高度纯化的细胞因子激活因子和使用方法 【发明背景】
生物因子，如辅酶、辅因子、维生素等，在生物转化过程中起重要作用。它们通常在整个细胞中以少量产生(1×10-5-1×10-6)。然而，从正常细胞中分离和纯化这种生物因子是一个难题。
超免疫卵已经被开发，而且它们表现出过量产生抗体和某些生物因子。因为超免疫法是通过向靶动物中注射多价菌抗原而进行的，所以这些超免疫动物卵中的生物因子的量不会增加一个数量级以上。所以，超免疫卵中的小量生物因子使生物因子的纯化非常困难，正因为如此，需要分离、纯化或其它生产这些生物因子的有效方法。
正常免疫系统处于一种平衡，其中促炎和抗炎细胞和分子被精密调节，从而促进正常宿主免疫防御而不破坏宿主组织。一旦这种精密调节平衡被破坏，非特异性刺激和激活可以导致潜在破坏性免疫和炎性分子产生和释放量增加。这样，过量产生促炎细胞因子或在错误的生物环境下产生细胞因子，与许多疾病如疟疾、脓毒症、类风湿关节炎、炎性肠病、癌症和艾滋病等的死亡率和病理相关。
细胞因子是通过与特异的细胞受体相结合而以自分泌/旁分泌模式起作用的多潜能多肽。它们的分泌对判断免疫应答的持续时间和强度非常重要。例如，在小鼠中，不同亚型的CD4+T辅助细胞(Th)克隆分泌经典描述为Th1和Th2的细胞因子。Th1细胞产生白介素-2(IL-2)和γ干扰素(IFN-γ)并促进细胞免疫应答。Th2细胞产生IL-4，IL-5，IL-6和IL-10并支持免疫球蛋白分泌细胞的激活。在炎症过程中，细胞因子如IL-1β，IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNFα)在炎症位点被释放。这些细胞因子有多效地作用并介导许多与炎症相关的症状。
一种关键的细胞因子TNF-α，也称作恶液质素，是一种由157个铬氨基酸组成的17千道尔顿的蛋白，并主要由单核细胞和激活的巨噬细胞产生。TNF-α表现出具有杀肿瘤活性和最主要器官系统的各种生理作用。在中枢神经系统中，TNF-α参与发热、厌食和垂体激素释放的改变。在心血管系统中，TNF-α在休克、急性呼吸窘迫和毛细血管渗漏综合症(前凝血质)中起重要作用。TNF-α在肾脏急性小管坏死和肾炎以及胃肠系统的局部缺血、结肠炎和肝坏死中起辅助作用。它也是参与炎症过程的关键细胞因子。
鸟纲的各种属，如鸡(gallus domesticus)、火鸡和鸭，在血液和卵中产生对抗导致鸟类疾病和其它疾病的免疫原。例如，LeBacq-Verheyden等(Immunology 27：683(974))及Leslie，G.A.等(J Med.130：1337(1969))，都从数量上分析了鸡的免疫球蛋白。Polson等(ImmunologicalCommunications 9：495-514(1980))用一些蛋白和蛋白的天然混合物免疫了母鸡并检测到卵黄中的IgY抗体。Fertel等(Biochemicaland BiopHysical Research Communications 102：1028：1033(1981))用前列腺素免疫了母鸡并检测到卵黄中的抗体。Jensenius等(Journaloflmmunological Methods 46：63-68(1981))提供了分离用于免疫诊断的卵黄IgG的方法。Polson等(Immunological Communications 9：475-493(1980))描述了从用各种植物病毒免疫的母鸡卵黄中得到的抗体。
美国专利4,357,272公开了从超免疫母鸡卵黄中分离抗体的方法。通过重复注射由植物病毒、人IgG、破伤风抗毒素、蛇抗蛇毒素和Serameba衍生的免疫原而引发抗体应答。
美国专利4,550,019公开了将通过用分子量或粒子重量为30,000的免疫原超免疫而在母鸡中产生的抗体从卵黄中分离的方法。用于超免疫小鸡的免疫原选自于植物病毒、人免疫球蛋白、破伤风毒素和蛇毒。
美国专利4,748,018公开了包括肠外给予从用对应抗原免疫的禽卵中得到的纯化抗体被动免疫哺乳动物的方法，其中哺乳动物获得了对该卵的免疫。
授权于DCV生物公司的美国专利5,772,999公开了通过给予受试者超免疫卵和/或乳汁或其部分而预防、对抗或减少受试者中慢性胃肠疾病或非甾体抗炎药诱导的(NSAID诱导的)胃肠损伤的方法。
发明概述
本发明是基于本发明者的发现，即在卵中，特别是从超免疫动物中获得的卵中有特异性免疫调节活性，当给予受试动物特别是哺乳动物时，激活该受试动物的细胞因子产生。
更具体地说，本发明涉及一种可以从禽卵中获得的高度纯化的细胞因子激活因子。细胞因子激活因子可以从卵黄和卵白分离的部分中高度纯化。细胞因子激活因子也可通过重组或化学合成产生。
本发明的一种实施方案涉及分离的细胞因子激活因子(CAF)蛋白。这种蛋白包含一个选自于下列之一的氨基酸序列(a)选自于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：6之一的氨基酸序列；及(b)包含任何一个(a)氨基酸序列中至少9个连续的氨基酸残基的氨基酸序列。本发明的这种分离CAF蛋白上调肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素-1β(IL-1β)和/或白介素-6(IL-6)的表达，和/或下调转化生长因子β(TGFβ)的表达。在一种优选实施方案中，本发明的分离蛋白包含具有任何一个(a)氨基酸序列中的至少15个连续氨基酸残基，更优选任何一个(a)氨基酸序列中的至少20个连续氨基酸残基，甚至更优选至少25个连续氨基酸残基的氨基酸序列。在另一种实施方案中，本发明的分离蛋白包含一个至少有SEQ ID NO：6的50个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的一种实施方案中，本发明的分离蛋白包含一个至少约65％等同于(a)的氨基酸序列中至少15个氨基酸的氨基酸序列的氨基酸序列。优选地，此蛋白包含一个至少约75％等同于(a)的氨基酸序列中至少15个氨基酸的氨基酸序列的氨基酸序列。在一种优选实施方案中，此蛋白包含一个至少约60％等同于SEQ ID NO：6中66个氨基酸的氨基酸序列。而在另一种实施方案中，蛋白由在高严格条件下与编码选自SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：6之一的核酸序列杂交的核酸序列编码。在一种最优选的实施方案中，本发明的分离CAF蛋白包含选自SEQ ID NO：1和SEQID NO：6之一的氨基酸序列，最优选为SEQ ID NO：6。
在一种实施方案中，本发明的一种分离CAF蛋白有下列一种或更多生化特征：(a)有至少一个通过3000MW截止过滤器的生物活性亚单位；(b)在高达至少50℃的温度下保持稳定；(c)在从2左右到10左右的pH条件下保持稳定；(d)为水溶性；(e)为非甾体类；(f)带负电；(g)基本为非极性；和/或(h)在约254nm有λmax。本发明的分离蛋白口服时具有生物活性。本发明的分离蛋白天然存在与鸟卵的卵白和卵黄中。如前面所讨论的，本发明的一种分离CAF蛋白优选上调肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素-1β(IL-1β)和/或白介素-6(IL-6)的表达。在一种实施方案中，本发明的一种分离蛋白下调转化生长因子β(TGFβ)的表达。
本发明的一种实施方案涉及一种选择性与本发明的分离CAF蛋白相结合的分离抗体。
而本发明的另一种实施方案涉及一种组合物。这种组合物包括一种可药用载体和上述本发明的一种细胞因子激活因子(CAF)蛋白。在一种实施方案中可药用载体选自于下列食品之一：(a)经选择富含CAF蛋白的超免疫卵产品；和(b)由超免疫卵产品的至少一部分生产的食品，其中此部分与超免疫卵产品相比富含CAF蛋白。可药用载体优选包含与超免疫卵产品相比富含CAF蛋白的超免疫卵产品的一部分。超免疫卵的适当部分包括，但不限于：液体卵白、液体卵黄、粉末状卵黄、粉末状卵白和超免疫卵产品的水溶部分。
在一种实施方案中，本发明的组合物选自液体、气溶胶、胶囊、片剂、丸剂、粉末、凝胶和颗粒的形式之一。在另一种实施方案中，可药用载体包含一个控释配方。而在另一种实施方案中，可药用载体选自如下之一：水，磷酸缓冲液、林格氏液、葡萄糖液、含血清溶液、汉克氏液、其它水溶生理平衡液、油、酯、乙二醇、生物相容聚合物、聚合物基体、胶囊、微胶囊、微粒、团块制剂、渗透泵、扩散设备、脂质体、脂质球、细胞和细胞膜。
而本发明的另一种实施方案涉及调节动物免疫应答的方法。这种方法包括给予动物前面阐述的包含本发明的细胞因子激活因子(CAF)蛋白的组合物的步骤。此组合物优选包括一个可药用载体。一方面，以动物每公斤体重约1ng到约400mg CAF蛋白的剂量给予此组合物。优选的给药途径包括，但不限于：口服、静脉内给药、腹膜内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮运送、气管内给药、吸入、导管渗透、通过栓剂和直接注入组织。在一种实施方案中，此组合物包含一种含CAF蛋白的食品。在一种优选实施方案中，动物为哺乳动物。
优选地，给予此组合物上调动物细胞对肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素-1β(IL-1β)和/或白介素-6(IL-6)的表达。一方面，使用本组合物下调动物细胞对转化生长因子β(TGFβ)的表达。
本发明的另一种实施方案涉及一种治疗动物癌症的方法。这种方法包括给予有癌症或有发生癌症的危险性的动物包含前面所描述的含本发明的细胞因子激活因子(CAF)蛋白的组合物的步骤。优选以每公斤动物体重约1ng到约400mg CAF蛋白的剂量给予此组合物。优选的给药途径包括，但不限于：口服、静脉内给药、腹膜内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮运送、气管内给药、吸入、导管渗透、通过栓剂和直接注入位于或临近癌症的组织。在一种实施方案中，此组合物包含一种含有CAF蛋白的食品。
优选地，给予此组合物产生以下几种结果之一：减轻癌症症状、缩小癌症相关肿块、去除癌症相关肿块、预防转移癌、预防癌症并刺激抗癌的效应细胞免疫。
而本发明的另一种实施方案涉及一种分离核酸分子。这种核酸分子包含下列核酸序列之一：(a)一种编码包含下列氨基酸序列之一的核酸序列：(i)选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：6之一的氨基酸序列；和(ii)包含(i)的一个氨基酸序列的至少9个连续氨基酸残基的氨基酸序列；和(b)与核酸序列(a)完全互补的核酸序列。由核酸序列(a)编码的蛋白优选上调肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素-1β(IL-1β)和/或白介素-6(IL-6)的表达。在一种优选实施方案中，核酸分子包含编码选自SEQ ID NO：1和SEQID NO：6之一的氨基酸序列的核酸序列。
本发明的一种实施方案涉及包含前面提出的本发明的分离核酸分子的重组核酸分子。而本发明的另一种实施方案涉及包含前面所阐述的本发明的分离核酸分子的细胞。其中此细胞表达这种核酸分子。而本发明的另一种实施方案涉及前面提出的本发明的分离核酸分子。
附图简述
图1是表示在一项体外测定中3,000道尔顿MW滤过物对细胞因子诱导的作用的数字化图像。
图2是表示在一项体外测定中3,000道尔顿MW滤过物对TNFα诱导的作用的数字化图像。
图3是PL-100 3,000道尔顿MW滤过物的HPLC层析图。
图4是表示3,000道尔顿MW滤过物的Q琼脂糖部分对THP-1细胞中TNFα诱导的作用的数字化图像。
图5是Q琼脂糖柱上的CAF活性部分的HPLC层析图。
图6是Q琼脂糖柱得到的CAF1活性部分的固相萃取层析图。
图7是表示在一项体外测定中固相萃取部分对TNFα诱导的作用的数字化图像。
图8是固相萃取的CAF活性部分的HPLC层析图。
图9是表示在一项体外测定中分配萃取部分对TNFα诱导的作用的数字化图像。
图10是分配萃取的水溶部分的HPLC层析图。
图11是水溶部分C18 HPLC分离的HPLC层析图。
图12是纯化CAF的HPLC层析图。
图13是表示在一项体外测定中CAF对IL-1β诱导的作用的数字化图像。
图14是表示CAF的红外分光光度色谱。
图15表示SPE-GF II序列与鸡卵黄生成素II前体的排列和定位。
图16是说明CAF纯化步骤的示意图。
图17是表示用卵不同部分处理的THP-1细胞中的细胞因子RNA水平的数字化图像。
图18是表示卵3000Da滤过物部分激活TNFα的动力学的数字化图像。
图19是表示CAFb诱导三种细胞因子的数字化图像。
图20是表示CAFb抑制转化生长因子β的数字化图像。
发明详述
本发明总体上涉及一种新颖的细胞因子激活因子(CAF)、一种包含细胞因子激活因子(CAF)的组合物、和一种用此组合物调节免疫系统的方法。本发明的组合物可以包括包含重组产生的CAF，合成(即化学)产生的CAF或纯化CAF的组合物和/或本发明的组合物可以是包含CAF的天然食品，优选包括通过如选择过程或通过产生富集部分的方法得到的富含CAF的天然食品或其部分。这些天然食品包括超免疫卵产品，其中包括超免疫卵产品富含CAF的部分。本发明发现新颖的蛋白即CAF上调肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素-1β(IL-1β)和/或白介素-6(IL-6)的表达并下调转化生长因子β(TGFβ)的表达。所以，本发明的CAF蛋白总的说来可以通过调节这些细胞因子的表达和产生这些细胞因子或受其影响的细胞而用来调节免疫系统。另外，由于TNFα、IL-1β和IL-6一般被认为是促炎细胞因子，且TGFβ一般被认为是抗炎细胞因子，本发明的CAF蛋白对于处理需要免疫应答刺激和应答于促炎细胞因子的细胞的状况，包括但不限于细菌感染、脓毒症和癌症非常有用。
本发明者一开始发现本发明的CAF是超免疫卵产品中产生的一种成分。优选通过注射给予产卵动物而诱导免疫应答并产生含有本发明的细胞因子激活因子的超免疫卵产品的优选免疫原混合物不要求包含已知可以通过激活特定细胞因子或诱导产生诱导特定细胞因子的因子来调节免疫系统的特异性免疫原。所以，从混合抗原疫苗免疫的动物中获得的超免疫卵产品中找到这种细胞因子激活因子是令人惊讶的，预料当给予受试者时对调节免疫系统是有效的。而且，在本发明之前，并不知道超免疫产卵动物会导致产生将具有能够调节细胞因子产生和动物免疫系统细胞分化特征的本发明的新颖细胞因子激活因子。根据本发明者的了解，在本发明之前，这里所描述的细胞因子激活因子从未被识别、分离、鉴定或测序。
本发明的细胞因子可以用超滤、Q琼脂糖离子交换层析、固相萃取、分配萃取和反相C18 HPLC技术分离(见实施例1)。分析性HPLC、体外细胞因子表达研究和生物测定数据都证明了具有生物活性的细胞因子激活因子的纯化。而且，如这里所描述的，细胞因子激活因子可以用这里提供的序列信息被分离、克隆和重组产生或合成产生。
定义
除非另外指定，下面的定义应用于整个申请：
名词“超免疫”表示暴露于一中或更多免疫原(如抗原)使得免疫应答升高并维持高于自然未暴露状态。
名词“免疫原”表示可以诱导体液抗体和/或细胞介导免疫应答而不是免疫耐受的物质。此名词强调刺激免疫应答和与其产物如抗体反应的能力。
名词“组合衍生免疫原”是指通过组合合成的途径在免疫原中产生分子多样性的方法。
名词“生物工程免疫原”是指通过基因克隆技术和遗传操作或化学合成的方法获得的免疫原。
名词“遗传疫苗”是指一般通过重组技术产生并可以激发免疫应答的核酸疫苗。
名词“卵”或“卵产品”均都表示任何完整的卵(餐用的，超免疫的或其它)或任何由其衍生的产品或部分。
名词“餐用卵”或“餐用卵产品”均都表示从没有维持在超免疫状态的产卵动物中获得的完整的卵或任何由其衍生的产品或部分。
名词“超免疫卵”或“超免疫卵产品”均都表示从维持在超免疫状态的产卵动物中获得的完整的卵或任何由其衍生的产品或部分。
名词“超常水平”表示超过没有维持在超免疫状态的产卵动物中的水平。
名词“免疫调节卵”表示含有这里公开的细胞因子激活因子的卵或卵部分。
名词“免疫应答”一般是指细胞介导的或细胞免疫应答(即由免疫系统的细胞包括T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞介导的免疫应答)和/或体液免疫应答(即由抗体介导的免疫应答)。
名词“动物”是指任何动物界的种。本发明的优选免疫动物包括脊椎动物门鸟纲的任何动物，包括但不限于鸡、火鸡和鸭。本发明优选的治疗动物包括脊椎动物门鸟纲和哺乳动物纲的任何动物，包括但不限于灵长类、啮齿类、家畜和家养宠物。家畜包括食用或产生有用产品的(如产毛的羊)哺乳动物。优选预防疾病或状况的哺乳动物包括人、狗、猫、小鼠、大鼠、羊、牛、马和猪，人尤其优选。
名词“靶动物”是指作为产卵动物的动物。
名词“受试动物”是指给予了本发明的一种包含CAF的组合物的动物，此组合物包括包含纯化CAF，合成产生的CAF，重组产生的CAF或由靶动物产生的富含CAF的卵或卵产品的组合物。受试动物也可指病人。
名词“细胞因子激活因子”或“CAF”一般是用来指本发明任何纯度的(如作为卵的成分、作为半纯化蛋白、作为高度纯化蛋白、作为重组蛋白或作为化学合成蛋白)并具有这里所描述的细胞因子激活因子的生化、物理、结构和/或功能特征(如生物活性)的因子。注意高度纯化的CAF根据本发明也可以称作“CAFb”(见实施例1)。
名词“高纯度的细胞因子激活因子”或“高纯度的CAF”表示至少具有实施例1描述的CAFb纯度的细胞因子激活因子。
名词“富含细胞因子激活因子的”或“富含CAF的”产品或组合物是指已经被纯化、加工和/或生产而与纯化、加工和/或生产阶段前产品或组合物的细胞因子激活因子水平相比在富集或终产品中含有更高水平的细胞因子激活因子的产品或组合物。所以，在一种实施方案中，初产品或组合物中有CAF，纯化、加工和/或生产的步骤一般是通过从初产品中去除或减少一些成分的量而相对于产品或组合物中的其它成分增加了产品或组合物中CAF的量。在另一种实施方案中，初产品或组合物或者不包含CAF，或者包含初始量的CAF，富含CAF的产品或组合物通过在初产品或组合物中添加纯化、重组或合成的CAF而产生。这种富含CAF的组合物在下面有更详细的讨论。其它富集组合物或产品中CAF的途径对本领域中的技术人员将是显而易见的。
关于一种化合物(如本发明的蛋白或核酸分子)的名词“分离的”是指从天然的环境中被去除的化合物(即接受了人为操作)。同样，“分离的”并不反映化合物被纯化的程度。
名词“蛋白”可以与名词“多肽”互换使用，尽管后者一般是指具有基本为线性二级结构的相对小的蛋白。名词“蛋白”或“多肽”包括全长蛋白、融合蛋白、或这种蛋白的同系物。
短语“CAF蛋白的同系物”(即“CAF同系物”)包括至少一个或几个，但不限于一个或几个氨基酸被去除(如蛋白的截短版本，如多肽或片段)、插入、反向、替换和/或衍生(如通过糖基化、磷酸化、乙酰化、豆蔻酰化、异戊二烯化、棕榈酰化、酰胺化和/或添加糖基磷脂酰肌醇)的CAF蛋白。优选地，CAF同系物具有CAF的生物活性。
关于本发明的CAF蛋白的短语“具有生物活性的”或“生物活性”是指CAF蛋白的任何功能活性，一般说来是天然存在的CAF蛋白的功能活性。特别涉及CAF蛋白的生物活性优选指CAF蛋白上调(诱导、刺激、促进、升高)细胞因子包括肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素-1β(IL-1β)和/或白介素-6(IL-6)的表达的能力。注意这里详细描述的天然存在的CAF可以上调TNFα、IL-1β和IL-6表达的能力。CAF的生物活性也可以包括下调(抑制、减少、压制)转化生长因子β(TGFβ)的表达。CAF蛋白的生物活性也可以包括但不限于CAF与受体或另一种蛋白、DNA、糖部分或脂部分结合的能力，这产生或归因于上述指定的生物活性之一。
蛋白的“有生物活性的亚单位”是具有全长蛋白或多聚体生物活性的蛋白部分(即片段、结构域或单体)。
名词“模拟物”是指任何可以模拟天然存在肽的生物活动的肽或非肽化合物，这通常是因为模拟物有模拟天然存在肽的基本结构和/或具有天然存在肽的显著生物性质的基本结构。模拟物可以包括，但不限于：有对原型的充分修饰如与天然存在肽无侧链相似性(这些修饰，例如可以减少它的易降解性)的肽；抗特应性和/或催化抗体或其片段；分离蛋白的非蛋白部分(如糖结构)；或合成或天然有机分子，包括通过例如组合化学鉴别的核酸和药物。
关于本发明的蛋白的名词“稳定的”，是指蛋白对抗由温度增高或降低、pH增加或减少、盐浓度增加或减少、氧化和/或还原、脱酰胺作用导致的降解，和/或抗其它形式的化学降解和蛋白酶降解的能力。更具体地说，通过检测任何可测量水平的蛋白生物活性，优选通过检测蛋白影响细胞表达TNFα、IL-1β和IL-6的任何可测量增加的能力来判断蛋白在任何特定条件下是稳定的。优选地，被认为稳定的蛋白在暴露于特定条件之后与暴露于该条件之前的生物活性(如自然条件下的生物活性)相比，保持至少10％，更优选至少25％，更优选50％的生物活性。蛋白的稳定性可以指如上所述，蛋白在储存或使用时保持稳定的能力。
短语“核酸分子”主要是指物理的核酸分子，短语“核酸序列”主要是指核酸分子中的核苷酸序列。然而，这两个短语可以互换使用，特别是对于能够编码蛋白的核酸分子或核酸序列更是如此。
短语“重组分子”或“重组核酸分子”主要指操作连接到转录控制序列的核酸分子。
短语“操作连接”是指通过当分子被转染(即转化、转导、转染、接合或传导)到宿主细胞时仍可以被表达的方式将核酸分子连接到转录控制序列。
短语“转录控制序列”是指任何控制转录起始、延伸和终止的序列。特别重要的转录控制序列是那些控制转录起始的序列，如启动子、增强子、操纵基因和阻遏物序列。
名词“转染”是指任何可以使外源性核酸分子(即重组核酸分子)插入细胞的方法。当用来指将核酸分子引入微生物细胞如细菌和酵母时，名词“转化”可以与名词“转染”互换使用。在微生物系统中，名词“转染”用来描述由于微生物获得外源性核酸而造成的遗传改变，并基本与名词“转染”同义。然而，在动物细胞中，转化获得了第二种意思，可以指例如培养物中的细胞变为癌性时生长属性的改变。所以，为避免混淆，名词“转染”优选用于关于将外源性核酸引入动物细胞，名词“转染”在这里将主要用于将动物细胞转染和微生物细胞转化包含到此名词关于将外源性核酸引入细胞的范围。所以，转染技术包括，但不限于转化、电穿孔、微量注射、脂质转染、吸收、感染和原生质融合。
关于这里描述的核酸或氨基酸的名词“邻接的”或“连续的”可以互换使用并且是指被连接为无中断的序列。例如，对于第一个序列包含第二个的30个邻接的(或连续的)氨基酸，表示第一个序列包含一个与第二个序列中30个氨基酸残基的未中断序列100％等同的30个氨基酸残基的未中断序列。同样，对于第一个序列与第二个序列有“100％等同性”表示第一个序列完全符合第二个氨基酸序列，在核苷酸或氨基酸中间没有缺口。
关于等同百分比(％)，除非另外指定，是指在两个或更多氨基酸或核酸序列间进行的同源性评价，使用(1)BLAST 2.0 Basic BLAST同源性搜索(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，使用标准缺省参数用blastp进行氨基酸搜索以及用blastn进行核酸搜索，其中通过缺省对询问序列进行低复杂区筛选(在Altschul，S.F.，Madden，T.L.，Schaaffer，A.A.，Zhang，J.，Z.，Miller，W. & Lipman，D.J.(1997)“Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs.”NucleicAcids Res.25：3389-3402中有描述，在此引入其完整内容作为参考)；(2)BLAST 2对比(使用下面描述的参数)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)；(3)BLAST 2.0和BLAST。注意由于BLAST 2.0 Basic BLAST和BLAST 2的标准参数之间的一些不同，用BLAST 2程序可能将两个特定序列识别为有显著同源性，而将其中一个序列作为询问序列在BLAST 2.0 Basic BLAST中进行的搜索可能不会将第二个序列识别为最高匹配。所以，应该理解等同百分比可以用两个程序之一或二者一起来判断，但优选使用BLAST 2.0 Basic BLAST。两个特定序列可以用BLAST 2测序进行互相对比，如Tatusova andMadden，(1999)，“Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein andnucleotide sequences”，FEMS Microbiol Lett.174：247-250的描述，在此引入其完整内容作为参考。BLAST 2序列对比在blastp和blastn中使用BLAST 2.0算法在两个序列间进行有缺口的BLAST搜索(BLAST 2.0)，允许在产生的排列中引入缺口(缺失和插入)。这里为了明确，用如下缺省参数进行了一个BLAST 2序列对比。
对于blastn，使用0 BLOSUM62模板：
Reward for match＝1
Penalty for mismatch＝-2
Open gap(5)and extension gap(2)penalties
gap x_dropoff(50)expect(10)word size(11)filter(on)
对于blastp，使用0 BLOSUM62模板：
Open gap(11)and extension gap(1)penalties
gap x_dropoff(5O)expect(10)word size(3)filter(on).
“杂交条件”是指核酸分子用来识别相似核酸分子的标准杂交条件。这种标准条件公开在例如Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Labs Press，1989.Sambrook et al.，ibid.，在此引入其完整内容作为参考(特别见9.31-9.62页)。另外，计算允许获得不同程度核苷酸错配的杂交的适当杂交和漂洗条件的公式公开在例如Meinkoth et al.，1984，Anal.Biochem.138，267-284；Meinkoth etal，ibid.，在此引入其完整内容作为参考。本领域的技术人员可以运用Meinkoth et al.，ibid.中的公式计算获得特定水平核苷酸错配的适当杂交和漂洗条件。这种条件将根据是否形成了DNA∶RNA或DNA∶DNA杂交物而改变。计算得到的DNA∶DNA杂交物解链温度比DNA∶RNA杂交物的解链温度低10℃。通过实施例，特别是实施方案，DNA∶DNA杂交物的严格杂交条件包括在离子强度为6X SSC(0.9M Na+)下，温度处为约20℃到约35℃(如较不严格的条件)，更优选为约28℃到约40℃(如更严格的条件)，甚至更优选为约35℃到约45℃(甚至更严格的条件)的条件下杂交。在一种的特定的实施方案中，DNA∶DNA杂交物的严格杂交条件包括在离子强度为6X SSC(0.9M Na+)下，温度为约20℃到约45℃，更优选为约38℃到50℃，甚至更优选约45℃到约55℃(甚至更严格的条件)的条件下杂交。这些值是以大于约100个核苷酸，0％甲酰胺和G+C含量约40％的解链温度计算为基础的。另外，Tm可以按Sambrook et al，supra，pages 9.31到9.62中所阐述的进行经验计算。
“低严格杂交”(和漂洗条件)是指允许分离与杂交反应中用作探针的核酸分子有至少约40％核酸序列等同的核酸分子的条件(即用Meinkoth et al.，ibid.中的公式判断的允许约60％或更少核苷酸错配的条件)。
“中度严格杂交”(和漂洗条件)是指允许分离与在杂交反应中用作探针的核酸分子有至少约60％核酸序列等同的核酸分子的条件(即用Meinkoth et al.，ibid.中的公式判断的允许约40％或更少核苷酸错配的条件)。
“高严格杂交”(和漂洗条件)是指允许分离与在杂交反应中用作探针的核酸分子有至少约80％核酸序列等同的核酸分子的条件(即用Meinkoth et al.，ibid.中的公式判断的允许约20％或更少核苷酸错配的条件)。
“极高严格杂交”(和漂洗条件)是指允许分离与在杂交反应中用作探针的核酸分子有至少约90％核酸序列等同的核酸分子的条件(即用Meinkoth et al.，ibid.中的公式判断的允许约10％或更少核苷酸错配的条件)。
名词“调节”或此名词的派生词，表示从一个状态改变、调节到另一个状态，并包括任何可测量特征的任何可测量或可观察的增加或减少和/或从一个特征改变为另一个不同的特征。
短语“可药用载体”是指可药用的赋形剂、配方和/或可药用的运送载体，它适用于将本发明的组合物给予到适当的体外、来自体内或体内的位点。可药用载体可以使本发明的组合物以任何适当的形式包括但不限于，液体、气溶胶、片剂、丸剂、粉末、凝胶和颗粒生产/提供。一些可药用载体包括细胞、膜、脂配方(包括当给予病人时，原位形成固体或凝胶的液体)、抗体配方、食品(如任何可食用产品或制剂)及重组病毒。优选载体也是生物可降解的(即生物可蚀的)。
“可药用赋形剂”包括运输或帮助运输，但不特异性将组合物定向于细胞的赋形剂或配方(这里也称作非定向载体)。可药用赋形剂的例子包括，但不限于水、磷酸缓冲液、林格氏液、葡萄糖液、含血清溶液、汉克氏液、其它生理平衡水溶液、油、酯和乙二醇。液态载体可以包含适当的辅助物质以便例如，通过提高化学稳定性和等渗性接近受体的生理状况。适当的辅助物质包括，例如乙酸钠、氯化钠、乳酸钠、氯化钾、氯化钙和其它用于产生磷酸缓冲液、Tris缓冲液和碳酸氢盐缓冲液的其它物质。辅助物质也可包括防腐剂，如硫柳汞、或o-甲酚、福尔马林、苯甲醇。
“控释载体”是一种能够以控制的方式向病人或培养物释放本发明的组合物或蛋白的可药用载体类型。控释配方将本发明的一种化合物(如CAF蛋白(包括同源物)、抗体、核酸分子或模拟体)包含在控释载体中。适当的控释载体包括，但不限于生物相容聚合物、其它聚合物基体、胶囊、微胶囊、团块制剂、渗透泵、扩散装置、脂质体、脂质球和经皮运送系统。
“可药用运送载体”是一种可以将本发明的组合物或蛋白运送到靶位点的可药用载体。优选地，可药用运送载体可以将组合物定向于(即指定、选择性运送到)靶位点。“靶位点”是指希望将组合物运送到的病人的位点。例如，靶位点可以是任何通过使用人工和天然含脂运送载体(如脂质体)、抗体、病毒载体或其它运送系统包括核酶直接注射或运送而定向的任何细胞或组织。天然含脂运送载体包括细胞和细胞膜。人工含脂运送载体包括脂质体和胶粒。当化合物为蛋白(如CAF蛋白)时，适当的运送载体包括，但不限于抗体、脂质体和细胞(如表达此蛋白的重组细胞)。当化合物为重组核酸分子时，适当的运送载体包括，但不限于脂质体、病毒载体、金颗粒、聚L-赖氨酸/DNA分子结合、人工染色体或其它运送载体，包括核酶。
名词“脂质体”是指可以运送核酸分子和蛋白质到病人特定或选择位点的包含脂质成分的运送载体。脂质体包含可以与靶细胞细胞膜融合而将核酸分子运送到细胞的脂质组成。本发明使用的适合脂质体包括任何脂质体。本发明优选的脂质体包括通常用于如本领域技术人员公知的基因运送方法的脂质体。更优选的脂质体包含具有聚阳离子脂质组成的脂质体和/或有与聚乙二醇结合的胆固醇主链的脂质体。可以用本领域中的标准方法完成将脂质体与本发明的核酸分子混合。
名词“病毒载体”是指本发明中有用的分离核酸分子，其中此核酸分子被装配在允许DNA进入细胞的病毒外衣中。可以使用许多病毒载体，包括但不限于，基于甲病毒、痘病毒、腺病毒、疱疹病毒、慢病毒、腺病毒相关病毒和逆转录病毒的病毒载体。
名词“给药”表示任何给受试者提供物质的方法(如将物质引入受试者)，包括体内或来自体内给药。体内给药方法包括，但不限于，静脉内给药、腹膜内给药、肌肉内给药、冠状动脉内给药、动脉内给药(如进入颈动脉)、皮下给药、经皮运送、气管内给药、皮下给药、关节内给药、心室内给药、吸入(如气溶胶)、脑内、鼻腔、口腔、眼球内、肺部给药、导管渗透、通过栓剂和直接注射入组织。来自体内是指在病人体外进行部分调节步骤，如通过在使重组分子被转染细胞表达的条件下用包含编码本发明CAF蛋白的核酸序列的重组分子转染从病人中去除的一个细胞群，并使被转染细胞返回病人。获得这种转染的方法包括，但不限于，转染、病毒感染、电穿孔、脂转染、细菌转移、原生质球融合和吸附。来自体内方法特别适合于靶细胞可以轻易从病人去除和返回的情况。
名词“治疗益处”并不一定指治愈特定疾病或状况，而优选可以缓解疾病或状况、去除疾病或状况、减轻疾病或状况相关症状、预防或缓解由原发疾病或状况而继发的疾病或状况(如由原发癌产生的转移癌)，和/或预防疾病或状况的结果。
关于疾病或状况的名词“保护”是指减轻疾病症状；减少发病；和/或减轻疾病的严重性。保护病人或受试者可以指当给予病人本发明的组合物时，此组合物预防发病和/或治愈或缓解疾病症状、体征或病因的能力。同样，保护病人不受疾病侵袭。包括预防发病(预防性治疗)和治疗患病的病人(治疗性治疗)
名词“预防”表示减轻和/或消除疾病进展，或消除疾病的发生(预防性治疗)。
名词“治疗”表示疾病症状(包括疼痛)和/或疾病病原体的来源被延缓、减轻或完全预防，或，如果有症状，症状被改善或完全消除。例如，CAF组合物不仅通过抑制人和其它哺乳动物的疾病症状，也通过作为对抗受体疾病出现的预防试剂而治疗癌症。
名词“疾病”是指任何从哺乳动物正常健康的偏离并包括出现疾病症状的状态，和出现偏离(如感染、基因突变、基因缺陷等)而还没有表现出症状的状况。
名词“一种”实体表示一种或更多该实体。同样，名词“一种”，“一种或更多”和“至少一种”在这里可以互换使用。
发明详述
本发明的一种实施方案涉及一种分离细胞因子激活因子(CAF)蛋白。分离CAF蛋白包括全长蛋白、截短蛋白(即全长蛋白的片段)、融合蛋白。或这种蛋白的同系物。前面已经定义了CAF同系物。CAF同系物优选有CAF的生物活性，前面也已经定义。具体地说，本发明的CAF蛋白优选具有CAF生物活性，包括上调(升高、刺激、诱导、促进)肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素-1β(IL-1β)的表达和/或下调(降低、抑制、防止、减少)白介素-6(IL-6)的表达的能力。这种生物活性可以用本领域任何适当的测量细胞因子活性的方法，包括，但不限于免疫测定(包括酶联免疫测定，或ELISA)、放射免疫测定、和RNA测定(见实施例)而测量。CAF的蛋白的生物活性也可以包括，但不限于：CAF与受体或另一种蛋白、DNA、糖部分或脂部分结合的能力，这产生或归因于前面指出的生物活性。测量蛋白与另一种部分结合的方法处在本领域技术的能力范围内。而且，使用这里提供的指导，本领域的一种技术可以对野生型CAF的核酸和/或氨基酸序列(如氨基酸SEQ ID NOs：1或6)进行修饰并检验具有此修饰的同系物的一种或更多CAF生物活性。例如，判断CAF诱导或抑制细胞因子表达的能力的方法在实施例部分有描述。
分离CAF蛋白可以包括基本上从天然来源(如本发明的超免疫卵)中纯化出的CAF蛋白，重组产生的CAF和/或合成产生的CAF。本发明的一种特别优选的CAF蛋白包含选自SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：6之一的氨基酸序列。SEQ ID NO：1跨越SEQ ID NO：6的氨基酸1-30，并且是SEQ ID NO：6的N端片段。SEQ ID NO：6被认为是从超免疫卵中纯化出的本发明的CAF蛋白的全长氨基酸序列。
在一种实施方案中，CAF蛋白包括具有包含SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：6的至少9个邻接氨基酸残基(即9个邻接的氨基酸残基与SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：6的9个邻接氨基酸有100％等同性的氨基酸残基)的氨基酸序列的蛋白质。这种蛋白可以称作包含SEQ ID NO：1和/或SEQID NO：6的蛋白(如天然存在的CAF蛋白)的同系物。在一种优选实施方案中，CAF蛋白同系物包含含有至少12个，更优选至少约15个，更优选至少约20个，更优选至少约25个SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：6的邻接氨基酸残基的氨基酸序列。在另一种优选实施方案中，CAF蛋白同系物包含含有至少30个，更优选至少约35个，更优选至少约40个，甚至更优选至少约45个，更优选至少约50个，更优选至少约55个，更优选至少约60个，更优选至少约65个SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：6的邻接氨基酸残基的氨基酸序列。
CAF蛋白同系物可以包括由包含编码SEQ ID NO：1和/或SEQ IDNO：6的至少27个，优选至少36个，更优选至少45个，更优选至少60个，更优选至少75个核酸序列的邻接核苷酸的核酸序列编码的蛋白。在另一种实施方案中，CAF蛋白同系物可以包括由包含编码SEQ ID NO：6的核酸序列的至少90个，优选至少120个，更优选至少135个，更优选至少150个，更优选至少165个，更优选至少180个，更优选至少195个邻接核苷酸的核酸序列编码的蛋白。
如前面所讨论的，CAF蛋白同系物优选具有可测量的CAF生物活性(即有生物活性)。然而，在一些实施方案中，CAF蛋白，包括CAF蛋白同系物被用于制备抗体或产生对识别CAF和CAF相关蛋白有用的寡核苷酸(如用抗体或寡核苷酸筛选/选择超免疫卵富含CAF的部分)，用于克隆编码CAF的核酸序列(用寡核苷酸)，和/或用于识别与CAF结合的蛋白或核酸。在这些实施方案中，除了对这些方法有用的CAF蛋白内在具有CAF生物活性的程度之外，CAF蛋白是否具有生物活性与其它因素并不特别相关。
在一种实施方案中，CAF蛋白(如CAF蛋白同系物)包含一个分别至少约65％等同于SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：6，超过SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：6的至少约15个邻接氨基酸，更优选超过至少约20个氨基酸，更优选超过至少约25个氨基酸的氨基酸序列。优选地，CAF蛋白包含分别至少约70％，更优选至少约75％，更优选至少约80％，更优选至少约85％，更优选至少约90％，甚至更优选至少约95％等同于SEQID NO：1和/或SEQ ID NO：6，超过SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：6的至少约15个氨基酸，更优选超过至少约20个氨基酸，更优选超过至少约25个氨基酸的氨基酸序列。在另一种实施方案中，CAF蛋白包含分别至少约65％，更优选至少约70％，更优选至少约75％，更优选至少约80％，更优选至少约85％，更优选至少约90％，甚至更优选至少约95％等同于SEQ ID NO：6，超过SEQ ID NO：6的至少约30个氨基酸，更优选超过至少约35个氨基酸，更优选超过至少约40个氨基酸，更优选超过至少约45个氨基酸，更优选超过至少约50个氨基酸，更优选超过至少约55个氨基酸，甚至更优选超过至少约60个氨基酸的氨基酸序列。
在另一种实施方案中，CAF蛋白包含至少约60％等同于SEQ IDNO：6，超过SEQ ID NO：6的至少66个氨基酸，更优选超过至少约67个氨基酸，更优选超过至少约68个氨基酸，更优选超过至少约69个氨基酸的氨基酸序列。优选地，CAF蛋白包含至少约65％，更优选至少约70％，更优选至少约75％，更优选至少约80％，更优选至少约85％，更优选至少约90％，甚至更优选至少约95％等同于SEQ ID NO：6，超过SEQID NO：6的至少66个氨基酸，更优选超过至少约67个氨基酸，更优选超过至少约68个氨基酸，更优选超过至少约69个氨基酸的氨基酸序列。前面已经描述过判断等同百分比的方法。
在另一种实施方案中，CAF蛋白，包括CAF蛋白同系物，包括具有与天然CAF氨基酸序列足够相似的氨基酸序列，编码同系物的核酸序列可以在中度、高或极高严格条件下(前面所描述的)与编码天然CAF蛋白的核酸杂交(即与编码天然CAF氨基酸序列的核酸分子互补)。这些条件在前面已经定义。优选地，CAF蛋白的同系物由包含在中度、高或极高严格条件下与编码包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：6所代表的氨基酸序列的蛋白的核酸序列的互补序列杂交的核酸序列的核酸分子编码。与编码本发明的CAF蛋白的核酸序列互补的核酸序列是指与编码CAF的链互补的核酸链的核酸序列。最好是编码某种氨基酸序列的双链DNA包含一个单链DNA和具有与单链DNA互补序列的它的互补链。同样，本发明的核酸分子即可以是双链也可以是单链，包括在严格杂交条件下与编码氨基酸序列SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：6的核酸序列，和/或与编码氨基酸序列SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：6的核酸序列互补序列形成稳定杂交物的核酸分子。推测互补序列的方法在本领域的技术人员中是公知的。应该注意氨基酸测序和核酸测序技术并不是完全无错误的，这里列出的序列最多只能代表本发明的CAF蛋白的近似序列。
CAF蛋白同系物可以是天然等位基因变异或自然突变的结果。本发明的CAF蛋白同系物也可以用包括，但不限于，直接修饰蛋白或利用例如经典或重组DNA技术影响随机或定向诱变来修饰编码蛋白的基因等本领域公知的技术产生。编码CAF的核酸的天然存在的等位基因变体是在基因组中与编码氨基酸序列SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：6出现于基本相同基因座，但由于例如突变或重组导致的自然变异，而具有相似但不等同的序列的基因。天然等位基因变体一般编码与由它们所对比的基因编码的蛋白有相似活性的蛋白。由于遗传密码简并，一类等位基因变体可以编码相同的蛋白而具有不同的核酸序列。等位基因变体也可以包含基因5’或3’端为未翻译区(如在调控区)的改变。等位基因变体是本领域技术人员公知的并由于基因组为单倍体而可以在某种细菌种属中和/或在两种或更多细菌种属中发现。
CAF蛋白也包括基因融合(例如，用于过度表达重组蛋白的可溶、活性形式)、诱变基因(如具有增强基因转录和翻译的密码修饰的基因)和截短基因(如去掉一些结构域而产生全长蛋白的生物活性片段或亚单位的基因)的表达产物。注意本发明的CAF蛋白和蛋白同系物包括没有CAF活性的蛋白。这种蛋白对例如抗体产生是有用的。
本发明的分离CAF蛋白，包括全长蛋白、截短蛋白、其它同系物和融合蛋白，可以用直接方式识别：(1)如实施例中所说明的，通过蛋白上调TNFα、IL-1β和/或IL-6的表达，和/或下调TGFβ的能力；(2)通过蛋白的生化和结构属性(如分子量、初级结构、稳定性特征)；(3)通过蛋白与抗CAF蛋白抗体的选择性结合；和/或(4)通过蛋白与其它CAF氨基酸和核酸序列如与超免疫卵以外来源的CAF氨基酸和核酸序列的同源性。本发明的蛋白和/或同系物的最小大小是足够有CAF生物活性或，当蛋白不要求有这种活性时，足够对另一种与本发明的CAF相关的目的，如对产生与天然存在CAF蛋白结合的抗体有用的大小。同样，本发明的蛋白和/或同系物的最小大小是适合形成至少一个可以由抗体识别的表位的大小，长度一般至少为8-30个氨基酸(包括以一个氨基酸为单位增加的8和30之间的任何长度)，优选大小取决于需要这种蛋白的全长、多价(即具有一个以上各自有功能的结构域的融合蛋白)还是功能部分。除了实际限制，没有对这种蛋白最大大小的限制，其中此蛋白可以包括CAF蛋白的一部分(包括CAF同系物)或全长蛋白。
本发明也包括一种包括附着于一个或更多融合片段的含CAF的结构域(包括CAF蛋白同系物)的融合的蛋白。本发明可以使用的适当融合片段包括，但不限于可以：增强蛋白稳定性；提供其它需要的生物活性(如细胞因子)；和/或帮助CAF蛋白纯化(如通过亲和层析)的片段。适当融合片段可以是具有需要功能(如赋予增加的稳定性、溶解性、作用或生物活性；和/或简化蛋白纯化)的任何大小的结构域。融合片段可以与蛋白含CAF结构域的氨基和/或羧基端连接因而可以易受剪切从而允许CAF蛋白直接回收。融合蛋白优选通过培养用编码包括与含CAF结构域羧基和/或氨基端附着的融合片段的蛋白的融合核酸分子转染的重组细胞而产生。
本发明也包括CAF蛋白的模拟物。这里用到的名词“模拟物”是指任何可以模拟天然存在肽的生物活性的肽或非肽化合物，这通常是因为模拟物具有模拟天然存在肽的基本结构和/或具有天然存在肽的显著生物性质的基本结构。模拟物可以包括，但不限于：有对原型的充分修饰如与天然存在肽无侧链相似性(这些修饰，例如可以减少它的易降解性)的肽；抗特应性和/或催化抗体或其片段；分离蛋白的非蛋白部分(如糖结构)；或合成或天然有机分子，包括通过例如组合化学鉴别的核酸和药物。
这些模拟物可以用本领域中许多公知的方法进行设计、选择和/或识别。许多对设计在本发明中有用的模拟物或其它治疗化合物有用的药物设计方法公开在Maulik et al.，1997，Molecular Biotechnology：TherapeuticApplications and Strategies，Wiley-Liss，Inc.，在此引入其全部内容作为参考。可以从例如分子多样性策略(允许迅速构建大型的、化学多样性分子文库的相关策略的结合)、天然或合成化合物文库，特别是从化学或组合文库(即序列或大小不同但有相似构件的化合物文库)，或通过推理、定向或随即药物设计得到CAF模拟物。见例如Maulik et al.，supra。
在一种分子多样性策略中，大型化合物文库是用生物、酶和/或化学方法从例如肽、寡核苷酸、糖和/或合成有机分子合成的。建立分子多样性策略的关键参数包括亚单位多样性、分子大小和文库多样性。筛选这种文库的总目标是利用结合选择的序贯应用来获得所需靶的高亲和性配体，然后通过随机或定向设计策略最优化引导分子。分子多样性的方法在Maulik et al.，ibid中有详细描述。
Maulik等也公开了例如定向设计方法，其中使用者指定从适当选择的片段的片段文库建立新分子的过程；随机设计，其中使用者用遗传或其它算法将片段和它们的组合随机突变并同时应用选择标准来评估候选配体的适合度；以及一种基于网格的方法，其中使用者计算三维受体结构和小片段探针之间的相互作用能，然后将适合的探测位点连接在一起。
根据本发明，CAF蛋白可以从任何动物，特别是脊椎动物哺乳纲或鸟纲的任何动物得到。优选地，CAF蛋白来自于脊椎动物鸟纲的产卵动物。优选CAF蛋白包括来自于超免疫鸡、火鸡或鸭的分离CAF蛋白。特别优选的CAF蛋白来自于超免疫鸡卵中的CAF蛋白。
如前面所讨论的，本发明的CAF蛋白可以由任何适于产生蛋白或多肽的方法产生。产生本发明的CAF蛋白的特别优选的方法是通过化学合成方法。例如，这些方法包括熟知的化学程序，如溶解或固相肽合成，或以通过常规溶解方法偶联的蛋白片段开始的溶解半合成。这些方法是本领域中熟知的并可以在本领域的普通课本和文章中找到，如：Merrifield，1997，Methods Enzymol.289：3-13；Wade et al.，1993，Australas BiotechnoL3(6)：332-336；Wong Ct al.，1991，Experientia 47(11-12)：1123-1129；Careyetal.，1991，Ciba Found Symp.158：187-203；Plauc etal.，1990，Biologicals18(3)：147-157；Bodanszky，1985，Int.J Pept.Protein Res.25(5)：449-474；或H.Dugas and C.Penney，BIOORGAMC CHEMISTRY，(1981)54-92页，在此引入所有这些文章的全部内容作为参考。例如，可以利用可购买到的肽合成剂和生产商提供的合成循环通过固相方法学合成肽。本领域中的技术人员发现固相合成也可以用FMOC策略和TFA/清除剂切除混合物完成。
尽管对于较小的蛋白，一般优选肽合成，如果需要更大量的CAF蛋白，可以用重组DNA技术产生蛋白。蛋白可以在有效产生蛋白并回收蛋白的条件下通过培养能够表达此蛋白的细胞而重组产生(即通过表达编码蛋白的重组核酸分子，后面由详细描述)。有效培养条件包括，但不限于有效培养基、生物反应器、温度、pH和允许蛋白产生的氧条件。有效培养基是指可以在其中培养细胞而产生本发明的CAF蛋白的培养基。这种培养基一般包括具有可吸收碳、氮和磷酸盐来源以及适量盐、矿物质、金属和其它营养成分如维生素的液态培养基。重组细胞(即表达编码CAF蛋白的核酸分子的细胞)可以在常规发酵生物反应器、摇瓶、微量滴定皿和培养皿中培养。培养可以在适合重组细胞的温度、pH、和氧含量下进行。这种培养条件在本领域的普通技术的专门技术的范围内。这些技术在本领域中是熟知的，在例如Sambrook et al.，1988，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York或Current Protocols inMolecular Biology(1989)及增补中有描述。
根据用于产生CAF蛋白的载体和宿主系统，产生的本发明的CAF蛋白可以保持在重组细胞中；被分泌到培养基中；被分泌到两个细胞膜之间的空间如大肠杆菌周质空间；或保留在细胞或病毒膜的外表面。短语“回收蛋白”是指收集含有此蛋白的整个培养基并不需要指额外的分离或纯化。本发明的CAF蛋白可以用多种标准纯化技术纯化，如，但不限于亲和层析、离子交换层析、过滤、电泳、疏水作用层析、凝胶过滤层析、反相层析、伴刀豆凝集素A层析、层析聚焦和差别溶解。本发明的蛋白优选以“基本纯净”的形式回收。这里使用的“基本纯净”是指允许将蛋白有效使用为生物催化剂、其它试剂或给予受试者的纯度。例如，实施例1中描述的包含CAF的水溶部分本认为是基本纯净的并适于给予病人。
而在另一种实施方案中，本发明的CAF蛋白可以从适当的来源包括，但不限于用一种或更多免疫原，特别是细菌抗原或它们的合成等同物超免疫的鸟类的卵中高度纯化。本发明者发现本发明的细胞因子激活因子以超常水平出现在超免疫卵中。高度纯化的卵细胞因子激活因子可以从完整卵、卵黄和卵白中分离。从卵黄中高度纯化的CAF表现出比从卵白中高度纯化的CAF更高的免疫调节活性。
从卵中大规模纯化CAF的过程一般使用40kg超免疫卵黄(如在美国专利5,772,999中描述的PL-100或S-100卵黄)作为起点。CAF可以用超滤、Q琼脂糖离子交换层析、固相萃取和下面简要描述以及实施例部分详细描述的其它方法进行高度纯化。
细胞因子激活因子可以从完整卵、卵黄或卵白中高度纯化。优选高度纯化过程的一个例子如下：
1.卵黄去脂；
2.卵黄3000道尔顿MW滤过物制备；
3.用离子或阴离子交换层析分离各部分；
4.固相萃取；
5.固相萃取部分的分配萃取；
6.HPLC分离；及
7.细胞因子诱导活性的生物测定。
下面是对这一过程的更详细的描述：
步骤1：
细胞因子激活因子可以从完整卵、卵黄和卵白中高度纯化。在一种优选实施方案中，此组合物从卵黄中纯化。用本领域技术人员熟知的方法去除完整卵或卵黄中的脂质部分。例如，对于喷雾干燥的卵黄粉末，可以用溶剂(丙烷、丁烷或己烷或其它二元溶剂)、超临界CO2、酶等完成脱脂。对于液体卵黄，可以用Lee(美国专利5,367,054)公开的辛酸分离法(CAPS)完成脱脂。卵白不需要脱脂，并且卵白的液体或粉末形式可以按下面列出的实施例中描述的常规方法被直接加热或溶解。然后优选将完整卵、卵黄或卵白加工为液体或粉末形式，然后进一步加工获得水溶部分。(见实施例)
步骤2：
从完整卵、卵黄或卵白中得到的水溶部分接受超滤，使用装备了3000道尔顿分子量截止膜的超滤系统。超滤过程将将分子量大于约3,000道尔顿的分子与分子量小于约3000道尔顿的分子分开。注意3000道尔顿的截止是近似的，因为如果次级结构允许(即基本线性多肽/蛋白)，明显更大的蛋白可以通过过滤器。一旦被过滤，产生的超滤物包含分子量小于约3000道尔顿的分子(或更大的基本线性的多肽)，然后冻干、称重并准备进行生物测定检验和进一步分离。
步骤3-7：
这些步骤在实施例1和附图中详细阐明，在这里将不重复。
本发明的高度纯化的细胞因子激活因子有下列物理/化学特征(即鉴定特征)：
a.有至少一个通过3000道尔顿分子量截止超滤过滤器的生物活性亚单位；
b.在高达至少约50℃的温度下保持稳定(即有可测量的生物活性)；
c.在从2左右到10左右的pH下稳定；
d.为水溶性；
e.为非甾体的；
f.带负电的；
g.基本为非极性的；和
h.在约254nm有λmax；
另外，本发明的高度纯化细胞因子激活因子有下列生化/功能特征：
a.在受试动物中有免疫调节活性；
b.在鸟卵的卵白和卵黄中都有；
c.当从卵黄中分离时，一般比从卵白中分离时有更高的免疫调节活性；
d.体外诱导细胞因子表达，并特别诱导肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素-1β(IL-1β)和/或白介素-6(IL-6)的表达；和/或
e.下调转化生长因子β(TGFβ)的表达。
另外，本发明的CAF蛋白可以有诱导巨噬细胞和/或单核细胞系的细胞分化的能力。
3,000道尔顿的分子量是从组合物的分离和纯化中推断的，其中此分离和纯化过程使用不允许大于3,000道尔顿的分子种类通过的超滤膜。高度纯化的细胞因子激活因子开始被怀疑为是非蛋白的和非甾体的，因为它较小并不被降解蛋白的酶降解(以体内测定为基础，其中蛋白在被口服后显示出生物活性，并由此暴露于消化酶)。而且，此组合物为口服有活性的。没有经过理论结合，本发明者相信高度纯化的细胞因子激活因子的小而稳定的形式(区别于大多数大得多的蛋白)促进其从消化道吸收。最后，这种高度纯化的细胞因子激活因子是热稳定的，这是一种在大多数蛋白中一般没有的特征。然而，现在已知这种高度纯化的细胞因子激活因子实际是一种有上述确定的稳定特征的蛋白。这一发现是惊人的并进一步证明了本发明的细胞因子激活因子高度适合用于配方、加工食物和疫苗，包括口服疫苗和配方。
本发明的另一种实施方案包括编码CAF蛋白的核酸分子。本发明的核酸分子包括包含编码前面所描述的任何分离CAF蛋白，包括CAF同系物的核酸序列的核酸分子。本发明的优选CAF核酸分子包含编码一种蛋白质的核酸序列，这种蛋白质包含含有至少9个，更优选至少12个，更优选至少约15个，更优选至少约20个，更优选至少约25个SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：6的邻接氨基酸残基的氨基酸序列。在另一种实施方案中，优选CAF核酸分子包含编码一种蛋白质的核酸序列，这种蛋白质包含含有至少约30个，更优选至少约35个，更优选至少约40个，更优选至少约45个，更优选至少约50个，更优选至少约55个，更优选至少约60个且更优选至少约65个SEQ ID NO：6的邻接氨基酸残基的氨基酸序列。
在一种实施方案中，这种核酸分子包括在中度严格杂交条件下，更优选在高严格条件下，甚至更优选在极高严格条件下与编码天然存在CAF(即包括编码CAF的天然存在的等位基因变体)的核酸序列的互补序列杂交的分离核酸分子。优选地，编码本发明CAF蛋白的分离核酸分子包含在中度、高或极高严格条件下与编码包含由SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：6表示的氨基酸序列的核酸序列的互补序列杂交的核酸序列。
在本发明的一种实施方案中，编码本发明的一种CAF蛋白的核酸分子包含编码至少分别约65％等同于SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：6，超过SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：6的至少约15个邻接氨基酸，更优选超过至少约20个氨基酸，更优选超过至少约25个氨基酸的氨基酸序列的核酸序列。优选地，编码本发明CAF蛋白的核酸分子包含分别至少约70％，更优选至少约75％，更优选至少约80％，更优选至少约85％，更优选至少约90％，甚至更优选至少约95％等同于SEQ ID NO：1和/或SEQID NO：6，超过SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：6的至少约15个氨基酸，更优选超过至少约20个氨基酸，更优选超过至少约25个氨基酸的氨基酸序列的核酸序列。在一种实施方案中，编码本发明CAF蛋白的核酸分子包含分别至少约65％，更优选至少约70％，更优选至少约75％，更优选至少约80％，更优选至少约85％，更优选至少约90％，甚至更优选至少约95％等同于SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：6，超过SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：6的至少约30个氨基酸，更优选超过至少约35个氨基酸，更优选超过至少约40个氨基酸，更优选超过至少约45个氨基酸，更优选超过至少约50个氨基酸，更优选超过至少约55个氨基酸，甚至更优选超过至少约60个氨基酸的氨基酸序列的核酸序列。
在另一种实施方案中，编码本发明CAF蛋白的核酸分子包含至少约60％等同于SEQ ID NO：6，超过SEQ ID NO：6的至少66个氨基酸，更优选超过至少约67个氨基酸，更优选超过至少约68个氨基酸，更优选超过至少约69个氨基酸，的氨基酸序列的核酸序列。优选地，编码本发明CAF蛋白的核酸分子包含至少至少约65％，更优选至少约70％，更优选至少约75％，更优选至少约80％，更优选至少约85％，更优选至少约90％，甚至更优选至少约95％等同于SEQ ID NO：6，超过SEQ ID NO：6的至少66个氨基酸，更优选超过至少约67个氨基酸，更优选超过至少约68个氨基酸，更优选超过至少约69个氨基酸的氨基酸序列的核酸序列。前面已经描述过判断百分比等同性的方法。
根据本发明，分离核酸分子是从其天然环境中去除(即接受人为操作)的核酸分子并可以包括DNA，RNA或DNA或RNA的衍生物，包括cDNA。同样，“分离”并不反映核酸纯化的程度。分离CAF核酸分子可以包括例如CAF基因，CAF基因的天然等位基因变体，CAF编码区或其部分，及由核苷酸插入、缺失、替换和/或反向而修饰的CAF编码和/或调节区，这些修饰是以基本不干扰核酸分子编码本发明的CAF蛋白在严格条件下或与天然基因分离物形成稳定杂交体的方式进行的。本发明的分离核酸分子并不包括天然存在的大于CAF基因的分子。所以，包含CAF基因加额外侧翼序列的染色体和分子并不包括在本发明的范围内。本发明核酸分子的最小大小是足够编码具有CAF生物活性、足够编码包含至少一个与抗体结合的表位，或足够形成可以与编码天然CAF蛋白的核酸分子的互补序列形成稳定杂交体(如在低、中度或高严格条件下)的探针或寡核苷酸引物的大小。同样，编码这种蛋白的核酸分子大小可以取决于核酸组成和核酸分子与互补序列之间的同源或等同百分比以及本身的杂交条件(如温度、盐浓度和甲酰胺浓度)。如果核酸分子为富含GC的，作为寡核苷酸引物或探针的核酸分子的最小大小一般至少约12个到约15个核苷酸长，如果它们是富含AT的，至少约15个到约18个碱基长。
分离CAF核酸分子可以包括简并。这里用到的核苷酸简并是指一个氨基酸可以由不同核苷酸密码子编码的现象。这样，编码本发明CAF蛋白的核酸分子的核酸序列由于简并可以不同。注意本发明的分离CAF核酸分子并不是编码有CAF活性的蛋白所必须的。例如，CAF核酸分子可以编码截短的、突变的或无活性的蛋白。这种核酸分子和这种核酸分子编码的蛋白在例如克隆其它编码CAF的核酸分子、检测样品中CAF的存在、或对其它目的如抗体产生是有用的。
根据本发明，CAF基因包括所有与天然(即野生型)CAF基因相关的核酸序列，如控制由该基因编码的CAF蛋白的产生的调节区(如，但不限于，转录、翻译或翻译后控制区)和编码区自身。在另一种实施方案中，CAF基因可以是包括与编码某种CAF蛋白的核酸序列相似但不等同的天然存在的等位基因变体。
本发明的分离CAF核酸分子可以从它的天然来源中分离或用重组DNA技术(如多聚酶链式反应(PCR)扩增、克隆)或化学合成产生。产生合成核酸分子的方法在本领域中是熟知的。例如，由于CAF蛋白是相对较小的蛋白，编码需要蛋白的DNA序列可以用常规的、可购买到的DNA合成装置产生。另外，编码所需蛋白的DNA也可以用多聚酶链式反应(PCR)技术或其它克隆技术从许多种属的基因组DNA，特别是产卵动物的卵中产生。这些方法在本领域中是熟知的(Sambrook et al.，supra)。
CAF核酸分子同系物(即编码CAF蛋白同系物)可以用许多本领域中的技术人员公知的方法产生(见，例如，Sambrook et al.)。例如，核酸分子可以用一系列技术修饰，包括但不限于经典诱变和重组DNA技术(如定向位点诱变、化学处理、限制性酶剪切、核酸片段连接和/或PCR扩增)，或合成寡核苷酸混合物并连接混合物组而“建立”核酸分子混合物及其组合。另一种修饰编码CAF蛋白的重组核酸分子的方法是基因混排(即分子杂交)(见，例如，授予Stemmer的美国专利5,605,793；Minshull and Stemmer；1999，Curr.Opin.Chem.Biol.3：284-290；Stemmer，1994，P.N.A.S.USA 91：10747-10751，在此引入其全部内容作为参考)。这种技术可以用来有效引入CAF蛋白作用的多种同时发生的阳性改变。可以通过与CAF基因杂交或通过筛选由核酸分子编码的蛋白的功能(如增加B细胞增殖的能力)而选择核酸分子同系物。
优选地，核酸分子是重组核酸分子的一部分。这种重组核酸分子包含一个与核酸分子操作连接的表达载体。重组核酸分子在下面有详细描述。在这种实施方案中，由核酸分子编码的CAF蛋白优选具有CAF生物活性。这种核酸分子可以包括编码CAF蛋白同系物的核酸序列，并因此可以称作编码天然存在CAF的核酸序列的同系物(即核酸序列同系物)。
所以，本发明的一种实施方案包括一种重组核酸分子，它包括至少一种插入任何适于克隆、测序、和/或其它对核酸分子的操作如表达和/或将核酸分子运送到宿主细胞形成重组细胞的核酸载体(即重组载体)的本发明的分离核酸分子。尽管载体也可以包含天然邻近于本发明的核酸分子的调节核酸序列(如启动子、未翻译区)，这种载体包含异源核酸序列，即并非天然邻近于本发明的核酸分子的核酸序列(下面有详细讨论)。载体可以是RNA或DNA，原核或真核，并一般是病毒或质粒。载体可以保持为染色体外元素(如质粒)或可以被整合入染色体。完整载体可以保持在宿主内的适当位置，或在某种条件下，质粒可以被去除，留下本发明的核酸分子。被整合的核酸分子可以受染色体启动子的控制，受天然或质粒启动子的控制，或受一些启动子结合的控制。核酸分子的单体或多拷贝可以整合到宿主染色体。
一般说来，重组分子包括与一个或更多转录控制序列操作连接的本发明的重组核酸分子。这里用到的短语“重组分子”或“重组核酸分子”主要指操作连接到分子转录控制序列的核酸或核酸序列，但当这种核酸分子为这里讨论的重组分子时，可以与短语“核酸分子”互换使用。适合的转录控制序列包括任何可以在至少一个对表达本发明的CAF蛋白有用的重组细胞中起作用的转录控制序列。许多这种转录控制序列在本领域的技术人员中是公知的。优选转录控制序列包括在细菌、真菌(如酵母)、昆虫、植物或动物细胞中起作用的转录控制序列。
可以是DNA或RNA的本发明的重组分子也可以包含额外的调节序列，如翻译调节序列、复制起点和其它与重组细胞相容的调节序列。在一种实施方案中，本发明的重组分子，包括整合到宿主细胞染色体中的重组分子，也含有使表达的CAF蛋白从产生蛋白的细胞被分泌的分泌信号(即信号节段核酸序列)。适合的信号节段包括与本发明的CAF蛋白天然关联的信号节段或任何根据本发明可以定向CAF蛋白分泌的信号节段。在另一种实施方案中，本发明的重组分子包含使表达的CAF蛋白运送到并插入宿主细胞膜的前导序列。适合的前导序列包括与本发明的CAF蛋白天然关联的前导序列，或任何可以定向运送和插入CAF蛋白到细胞膜的异源前导序列。
这里称作重组病毒的一种重组分子类型包括一种装配于病毒外壳中并可以在将病毒运送到细胞后表达的重组核酸分子。可以使用许多病毒粒，包括，但不限于基于甲病毒、杆状病毒、痘病毒、腺病毒、疱疹病毒和逆转录病毒的病毒粒。
本发明的一种或更多重组分子可以用于产生本发明的编码产品(如CAF蛋白)。在一种实施方案中，编码产品通过在有效产生蛋白的条件下表达这里描述的核酸分子而产生。产生编码蛋白的优选方法是通过用一种或更多重组分子转染宿主细胞而形成重组细胞。适合转染的宿主细胞包括但不限于任何可以被转染的细菌、真菌(如酵母)、昆虫、植物或动物细胞。宿主细胞可以用是未转染细胞或已经用至少一种核酸分子转染的细胞。
本发明也包括可以与本发明的CAF蛋白(包括CAF同系物)或其模拟物(如CAF抗体)选择性结合的分离(从天然环境中去除)抗体。这里用到的名词“选择性结合”是指本发明的抗体与本发明的特定蛋白及其模拟物优选结合的能力。可以用本领域中的许多标准方法测量结合，包括酶免疫测定(如ELISA)，免疫印记测定等；见，例如Sambrook et al.，ibid。在一种实施方案中，CAF抗体优选以降低蛋白活性的方式选择性与CAF蛋白结合，如通过阻断蛋白与受体(即CAF受体)、与另一种蛋白或与核酸分子结合的能力，或破坏其作用机制降低蛋白活性。
本发明的分离抗体可以包括含这种抗体的血清，或纯化到不同程度的抗体。本发明的抗体可以是多克隆或单克隆的，功能等同物如抗体片段和基因工程抗体，包括单链抗体或嵌合抗体，包括可以与一个以上表位结合的双特异性抗体。
产生本发明的抗体的优选方法包括(a)给予动物有效量的本发明的蛋白、肽或其模拟物而产生抗体及(b)回收抗体。在另一种方法中，本发明的抗体用此前所公开的产生本发明的CAF蛋白的技术重组产生。抗确定蛋白或模拟物而培育的抗体可以是有利的，因为这些抗体基本不受抗其它物质的抗体污染，否则可能导致干扰诊断测定、筛选测定或在治疗组合物中导致副作用。
本发明的另一种实施方案涉及包含本发明的细胞因子激活因子的组合物。优选地，组合物也包括一种前面已经定义的可药用载体。根据本发明，“组合物”包括任何包含本发明的细胞因子激活因子的组合物(配方、产品)，其中CAF以纯化的、重组产生的、化学产生的、充分纯化的(即任何纯化到与卵产品的其它成分相比增加CAF量的程度的超免疫卵)或特别是其它任何与没有CAF选择和筛选过程相比的富含CAF的形式存在于组合物中(如美国专利5,772,999所描述的)。所以，在没有选择或筛选与超免疫卵中的CAF平均量相比的富集量CAF的情况下，或没有其它富集卵产品中CAF含量的其它方法时的情况下的超免疫卵不包括在本发明的组合物范围中。同样，包括含有本发明的CAF蛋白的超免疫卵的组合物必需经过选择、筛选或或生产或富集，如通过：筛选免疫过程选择超免疫动物和/或含有统计学上显著高于超免疫卵产品中平均数的CAF量的超免疫卵；通过筛选超免疫产品得到与超免疫卵产品中平均量相比统计学上显著更高的CAF含量；或通过富集超免疫卵产品的CAF(如通过分级、纯化或用外源性CAF补充)。
所以，在一种实施方案中，本发明的组合物特别定向于生产包含超免疫卵和由其产生的产品(即食品或非食品)的组合物，它富含本发明的细胞因子激活因子，对调节免疫系统有用，。由于是天然的，这些食品可以用于调节免疫系统而不用担心副作用，当然除了那些不耐受卵的人会有过敏反应。超免疫卵优选从用至少一种免疫原免疫的产卵动物，更优选从鸟类获得。可以选择、筛选或生产具有比从同一群由相同或不同免疫原免疫的动物中得到的超免疫卵中的平均含量统计学上显著更高(如p＞0.05)的CAF含量的超免疫卵产品。这种超免疫卵产品优选进一步分为CAF富集部分，如实施例1中所描述。
通过实施例，可以筛选几批超免疫卵产品而选择每干重单位卵产品中有最高水平细胞因子激活因子的超免疫卵产品。另外，可以监控超免疫过程(如通过在免疫过程中检验卵产品)从而达到细胞因子激活因子的最大产量。检测细胞因子激活因子的方法包括，但不限于，如通过适当的蛋白质纯化和定量方法(纯化方法的举例见实施例部分)进行的产品中因子的纯化和定量。在一种实施方案中，超免疫卵中细胞因子激活因子的量采用与卵样品中的蛋白选择性结合的本发明的抗体检测。
另外，可以分级和/或纯化卵产品，从而相对于卵产品中的其它成分富集本发明的细胞因子激活因子或与初始卵产品中CAF量相比，增加终产品中CAF的量(如重量)。优选地，在一个部分或纯化产品中的细胞因子激活因子的量与未纯化超免疫食品中的细胞因子激活因子的量相比富集了至少富集了约5％，更优选至少约10％，更优选至少约25％，，更优选至少约50％，更优选至少约75％，更优选至少约100％。甚至更优选地，在一个部分或纯化产品中的细胞因子激活因子的量与初产品中细胞因子激活因子的量相比富集了至少约2倍，更优选至少约3倍，更优选至少约5倍，更优选至少约10倍，更优选至少约50倍，更优选至少约100倍，甚至更优选至少约500倍。在一种实施方案中，本发明的细胞因子激活因子被纯化为基本100％纯净，因此可以将它作为基本纯净因子添加到这里描述的任何组合物中。在另一种实施方案中，本发明的细胞因子激活因子是由重组或合成产生，如这里的其它部分所讨论。
下面简要描述超免疫产卵动物的方法。超免疫卵或卵产品可以用任何产卵动物产生。产卵动物优选为鸟纲即鸟类中的一种。在鸟纲中，优选家禽，但此纲的其它动物，如火鸡、鸭和鹅也是超免疫卵产品的适当来源。
当用例如周期性加强给予免疫原的方法使这些产卵动物达到特定免疫状态时，这些动物产的卵将在受试者食用时具有有益的特性，包括对调节受试者免疫系统有效的超常水平的细胞因子激活因子。
仅诱导产卵动物中的免疫敏感性对导致卵中出现超常水平的细胞因子激活因子是不够的，尽管鸟类在正常免疫鸟类疾病和正常暴露于环境因素时被许多免疫原致敏，但餐用卵仍然不含超常水平的细胞因子激活因子的事实说明了这一点。本发明者发现，只有在特定超免疫状态下卵具有需要的超常水平的细胞因子激活因子。
优选通过给予初始免疫，然后用足够高剂量的特异性免疫原或免疫原混合物周期性加强而达到特殊超免疫状态，其中卵将含有高水平细胞因子激活因子。优选加强剂量应等于或大于产生鸟类初级免疫所必需的剂量的50％。所以，存在一个域加强剂量，低于此剂量在鸟卵中不产生需要的特性，尽管鸟类处于通常所说的免疫状态。了解了建立和维持超免疫状态的要求，为使动物保持在超免疫状态，根据使用的产卵动物属和株而改变所给予的免疫原的量处于本领域技术的范围内。另外，了解了本发明提供的CAF蛋白，可以通过如增加增强剂量的数目，或通过选择特异性免疫原对免疫过程进行额外修饰，使CAF产量与不暴露于这种选择/筛选过程的普通超免疫卵相比有所增加。
超免疫状态优选由免疫原或免疫原的结合而产生。优选通过对多种免疫原的多次暴露、对单免疫原的多次暴露、或对免疫原文库的单次暴露而获得超免疫。几乎任何免疫原都可用于诱导超免疫状态，包括，但不限于细菌、病毒、原生动物、变应原、真菌或细胞物质。
除了用天然存在的免疫原免疫，也可用通过组合化学合成衍生的免疫原实现免疫。基本策略是集合多种化学构件的组合，用于产生一群多样性分子。最近建立了一些用于固相和液相组合合成寡聚体文库(Fodor，S.et al.，Science 251：767(1991)；Houghton，R.et al.，Nature 354：82(1991))和小型有机分子(Bunin，B. & Eliman，3.，3.Ani Chem.Soc.114：10997(1992))的方法。迅速的多种肽和寡聚体合成可以作为组合衍生的免疫原的来源。另外，其它策略将允许以结合形式向主链分子添加有机构件而得到改善的免疫原性。
超免疫产卵动物的其它方式可以替代免疫原性疫苗并包括使用基因疫苗。特别是任何DNA构建体(一般由一个启动子区和一个抗原编码序列组成)将触发免疫应答。基因疫苗由抗原编码载体、裸DNA片段、质粒DNA、DNA-RNA抗原、DNA-蛋白结合物、DNA-脂质体结合物、DNA表达文库以及被运送而产生免疫应答的病毒和细菌DNA组成。运送DNA的方法包括粒子轰击、直接注射、病毒载体、脂质体和喷射注射及其它。当应用这些运送方法时，可能必需为更小量，并一般导致更持久的免疫原的产生。当用这些基因方法时，将DNA引入鸟类的优选方法是通过将DNA肌肉内注射到胸肌中。
DNA运送的方法包括，但不限于粒子轰击、直接注射、脂质体、喷射注射(Fynan，E.F.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：11478-11482(1993))。编码已知或未知免疫原、启动子区(著名的CMV，花椰菜花叶病毒)和SV40细菌起点的核酸可以在细菌中复制，产生用于DNA注射的质粒DNA。尽管一些肠外给药的途径在鸡中是有效的，优选的方法为肌肉注射到胸肌。疫苗试验在产卵鸟类优选鸡中执行。重复免疫以一到两周的间隔给予，直到6个月。
使用的DNA量优选以50-300μgDNA溶于盐水中进行直接注射。对于粒子轰击，优选通过添加2.5M CaCl2将4-100mg DNA共沉淀到颗粒。重复免疫可以通过这种促进DNA包被的粒子进入活体动物的方法真皮内给予。
用于使产卵动物达到升高的免疫状态，得到可以给予受试者的超免疫卵或卵产物的优选程序，公开于美国专利5,772,999，在此引入其完整内容作为参考。简言之，下面是使产卵动物达到升高的免疫状态而用于CAF纯化或产生给予受试者的富含CAF的食品的例子。需要理解这种方法可以按前面所讨论的进行修饰从而选择或筛选提高的CAF产量。一般说来，超免疫过程包括下列步骤：
1.选择一种或更多抗原。
2.通过初级免疫引发产卵动物的免疫应答。
3.给予适当剂量的抗原的加强疫苗而诱导并保持超免疫状态。
4.收集并处理卵从而从保持在超免疫状态的产卵动物中产生超免疫卵。
步骤1 可以使用任何抗原或抗原组合。抗原可以是细菌、病毒、原生动物、细胞或产卵动物的免疫系统能产生应答的其它物质。此步骤的关键点是抗原必需可以诱导产卵动物中的免疫和超免疫状态。一种优选疫苗是多价细菌抗原的混合物，称作系列100(S-100)疫苗(也称作PL-100)。包括在S-100疫苗(PL-100)中的细菌列于美国专利5,772,999(表1)。这种疫苗以前在美国专利5,106,618和5,215,746中有描述，在此引入其全部内容作为参考。另一种优选使用的疫苗是EB-100E疫苗，其详细内容在美国专利5,772,999的实施例1中也有描述。
步骤2 疫苗可以是灭活疫苗或减毒活疫苗，并可以用任何引起免疫应答的方法给予。优选通过肌肉内注射给予抗原而完成免疫。鸟类中优选用于注射的肌肉为胸肌。剂量优选为0.5-5毫克抗原疫苗。其它可以使用的给药方法包括静脉内注射、腹膜内注射、直肠栓剂或口服。当超免疫过程使用DNA技术时，要求小得多的剂量，一般是1-100mg。可以通过免疫学领域技术人员公知的方法判断疫苗是否在产卵动物中引起了免疫应答。其例子包括酶联免疫吸附测定(ELISA)，检验针对刺激抗原的抗体的存在，以及为评价宿主免疫细胞应答抗原的能力而设计的检验。一般说来，用疫苗免疫后卵抗体的出现提示免疫应答。诱导免疫应答所必需的抗原的最小剂量取决于使用的疫苗接种程序，包括使用的抗原类型和作为宿主的产卵动物的类型。
步骤3 优选以固定时间间隔通过重复加强给予适当的剂量而诱导并维持超免疫状态。时间间隔在6个月的时间段中优选为2周。然而，首要的是加强剂量不导致免疫耐受。可以使用其它超免疫维持程序或程序组合，如，肌肉内注射进行首次免疫，静脉内注射作为加强注射。其它程序包括同时给予微胶囊或液体抗原，或肌肉内注射进行首次免疫，通过微胶囊法口服或进行肠外给药而加强剂量。一些首次和超免疫的组合是本领域技术人员公知的。
步骤4 可以用不同方式处理超免疫卵从而给予受试者或进行纯化。这包括制备包含基本只有超免疫卵自身(如以胶囊形式)以及将超免疫卵加入食物而给予受试者的组合物的制备，或遵循这里其它部分描述的细胞因子激活因子纯化方案。
在其它实施方案中，本发明的组合物可以包括以纯化、重组、化学合成、充分纯化或任何其它富集形式存在，与适当的可药用载体结合的CAF。本发明的适当可药用载体包括前面描述的可药用赋形剂、控释载体和可药用运送载体。此组合物可以以任何适于运送的形式存在，包括，但不限于液体、气溶胶、胶囊、片剂、丸剂、粉末、凝胶和颗粒。特别适于肠外给药的CAF制剂包括无菌水或非水溶液、悬浮液或乳状液。非水溶剂或载体的例子为丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射有机酯如乙基油酸。
以固体剂型存在时，CAF蛋白可以与至少一种惰性稀释剂如蔗糖、乳糖或淀粉混合。这种剂型也可以按照常规惯例包括惰性稀释剂以外的其它物质。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型也可以包括缓冲剂、pH敏感聚合物或一般在食品和药品行业中用于胶囊组合物的其它缓释胶囊(即控释载体)或其它控释配方。片剂和丸剂也可用肠衣制备。
口服细胞因子激活因子液体剂型包括可药用乳状液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂，其中含制药领域常用的惰性稀释剂。除惰性稀释剂外，组合物也包括润湿剂、乳化剂、悬浮剂和甜味剂。
在一种实施方案中，组合物以食品的形式存在。在这种实施方案中，一方面，富含CAF的卵、其CAF富集部分、高度纯化CAF、重组CAF、和/或化学合成CAF被整合到营养补充物。制备加入营养补充物的卵或其任何部分的一种优选方法包括将卵干燥至粉末。尽管干燥卵有许多方法，喷雾干燥是一种优选的方法。喷雾干燥卵的方法是本领域中公知的。这种干燥的卵粉末可以以例如蛋白粉末、强力饮品、蛋白补充物和任何其它营养、运动相关产品的形式加入饮料中。此外，卵粉末可以用于烘烤配料、能量棒(power bar)、糖果、小甜饼等。其它处理卵的例子包括制作煎蛋卷、煮熟或半煮熟卵、烤卵或如果需要，可以生吃或处理为液体卵。本发明富含CAF的卵产品的优选部分包括，但不限于：液体卵黄、液体卵白、粉末状卵黄、粉末状卵白、和/或上述超免疫卵产品的水溶部分。
在本发明的一种实施方案中，组合物可以包括含有一个编码前面描述的编码CAF蛋白(包括CAF同系物)和/或选择性与CAF蛋白结合的抗体的核酸序列的重组核酸分子。
可以用任何适当的方法将本发明的组合物运送(即给予)到细胞培养物(如在细胞因子测定中)或病人。这种方法的选择将根据给予或运送的化合物的类型(即蛋白质、核酸、模拟物)、运送方式(即体外、体内、来自体内)和给予/运送化合物或组合物要达到的目的而不同。根据本发明，有效的给药方案(即以有效方式给予组合物)包括使组合物运送到所需位点(即到达所需细胞)和/或产生受试者中免疫应答调节的适当的剂量参数以及给药方式。本发明的组合物优选通过调节受试动物免疫系统的方式给予受试动物。
给药途径包括体内、体外和来自体内途径。体内途径包括，但不限于口腔、鼻腔、气管内注射、吸入、经皮、直肠、导管渗透、栓剂、直接注射入组织和肠外途径。优选的肠外途径可以包括，但不限于皮下、真皮内、静脉内、肌肉内和腹膜内途径。在本发明的一种实施方案中，包含本发明的CAF蛋白、抗体、模拟物和核酸分子的组合物以肠外途径给药。可以用本领域中的标准方法进行静脉内、腹膜内、真皮内、皮下和肌肉内给药。可以使用本领域中的标准方法(见，例如，Stribling et al.，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 189：11277-11281，1992，在此引入其完整内容作为参考)进行气溶胶(吸入)运送。在另一种实施方案中，是口服包含本发明CAF蛋白的组合物。可以将本发明的治疗组合物与可以承受动物肠道中消化酶降解的载体混合而进行口服。注意本发明的CAF尤其抗消化酶，所以这种载体可能不是关键的。这种载体的例子如本领域所公知的，包括塑料胶囊或片剂。这种途径可以包括前面描述的可药用载体的使用。来自体内是指在病人外进行部分调节步骤，如通过在转染细胞表达重组分子的条件下用包含编码本发明的蛋白的核酸序列的重组分子转染一群从病人去除的细胞，并使转染细胞返回病人。体外和来自体内的将组合物给予宿主细胞培养物的途径可以通过包括，但不限于，转染、转化、电穿孔、微量注射、脂质转染、吸收、原生质融合、蛋白携带剂的使用、离子携带剂的使用、细胞渗透洗涤剂的使用和将化合物简单混合(如，结合)到有靶细胞的培养物的方法完成。
在一种实施方案中，处理富集本发明的细胞因子激活因子并从超免疫动物中得到的超免疫卵或其部分而产生可以给予受试动物的超免疫卵产品。在一种实施方案中，通过直接给受试动物喂食卵或任何其衍生物而给药。重要的是注意卵是无毒并安全的天然食物成分。同样，在另一种实施方案中，充分纯化的、重组产生的或合成产生的细胞因子激活因子优选以随后可以给予动物的方式制备(如配方)。
当进行免疫系统调节时，优选将本发明的组合物以免疫学上有效获得细胞因子(即TNFα，IL-1β和/或IL-6)表达并优选获得细胞因子激活和免疫调节的量给予受试者。治疗的持续时间和强度将取决于特定受试者和受试者的状况以及它是否存在，且如果存在，受试者状况的进步。也以治疗和/或预防状况和状况的症状的剂量提供组合物。例如，在给予富含CAF的超免疫卵或由其产生的产品时。可以根据特定状况环境给予受试者每日用量从不到一个到几个完整超免疫卵(或含有与一个到几个完整超免疫卵相等量的超免疫卵产品)。可以通过这里描述的和其它本领域中公知的方法分离和浓缩更多有效部分。关于给予受试者富含CAF的超免疫卵或卵产品，已经判断出给予受试者的超免疫卵或卵产品的优选剂量范围是受试者每公斤体重100mg到10g之间。
关于本发明的分离细胞因子激活因子，包括高度纯化的CAF，重组CAF和/或化学合成CAF，已经判断了出高度纯化组合物的优选剂量范围是受试者每公斤体重1ng到400mg之间。在一种优选实施方案中，优选剂量范围是受试者每公斤体重约0.01mg到约100mg之间。在另一种实施方案中，以病人每公斤体重约0.1μg到约10mg之间，更优选病人每公斤体重约0.1μg到约100μg的量给予病人蛋白或抗体。
当被运送化合物为核酸分子时，适当单剂量导致每μg运送的核酸在每mg总组织蛋白中表达至少约1pg蛋白。更优选的适当单剂量为导致每μg运送的核酸在每mg总组织蛋白中表达至少约10pg蛋白的剂量；甚至更优选为每μg运送的核酸在每mg总组织蛋白中表达至少约50pg蛋白的剂量；最优选为每μg运送的核酸在每mg总组织蛋白中表达至少约100pg蛋白的剂量。根据给药途径和/或运送方式，优选裸核酸疫苗的单剂量为约1ng到约100μg之间，可以由本领域中的技术人员判断。适当的运送方法包括，如，通过注射、滴注、喷雾和/或局部运送。在一种实施方案中，纯净的DNA构建体包被了金颗粒表面(直径1到3μm)并用“基因枪”射入皮肤细胞或肌肉。对于本领域技术人员将很明显的是给予病人的剂数将取决于给药目的(如疾病程度和个体病人对治疗的反应)。所以，适当的剂数包括调节动物免疫应答或调节准备通过上调促炎因子(TNFα，IL-1β，IL-6)和/或通过下调TGFβ而治疗或预防的疾病或状况所要求的任何数，这一点在本发明的范围中。可以用本领域中的标准方法判断有效体内剂量参数。这些方法包括，例如，生存率判断、副作用(即毒性)、细胞和体液免疫应答判断、和/或对与这种免疫应答作用相关的状况的作用。
本发明的一种实施方案提供调节动物免疫应答的方法。这种实施方案包括给予动物前面描述的包含本发明的细胞因子激活因子(CAF)蛋白的组合物。在一种优选实施方案中，组合物包含前面描述的一种可药用载体。在这种实施方案中，本发明的组合物可以用作免疫系统的局部或系统刺激物。它也可以预防和/或治疗局部和系统细菌感染并可以作为普通抗癌剂使用。它也可以用特异性运送剂如组织特异性抗体标记，从而可以通过静脉内途径运送到细菌感染或肿瘤形成的特定位点。它也可以与能买到的特异性脂质体或运送载体混合，从而将它运送通过细胞的胞浆和核膜并在RNA水平促进TNFα，IL-1β和/或IL-6表达的调节。给药的适当方式，包括优选途径和剂量如前面所述。优选地，以适于通过增加TNFα，IL-1β和/或IL-6的表达和/或减少TGFβ而调节免疫应答的剂量和途径给予动物本发明的组合物。
本发明的一种实施方案涉及治疗动物癌症的方法，包括给予有癌症或有发生癌症的危险性的动物包含本发明的细胞因子激活因子(CAF)蛋白的组合物。给药方法和组合物的具体内容如前面所详细描述的。优选地，给予此组合物产生下列结果之一：减轻癌症症状、缩小癌症相关肿块、去除癌症相关肿块、预防转移癌、预防癌症并刺激抗癌的效应细胞免疫。
而本发明的另一种实施方案涉及治疗或预防动物脓毒症和/或败血症性休克的方法。这种方法包括给予有脓毒症和/或败血症性休克或有发展为脓毒症和/或败血症性休克危险性的动物包含本发明的细胞因子激活因子(CAF)蛋白的组合物的步骤。给药方法和组合物的具体内容如前面所详细描述的。优选地，给予此组合物产生下列结果之一：减轻脓毒症或败血症性休克的症状，预防脓毒症或败血症性休克并刺激抗脓毒症或败血症性休克相关细菌的效应细胞免疫。
可以参考下列具体说明本发明的实施例发现本发明的优点。这些实施例是为具体说明的目的而提供的，而不准备限制本发明的范围。
实施例
实施例1
下面的实施例证明了本发明细胞因子激活因子(CAF)的纯化、分离和测序。
纯化细胞因子激活因子
CAF纯化的总体概括
首先用7个步骤从PL-100完整卵中将CAF初步纯化600,000倍(图16)，并且在HPLC层析谱中显示为均质成分。通过细胞因子测定法，测定各部分的CAF体外生物活性而跟踪整个过程中CAF的纯化(下面有描述)。第一步将卵分成卵黄。在卵黄去脂后，用超滤技术将CAF集中为3,000道尔顿(或更小)的滤过物部分。注意3000道尔顿截止是近似的，因为如果次级结构允许(即基本线性多肽/蛋白)，明显更大的蛋白可以通过过滤器。将通过3000MW截止过滤器的渗透物应用于Q琼脂糖层析进一步分离。CAF表现为强负电性分子，与Q琼脂糖柱紧密结合并可以用0.3M NaCl洗脱。在下一步，用固相萃取去掉大量NaCl。这一步骤也通过去掉其它极性更大的成分而增加了CAF纯化。SPE的CAF活性部分包含由乙酸乙酯和乙醇提取的非水溶性成分，将CAF留在水溶部分中。最后，用反相C18 HPLC和凝胶过滤HPLC将CAF分离为均质成分。CAF的总产量估计为约20％。完整卵中CAF的量为约3-5ppm(表1)。
表1
CAF纯化表步骤 机制 纯化(倍) 产量(g)完整卵卵黄3k过滤Q琼脂糖固相萃取分配萃取C18 HPLC凝胶过滤 分级 大小 电荷 脱盐 分级 极性 大小 1 2 40 30 8 2 3 5 100,000 50,000 1,000 30 2 0.8 0.2 0.02总量 -600,000
分离过程每个步骤的更详细描述如下。
卵黄脱脂
喷雾干燥的PL-100卵黄包含脂肪、蛋白质、糖、灰分和许多生物因子，包括CAF。为去除脂肪和非水溶性蛋白质，用辛酸相萃取及随后的离心处理卵黄。在水相中获得CAF和其它水溶性成分。
将3.0ml冰醋酸和100ml辛酸溶解于9升超纯水中制备PL-100卵黄的去脂缓冲液。缓冲液的pH大约为5.0。将卵黄物质(1.0kg喷雾干燥的卵或2.0升剥壳卵黄)添加入缓冲液然后通过以24,00rpm在室温下混合5分钟进一步将缓冲液均质化。去除泡沫，将另外20ml辛酸加入混合物补充辛酸。卵混合物放置在室温下2小时以上而允许相分离。去除絮状物，在室温下以2,190xg离心卵混合物的水相20分钟。用Whatman滤纸(113V，40μm)过滤卵黄上清液。用2.0M NaOH将上清液的pH调节到7.5。
卵黄3000道尔顿MW滤过物制备
脱脂卵黄上清液含有水溶性蛋白和CAF。可以用超滤法将CAF从大分子量成分中分离出来。在此制备过程中，将卵黄上清液集中到附着于过滤单位(3K MWCO，Amicon Model CH2泵箱和Spiral Cartidge Adapter试剂盒)的22L的容器中。过滤入口和出口的泵压维持在约30psi。分子量小于约3,000道尔顿的成分被收集为滤过物并低压冻干进行储存，或经冷冻进行进一步CAF纯化。完整卵黄的约2％被获得为3,000道尔顿的滤过物(这里也称作“3K滤过物”)。判断CAF抗TNFα和IL-1β活性体外测定从而跟踪CAF蛋白的存在(图1和2)。也用II型胶原诱导的关节炎和气袋动物测定检验卵黄3,000道尔顿MW滤过物(没有显示数据)。用反相C18 HPLC分析3k滤过物判断纯度(图3)。
Q琼脂糖离子交换层析
用阴离子交换Q琼脂糖层析进一步纯化3000道尔顿滤过物中的CAF。3000道尔顿滤过物中的大部分成分为带正电的分子，且它们不与Q琼脂糖结合。然而，此实施例中的CAF结合在Q琼脂糖并且是带强正电的分子。用Q琼脂糖纯化CAF是非常有效的方法。为建立Q琼脂糖柱，用1,000ml dH2O稀释2,000ml Q琼脂糖并加入玻璃柱(8×40cm)。直径与长度之比为1∶5。层析程序在室温下进行。用4,000ml水和8,000ml pH为7.5的20mM的醋酸铵以2,500ml/h的流速平衡层析柱。以1,500ml/h的流速将20-30L 3000道尔顿滤过物加入Q琼脂糖柱。用下列缓冲液以2,000ml/h的速度通过逐步洗脱洗涤Q琼脂糖：(1)4000ml 20mM醋酸铵，pH7.5，洗涤层析柱并洗脱未结合分子；(2)4000ml 300mM醋酸铵，pH6.5，洗脱一些弱结合分子；(3)4000ml 0.3M NaCl，洗脱CAF和其它分子；(4)4000ml 1.5M NaCl，洗脱最紧密结合的分子并再生Q琼脂糖层析柱。在1,200ml洗脱液之后将0.3M NaCl部分收集在烧瓶中。为进行进一步CAF纯化，将0.3M NaCl部分进行固相萃取。判断CAF抗TNFα和IL-1β活性体外测定(图4)。用反相C18 HPLC分析3,000道尔顿MW滤过物(图5)。
固相萃取(SPE)
Q琼脂糖的0.3M NaCl部分含有CAF和大量盐。引入固相萃取(SPE)方法而去除盐并增加CAF纯度。固相萃取是一种方便、便宜、省时的液相/液相萃取的替代方法。这种方法通常用于清除和浓集化合物从而达到分析或分离目的。为增加CAF在SPE上的结合，用三氟醋酸将Q琼脂糖部分调节为pH2.0。以相互作用条件在柱(5×22cm)中将酸性部分应用于反相C18树脂。在室温下以40ml/min的流速将Q琼脂糖部分加入SPE柱。在254nm的波长监视层析。CAF和其它成分保持在填充物质上，大多数污染物通过SPE柱。用800ml pH2.0的水和1,200ml pH2.0的15％的乙腈水溶液洗涤SPE柱。保留在填充柱上的CAF和其它成分被pH2.0的100％的乙腈洗脱(图6)。CAF部分(也称作SPE部分)收集为很小的体积。将高度纯化的CAF低压冻干准备进行下一步纯化。判断CAF抗TNFα和IL-1β活性体外测定(图7)。也用反相C18 HPLC分析SPE部分(图8)。
固相萃取部分的分配萃取
分配萃取第一步(图16)：Q琼脂糖柱的固相萃取部分含有非水溶性成分(即溶剂可溶部分)。该成分由乙酰乙酸和乙醇萃取，将CAF留在水溶部分(即SPE水溶部分)。简言之，将100mg固相萃取部分加入10ml乙酰乙酸并在室温下放置20分钟。将混合物转移到玻璃离心管并以2,190gx的转速离心20分钟。离心后得到白色沉淀(SPE水溶部分)。倒掉乙酰乙酸，重新加入10ml乙酰乙酸重复第一步。然后，将5.0ml乙醇与沉淀混合并在2,190xg下离心20分钟。
SPE水溶部分显示出抑制动物关节炎模型中的炎症。在一项体外测定中，SPE水溶部分(离心后的白色沉淀)显示出刺激THP1细胞中的TNFα和IL-1β。相反，SPE非水溶部分在体外测定中不显示这种活性。
分配萃取第二步(图16)：用5.0ml 20mM NH4Oac溶于含20％乙腈，pH7.0的水洗涤SPE水溶部分，在2,190xg下离心20分钟。在中性pH下，存在一个水溶部分(图16，中性pH WSF)和一个非水溶部分。将非水溶部分(在中性pH)低压冻干进行下面所描述的制备HPLC中的CAF纯化。尽管此中性pH非水溶部分实际在中性pH的水中是不溶的，本发明者发现它在低pH的水中是可溶的，所以将其称作酸性pH水溶部分。在酸性pH WSF中确定一项体外测定中CAF抗TNFα和IL-1β的活性并用反相C18 HPLC(图10)进一步分析该CAF活性部分(即图16，酸性pH WSF)。由于SPE水溶部分(离心后的沉淀)在0.1％TFA，pH2.0的水溶液中或在具有12.0的高pH的水中可溶，但在pH7.0(1.0mg/ml)的水中溶解性很低，这表示SPE水溶部分具有肽中常见的氨基基团和羧酸基团。
C18 HPLC分离
固相萃取的酸性pH水溶部分包含单一成分，显示于HPLC层析图(图11)。这个单一高峰被识别为在前面描述的细胞因子诱导实验中具有CAF活性。用反相C18 HPLC将富含CAF的部分进一步分为3个成分。在此分离中，使用Shimadzu HPLC单位。它装备了SPD-M10A VP二极管阵列探测器，LC-6AD液相层析，SCL-10A VP脱气装置，LPM-600低压调制和CTO-10A VP柱式加热炉。将酸性pH水溶部分制备为在含0.1％TFA的纯水中1.0mg/ml的浓度。在29℃下以12.0ml/min的流速将3.0ml的样品加入BTR IMPAQ C18柱(10μm，22×250mm)。将溶于的含0.1％三氟醋酸(TFA)的dH2O中20％-100％的甲醇的线性梯度作为流动相。收集将前面提到的三部分进行CAF分离。它们的名称为：CAFo，CAFa，CAFb。用旋转蒸发去除这些部分中的乙腈并低压冻干去除水分。确定CAFb部分(47min-49.5min)含有单独一个由HPLC层析图(图12)识别的峰。这个部分在一项体外测定中也表现出TNFα和IL-1β活性，表示CAF被纯化为CAFb均质成分(图13)。
凝胶过滤HPLC分离
用前面描述的Shimadzu HPLC装置中的凝胶过滤HPLC进行从SPE和C18 HPLC步骤得到的许多部分的进一步纯化。简言之，在流动条件下(缓冲液：50mM NH4OAc，pH8.0。流速：1.0ml/min，20℃，20min)将样品加入凝胶过滤柱(250×9.4mm，Zorbox GF-250生物系列)。样品以小于1.0mg/ml的浓度溶于流动缓冲液，每个流动时间注入30μl。
SPE水溶部分：以小于1.0mg/ml的浓度将SPE水溶部分溶解于pH8.0的50mM NH4OAc缓冲液中。简言之，将1.0mg SPE水溶部分与缓冲液混合。在10,000rpm下旋转5分钟，收集上清液。然后将沉淀与缓冲液再次混合。将第一次的上清液加入GF250 HPLC柱从而判断分子大小。GF250柱分离出三个主要部分。它们是530,000Da，122,000Da和1,240Da。收集这三部分并低压冻干进行细胞因子测定。分子量为530,000Da和122,000Da的部分在第一次的溶解缓冲液中充分溶解，但在第二次溶解中没有发现。然而1,240Da峰在第二次溶解中充分溶解，表示通过在缓冲液中溶解1.0mg SPE水溶部分可以去除大部分530,000Da和122,000Da分子。剩下的不溶解沉淀(即SPE-GFII)实际上是分子量为1,240Da的非常纯净的化合物。
CAFb部分。也将从C18 HPLC分离得到的CAFb部分加入凝胶过滤HPLC柱(GF 250)从而检测其分子量。发现在GF 250柱有三个分别为530,000Da，122,000Da和40,000Da的主要部分。530,000Da和122,000Da的分子可以用2-巯基乙醇和煮沸还原为700,000Da的大分子，提示可以改变氧化-还原条件发生聚合。
CAFo，CAFa，CAFb：为比较从GF250 HPLC柱上的酸性pH WSF得到的所有细胞因子阳性CAF部分的分子量，分析了CAFo，CAFa和CAFb。CAFo在8.261min有一个单独的峰(MW 122,000Da)。CAFa在7.27min(MW 530,000Da)和8.391min(MW 122,000Da)有两个峰。如前面所讨论的，CAFb在9.483min(MW 40,000Da)有一个额外的峰。分子量为530,000Da和122,000Da的分子可以还原为700,000Da的大分子，类似于SPE水溶部分。然而CAFb的唯一40,000Da部分在还原条件下保持稳定(表2)。在没有理论上的结合的条件下，提示CAFb的MW40,000Da分子仍然具有CAF的活性位点，可以从有活性CAF的更小分子聚合而来。从GF-250 HPLC得到的分离CAFb部分III(图16)(MW40,000Da)被命名为CAFb-GF II)。
表2
比较从HPLC C18柱得到的CAF部分 CAF 细胞因子测定 HPLC CF250峰 (分) TNFα IL-1β CAFo CAFa CAFb - - + - - + 8.621* 7.270* 8.391* 7.040* 8.621* 9.483**
*此峰可以被还原为一个大分子(～7.000min)。
**此化合物在还原条件下稳定。
SPE-GF II：在GF-250 HPLC上分析SPE水萃取物上清液。我们在HPLC层析发现两个主要的峰(8.40min和12.22min)。这两个峰的MW分别为约120,000Da和2,000Da。在CAFo，CAFa和CAFb没有发现20,000的分子，提示它为不同的化合物。给它命名为SPE-GF II。
各部分的生物活性
如前面所描述的，在整个纯化过程中，我们采用细胞因子活性测定(测量TNFα和/或IL-1β的诱导)来监测纯化过程并选择活性部分。在大多数实验中，判断出SPE水溶部分有强细胞因子激活活性。令人惊讶的是，高度纯化的CAFb并没有现出与SPE水溶部分相等或更强的活性。在没有理论结合的情况下，提示后来的纯化过程改变了CAFb的形式，在聚合过程后它对细胞因子的活性减低。
鉴定CAF部分
分析性C18 HPLC
用反相高压液相层析(HPLC)(Shimadzu单位，SPD-M10A VP二极管阵列探测器，LC-6AD液相层析，SCL-10A VP脱气装置，LPM-600低压调制和CTO-10A VP柱式加热炉)分析含有CAF的部分。将所有部分在纯水中制备为5.0mg/ml并通过0.2μm过滤单位进行过滤。在29℃下以1.0ml/min的流速将20μl每种样品加入水对称C18柱(3.9×150mm)。溶解于含有0.1％三氟醋酸(TFA)的dH2O的0％-60％乙腈的线性梯度作为流动相。
图3表示从脱脂PL-100卵黄中得到的3000道尔顿MW滤过物的Max plot层析分离。用同样的分析条件，也获得了前面所描述的纯化步骤得到的部分(图5，8，10和12)。
CAF结构分析
蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)
用SDS PAGE判断CAFb的分子量。结果表示CAFb是分子量约6,670Da的小肽。然而，由于SDS PAGE的可变性，并不认为用SDS PAGE测量的分子量是准确的数字，而是分子量的估计。
质谱分析法(MS)
在酸性溶液中溶解SPE水溶部分(酸性pH WSF)并加入反相C18制备层析柱进行CAF分离。收集了三部分。它们是CAFo，CAFa和CAFb。在一项体外实验中，活性CAFb部分刺激了TNFα和IL-1β活性。用质谱分析法研究CAFb从而判断分子量。ESI-MS的结果表示CAFb是一种分子量为15,500Da的蛋白质。CAFb部分的大分子量分子可以来自于作为脱盐结果的纯化过程中天然分子的聚合。
红外光谱法(IR)
红外光谱法表示CAFb是与乳汁蛋白质酪蛋白有类似模式的多肽(图14)。IR的结果也证明了CAFb是纯净化合物。
N端氨基酸序列
用装备了HP G1314A可变波长探测器的增强惠普G1005A N端测序仪进行N端氨基酸测序。使用的技术对从亚皮摩尔到纳摩尔水平的样品可以有效执行。判断了CAFb-GF II和SPE-GF II的N端氨基酸序列。
CAFb
简言之，用50μl水和50μl 8M的GuHCl溶解CAFb。使用惠普加样方案将约50μl样品加入反相样品柱。用1ml 2％的TFA洗涤样品柱。在初始测序中，主要的N端序列是一个非常重要的30个氨基酸的序列，这里用SEQ ID NO：1表示。在CAFb-GF II中也确定了两个次要序列，除了失去一个和两个N端残基外(分别表示为SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：3)，它们与主序列等同。起始序列的数据表示如下：
CAFb-GF II
900pmol H2N-AGSSHEVVPSLLQTLLEGSIEQLYAGPISR (SEQ ID NO：1)
90pmol H2N-s·hey·psl·qt··egsi·qly(a)gpI(s)r·n (SEQ ID NO：2)
90pmol H2N-···hev·psl··t····s··q····p(SEQ ID NO：3)
随后，获得了其它序列，并确定了一个70氨基酸的多肽，这里表示为SEQ ID NO：6，被认为表示全长CAFb蛋白。
CAFb-GF II
900pmol H2N-AGSSHEVVPSLLQTLLEGSIEQLYAGPISRYNVDEMTSAA
LAELKKCIDELPPXHLKALVNLXKQIRTEA (SEQ ID NO：6)
CAFb显示为一个70氨基酸的多肽，CAFb的分子量为8,839Da，如表3所示。由于序列位置54和63的不确定性，主序列(SEQ ID NO：6)在这些位置的排列不确定。这个多肽可以是二聚体并形成如质谱分析法(MS)研究中发现的15,000Da的蛋白。序列数据也提示在细胞代谢过程的免疫中初始CAFb可能被蛋白水解为小的活性肽。卵黄中的小CAFb可以在纯化过程中聚合为大分子。
本领域中一种常规技术可以用遗传密码和计算其简并而推断编码SEQ ID NO：6的核酸序列。考虑到了所有编码SEQ ID NO：6的核酸序列并包括在本发明的范围内。也应该理解，既然已经知道了CAF蛋白的核酸序列，本领域中的技术人员将可以使用本领域中公知的技术轻易识别、克隆和测序编码CAF蛋白的核酸分子。例如，本领域中的一种常规技术可以根据CAF氨基酸序列产生简并引物并通过多聚酶链式反应扩增从适当的文库中或其它适当来源中得到的所有核酸序列的一部分。例如，如果必要，为得到全长分子，可以通过制备探针和筛选DNA文库进行核酸分子的额外克隆。核酸分子测序技术在本领域的技术人员中是公知的。
表3.CAFb分子量的计算 位置 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 字母 A G S S H E V V P S L L Q T L L E G S I E Q L Y A G P I S R 氨基酸 丙氨酸 甘氨酸 丝氨酸 丝氨酸 组氨酸 谷氨酸 缬氨酸 缬氨酸 脯氨酸 丝氨酸 亮氨酸 亮氨酸 谷氨酰胺 苏氨酸 亮氨酸 亮氨酸 谷氨酸 甘氨酸 丝氨酸 异亮氨酸 谷氨酸 谷氨酰胺 亮氨酸 酪氨酸 丙氨酸 甘氨酸 脯氨酸 异亮氨酸 丝氨酸 精氨酸 分子量(Da) 89 75 105 105 155 147 117 117 115 105 131 131 146 119 131 131 147 75 105 131 147 146 131 181 89 75 115 131 105 174 R基团 NP P P P PC NC NP NP NP P NP NP P P NP NP NC P P NP NC P NP P NP P NP NP P PC 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 52 51 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 Y N V D E M T S A A L A E L K K C I D E L P P X H L K A L V N L 酪氨酸 天门冬酰胺 缬氨酸 天门冬氨酸 谷氨酸 甲硫氨酸 苏氨酸 丝氨酸 丙氨酸 丙氨酸 亮氨酸 丙氨酸 谷氨酸 亮氨酸 赖氨酸 赖氨酸 半胱氨酸 异亮氨酸 天门冬氨酸 谷氨酸 亮氨酸 脯氨酸 脯氨酸 沉默残基 组氨酸 亮氨酸 赖氨酸 丙氨酸 亮氨酸 缬氨酸 天门冬酰胺 亮氨酸 181 132 117 133 147 149 119 105 89 89 131 89 147 131 146 146 121 131 133 147 131 115 115 120 155 131 146 89 131 117 132 131 P P NP NC NC NP P P NP NP NP NP NC NP PC PC P NP NC NC NP NP NP PC NP PC NP NP NP P NP 63 64 65 66 67 68 69 70 X K Q I R T E A 沉默残基 赖氨酸 谷氨酰胺 异亮氨酸 精氨酸 苏氨酸 谷氨酸 丙氨酸 120 146 146 131 174 119 147 89 8839 PC P NP PC P NC NP
P＝极性但不带电
NP＝非极性
PC＝带正电
NC＝带负电
计算所得的CAFb分子量接近于8,839Da。
SPE-GF II
从N末端对SPE-GF II进行测序。观察从循环10开始的数据可以很清除地发现此样品中有两个主要序列。一个序列在这里表示为SEQ IDNO：4，识别为已知鸡卵黄生成素II前体的片段。x’s表示在这些位置发生了糖基化。
SPE-GF II H2N-AViENLKARXxVSxNxIxTFNqVxFxYSMPA (SEQID NO：4)
将肽序列与NIH提供的(高级BLAST，BLASTp，nr，Expect＝10，Filtered)BLAST数据库的其它已知序列相比较。
数据库中的同源性搜索
在进行70氨基酸的CAFb-GF II(SEQ ID NO：6)相似性搜索中，比较了518,313蛋白序列和162,653,948字母。结果显示CAFb-GF II的此部分是一个唯一的序列，并且没有一个与其有显著同源性的等同序列。与CAF有最接近的等同性的蛋白质是一种从挪威大鼠(编号No.S17449)中分离的可能的配体结合蛋白RYD5的氨基酸序列。这种94氨基酸的蛋白为51％等同于SEQ ID NO：6，超过SEQ ID NO：6的氨基酸残基1-66。这两个序列共同的最长的连续氨基酸段为5个。可能的配体结合蛋白RYD5的功能显示为在挪威大鼠嗅粘膜亚区的配体结合蛋白。所以，相信本发明的CAF和RYD5蛋白结构或功能上不相关。
也在BLAST数据库中搜索CAFb-GF II。确定它为鸡卵黄生成素II前体(SEQ ID NO：5)位置1572到1602的修饰片段(图15)。由于与CAF所假设的同样的现象，SPE-GF II的大小可以根据降解和聚合的过程而不同。卵黄生成素II前体是一种调节分化过程许多蛋白包括细胞因子的重要蛋白质。经修饰的卵黄生成素II前体也可以在抗炎功能中起重要作用。
实施例2
下面的实施例证明了细胞因子激活因子(CAF)对细胞因子分布图和激活的作用。
按如下方法进行细胞因子测定。
细胞刺激
洗涤人THP-1细胞(巨噬细胞/单核细胞起源)并将其以1×106的密度平铺在25ml的烧瓶中的10ml含有不同卵部分的无血清RPMI培养基。允许细胞在湿化的CO2孵育器中生长4小时，然后刮取细胞并将其收集在50ml的离心管中。以400xg的速度离心沉淀细胞并用750μlTRIzol试剂(Gibco BRL)溶胞并用来按如下方法提取总RNA。
从处理细胞提取RNA
根据TRIzol试剂方案(Gibco BRL)执行从PBL细胞沉淀中提取所有RNA。用紫外线分光光度测定定量提取的总RNA并通过分析TBE缓冲液中1.0％琼脂糖凝胶28s和18s带而判断制备质量。
由总RNA合成cDNA
使用RT-PCR的cDNA Cycle试剂盒(InVitrogen，Carlsbad，CA)，用每个样品中的5ug总RNA合成cDNA的第一条链。为了对比的目的，将使用普遍存在的GAPDH mRNA对每个cDNA进行半定量。
图17描绘了用各种卵的部分纯化部分处理的THP-1细胞的细胞因子分布图。与餐用卵的3k部分相比，用PL-100卵3k部分(2mg/ml)处理的细胞中肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达水平更高。同样，与餐用卵相比，PL-100卵处理后白介素1β(IL-1β)水平也更高，但增高的程度小一些。在这个使用3k部分的测定中，在这些细胞中没有可检测到的白介素6(IL-6)或白介素10(IL-10)的增高。注意在随后的使用高度纯化CAFb的测定中，可清除地检测到IL-6的诱导。PL-100完整卵(10mg/ml)中的TNF-α水平比餐用卵中略高，但这是在比3k部分高很多的浓度下达到的。
超免疫卵3k部分激活TNF-α的动力学
图18描绘了PL-100卵黄的3k部分激活THP-1细胞中TNF-α的动力学。PL-100 3k部分对TNF-α的诱导30分钟后开始并且在2小时达到高峰，然后下降并在8小时后达到基线水平。餐用卵3k部分对TNF-α的诱导等于或略高于细胞中的正常水平。
超免疫卵纯化部分对THP-1.细胞中分化的诱导
THP-1细胞为单核细胞/巨噬细胞起源的转化人细胞，当用来自于超免疫卵黄中的3k部分处理它时，会进行分化。通常这些细胞成簇生长在悬浮液中并且不附着在塑料表面。然而，当生长在含有超免疫卵(此后称作PL-100)中的3k部分(1mg/ml)的无血清培养基中时，它们分化为类成纤维细胞并附着在塑料表面。将3k部分进一步在离子交换柱(Q琼脂糖)纯化并用200mM氯化钠洗脱后，将在低很多的浓度(0.01mg/ml)导致THP-1细胞分化。文献中的一些报道提示TNF-α，IL-1α和IL-1β的产生与抗单核细胞/巨噬细胞起源细胞的增生和分化相关。
CAFb对细胞因子表达的诱导
用SPE水溶部分和实施例1中描述的高度纯化的CAFb部分按前面的描述进行细胞因子测定。图19证明了SPE水溶部分和CAFb制剂诱导了TNF-α，IL-1β和Il-6的表达。
CAFb对TGFβ的抑制
用SPE水溶部分和实施例1中描述的高度纯化的CAFb部分按前面的描述进行细胞因子测定。图20证明了CAFb，而不是SPE水溶部分抑制了转化生长因子β(TGFβ)的诱导。
已经详细描述了本发明的各种实施方案，显而易见的是，本领域中的技术人员可以对这些实施方案进行修饰和改良。然而，特别需要理解的是，如下面的权利要求所阐明的，这些修饰和改良在本发明的范围内。