无需克隆的线性表达载体构建方法 【技术领域】
本发明涉及一种表达载体的构建方法，特别涉及一种无需克隆的构建线性表达载体的方法。技术背景
通常蛋白质的表达方法是将待克隆的目的基因与载体连接，将该重组子转化到受体菌中，筛选鉴定正确的克隆进行扩增，再将其转入宿主细胞中表达。这是目前蛋白质表达研究中运用最多的方法。但是该方法涉及的步骤多，并且繁琐费时。目前还有一种利用DNA拓扑异构酶I的切割和连接功能，构建线性表达载体的方法，该载体包含启动子，目的基因和终止子片段(Invitrogen公司TOPO Tools产品介绍)。DNA拓扑异构酶I的识别位点是CCCTT’位点。引物设计中，在启动子片段的反向引物、目的基因的两端引物和终止子片段的正向引物序列中分别加入该酶的识别位点，各DNA片段扩增后，经DNA拓扑异构酶I酶切，形成的启动子片段为：，中间的目地基因片段为：末端终止子片段为：。DNA拓扑异构酶I同时还有连接酶的功能，能将该三片段连接。然后，利用启动子正向引物和终止子反向引物，PCR扩增得到大量的载体片段，其转染受体细胞即可直接表达目的蛋白，不需要经过克隆的鉴定和转化子的扩增这些繁琐的步骤。但由于DNA拓扑异构酶I售价高，使得用该方法构建线性表达载体的试剂盒的应用受到了一定的限制。发明内容
本发明的目的是提供一种利用现有低成本的酶，来构建线性表达载体，以克服上述DNA拓扑异构酶I构建线性表达载体方法存在的缺陷。将此方法做成试剂盒，将大大方便使用者，为实现基因表达，蛋白功能研究等提供技术平台。
本发明的技术方案如下：
本发明提供一种构建线性表达载体的方法，其步骤包括：
1.设计引物
1)相邻的DNA片段待连接处，设计由引物1和引物2构成的一对引物，引物1和引物2包含与待连接片段互补的DNA序列和一段非对称性切割的限制性内切酶的识别序列，且引物1和引物2的酶识别序列是同一个酶的识别序列；
2)启动子正向引物和终止子反向引物仅包括和扩增片段互补的DNA序列；
2.分别以相应DNA片段为模板，以上述引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
3.分别纯化步骤2得到的扩增产物，并用非对称性切割的限制性内切酶酶切片段中的酶识别序列；
4.将酶切后的待连接片段混合，加入DNA连接酶，进行连接反应，得到含目的基因的线性表达载体；
本发明提供的构建线性表达载体的方法，在步骤3之后，还可包括将酶切后的待连接片段纯化这一步骤；步骤4所得线性表达载体进行PCR扩增后再转染受体细胞；步骤3中所用的非对称性切割的限制性内切酶为BsaMI、BstXI Alw NI、DrdI、AccI和MwoI中的任两种；步骤4连接反应所使用的酶为T4 DNA连接酶。
本发明使用的非对称性切割的限制性内切酶价格低廉，大大降低了使用成本，如果采用本方法构建线性表达载体，进行一个反应所消耗的试剂大约为30-50元人民币，仅为TOPO Tools试剂盒费用的15％-20％。由此可见，该方法可以在科研和生产中被推广使用。附图说明
附图1为使用本发明的方法构建线性表达载体的示意图
其中：A为启动子片段 B为目的基因片段
C为终止子片段 D为线性表达载体片段
A ’为A的扩增产物，其中方框为酶切位点(下同)
B’为B的扩增产物 C’为C的扩增产物
A”为A’经酶切后的待连接产物
B”为B’经酶切后的待连接产物
C”为C’经酶切后的待连接产物
1为启动子片段的反向引物 2为目的基因的正向引物
1’为目的基因的反向引物 2’为终止子片段的正向引物
3为启动子片段的正向引物 4为终止子片段的反向引物具体实施方式
其中Taq酶(DNA聚合酶)购自华美生物工程公司，质粒pCMV/myc/cyto/GFP购自Invitrogen公司(美国)，T4DNA连接酶(3unit/μl)购自Promega公司(美国)，BsaM I、BstX I购自Promega公司(美国)，Alw NI、DrdI、AccI、MwoI均购自NEB公司(英国)，引物由TAGC公司(丹麦)合成，PCR纯化试剂盒购自QIAGENE公司(德国)。
实施例1、构建含CMV(巨细胞病毒)启动子片段A，GFP(绿色荧光蛋白)片段B，BGHpA(多聚腺苷酸)片段(包含终止子)C的线性表达载体：
以质粒pCMV/myc/cyto/GFP为模板，分别扩增得到CMV(巨细胞病毒)启动子片段(A’)，GFP(绿色荧光蛋白)片段(B’)，BGHpA(多聚腺苷酸)片段(包含终止子)(C’)，酶切后连接，得到含上述片段的线性表达载体(D)，其构建过程如图1所示：
(1)设计引物
在片段A和B的连接处设计一对引物1和2：引物1是启动子CMV片段的反向引物，引物2是目的基因片段GFP的正向引物。它们都包括一段和扩增片段互补的DNA序列和一段非对称性切割的限制性内切酶的识别序列，酶识别序列如图中方框所示，且引物1和引物2中的酶识别序列是酶BsaMI的识别序列。
在片段B和C的连接处设计一对引物1’和2’：引物1’是目的基因片段GFP反向引物，引物2’是终止子BGHpA的正向引物。它们都包括一段和扩增片段互补的DNA序列和一段非对称性切割的限制性内切酶的识别序列，酶识别序列如图中方框所示，且引物1’和引物2’中的酶识别序列是酶BstXI的识别序列。
设计启动子CMV的正向引物3和终止子的反向引物4。引物序列如下表。
表1：引物 引物 序列CMV正向引物(3)5’gtaccgaattcacattgattattg3’CMV反向引物(1)5’CGCGAGCATTCgccagtaagcagtgggttct3’GFP正向引物(2)5’CGGCGAATGCTatggctagcaaaggagaagaact3’GFP反向引物(1’)5’TATTCCACGACTATGGctatttgtagagctcatccatgc3’BGH正向引物(2’)5’ATATCCATAGTCGTGGctcgctgatcagcctcgact3’BGH反向引物(4)5’atagagcccgggccatccc3’
其中小写字母是和扩增片段互补的DNA序列，大写字母包含酶BsaMI或BstXI识别的序列。
(2)PCR扩增三个DNA片段
按下列条件分别进行三个片段的PCR扩增：
质粒模板(22.5ng/μl) 1μl
10X PCR缓冲液 5μl
25mM MgCl2 3μl
10mM dNTP 1μl
正向引物(100ng/μl) 1μl
反向引物(100ng/μl) 1μl
Taq酶(3unit/μl) 1μl
无菌水 37μl
总体积 50μl
其中PCR缓冲液：500mM KCl.10mM Tris-HCl，(PH9.0)，下同。
以上混合物以94℃初始变性5分钟，随后以94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 1分钟进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。得到启动子扩增产物A’、目的基因片段扩增产物B’和终止子扩增产物C’。
(3)限制性内切酶酶切PCR产物
PCR扩增产物分别用DNA纯化试剂盒(QIAGENE，Germany)纯化，用紫外分光光度计测其OD260。分别用限制性内切酶BsaMI和BstXI酶切PCR产物。反应条件如下：
反应一：
CMV 2μg
10X限制性内切酶缓冲液 2μl
BsaMI(20units/μl) 0.5μl
乙酰化BSA，10μg/μl 0.2μl
无菌水 20-X
总体积 20μl
其中限制性内切酶缓冲液：60mM Tris-HCl(PH7.9)，1.5M NaCl，60mMMgCl2，10mM DTT；X表示除了无菌水以外的其它溶液体积之和，下同。
65℃反应3小时。
反应二：
GFP 2μg
10X限制性内切酶缓冲液 2μl
BsaMI(20units/μl) 0.5μl
乙酰化BSA，10μg/μl 0.2μl
无菌水 20-X
总体积 20μl
65℃反应3小时后，加入BstXI 1μl(10u/μl)，50℃反应3小时。
反应三：
BGH 2μg
10X限制性内切酶缓冲液 2μl
BstXI(20units/μl) 0.5μl
乙酰化BSA，10μg/μl 0.2μl
无菌水 20-X
总体积 20μl
50℃反应3小时。
酶切后得到启动子的待连接片段A”、目的基因的待连接片段B”和终止子的待连接片段C”。
(4)酶切产物的纯化
酶切产物A”、B”、C”分别用凝胶纯化试剂盒(QIAGENE，Germany)纯化，操作按说明书进行。用紫外分光光度计测其OD260。
(5)连接反应得到(CMV+GFP+BGHpA)
A”100ng、B”115.5ng、C”39.11ng(即摩尔比1∶1∶1)混合，加入T4 DNA连接酶1μl(3unit/μl)，室温下反应30分钟，得到连接产物线性表达载体D。
(6)以连接产物为模板进行PCR扩增
连接产物 2μl
10X PCR缓冲液 5μl
25mM Mgcl2 3μl
10mM dNTP 1μl
CMV正向引物(100ng/μl) 1μl
BGH反向引物(100ng/μl) 1μl
Taq酶(3unit/μl) 1μl
无菌水 37μl
总体积 50μl
以上混合物以94℃初始变性5分钟，随后以94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 1分钟进行30个循环，最后72℃延伸10分钟，即得到扩增后的线性表达载体。
在该实施例中，酶切产物的纯化步骤(4)不是必需的，但是纯化后去除反应体系中的杂质成分，使得连接反应更易进行。
实施例2、构建含CMV(巨细胞病毒)启动子片段A，GFP(绿色荧光蛋白)片段B，BGHpA(多聚腺苷酸)片段(包含终止子)C的线性表达载体：
在该实施例中，相邻片段连接处的引物包含非对称性切割的限制性内切酶Alw NI和DrdI的识别序列，并且无需第二次PCR扩增即可得到线性表达载体。其构建过程如图1所示：
(1)设计引物
引物1、2，1’、2’，和3、4构建原理同实施例1。
其中引物1和引物2中的酶识别序列是酶Alw NI的识别序列，引物1’和引物2’中的酶识别序列是酶DrdI的识别序列。引物序列见下表。
表2： 引物 序列CMV正向引物(3)5’gtaccgaattcacattgattattg3’CMV反向引物(1)5’GATCCAGAGACTGccagtaagcagtgggttct3’GFP正向引物(2)5’TAGCCAGTCTCTGatggctagcaaaggagaagaact3’GFP反向引物(1’)5’ATTAGACCAGTCAGTCctatttgtagagctcatccatgc3’BGH正向引物(2’)5’ATATGACTGACTGGTCctcgctgatcagcctcgact3’BGH反向引物(4)5’atagagcccgggccatccc3’
其中小写字母是和扩增片段互补的DNA序列，大写字母包含酶Alw NI或DrdI识别的序列。
(2)PCR扩增三个DNA片段
方法同实施例1。
(3)限制性内切酶酶切PCR产物
PCR扩增产物分别用DNA纯化试剂盒(QIAGENE，Germany)纯化，用紫外分光光度计测其OD260。分别用限制性内切酶AlwNI和DrdI酶切消化PCR产物。反应条件如下：
反应一：
CMV 2μg
10X限制性内切酶缓冲液 2μl
Alw NI(20units/μl) 0.5μl
乙酰化BSA，10μg/μl 0.2μl
无菌水 20-X
总体积 20μl
37℃反应3小时。
反应二：
GFP 2μg
10X限制性内切酶缓冲液 2μl
Alw NI(20units/μl) 0.5μl
DrdI(20units/μl) 0.5μl
乙酰化BSA，10ug/μl 0.2μl
无菌水 20-X
总体积 20μl
37℃反应3小时后。
反应三：
BGH 2μg
10X限制性内切酶缓冲液 2μl
DrdI(20units/μl) 0.5μl
乙酰化BSA，10μg/μl 0.2μl
无菌水 20-X
总体积 20μl
37℃反应3小时。酶切后得到启动子的待连接片段A”、目的基因的待连接片段B”和终止子的待连接片段C”。
(4)酶切产物的纯化
方法同实施例1。
(5)连接反应得到(CMV+GFP+BGHpA)
A”500ng，B”578.75ng，C”275ng(即摩尔比1∶1∶1)，用DNA连接试剂盒(Takara) 在室温下连接，先加入等体积溶液II混匀，再加入2倍体积的溶液I混匀5-10分钟(溶液I和溶液II为试剂盒中自带溶液)，即得到线性表达载体D，可直接用于转染受体细胞。
实施例3、构建含CMV(巨细胞病毒)启动子片段A，GFP(绿色荧光蛋白)片段B，BGHpA(多聚腺苷酸)片段(包含终止子)C的线性表达载体：
在该实施例中，相邻片段连接处的引物包含非对称性切割的限制性内切酶AccI和MwoI的识别序列，并且酶切后的产物A”、B”和C”无需纯化即可用于连接反应。其构建过程如图1所示：
(1)设计引物
引物1、2，1’、2’，和3、4构建原理同实施例1。
其中引物1和引物2中的酶识别序列是酶AccI的识别序列，引物1’和引物2’中的酶识别序列是酶MwoI的识别序列。引物序列见下表。
表3： 引物 序列CMV正向引物(3)5’gtaccgaattcacattgattattg3’CMV反向引物(1)5’GATCGTCTACgccagtaagcagtgggttct3’GFP正向引物(2)5’TAGCGTAGACatggctagcaaaggagaagaact3’GFP反向引物(1’)5’ATTAGCCATGTCAGCctatttgtagagctcatccatgc3’BGH正向引物(2’)5’ATATGCTGACATGGCctcgctgatcagcctcgact3’BGH反向引物(4)5’atagagcccgggccatccc3’
其中小写字母是和扩增片段互补的DNA序列，大写字母包含酶AccI或MwoI识别的序列。
(2)PCR扩增三个DNA片段
方法同实施例1。
(3)限制性内切酶酶切PCR产物
分别用限制性内切酶AccI和MwoI酶切PCR产物。反应条件如下：
反应一：
CMV 2μg
10X限制性内切酶缓冲液 2μl
AccI(20units/μl) 0.5μl
乙酰化BSA，10ug/μl 0.2μl
无菌水 20-X
总体积 20μl
37℃反应3小时。
反应二：
GFP 2μg
10X限制性内切酶缓冲液 2μl
AccI(20units/μl) 0.5μl
MwoI(20units/μl) 0.5μl
乙酰化BSA，10μg/μl 0.2μl
无菌水 20-X
总体积 20μl
37℃反应3小时后，加入MwoI 1μl(10u/μl)，60℃反应3小时。
反应三：
BGH 2μg
10X限制性内切酶缓冲液 2μl
MwoI(20units/μl) 0.5μl
乙酰化BSA，10μg/μl 0.2μl
无菌水 20-X
总体积 20μl
60℃反应3小时。
(4)连接反应得到(CMV+GFP+BGHpA)
方法同实施例2。
用本发明构建线性表达载体使用的酶价格低廉，其中6种非对称性切割的限制性内切酶售价约为1人民币/单位，T4DNA连接酶售价约为2人民币/单位，进行一个反应所消耗的试剂大约为30-50元人民币(包括所用的酶、各种溶液)；现有技术中Topo Tools一个反应约200元人民币，由此可见利用本发明提供的构建线性表达载体的方法可以作为一种常用技术在科研和生产中广泛应用。