的构建示意图。图3 Exendin4的融合表达。图4 重组质粒2(pPIC9-Ex4)构建示意图。图5 pPIC9物理图谱，其中，
5’AOX1启动子片段(5’AOX1 promoter fragment)：1-948；
α信号肽(α-factor secretion signal)：949-1218；
多克隆位点(Multiple Cloning Region)：1192-1241；
3’AOX1转录终点片段
(3’AOX1 transcription termination(TT)fragment)：1253-1586；
组氨酸基因(HIS4 ORF)：4514-1980；
3’AOX1片段(3’AOX1 fragment)：4870-5626；
ColE1复制起点(ColE1 origin)：6708-6034；
Amp抗性基因(Ampicillin resistance gene)：7713-6853。图6 E.coli表达的Exendin-4纯化电泳图，其中，
1.Chelating Sepharose FF柱层析纯化融合蛋白；
2.EK酶酶切后；
3.CM Sepharose FF柱层析纯化后；
4.Source 30 RPC柱层析纯化后；
5.Sephadex G-25柱层析纯化后；
6.分子量Marker。图7 Pichia pastoris表达的Exendin-4纯化电泳图，其中，
1.发酵液上清；
2.CM Sepharose FF柱层析穿透样；
3.CM Sepharose FF柱层析洗脱样；
4.Source 30 RPC柱层析洗脱样；
5.Sephadex G-25柱层析纯化后；
6.分子量Marker。具体实施方法
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。以下实施例用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》(NewYork，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。实施例1：Exendin-4多肽的制备方法
本实施例利用Novagen公司的pET表达系统表达Exendin-4，pET32a(+)质粒为表达载体，宿主细胞为大肠杆菌。
1.设计并合成引物
设计引物1，2，3，4(序列编号2，3，4，5)，引物1引入肠激酶识别位点响应DNA序列，同时引入BglII和KpnI酶切位点，引物4引入EcoRI与HindIII酶切位点。合成引物1，2，3，4(分别为序列编号2，3，4，5)，(合成的方法参见J.萨姆布鲁克等编写的《分子克隆实验指南》，第538-575页)。
2.用PCR方法拼接Exendin-4基因
用PCR方法拼接Exendin-4基因(序列编号6)：
1)按以下次序，将各成分在0.5ml灭菌离心管内混合：
灭菌水 30ul
10X扩增缓冲液(上海生工) 10ul
4种dNTP混合物，每种浓度为1.25mmol/L 16ul
引物1(25pmol) 1ul
引物2(25pmol) 1ul
引物3(25pmol) 1ul
引物4(25pmol) 1ul
Taq酶(上海生工) 0.5ul
加水至终体积100ul
加100ul矿物油
2)放入PCR仪，设置条件反应，首轮循环94℃5分钟，50℃2分钟，72℃3分钟，后续循环94℃1分钟，50℃2分钟，72℃3分钟，末轮循环94℃1分钟，50℃2分钟，72℃10分钟。设置30个循环，PCR扩增基因。
Exendin-4基因拼接完成后用KpnI和HindIII酶切(15ulPCR产物，3ul 10X缓冲液[华美公司]，1ulKpnI(华美公司)，1ulHindIII(华美公司)，10ul无菌水，37℃，反应1小时)。电泳回收得到KpnI和HindIII酶切后的Exendin-4基因片段。
3.构建重组质粒(参见图2)
参见图1，将Exendin-4基因克隆与硫氧还蛋白(Trx)基因后，Exendin-4基因与硫氧还蛋白(Trx)基因之间具有肠激酶(eternokinase)识别位点及六个连续组氨酸序列。
1)用KpnI和HindIII酶切开表达质粒pET32a(+)(15ul质粒pET32a(+)[Novagen公司]，3ul 10X缓冲液[华美公司]，1ulKpnI(华美公司)，1ulHindIII(华美公司)，10ul无菌水，37℃，反应1小时)。
2)电泳回收经KpnI和HindIII酶切的pET32a(+)质粒。
3)将用KpnI和HindIII酶切开的表达质粒pET32a(+)与KpnI和HindIII酶切后的Exendin-4基因片段连接。(5ul无菌水，1ul10X缓冲液[华美公司]，1ul步骤2)获得的产物，3ul步骤2获得的产物，0.3ul连接酶[华美公司]，16℃，反应过夜)。
4)转化入大肠杆菌DH5α(购自Invitrogen公司)，涂布在带氨苄青霉素的LB平板上。
5)长出的菌落即为含有重组质粒1的转化子，挑选单菌落，在LB培养基中培养并抽提质粒。
6)经DNA序列分析与设计序列相同。
4.重组质粒在宿主细胞(大肠杆菌)中融合表达
1)将重组质粒1转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自Novagen公司)，用氨苄青霉素抗性筛选，得阳性克隆，为Exendin-4的表达工程菌(pET32a(+)-Exendin-4/BL21(DE3))。
2)将经筛选的Exendin-4工程菌划线在含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃培养16小时。挑选生长良好的单菌落，接种于LB培养液(含Amp100μg/ml)，37℃培养过夜。将过夜菌以1∶20接种于LB培养液(含Amp100μg/ml)，37℃振荡培养。当OD600达0.6～0.8时，加IPTG至终浓度0.5mM，诱导6小时。菌液经5000rpm，5min离心。去培养基上清，沉淀菌体加入上样缓冲液，100℃水浴3min，离心后上SDS-PAGE电泳(浓缩胶5％，分离胶15％)，染色、脱色、扫描分析。因Trx-Exendin-4融合基因长591bp，融合蛋白含197个氨基酸，理论分子量约为21.67KD。SDS-PAGE结果表明：在14KD和24KD之间有明显表达条带(图3)，与预期相符，融合蛋白占菌体总蛋白20％左右。筛选高表达的菌株为工程菌株。
5.发酵培养表达或融合表达Exendin-4多肽的工程菌
自上述保存的工程菌株斜面上取一环菌种接入LB培养液中，30℃200rpm摇瓶培养12-16小时后按10％接种量接入M9+LB培养液中，30℃250rpm摇瓶培养6小时。将种子液按1∶20接入量加入装有M9+LB培养基的发酵罐中，30℃，400rpm培养，通气量0.2vvm，控制pH值7.0，溶解氧(DO)30％以上，培养至4-6小时，DO值开始上升时开始补加葡萄糖，至OD600约为20时，加入IPTG至终浓度为0.5mM，诱导3.5小时停止发酵。
6.纯化分离得到Exendin-4多肽
离心(6,000rpm)上述获得的发酵产物以收集菌体。按1∶10的比例将菌体垂悬于20mMPB，500mMNaCl的缓冲液中，压力匀浆破菌，压力达10,000psi。离心上清液过预平衡的Chelating Sepharose FF，淋洗至基线后用20mMPB，500mMNaCl，150mM咪唑缓冲液洗脱，收集洗脱液，经ChelatingSepharose FF纯化后，Trx-Exendin-4融合蛋白占总蛋白的80％左右。透析或超滤换液后调整蛋白浓度为2mg/ml。加重组肠激酶(Invitrogen公司)0.3U/ml，25-30℃反应过夜，反应液调pH至3.0后上CM-Sepharose FF，淋洗至基线后用20mMPB，300mMNaCl洗脱，收集洗脱液，加入0.1％TFA后，上Source 30RPC柱，淋洗后用0.1％TFA，50％乙腈梯度洗脱，收集洗脱峰，Sephadex G-25除去乙腈后取样分析。SDS-PAGE或RP-HPLC检测纯度大于95％(参见图6)。实施例2：Exendin-4多肽的制备方法
本实施例用Invitrogen公司毕赤氏酵母表达载体，如pPIC9质粒，以酵母为宿主细胞表达Exendin-4基因。
1.设计并合成引物
设计引物5，引物5中引入XhoI酶切位点和酵母α信号肽切割位点(KEX2酶识别位点)，合成引物5(序列编号7)，(合成方法参见《分子克隆实验指南》，第538-575页)。
2.用PCR方法拼接Exendin-4基因
用PCR方法拼接Exendin-4基因(序列编号8)：
1)按以下次序，将各成分在0.5ml灭菌离心管内混合：
灭菌水 10ul
10X扩增缓冲液(上海生) 10ul
4种dNTP混合物，每种浓度为1.25mmol/L 16ul
引物5(25pmol) 1ul
引物4(25pmol) 1ul
重组质粒1 2ug
Taq酶(上海生工) 0.5ul
加水至终体积100ul
加100ul矿物油
2)放入PCR仪，设置反应条件，首轮循环94℃5分钟，50℃2分钟，72℃3分钟，后续循环94℃1分钟，50℃2分钟，72℃3分钟，末轮循环94℃1分钟，50℃2分钟，72℃10分钟。反应30个循环，PCR扩增基因。
电泳回收基因片段，用Xho I和EcoRI酶切处理(15ulPCR产物，3ul 10X缓冲液[华美公司]，1ulXhoI(华美公司)，1ulEcoR I(华美公司)，10ul无菌水，37℃，反应1小时)。回收。
3.构建重组质粒
1)参见图5，用XhoI和EcoRI酶切pPIC9质粒(Invitrogen公司)。(15ulpPIC9质粒，3ul 10X缓冲液[华美公司]，1ulXho I(华美公司)，1ulEcoR I(华美公司)，10ul无菌水，37℃，反应1小时)。
2)电泳回收
3)回收片段与经XhoI和EcoRI酶切后的基因片段连接(5ul无菌水，1ul10X缓冲液[华美公司]，1ul步骤2)获得的产物，3ul步骤2获得的产物，0.3ul连接酶[华美公司]，16℃，反应过夜)。
4)转化大肠杆菌DH5α(购自Invitrogen公司)，涂布在带氨苄青霉素的LB平板上。
5)筛选转化子得重组质粒2(参见图4)
6)经测序证明序列正确。
4.重组质粒在宿主细胞(酵母)中融合表达
大量抽提重组质粒2，用SalI线性化，然后用无水乙醇沉淀，70％乙醇洗涤后晾干，溶于适量的TE溶液中(浓度约为1μg/μL)。然后电转化制备好的GS115宿主菌，涂布在MD筛选培养基上，30℃培养3天，得到酵母转化子。
从MD平板上选20个单克隆分别接种3ml到MGY培养基中，30℃培养48小时后加入27ml MM培养基进行诱导，表达72小时，取样进行SDS-PAGE检测，筛选高表达的菌株为工程菌株。
5.发酵培养表达或融合表达Exendin-4多肽的工程菌
将上述获得的工程菌株接种于BMGY培养基中30℃培养24小时后，作为种子液接种于发酵罐中，发酵培养基为基础培养基加入为量元素的溶液，发酵温度30℃，pH5.0，控制溶解氧不低于30％，菌体生长24小时后开始补加甘油，同时将pH调到3.0。菌体OD达到200时开始加入甲醇诱导表达。起始甲醇添加量控制为1-2ml/L.小时，随后逐渐增大至15-20ml/L.小时，通过调节搅拌温度和通气量保持溶氧值大于30％，必要时通入纯氧。连续诱导培养72小时后收获培养液，离心收集上清。
6.纯化分离得到Exendin-4多肽
将上述获得的发酵产物离心收集上清，将上清超滤浓缩，上用20mMPB预平衡的CM-Sepharose FF柱，淋洗至基线后用150mMNaCl，20mMPB洗脱，收集洗脱峰，加入0.1％TFA后上Source 30RPC柱，淋洗至基线后用0.1％TFA，30％异丙醇洗脱，收集洗脱峰，过Sephadex G-25除去异丙醇后取样分析，SDS-PAGE或RP-HPLC检测纯度大于95％(参见图7)。
序列表1.序列总数为8个2.各序列具体信息(1)序列1信息(A)序列特征：39氨基酸组成的多肽(B)序列描述：序列1：HisGlyGluGlyThr PheThrSerAspLeu SerLysGlnMetGlu GluGluAlaValArgLeuPheIleGluTrp LeuLysAsnGlyGly ProSerSerGlyAla ProProProSer(2)序列2信息：(A)序列特征：57bp的线性单链核酸(B)序列描述：序列2：GCCCAGATCT GGGTACCGAT GACGATGACA AGCATGGCGAAGGTACATTT ACCAGTG(3)序列3信息(A)序列特征：48bp的线性单链核酸(B)序列描述：序列3：ACATTTACCA GTGACTTGTC AAAACAGATG GAAGAGGAGGCAGTGCGC(4)序列4信息(A)序列特征：48bp的线性单链核酸(B)序列描述：序列4：CGGGCCACCG TTCTTAAGCC ACTCAATAAA TAAGCGCACTGCCTCCTC(5)序列5信息：(A)序列特征：56bp的线性单链核酸(B)序列描述：序列5：CGCAAGCTTG AATTCATTAC GATGGCGGAG GTGCCCCGCTACTCGGGCCA CCGTTC(6)序列6信息：(A)序列特征：168bp的线性双链核酸(B)序列描述：序列6GCCCAGATCT GGGTACCGAT GACGATGACA AGCATGGCGA AGGTACATTT 50CGGGTCTAGA CCCATGGCTA CTGCTACTGT TCGTACCGCT TCCATGTAAAACCAGTGACT TGTCAAAACA GATGGAAGAG GAGGCAGTGC GCTTATTTAT 100TGGTCACTGA ACAGTTTTGT CTACCTTCTC CTCCGTCACG CGAATAAATATGAGTGGCTT AAGAACGGTG GCCCGAGTAG CGGGGCACCT CCGCCATCGT 150ACTCACCGAA TTCTTGCCAC CGGGCTCATC GCCCCGTGGA GGCGGTAGCAAATGAATTCA AGCTTGCG 168TTACTTAAGT TCGAACGC(7)序列7信息(A)序列特征：32bp的线性单链核酸(B)序列描述：序列7：GTATCTCTCG AGAAAAGACA TGGCGAAGGT AC(8)序列8信息(A)序列特征：154bp的线性双链核酸(B)序列描述：序列8：GTATCTCTCG AGAAAAGACA TGGCGAAGGT ACATTTACCA GTGACTTGTC 50CATAGAGAGC TCTTTTCTGT ACCGCTTCCA TGTAAATGGT CACTGAACAGAAAACAGATG GAAGAGGAGG CAGTGCGCTT ATTTATTGAG TGGCTTAAGA 100TTTTGTCTAC CTTCTCCTCC GTCACGCGAA TAAATAACTC ACCGAATTCTACGGTGGCCC GAGTAGCGGG GCACCTCCGC CATCGTAATG AATTCAAGCT 150TGCCACCGGG CTCATCGCCC CGTGGAGGCG GTAGCATTAC TTAAGTTCGATGCG 154ACGC