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1、10申请公布号CN104095846A43申请公布日20141015CN104095846A21申请号201410360802322申请日20140725A61K31/37200601A61P11/00200601A61P29/0020060171申请人杭州师范大学地址310018浙江省杭州市余杭区仓前街道海曙路58号72发明人史丽云俞雯雯卢哲74专利代理机构杭州求是专利事务所有限公司33200代理人杜军54发明名称祖师麻甲素在制备预防急性肺损伤药物中的应用57摘要本发明公开祖师麻甲素在制备预防急性肺损伤药物中的应用。祖师麻甲素能够有效预防急性肺损伤导致的肺部炎症和损伤。本发明揭露了祖师麻甲素。
2、可用于制备预防急性肺损伤及其并发症药物，以及祖师麻甲素用于预防急性肺损伤及其并发症的作用机制。祖师麻甲素通过抑制NFB的活性而抑制TLR诱导的炎症反应，且祖师麻甲素以TNFAIP3为靶标，通过调节TNFAIP3来调节TRAF6第63位赖氨酸的泛素化和NFB介导的炎症反应。51INTCL权利要求书1页说明书11页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书11页附图4页10申请公布号CN104095846ACN104095846A1/1页21祖师麻甲素在制备预防急性肺损伤药物中的应用。2如权利要求1所述的祖师麻甲素在制备预防急性肺损伤药物中的应用，其特征在于所述的。
3、祖师麻甲素是从瑞香属植物中提取的天然产物，具有7，8二羟基香豆素的结构，如下所示3如权利要求1所述的祖师麻甲素在制备预防急性肺损伤药物中的应用，其特征在于祖师麻甲素通过抑制NFB的活性而抑制TLR诱导的炎症反应，且祖师麻甲素以TNFAIP3为靶标，通过调节TNFAIP3来调节TRAF6第63位赖氨酸的泛素化和NFB介导的炎症反应。权利要求书CN104095846A1/11页3祖师麻甲素在制备预防急性肺损伤药物中的应用技术领域0001本发明属生物医学类技术领域，涉及祖师麻甲素在制备预防急性肺损伤药物中的应用。背景技术0002急性肺损伤以肺间质中大量炎症因子的释放，炎症细胞的聚集，纤维素沉积和肺水。
4、肿为病理生理特征。失调的炎症反应引起组织的严重损伤和肺功能的持续恶化。现在科学界对于急性肺损伤及其并发症的起因还未有深入研究，也没有开发出有效的治疗方法。因此，急性肺损伤的死亡率至今高达40。0003大部分的肺部炎症性疾病是由核转录因子BNUCLEARFACTORB,NFB的持续活化引起。NFB作为转录因子，介导很多促炎因子的表达，因此，被认为是炎症反应和损伤的驱动者。特异性的TOLL样受体TOLLLIKERECEPTOR,TLR，白细胞介素1受体TYPEINTERLEUKIN1RECEPTOR,IL1R，肿瘤坏死因子受体TUMORNECROSISFACTORRECEPTOR,TNFR的激活招。
5、募髓样分化因子MYELOIDDIFFERENTIATIONFACTOR88,MYD88或者TOLL样受体相关的干扰素活化子TOLL/IL1RHOMOLOGYDOMAINCONTAININGADAPTORINDUCINGINTERFERON,TRIF等接头蛋白，从而激活经典的NFB通路。肿瘤坏死因子受体相关因子6TNFRECEPTORASSOCIATEDFACTOR6,TRAF6是信号通路中一个重要的信号分子，具有连接酶的活性，起到连接受体和下游NFB信号通路的作用。它把多聚泛素链连接到自身或者其它目标蛋白的第63位赖氨酸残基上，如TGF活化激酶1TRANSFORMINGGROWTHFACTOR。
6、BETAACTIVATEDKINASE1,TAK1上，TAK1可以把信号传递给下游丝裂原活化蛋白激酶MITOGENACTIVATEDPROTEINKINASE，MAPK和核转录因子B抑制蛋白激酶INHIBITOROFNFBKINASE,IKK。激活的IKK引起核转录因子B抑制蛋白IB,INHIBITOROFNFB的磷酸化和蛋白酶体介导的IB的降解，随之NFB释放入核。在胞核中，NFB与相关超二级结构结合参与促炎因子的表达HOFFMANN,A,ALEVCHENKO,MLSCOTT,ANDDBALTIMORE2002THEIKAPPABNFKAPPABSIGNALINGMODULETEMPORAL。
7、CONTROLANDSELECTIVEGENEACTIVATIONSCIENCE29812411245；MEDZHITOV,R,ANDTHORNG2009TRANSCRIPTIONALCONTROLOFTHEINFLAMMATORYRESPONSENATUREREVIEWSIMMUNOLOGY9692703。0004NFB调控重要的炎症信号通路和相关的免疫病理反应，在炎症的发生发展中起重要的作用。蛋白泛素化在调控NFB信号通路和炎症反应中起到重要作用。蛋白泛素化是一个动态的过程，泛素化的程度由E3泛素连接酶和去泛素化酶DEUBIQUITINGENZYMES，DUBS的相对活性决定HOCHSTR。
8、ASSER,M2000BIOCHEMISTRYALLINTHEUBIQUITINFAMILYSCIENCE289563564。一方面，E3泛素连接酶把泛素分子连接到目标蛋白的赖氨酸残基上，进行单泛素化或者多聚泛素化修饰。多聚泛素化修饰的类型决定了目标蛋白的走向。如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48位赖氨酸残基相连，可介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解；如果与被修饰蛋白上其它位点，如第63位赖氨酸残基相说明书CN104095846A2/11页4连，则靶蛋白不被降解而发挥信号通路功能HOCHSTRASSER,M2006LINGERINGMYSTERIESOFUBIQUITINCHAINASSEMBL。
9、YCELL1242734。另一方面，去泛素化酶DUBS酶可以剪切泛素化链，从而终止NFB信号通路REILEY,WW,MZHANG,WJIN,MLOSIEWICZ,KBDONOHUE,CCNORBURY,ANDSCSUN2006REGULATIONOFTCELLDEVELOPMENTBYTHEDEUBIQUITINATINGENZYMECYLDNATUREIMMUNOLOGY7411417。0005TNF诱导蛋白3TNFINDUCINGPROTEIN3,TNFAIP3，即A20，属于DUB酶的一种，是NFB信号通路中的调节蛋白。TNFAIP3的氨基端有一个卵巢囊肿结构域，使其具有去泛素化酶的活性。
10、，同时，其羧基端锌指结构使其具有E3泛素化连接酶的活性SUN,SC2008DEUBIQUITYLATIONANDREGULATIONOFTHEIMMUNERESPONSENATUREREVIEWSIMMUNOLOGY8501511。然而，在很多细胞中，TNFAIP3是作为NFB的负调控因子，可以去除TRAF6上的泛素化链，或者通过直接跟TRAF6结合而影响E2结合酶UBC13跟TRAF6的结合MABILLEAU,G,DCHAPPARD,ANDASABOKBAR2011ROLEOFTHEA20TRAF6AXISINLIPOPOLYSACCHARIDEMEDIATEDOSTEOCLASTOGENE。
11、SISTHEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRY28632423249；SHEMBADE,N,AMA,ANDEWHARHAJ2010INHIBITIONOFNFKAPPABSIGNALINGBYA20THROUGHDISRUPTIONOFUBIQUITINENZYMECOMPLEXESSCIENCE32711351139。TNFAIP3敲除的细胞高度活化并分泌大量的促炎因子，TNFAIP3敲除小鼠在幼年即死于多器官炎症。TNFAIP3功能缺失突变导致一系列炎症和自身免疫疾病，像类风湿关节炎，系统性红斑狼疮，肠道炎症性，银屑病和I型糖尿病VEREECKE,L,RBEYAERT。
12、,ANDGVANLOO2009THEUBIQUITINEDITINGENZYMEA20TNFAIP3ISACENTRALREGULATOROFIMMUNOPATHOLOGYTRENDSINIMMUNOLOGY30383391；WANG,J,YOUYANG,YGUNER,HRFORD,ANDAVGRISHIN2009UBIQUITINEDITINGENZYMEA20PROMOTESTOLERANCETOLIPOPOLYSACCHARIDEINENTEROCYTESJOURNALOFIMMUNOLOGY18313841392。0006在呼吸系统中，TNFAIP3水平对维持肺组织内平衡非常重要。TN。
13、FAIP3可以抑制促炎因子IL8的释放，降低人气管上皮细胞中由TLR2和TLR4介导的炎症反应GON,Y,YASAI,SHASHIMOTO,KMIZUMURA,IJIBIKI,TMACHINO,CRA,ANDTHORIE2004A20INHIBITSTOLLLIKERECEPTOR2AND4MEDIATEDINTERLEUKIN8SYNTHESISINAIRWAYEPITHELIALCELLSAMERICANJOURNALOFRESPIRATORYCELLANDMOLECULARBIOLOGY31330336。TNFAIP3缺失导致肺部炎症反应加剧，增强肺部损伤。TNFAIP3的表达水平与浸润。
14、炎症细胞的多少和细胞因子的释放成负相关ONOSE,A,SHASHIMOTO,SHAYASHI,SMARUOKA,FKUMASAWA,KMIZUMURA,IJIBIKI,KMATSUMOTO,YGON,TKOBAYASHI,NTAKAHASHI,YSHIBATA,YABIKO,TSHIBATA,KSHIMIZU,ANDTHORIE2006ANINHIBITORYEFFECTOFA20ONNFKAPPABACTIVATIONINAIRWAYEPITHELIUMUPONINFLUENZAVIRUSINFECTIONEUROPEANJOURNALOFPHARMACOLOGY541198204。最近，有。
15、报导指出，TNFAIP3水平在囊性纤维化患者中降低，并且TNFAIP3的水平与肺功能指标蛋白FORCEDEXPIRATORYVOLUMEINONESECOND,FEV1的表达成正相关。在有炎症的呼吸道上皮细胞中，存在功能缺失突变型TNFAIP3，不与TRAF6结合，不能抑制NFB的活化KELLY,C,MTWILLIAMS,JSELBORN,MENNIS,ANDBCSCHOCK2013EXPRESSIONOFTHEINFLAMMATORYREGULATORA20CORP65TESWITHLUNGFUNCTIONINPATIENTS说明书CN104095846A3/11页5WITHCYSTICBR。
16、OSISJOURNALOFCYSTICBROSISOFCIALJOURNALOFTHEEUROPEANCYSTICFIBROSISSOCIETY12411415。与这些结果相吻合的是，在其它炎症疾病中，如哮喘，囊性纤维化和变性阻塞性肺炎中，也发现了TNFAIP3的异常表达和功能缺失型突变KELLY,C,MDSHIELDS,JSELBORN,ANDBCSCHOCK2011A20REGULATIONOFNUCLEARFACTORKAPPABPERSPECTIVESFORINFLAMMATORYLUNGDISEASEAMERICANJOURNALOFRESPIRATORYCELLANDMOLECUL。
17、ARBIOLOGY44743748。因此，在这些疾病中，TNFAIP3甚至作为一个潜在的诊断治疗标志蛋白，科学家们也在努力探求以TNFAIP3为靶标的治疗方法。0007祖师麻DAPHNEGIRALDIINITSCHE为瑞香科瑞香属植物黄瑞香、陕甘瑞香及凹叶瑞香的根皮及茎皮，制成中成药后临床应用较广泛，目前在临床上使用的有如祖师麻片、祖师麻膏药和祖师麻注射液等。在古代，祖师麻常被用于治疗疟疾、类风湿性关节炎、支气管炎和伤口愈合等SUNTARI,ETALEFCACYOFDAPHNEOLEOIDESSUBSPKURDICAUSEDFORWOUNDHEALINGIDENTIFICATIONOFACTI。
18、VECOMPOUNDSTHROUGHBIOASSAYGUIDEDISOLATIONTECHNIQUEJJETHNOPHARMACOL,2012,1413105870。现代研究认为祖师麻甲素是祖师麻中的主要有效成分，其结构式为7,8二羟基香豆素，分子量为17815。目前，有关于祖师麻甲素，对其的研究主要集中在抗疟原虫作用和对类风湿性关节炎的治疗作用以及其化学结构、提取分离和合成代谢等方面，而对抗炎作用及其机制的研究较少。现有相关报道包括FINN,GJ等发现祖师麻甲素对A498细胞的调节作用与P38MAPK信号通路有关FINNGJ,BSCREAVEN,DAEGANDAPHNETININDUCEDD。
19、IFFERENTIATIONOFHUMANRENALCARCINOMACELLSANDITSMEDIATIONBYP38MITOGENACTIVATEDPROTEINKINASEJBIOCHEMPHARMACOL,2004,679177988；LIAO,MJ等发现祖师麻甲素可能是一种非常有效的化合物用于治疗由长期不可预知的压力引起的认知缺陷LIAOMJ,ETALDAPHNETINPREVENTSCHRONICUNPREDICTABLESTRESSINDUCEDCOGNITIVEDECITSJFUNDAMCLINPHARMACOL,2013,27510516；JIMENEZOROZCO,FA等发。
20、现祖师麻甲素是一种非常有前景的抗肿瘤药物，并且它作用于雌激素依赖的肿瘤JIMENEZOROZCO,FA,ETALDIFFERENTIALEFFECTSOFESCULETINANDDAPHNETINONINVITROCELLPROLIFERATIONANDINVIVOESTROGENICITYJEURJPHARMACOL,2011,668123541；HONG,YL等发现祖师麻甲素能够有效地抑制H2O2调节的脂质过氧化作用HONGYL,ETALACTIVATEDOXYGENGENERATIONBYAPRIMAQUINEMETABOLITEINHIBITIONBYANTIOXIDANTSDERIV。
21、EDFROMCHINESEHERBALREMEDIESJFREERADICBIOLMED,1992,1232138，YAO,R等研究发现祖师麻甲素对胶原蛋白诱导的关节炎的调节作用是通过调节调节性T细胞和辅助性T细胞17的平衡来实现的YAOR,ETALREGULATORYEFFECTOFDAPHNETIN,ACOUMARINEXTRACTEDFROMDAPHNEODORA,ONTHEBALANCEOFTREGANDTH17INCOLLAGENINDUCEDARTHRITISJEURJPHARMACOL,2011,670128694。0008在本项专利中，我们首次发现祖师麻甲素对肺部炎症和损伤的预。
22、防作用。具体的，本专利发现祖师麻甲素在制备预防急性肺损伤及其并发症药物中的应用，并揭示了其用于预防急性肺损伤及其并发症的作用机制。祖师麻甲素通过抑制NFB的活性而抑制TLR诱导的炎症反应。并且，我们发现祖师麻甲素以TNFAIP3为靶标，通过调节TNFAIP3来调节说明书CN104095846A4/11页6TRAF6第63位赖氨酸的泛素化和NFB介导的炎症反应。0009失控的炎症反应可以引起组织损伤和严重的免疫病理损伤，通过药物干预细胞内的免疫调节通路可以修复免疫病理损伤。祖师麻甲素DAPHNETIN被广泛地用来治疗炎症和感染性疾病，因此被认为具有调节免疫反应的潜能。但是，祖师麻甲素在预防和治疗。
23、气道炎症性疾病中的作用还未有定论，相关机制更是未有探及。发明内容0010本发明的目的是针对上述技术问题，提出了祖师麻甲素在制备预防急性肺损伤药物中的应用。0011所述的祖师麻甲素DAPHNETIN是从瑞香属植物中提取的天然产物，具有7，8二羟基香豆素的结构，如下所示00120013本发明以气道灌注脂多糖LIPOPOLYSACCHARIDE,LPS建立小鼠急性肺损伤ALIACUTELUNGINJURY模型，通过对炎症因子表达、组织病理学切片等多项指标检测，符合ALI表现，造模成功。我们发现祖师麻甲素可以减少促炎因子的产生，减弱气道的炎症反应，减少炎症细胞的浸润。祖师麻甲素抑制了LPS诱导的MAP。
24、K、NFB信号通路的激活，抑制了NFB启动子转录活性，抑制了P65核转位。除此之外，我们发现祖师麻甲素通过上调TNF诱导蛋白3TNFINDUCEDPROTEIN3，TNFAIP3，即A20，来调节TRAF6的泛素化，从而下调NFB通路。敲除原代巨噬细胞中的TNFAIP3后，祖师麻甲素介导的免疫抑制作用消失；敲减小鼠中TNFAIP3后，祖师麻甲素治疗急性肺损伤的作用也削弱了。以上实验结果揭示了祖师麻甲素在治疗肺部炎症疾病中的作用及机理。0014祖师麻甲素的有效用量为5MG/KG，药物配成溶剂，以腹腔注射方式给药。0015本发明的有益效果是祖师麻甲素能够有效预防急性肺损伤导致的肺部炎症和损伤。祖师。
25、麻甲素可减少促炎因子的产生，减弱气道的炎症反应，减少炎症细胞的浸润。本发明揭露了祖师麻甲素可用于制备预防急性肺损伤及其并发症药物，以及祖师麻甲素用于预防急性肺损伤及其并发症的作用机制。祖师麻甲素通过抑制NFB的活性而抑制TLR诱导的炎症反应，且祖师麻甲素以TNFAIP3为靶标，通过调节TNFAIP3来调节TRAF6第63位赖氨酸的泛素化和NFB介导的炎症反应。附图说明0016图1为祖师麻甲素对RAW2647细胞毒性实验；0017图2为祖师麻甲素抑制RAW2647中IL6，TNF和IL1在转录水平的表达具浓度依赖性；其中A为IL6，B为TNF，C为IL1；0018图3为祖师麻甲素抑制RAW264。
26、7中IL6，TNF和IL1在蛋白水平的表达具说明书CN104095846A5/11页7浓度依赖性；其中A为IL6，B为TNF，C为IL1；0019图4为祖师麻甲素抑制A549中IL6和TNF在MRNA水平的表达；其中A为IL6，B为TNF；0020图5为祖师麻甲素抑制A549中IL6和TNF在蛋白水平的表达；其中A为IL6，B为TNF；0021图6为祖师麻甲素抑制RAW2647中INOS在MRNA水平的表达；0022图7为祖师麻甲素抑制RAW2647和A549中NFB启动子转录活性；其中A为RAW2647细胞，B为A549细胞；0023图8为祖师麻甲素诱导RAW2647中TNFAIP3的MRN。
27、A表达水平；其中A为浓度梯度处理组，B为时间梯度处理组；0024图9为TNFAIP3参与受祖师麻甲素抑制的NFB启动子转录活性；0025图10为TNFAIP3参与受祖师麻甲素抑制的IL6，TNF和IL1的MRNA表达；其中A为IL6，B为TNF，C为IL1；0026图11为TNFAIP3参与受祖师麻甲素抑制的IL6，TNF和IL1的蛋白表达；其中A为IL6，B为TNF，C为IL1；0027图12为祖师麻甲素抑制小鼠肺组织中IL6,TNF和IL1的分泌；其中A为IL6，B为TNF，C为IL1；0028图13为祖师麻甲素抑制小鼠肺灌洗液中细胞总数和中性粒细胞数；其中A为细胞总数，B为中性粒细胞数；。
28、0029图14为祖师麻甲素抑制小鼠肺组织灌洗液中总蛋白的含量；0030图15为祖师麻甲素对小鼠中内毒素诱发的死亡率具有保护作用；0031图16为TNFAIP3参与受祖师麻甲素抑制的小鼠肺灌洗液中总蛋白的分泌；0032图17为TNFAIP3参与受祖师麻甲素抑制的小鼠肺灌洗液中IL6和TNF的表达；其中A为IL6，B为TNF。具体实施方式0033下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，而非限定本发明。0034小鼠巨噬细胞株RAW2647购自美国细胞库AMERICANTYPECULTURECOLLECTION,ATCC；质粒PGL3NF,PGL3阴性对照质粒由杭州师范大学医学院炎症和免疫调控实验。
29、室常规保存。本发明中所用的祖师麻甲素的纯度为994，购自中国食品药品检定研究院。二甲基亚砜DIMETHYLSULFOXIDE,DMSO,脂多糖LIPOPOLYSACCHARIDE,LPS，34，5二甲基噻唑22，5二苯基四氮唑溴盐MTT，4,6二脒基2苯基吲哚4,6DIAMIDINO2PHENYLINDOLE,DAPI等从美国SIGMAALDRICH公司购买。在实验中稀释药物所用的二甲基亚砜浓度低于01并且与对照组所用二甲基亚砜浓度一致。本发明中所使用的所有抗体，除特别说明，均购自美国CELLSIGNALINGTECHNOLOGY公司。肌动蛋白ACTIN抗体购自SIGMAALDRICH。所有细。
30、胞培养用的试剂和培养基购自美国LIFETECHNOLOGIES公司。清洁级C57BL/6小鼠购自JACKSONLAB,饲养于杭州师范大学实验动物中心清洁级动物房，小鼠均为雄性，实验时小鼠为68周龄。在整个体内实验过程中，所有操作均遵守国家及杭州师范大学伦理委员会说明书CN104095846A6/11页8制定的实验动物使用条例。所有实验结果均是由独立的三次重复实验得到，采用不配对的T检验分析数据，均用士SEM表示。P值005为显著性差异标准005，001。0035实施例一祖师麻甲素在RAW2647和A549细胞中具有抑制LPS诱导的炎症反应的作用00361RAW2647和A549细胞的培养和祖师。
31、麻甲素的细胞毒性实验0037RAW2647和A549从美国ATCC公司购得，用RPMI1640培养基加10胎牛血清FBS培养。为了排除祖师麻甲素可能的致细胞毒性和死亡的作用，我们先用34，5二甲基噻唑22，5二苯基四氮唑溴盐MTT分析法检测祖师麻甲素对细胞生存率的影响。RAW2647细胞分别用不同浓度的祖师麻甲素10M,20M,40M,80M,160M和二甲基亚砜对照处理。配制浓度为5MG/ML的MTT溶液溶剂为磷酸缓冲液PHOSPHATEBUFFEREDSALINE，PBS或无酚红的培养基，用022M微孔滤膜除菌，4避光保存。收集处于对数生长期的RAW2647，铺板使待测细胞密度调整至110。
32、31104/孔，在细胞培养箱中进行孵育，至细胞单层铺满孔底。次日，加入浓度梯度的祖师麻甲素药物每个浓度设置5个复孔然后在孵箱孵育48小时，每个处理孔分别加入20LMTT溶液，继续培养4小时；将培养板取出，小心吸去孔内培养基；每个处理孔分别加入150L二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10分钟，使结晶充分溶解。在光密度值490NM处测量各孔的吸亮度值。经检测，祖师麻甲素在浓度高达160M的情况下48小时处理RAW2647细胞对其没有细胞毒性作用图1。因此，在接下来的实验中，我们使用的祖师麻甲素的浓度均小于或者等于160M。00382祖师麻甲素抑制受LPS刺激的巨噬细胞分泌促炎因子0039基于巨噬细胞在。
33、肺部炎症和损伤中的作用，我们评估了祖师麻甲素在受LPS刺激的巨噬细胞中的作用。我们先检测了祖师麻甲素对RAW2647细胞产生促炎因子IL6白介素6，INTERLEUKIN6、IL1白介素1，INTERLEUKIN1及TNF肿瘤坏死因子，TUMORNECROSISFACTOR的影响。将腹腔巨噬细胞RAW2647消化计数，并以2105/孔的密度接种于12孔板中。用5个祖师麻甲素浓度预处理细胞1小时，祖师麻甲素终浓度分别为10M,20M,40M,80M,160M。随后用LPS100NG/ML刺激6小时，收集细胞和上清；将收集所得上清分装保存，按照RD公司与EBIOSCIENCE公司酶联免疫吸附试验试。
34、剂盒说明书，在蛋白水平检测IL6、IL1及TNF的表达。细胞用于提取核糖核酸信使MRNA和总蛋白。RNA的提取使用TAKARA公司的TRIZOL试剂,经逆转录得互补DNACOMPLEMENTARYDNA,CDNA，然后按照TAKARA公司SYBRPREMIXEXTAQTM说明书配制实时定量聚合酶链式反应POLYMERASECHAINREACTION,PCR体系表1，反应体系在冰上操作，在MRNA水平检测炎症因子检测IL6、IL1及TNF的相对表达ACTIN为内参,采用CT法进行分析。在LPS的刺激下，RAW2647产生大量的促炎因子IL6，TNF和IL1。但是在祖师麻甲素存在的情况下，这三种细。
35、胞因子的MRNA表达和蛋白的表达被抑制，并且抑制的程度随着祖师麻甲素浓度的增加而增强图2和图3。我们又进一步在A549细胞中检测了祖师麻甲素对LPS诱导的炎症反应的作用。A549是人肺泡上皮细胞株。在A549中，祖师麻甲素也能显著抑制LPS诱导下IL6和TNF的MRNA和蛋白的表达图4和图5。这上结果显示，祖师麻甲素具有抑制TLR介导的炎症反应的作用。0040专利中使用REALTIMEPCR的体系如下表1说明书CN104095846A7/11页90041表1PCR反应体系及反应过程00420043专利中所用的IL6，TNF和IL1引物序列如下表20044表2基因引物序列004500460047。
36、3祖师麻甲素抑制巨噬细胞产生诱导型一氧化氮合成酶0048一氧化氮NITRICOXIDE,NO是急性肺损伤中的重要调控因子之一，因此，我们用REALTIMEPCR的方法检测了一氧化氮产生过程中依赖的诱导型一氧化氮合成酶INDUCIBLENITRICOXIDESYNTHASE,INOS的表达。结果显示，INOS的表达在祖师麻甲素预先处理的受LPS刺激的巨噬细胞中显著降低图6。0049专利中所用的INOS引物序列为FCCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAGCG；RGGCTGTCAGAGCCTCGTGGCTTTGG。0050实施例二祖师麻甲素抑制NFB和MAPK通路00511小鼠腹腔巨噬细胞的。
37、培养说明书CN104095846A8/11页100052将3的巯基乙醇酸盐培养基2ML，注射入68周雄性小鼠腹腔内；4天后颈椎脱臼法处死小鼠，用70的酒精浸泡5分钟，取出小鼠，腹面向上，置于经紫外灯照射并通风的生物安全柜内的无菌锡箔纸上；用镊子提起小鼠下腹部皮肤，使用10ML注射器，向腹腔中注入5ML左右PBS，向各个不同方向轻晃小鼠，使PBS完全浸于小鼠整个腹腔；用镊子提起小鼠下腹部皮肤，剪开一小口，撕开皮肤，完全暴露腹膜，用注射器针尖朝上，避开肠和脂肪，轻轻回抽腹腔灌洗液，不同方向冲洗数次，吸出腹腔灌洗液，置于15ML无菌离心管内，每分钟1000转离心5分钟；弃上清，加入2ML红细胞裂解液。
38、，常温静置23分钟，用培养基终止裂解，每分钟1000转离心5分钟；弃上清，用培养基重悬细胞，计数，按需要分别铺入12孔板2X105/孔或6孔板2X106/孔；将细胞置于细胞培养箱中，继续培养23小时，弃掉原有培养基，按需要加入新鲜培养基12孔板1ML或6孔板2ML，置细胞于细胞培养箱内，继续培养24小时，继续后续试验。2祖师麻甲素抑制NFB和MAPK的磷酸化0053NFB和MAPK通路在TLR介导的炎症反应中具有促进促炎因子表达的作用，因此我们检测了祖师麻甲素对NFB和MAPK通路的影响。小鼠腹腔巨噬细胞分别经160祖师麻甲素或二甲基亚砜预处理1小时后，加入LPS100NG/ML刺激，分别在刺。
39、激后的0、15、30和60分钟收集细胞，将细胞蛋白裂解液、苯甲基磺酰氟、磷酸酶抑制剂按10011的体积比例混合，充分混匀，按200L/孔的体积加至6孔板，用移液器轻轻反复吹打细胞，使细胞完全溶解。收集裂解细胞于离心管内，于振荡器震荡片刻，4冰上放置5分钟，反复三次，然后在4，每分钟12000转条件下离心1分钟，将上清轻轻转移至另一离心管内；按照蛋白定量试剂盒说明书，测定标准蛋白浓度，制作出标准曲线，根据标准曲线计算出蛋白浓度，分装50G/管后进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后转膜，封闭，然后用相应的一抗，二抗封闭。结果显示祖师麻甲素下调了小鼠巨噬细胞中MAPK通路，抑制了P38,细胞。
40、外调节蛋白激酶1/2EXTRACELLULARREGULATEDPROTEINKINASES，ERK1/2和CJUN氨基末端激酶CJUNNTERMINALKINASE,JNK的活化。同时，祖师麻甲素也抑制了LPS诱导的NFB的通路，包括P65/NFB的磷酸化，IKK激酶的活化和NFB抑制蛋白IB的降解。00543祖师麻甲素抑制NFB启动子转录活性0055为了检测NFB启动子转录活性，在RAW2647和A549细胞中转入PGL3NFB质粒海肾共转，为内参，对照组细胞中转入PGL3质粒海肾共转。转染PGL3NFB与海肾的比例为51，转染PGL3与海肾的比例也为51，转染试剂和质粒的比例为31用XT。
41、REME转染试剂进行转染。转染24小时后，细胞用五个浓度的祖师麻甲素10M,20M,40M,80M,160M预处理30分钟，对照孔用等体积的二甲基亚砜处理,随后均用LPS100NG/ML刺激6小时，6小时后检测NFB报告基因的活性。除去细胞培养皿中的培养基，用1PBS清洗细胞，加入100L1被动裂解液PASSIVELYSISBUFFER,PLB到相应24孔板中，常温缓慢摇晃15分钟，收集裂解液至15ML离心管中，取20L被动裂解液至96孔板内，加入100L荧光素酶测试试剂II，检测荧光素酶活性，加入100LSTOPG10终止试剂，检测海肾荧光素酶活性。结果显示NFB启动子转录活性受祖师麻甲素抑。
42、制，并且祖师麻甲素浓度越高，抑制的程度越显著图7。00564祖师麻甲素抑制P65/NFB入核0057促炎因子的转录依赖于IB的磷酸化释放P65/NFB入核，所以我们检测了说明书CN104095846A109/11页11祖师麻甲素对P65入核的影响。将处理过的圆玻片用70酒精浸泡，过酒精灯烘烤置于12孔板内，取小鼠腹腔巨噬细胞，以5104/孔的密度铺板，培养；次日，去掉原有培养基，加入祖师麻甲素使终浓度达到160，预处理30分钟，加入LPS100NG/ML分别刺激0，15，30，60分钟，到达相应时间后，用适量预冷过的甲醇固定，20放置8分钟。PBS清洗后用02皂角苷穿透细胞膜。用5的牛血清白蛋。
43、白封闭后用P65兔抗4过夜，然后用德克萨斯红结合的羊抗兔免疫球蛋白G处理。细胞核用DAPI染色，片子最后用抗淬灭封片，用激光共聚焦显微镜观察。结果显示，祖师麻甲素阻止了LPS刺激下RAW2647中P65的入核。以上结果显示，祖师麻甲素通过调节炎症相关通路，从而可能起到对急性肺损伤的保护作用。0058实施例三TNFAIP3是祖师麻甲素抑炎作用的靶蛋白00591祖师麻甲素抑制TRAF6的泛素化0060我们进一步研究了祖师麻甲素是如何调控NFB和MAPK通路的。TAK1属于MAP3激酶家族，是IKK和MAPK的上游蛋白。我们实验显示，祖师麻甲素可以显著抑制TAK1的磷酸化。TRAF6可以与TAK1结。
44、合从而调节TAK1的活性，所以，我们进一步检测了TRAF6是否受祖师麻甲素的调控。TRAF6含有一个环状的结构域，具有泛素连接酶的活性，可以把多聚泛素链连接到TAK1的第63位赖氨酸残基上，从而激活下游IKK的通路。腹腔巨噬细胞分别用160祖师麻甲素及二甲基亚砜预处理1小时，然后加入LPS100NG/ML刺激，分别在刺激后的0、15、30和60分钟收集细胞，提取蛋白，然后取150G总蛋白，加入2GTRAF6抗体，4摇床过夜；用适量15MTRISHCL无十二烷基磺酸钠洗涤蛋白APROTEINATRAF6抗体TRAF6的复合物三次，每次3000转/分钟，3分钟；加入6L5十二烷基磺酸钠上样缓冲液，。
45、100煮5分钟，进行K63位点的泛素化检测。结果显示TRAF6的表达水平不受祖师麻甲素的影响，但是与二甲基亚砜对照组相比，祖师麻甲素处理组在15，30，60分钟K63泛素化程度有显著降低。蛋白的泛素化是一个动态的过程，泛素化的水平由泛素化酶和去泛素化酶的活性共同决定。我们在RAW2647细胞中检测了祖师麻甲素对泛素化修饰酶TNFAIP3的影响。TNFAIP3可以剪切TRAF6的第63位赖氨酸上连接的泛素化链，从而抑制NFB信号通路。在巨噬细胞中，祖师麻甲素可以引起TNFAIP3的MRNA图8和蛋白表达水平的显著增加，并且其表达水平的增加呈现对祖师麻甲素浓度和时间的依赖性。我们的动物实验也得到了。
46、类似的结果。受LPS刺激后，事先用祖师麻甲素处理的小鼠中TNFAIP3的表达水平比未用祖师麻甲素处理的小鼠中TNFAIP3的表达水平显著增高。以上体内体外实验证实了TNFAIP3在祖师麻甲素的抑炎作用中发挥了很大的作用。00612TNFAIP3是祖师麻甲素抑炎过程中必要的参与蛋白0062为了进一步证实TNFAIP3参与祖师麻甲素抑炎通路，我们用小干涉RNA敲减了原代巨噬细胞中的TNFAIP3。针对TNFAIP3的小干涉RNA和对照小干涉RNA从中国上海GIMA公司订购，用XTREME转染试剂转入RAW2647细胞中。转染后24小时，细胞预先接受二甲基亚砜或者祖师麻甲素的处理，然后接受LPS的刺。
47、激。TNFAIP3敲减后，巨噬细胞中IB的磷酸化和降解增强，导致NFB的活性增强。TNFAIP3敲减后，用祖师麻甲素预先处理经LPS刺激的细胞中NFB启动子转录活性与二甲基亚砜处理的对照组细胞中的NFB启动子转录活性相当图9，暗示TNFAIP3在祖师麻甲素下调NFB的过程中发挥重要的作用。在RAW2647中，TNFAIP3敲减后，受祖师麻甲素抑制的IL6，TNF和IL1的表达说明书CN104095846A1110/11页12又重新上调图10和图11。0063实施例四祖师麻甲素预防LPS诱导的急性肺损伤动物模型的肺部炎症和损伤0064为了进一步地研究祖师麻甲素在体内的生物学功能，本发明采用LPS。
48、气管灌注法建立了小鼠急性肺损伤模型ACUTELUNGINJURY,ALI。动物实验前，小鼠用100MG/KG的盐酸氯胺酮和10MG/KG赛拉嗪麻醉。100L浓度为5MG/KG的祖师麻甲素通过小鼠腹腔注射。50L的PBS对照或者LPS1MG/KG通过小鼠气管灌注。将C57BL/6小鼠68周，体重20G左右随机分成药物处理组，对照组及空白组N10，腹腔注射祖师麻甲素5MG/KG。2小时后，将小鼠麻醉固定于小鼠固定器上，气管灌注LPS，刺激6小时后摘肺。小鼠的肺部标本用PBS冲洗后用4的福尔马林浸泡，脱水后用石蜡包埋，用石蜡切片机切成5M的切片，然后用苏木精伊红染色后作免疫病理检测。结果显示，与对照。
49、小鼠相比，事先用祖师麻甲素处理的小鼠在LPS诱导的肺部炎症中表现出较轻的肺泡损伤和炎症。具体地，祖师麻甲素减少了小鼠肺间质水肿和炎症细胞的聚集。除此之外，我们还检测了肺灌洗液中蛋白的含量。气管灌注LPS6小时后，再将小鼠麻醉，打开小鼠腹腔，剪断腹主动脉，小心打开小鼠胸腔，剪去肺部周围肋骨，抽取PBS注入右心室，剥离气管周围组织，将手术线从气管底部穿过，在气管上端剪一小口靠近甲状腺的部分，插入灌洗针，用手术线将其固定，抽1MLPBS注入气管，待肺鼓起，再将PBS回抽，重复此操作三次；将回抽的灌洗液收集于15ML离心管中，1000转/分钟，离心5分钟，上清分装于15ML离心管中，酶联免疫吸附试验检测灌洗液中IL6、IL1、及TNF的表达，结果显示祖师麻甲素抑制了肺组织中促炎因子IL6,TNF和IL1蛋白水平的表达图12。本研究用相同的方法收集LPS处理6小时的肺灌洗液，并用细胞计数仪进行细胞计数。结果显示，与对照组相比，祖师。