胰岛素稳定表达质粒的构建及其在体内的高效导入方法 【技术领域】
本发明涉及在糖尿病基因治疗中体内高效，较长时间表达外源基因的载体构建，及这些表达载体导入体内高效表达以达到治疗糖尿病目的的方法。背景技术
糖尿病基因治疗中外源基因的导入的常用以下方法：
a病毒介导：如腺病毒，腺相关病毒，反转录病毒，但是该类病毒介导的主要问题是易引起免疫性及存在安全性问题。
b裸质粒注射：该方法的主要问题是转染效率低，表达时间短。
尾静脉大容量快速质粒注射法(Intravenous administration of plasmid DNA using ahydrodynamics-based procedure)1999年开始报导，此方法可介导裸质粒高效转染小鼠肝、牌及肾等器官，外源基因可获得高水平表达，是研究基因功能的简易而有效的基因导入途径。FIX，AAT等基因已被用于基因治疗研究，但是尚未见用于胰岛素的基因治疗。发明内容
本发明的目的是构建胰岛素稳定表达质粒及其在体内高效导入方法，其特征是转座子携带的可整合的胰岛素表达质粒载体，或ApoE基因区的肝位置控制区序列(HCR)介导的胰岛素基因表达载体。用于本发明的原始生物材料
pT为Zoltan Ivics实验室赠送；(Cell 91：501-510)
pCMV-SB为Zoltan Ivics实验室赠送；(Cell 91：501-510)
pHCR.hAAT.bpA，为Miao CH实验室赠送；(Molecular Therapy 3：403-410)
pcDNA3-mINS，为华山医院沈坤堂博士赠送；(in published)
pgINS，为华山医院沈坤堂博士赠送；(in published)
pBlue-erINS，为Macia Meseck实验室赠送；(Diabetes Research and Clinical
Practice 52：153-163)
pBlue-PC3，为Iminger JL实验室赠送；(Diabetes 46：978-982)以上质粒地宿主菌为Escherichia coli大肠杆菌，例如DH5α，JM109等。本发明基于用上述生物材料，构建稳定表达胰岛素的载体，用于糖尿病基因治疗。本发明胰岛素表达载体的构建及其特征pT-mINS质粒的构建及其特征。见附图1。pT-mINS载体中mINS通过EcoRI、HindIII酶切位点插入，mINS基因前为CMV启动子，后面为终止子BGH poly A。在CMV-mINS-BGH pA表达单位的外侧接有sleepingbeauty转座子末端重复序列IR/DR。pT-erINS质粒的构建及其特征。见附图2。pT-erINS载体中erINS通过EcoRI、HindIII酶切位点插入，erINS基因前为CMV启动子，后面为终止子BGH poly A。在CMV-erINS-BGH pA表达单位的外侧接有sleepingbeauty转座子末端重复序列IR/DR。pT-gINS-PC3质粒的构建及其特征见附图3。pT-gINS-PC3载体中gINS基因通过IRES核糖体进入位点与PC3基因相连，通过EcoRI、HindIII酶切位点插入，PC3为大鼠prohormone convertase 3 cDNA，其蛋白产物可将胰岛素原加工为成熟的胰岛素。gINS前为CMV启动子，后面为终止子BGH poly A。在CMV-gINS-PC3-BGH pA表达单位的外侧接有sleeping beauty转座子末端重复序列IR/DR。pT-gINS，pT-PC3质粒的构建及其特征见附图4。pT-gINS载体中gINS基因通过EcoRI、HindIII酶切位点插入，gINS前为CMV启动子，后面为终止子BGH poly A。pT-PC3载体中PC3为大鼠prohormone convertase 3cDNA，其蛋白产物可将胰岛素原加工为成熟的胰岛素。PC3通过EcoRI、Hind III酶切位点插入，PC3前为CMV启动子，后面为终止子BGHpolyA。在CMV-PC3-BGH pA表达单位的外侧接有sleeping beauty转座子末端重复序列IR/DR。pHCR-hAATp-mINS质粒的构建及其特征。见附图5。HCR，载脂蛋白E位点控制区(apolipoprotein E locus control region)，hAATp人α-抗胰蛋白酶启动子(the human α-antitrypsin promoter)。mINS基因为突变的人胰岛素cDNA，其蛋白产物可被广谱表达的furin蛋白加工酶切割加工为成熟的胰岛素。BGH poly A为终止子，mINS通过BamHI、XbaI酶切位点插入。pHCR-hAATp-erINS质粒的构建及其特征。见附图6。HCR，载脂蛋白E位点控制区(apolipoprotein E locus control region)，hAATp人α-抗胰蛋白酶启动子(the humanα-antitrypsin promoter)。erINS基因为突变的大鼠胰岛素cDNA，其蛋白产物可被广谱表达的furin蛋白加工酶切割加工为成熟的胰岛素。BGH poly A为终止，erINS通过BamHI、XbaI酶切位点插入。pHCR-hAATp-gINS-PC3质粒的构建及其特征见附图7。HCR，载脂蛋白E位点控制区，hAATp人α-抗胰蛋白酶启动子(the human α-antitrypsin promoter)。gINS基因为人胰岛素genomic DNA，其蛋白产物可被胰腺特异表达的PC3蛋白加工酶切割加工为成熟的胰岛素。gINS基因通过IRES核糖体进入位点与PC3基因相连，通过BamHI、XbaI酶切位点插入，PC3为大鼠prohormone convertase 3 cDNA，其蛋白产物可将胰岛素原加工为成熟的胰岛素。BGH poly A为终止子。
Sleeping beauty：转座子，可在sleeping beauty转座酶作用下整合到脊椎动物细胞染色体上，使得外源基因在体内长期存在，从而介导长期表达。
HCR(hepatic locus control region)是载脂蛋白基因区的肝特异表达框架，它与肝脏特异表达启动子hAATp结合可介导外源基因在肝脏长期稳定的表达。
线状DNA可在细胞中以多联体的形式存在，这种存在形式有利于外源基因的表达，从而提高表达时间。动物转染方法本发明将上述质粒尾静脉注射，Ringer’s生理盐水溶液，2-3ml，质粒1-100μg，4-8秒内从小鼠尾静脉注射到小鼠体内。本发明方法容易操作，构建的质粒载体能够高效表达胰岛素基因，通过尾静脉大容量快速法注射到动物体内，使血糖下降并长期稳定。下表列出本发明的效果：治疗组治疗前血糖mM 治疗后血糖mM 1天 2天 3天 4天 5天 6天 7天 9天 11天 14天 1 28.9 1.8 3.2 3.4 2.0 4.0 2.6 2.3 6.9 6.3 19.1 2 25.4 2.4 2.7 5.8 2.5 3.8 5.1 6.0 5.9 8.8 22 3 24.7 4.7 4.6 3.3 2.7 1.5 3.9 7.7 5.9 7.9 21.9 4 20.8 4.9 12.0 3.4 4.0 3.4 3.5 7.811.0 11.8 17.71为pT-mINS质粒与pCMV-SB质粒共转染体系2为pT-erINS质粒与pCMV-SB质粒共转染体系3为pT-gINS-PC3质粒与pCMV-SB质粒共转染体系4为pHCR-hAATp-mINS质粒附图说明图1是pT-mINS与pCMV-SB结构示意图图2是pT-erINS与pCMv-SB结构示意图图3是pT-gINS-PC3结构示意图图4是pT-gINS与pT-PC3结构示意图图5是pHCR-hAAT-mINS结构示意图图6是pHCR-hAAT-erINS结构示意图图7是pHCR-hAATp-gINS-PC3结构示意图图8是pCMV-SB结构示意图实施例
以下实施例对系列胰岛素表达载体的用途作了详细说明，但并不意味着限制本发明的内容，本领域技术人员均能按照图1-8方式构建质粒。具体实施例
实施例1 质粒DNA的制备参照Mokecular Cloning-A Laboratory Manual(SambrookJ.et al，1996)用碱裂解法制备质粒DNA，用于质粒的构建。动物注射用质粒用QiagenMaxi-Prep Kit(Valencia，CA)制备，纯化的质粒未检测到蛋白与RNA。
实施例2 pT-mINS质粒与pCMV-SB质粒共转染体系。
两种质粒抽提纯化后以80μg∶8μg的量与比例混合，溶于2-3ml Ringer’s生理盐水溶液，通过小鼠尾静脉注射到糖尿病小鼠体内，注射时间为6-8秒。注射后每天检测小鼠血糖浓度及体重等指标。治疗后糖尿病小鼠血糖降至正常，体重不再下降，并逐渐开始增加。
实施例3 pT-erINS质粒与pCMV-SB质粒共转染体系。
两种质粒抽提纯化后以80μg∶8μg的量与比例混合，溶于2-3ml Ringer’s生理盐水溶液，通过小鼠尾静脉注射到糖尿病小鼠体内，注射时间为6-8秒。注射后每天检测小鼠血糖浓度及体重等指标。治疗后糖尿病小鼠血糖降至正常，体重不再下降，并逐渐开始增加。
实施例4 pT-gINS-PC3质粒与pCMV-SB质粒共转染体系。
两种质粒抽提纯化后以80μg∶8μg的量与比例混合，溶于2-3ml Ringer’s生理盐水溶液，通过小鼠尾静脉注射到糖尿病小鼠体内，注射时间为6-8秒。注射后每天检测小鼠血糖浓度及体重等指标。治疗后糖尿病小鼠血糖降至正常，体重不再下降，并逐渐开始增加。
实施例5 pT-gINS，pT-PC3质粒与pCMV-SB质粒共转染体系。
三种质粒抽提纯化后以80μg∶80μg∶8μg的量与比例混合，溶于2-3ml Ringer’s生理盐水溶液，通过小鼠尾静脉注射到糖尿病小鼠体内，注射时间为6-8秒。注射后每天检测小鼠血糖浓度及体重等指标。治疗后糖尿病小鼠血糖降至正常，体重不再下降，并逐渐开始增加。
实施例6 pHCR-hAATp-mINS质粒。
质粒抽提纯化后100μg，溶于2-3ml Ringer’s生理盐水溶液，通过小鼠尾静脉注射到糖尿病小鼠体内，注射时间为6-8秒。注射后每天检测小鼠血糖浓度及体重等指标。治疗后糖尿病小鼠血糖降至正常，体重不再下降，并逐渐开始增加。
实施例7 pHCR-hAATp-erINS质粒。
质粒抽提纯化后100μg，溶于2-3ml Ringer’s生理盐水溶液，通过小鼠尾静脉注射到糖尿病小鼠体内，注射时间为6-8秒。注射后每天检测小鼠血糖浓度及体重等指标。治疗后糖尿病小鼠血糖降至正常，体重不再下降，并逐渐开始增加。
实施例8 pHCR-hAATp-gINS-PC3质粒。
质粒抽提纯化后100μg，溶于2-3ml Ringer’s生理盐水溶液，通过小鼠尾静脉注射到糖尿病小鼠体内，注射时间为6-8秒。注射后每天检测小鼠血糖浓度及体重等指标。治疗后糖尿病小鼠血糖降至正常，体重不再下降，并逐渐开始增加。
实施例9 pHCR-hAATp-mINS线状质粒。
质粒抽提纯化后100μg，单酶切为线状，酒精沉淀后溶于2-3ml Ringer’s生理盐水溶液，通过小鼠尾静脉注射到糖尿病小鼠体内，注射时间为6-8秒。注射后每天检测小鼠血糖浓度及体重等指标。治疗后糖尿病小鼠血糖降至正常，体重不再下降，并逐渐开始增加。
实施例10 pHCR-hAATp-erINS线状质粒。
质粒抽提纯化后100μg，单酶切为线状，酒精沉淀后溶于2-3ml Ringer’s生理盐水溶液，通过小鼠尾静脉注射到糖尿病小鼠体内，注射时间为6-8秒。注射后每天检测小鼠血糖浓度及体重等指标。治疗后糖尿病小鼠血糖降至正常，体重不再下降，并逐渐开始增加。
实施例11 pHCR-hAATp-gINS-PC3线状质粒。
质粒抽提纯化后100μg，单酶切为线状，酒精沉淀后溶于2-3ml Ringer’s生理盐水溶液，通过小鼠尾静脉注射到糖尿病小鼠体内，注射时间为6-8秒。注射后每天检测小鼠血糖浓度及体重等指标。治疗后糖尿病小鼠血糖降至正常，体重不再下降，并逐渐开始增加。