肿瘤坏死因子抑制肽及其应用 本发明涉及肿瘤坏死因子抑制剂及其应用，具体涉及能够与肿瘤坏死因子特异结合并抑制其活性的肿瘤坏死因子抑制肽及其应用。
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种有多种生物学活性的免疫和炎症介质，其在体内的过量表达可造成严重的炎症反应，导致血栓、低血压、休克、组织损伤甚至死亡。肿瘤坏死因子-α的非正常表达还与一些常见的自身免疫性疾病，如：类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化症、节段性回肠炎(Crohn’s)等有关。因此以抑制肿瘤坏死因子-α为目的的治疗药物，受到人们的广泛关注(Andreas等，Immunology Today 18：487(1997))。
通过抑制肿瘤坏死因子-α与受体的结合是一种比较好的抑制肿瘤坏死因子-α活性的方法。目前抑制肿瘤坏死因子-α与受体的结合有三种方式：肿瘤坏死因子-α抗体，可溶性肿瘤坏死因子受体，以及肿瘤坏死因子-α受体模拟肽。最初研究表明，抗肿瘤坏死因子-α抗体可中和肿瘤坏死因子-α的活性，提示肿瘤坏死因子-α抗体可望作为药物用于炎症治疗。在随后的研究中，许多公司致力于开发针对肿瘤坏死因子-α诱发炎症的抗体药物。Centorcor公司生产的抗肿瘤坏死因子-α抗体REMICADE(infliximab)于1998年8月获FDA批准用于Crohn’s的治疗(van Deventer等，Aliment Pharmacl Ther 13 Suppl 4：3(1999)；Scand JImmunol 51：18(2000))，该药于1999年11月再次获FDA批准用于RA的治疗。这是第一种用于RA治疗地抗体类药物。另外，英国BASF公司在成功实验了人-鼠杂合抗肿瘤坏死因子-α抗体cA2对RA的治疗之后，目前正在开展新抗体D2E7治疗RA的三期临床实验(Baert等，Int J Colorectal Dis 14：47(1999))。研究还表明除了抗肿瘤坏死因子-α的抗体可以中和肿瘤坏死因子-α的活性外，可溶性肿瘤坏死因子-α受体也同样具有比较好的效果。美国的Immunex公司于1993年就开始研究使用人肿瘤坏死因子R2胞外区与IgGlFc段融合的重组蛋白(商品名：ENBREL)治疗RA，并于1998年5月获得FDA批准，用于RA的临床治疗(Moreland等，Rheum Dis Clin North Am 24：579(1998))。1999年5月再次获准用于青少年类风湿性关节炎(JRA)的治疗。目前该公司正在实验用ENBREL治疗充血性心力衰竭。
虽然抗肿瘤坏死因子-α抗体、可溶性肿瘤坏死因子-α受体已经取得了较好的临床效果，但还存在一些问题。由于肿瘤坏死因子-α拮抗剂的适用症主要是一些急性或慢性炎症，因此实际临床应用时对这些拮抗剂的要求是：可以大剂量、长期使用，而且毒副作用小。然而，目前临床上使用的这些大分子物质在来源、稳定性、成本(例如：Enbrel的分子量为150kDa，一个成年人的用量是50mg/周)以及潜在的副作用等方面存在诸多问题，为了取得更好的治疗效果，并降低成本，人们开始把研究的注意力逐步转移到开发小分子拮抗剂，肿瘤坏死因子R模拟肽就是这样一种尝试。
肿瘤坏死因子-α受体小分子模拟肽的研究经历了三个阶段，最初人们尝试根据抗-肿瘤坏死因子-抗体或可溶性肿瘤坏死因子R上与配体结合有关的氨基酸一级结构进行多肽合成和药物筛选。但由于氨基酸的一级结构不能完全反映蛋白质的空间构象，因此很难达到理想的拮抗效果(Lie等，Biochemical andBiophysical Research Communication 188：503-509(1992))。后来由于肿瘤坏死因子-肿瘤坏死因子R复合物的晶体结构的发现，Takasaki等借助计算机的模拟，确定受体-配体结合位点的关键氨基酸，并合成了一系列肽模拟物(Takasaki等，Nature Biotech，15：1266(1997))。他们发现其中一些肽模拟物无论是在受体结合还是生物学活性方面，都具有拮抗肿瘤坏死因子-α的作用，其中最好的拮抗剂的IC50可达5μM。但开展这项研究首先要对细胞因子及其受体空间结构，以及对细胞因子的功能部位有深入研究，而且即使是象肿瘤坏死因子-肿瘤坏死因子R这样晶体结构已知的体系，由于单纯从配体结构分析入手得到的信息是十分有限的，尤其是肿瘤坏死因子-肿瘤坏死因子R间作用位点几乎分布在整个三聚体表面，因此仍然很难明确究竟哪个位点是最重要的，必须合成一系列的多肽，这样就存在一定的风险。目前这一条路线的成功率还很低。
随着80年代后期崛起的一种研究蛋白质间相互作用的有力工具—噬菌体展示技术的成熟和发展，对肿瘤坏死因子-α受体模拟肽的直接筛选工作终于成为可能。由于噬菌体展示技术的简单、直接以及丰富的库容量所赋予的极大的可能性，已成为药物筛选的首选工具。并且在肿瘤坏死因子-α拮抗剂的筛选中也已得到应用。1998年，Chirinos-Rojas等利用随机14肽库对肿瘤坏死因子-α进行筛选，得到了一种具有生物活性的结合肽(Chirinos-Rojas等，Journal ofImmuology 161：5621(1998)；Immunology 96：109(1999))。但由于他们得到的是单一序列，无法对序列中每个氨基酸的作用进行评价，因此不能做进一步的优化，限制了继续筛选高亲和力的肽配体。
本发明的目的是提供能够与肿瘤坏死因子专一结合，并能够抑制肿瘤坏死因子活性的肿瘤坏死因子抑制肽。
本发明的另一目的是提供肿瘤坏死因子抑制肽的用途。
本发明的肿瘤坏死因子抑制肽，是具有以下通式的12肽：H1-X2-4-H1-X0-2-H1-X3-6，其中，H代表组氨酸残基，X代表任何天然L-氨基酸残基或其D-异构体，脚注数字代表氨基酸残基的个数。
具有上述结构模式的多肽可与肿瘤坏死因子专一结合，并阻断肿瘤坏死因子与受体的结合，从而抑制肿瘤坏死因子的生物学活性，包括肿瘤坏死因子的细胞毒性以及肿瘤坏死因子诱导细胞凋亡的活性。此类结构模式即可以多肽形式单独存在，也可与其它蛋白或多肽融合，或插入蛋白质表面的特定部位，如凸环区，或与其它物质连接。无论以什么形式存在，含此结构模式的物质都可能表现出与肿瘤坏死因子结合并抑制肿瘤坏死因子活性的作用。
目前虽有肿瘤坏死因子结合肽的报道，但未能找到在结合过程中起关键作用的氨基酸残基。本发明通过对一组与肿瘤坏死因子结合的多肽的结构分析，确定了与肿瘤坏死因子结合所必须的氨基酸序列模式或称结构模式，这对于设计和研制新型抗肿瘤坏死因子的药物具有重要意义。
研究结果表明，本发明筛选到的多肽不仅能够竞争性地阻断肿瘤坏死因子与受体的结合，也能抑制肿瘤坏死因子对细胞的细胞毒性，因而可望成为新的抗肿瘤坏死因子药物或药物前体，为各种炎症或相关免疫性疾病的治疗提供了一条新的途径。本发明的肿瘤坏死因子抑制肽在制造抗肿瘤坏死因子的药物中具有广泛的应用价值及广阔的市场前景。
另外，肿瘤坏死因子结合肽作为生物制剂也有着潜在的应用价值，如作为配体用于肿瘤坏死因子的亲和纯化、作为探针用于肿瘤坏死因子的检测等等。
根据肿瘤坏死因子结合肽序列模式的多种存在形式，可以有多种获取含此序列模式物质的方法，如固相方法，溶液中合成，用基因工程方法生产重组蛋白，以及通过其他化学方法合成。含此序列模式的物质可有各种应用方式，主要包括在体外和体内抑制肿瘤坏死因子的活性，以各种给药方式实现以抑制肿瘤坏死因子活性为目的的疾病治疗，以及肿瘤坏死因子的检测或纯化等。
含本发明序列模式的物质在生物医学方面的应用还包括：
1、通过合成或基因重组的方式，将含此序列模式的肽段与其他蛋白或肽融合，用于以抑制肿瘤坏死因子活性为目的的各种感染性疾病、自免疫疾病以及其他相关疾病的治疗。
2、将其与琼脂糖偶联后，用于肿瘤坏死因子的亲和分离。
3、将其与指示标签偶联后，用于肿瘤坏死因子的鉴定。
下面结合附图对本发明作进一步说明。
图1为ELISA方法检测噬菌体展示多肽与TNF-α结合的结果
图2-A为TNF-α竞争性受体结合抑制实验的结果曲线
图2-B为TNF-α竞争性受体结合抑制实验的结果曲线
图3为TNF-α对TNF-α细胞毒活性抑制实验的结果曲线
实施例1、具有代表性的肿瘤坏死因子抑制肽
本发明选用以下6个具有代表性的肽进行说明。
1号肽：HPTHLTHTSPKH
2号肽：HKMHSHPRLTSP
3号肽：HSLHVHKGLSEL
4号肽：HLKHHPPYKDAT
5号肽：HTPKLHSHTHSS
6号肽：HKYHNHTTALSP
实施例2、六个具有代表性肽的合成
本发明具有代表性的6种肽是用下列固相方法合成的。
称取KR树脂1g置于反应器中，加入二甲基甲酰胺(DMF)溶涨30min，滤除DMF，将Fmoc氨基酸、HBTU、HOBT各0.4mmol和NMM 0.6mmol溶于适量DMF中，将其加入到反应器中，于40℃左右振摇2hr，滤除反应液，以甲醇、DMF、交替洗涤树脂各2次，用无水乙醚洗一次。用20％哌啶/DMF溶液脱除Fmoc基。反应10min，滤除反应液甲醇、DMF交替洗涤树脂各2次。进行下一个氨基酸残基的偶联。如此依次由C端第一个氨基酸向N端延伸，直到肽链组装完成。合成好的多肽经过G10脱盐柱纯化，冷冻干燥保存。
实施例3、ELISA方法检测噬菌体展示多肽与TNF-α结合
用含浓度为50μg/ml的TNF-α、0.1M NaHCO3，pH8.6的溶液包被酶联板，作为样品孔，如图1所示的第1、3、5、7、9、11号孔；以不包被TNF-α，加入同样缓冲液的为对照孔，如图1所示的第2、4、6、8、10、12号孔。4℃过夜，1％BSA37℃封闭1小时。依次加入展示实施例1的1-6号肽的等量噬菌体克隆(106pfu)，室温孵育1小时。用50mM Tris-HCI，pH7.5，含150mM NaCI和0.1％土温20(Tween20)的缓冲液洗3次，以HRP一标记的鼠抗M13噬菌体单克隆抗体孵育，充分结合后洗涤，再加入OPD显色。结果如图1所示，样品孔1、3、5、7、9、11均呈现黄色显色，对照孔2、4、6、8、10、12均没有显色，说明六种噬菌体克隆对TNF-α均有较强的亲和力。其原理是，用TNF-α包被的样品孔中的噬菌体与TNF-α结合后，附着在酶联板上，并与用HRP-标记的鼠抗M13噬菌体单克隆抗体结合而显色；没有用TNF-α包被的对照孔中的噬菌体，不会与酶联板结合，在冲洗过程中被洗去，因而用HRP-标记的鼠抗M13噬菌体单克隆抗体也不会附着在酶联板上，所以不会显色。如图1所示，本实验进行了A、B、C三次重复，结果相同。
实施例4、肿瘤坏死因子结合肽的竞争性受体结合抑制实验
先将重组表达并纯化的肿瘤坏死因子R1和肿瘤坏死因子R2受体分别包被到酶联板上，然后用含BSA的封闭液(含有1％BSA的PBS)封闭。将实施例1中的1-3号肽的合成肽样品进行系列倍比稀释后，与等体积的125I-肿瘤坏死因子混匀，再分别加入受体包被的平板上，室温反应4hr。用封闭液充分洗涤后，在γ计数器中测定放射强度。每个样品做三个平行孔，以BSA作为对照。抑制百分数的计算：[(cpmBSA-cpm样品)/cpmBSA]×100％。以抑制百分数对肽浓度作图，结果见图2-A、图2-B，其中，横坐标为肽浓度(μM)，纵坐标为抑制率，三条曲线分别为1、2、3号肽。从图中可以看出，1-3号肽都可以特异性地抑制肿瘤坏死因子-α与肿瘤坏死因子R1(图2-A)、肿瘤坏死因子R2(图2-B)的结合，IC50值均约为50μM。
由这个结果推测，筛选到的特异性结合肽能够特异性地与肿瘤坏死因子-α受体结合部位结合，并抑制肿瘤坏死因子-α与两种受体的作用。
实施例5、肿瘤坏死因子结合肽对肿瘤坏死因子-α细胞毒活性的抑制
将传代培养的L929细胞接种于96孔培养板，每孔4×103细胞，37℃培养24小时。将不同浓度的实施例1的1-3号合成肽与肿瘤坏死因子-α(浓度为54ng/ml)混合，37℃放置2小时后加入到培养板中，继续培养12小时。弃去培养液，结晶紫固定及染色，测定595nm的吸光度值。每个样品浓度做3个平行孔，以只加肿瘤坏死因子孔作为阴性对照，以只加缓冲液孔为阳性对照，抑制百分数的计算：[(OD样品-OD阴性)/(OD阳性-OD阴性)]×100％。以抑制百分数对肽浓度作图，结果见图3，其中，横坐标为肽浓度(μM)，纵坐标为抑制率，三条曲线分别为1、2、3号肽。由图3可见，3合成肽均能明显地抑制肿瘤坏死因子-α对L929细胞的杀伤活性。其中在肿瘤坏死因子-α的浓度为54ng/ml(对细胞的杀伤率达到75％)时，2号肽IC50的值为60.3μM。而1号、3号肽的IC50的值均约为100μM。