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本发明涉及一种喹啉降解菌及其培养方法和应用。所述菌株为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT-ql-116 CGMCC No.2790，可以有效降解高浓度喹啉化合物，最高可利用浓度达到850mg/L，此外还可以利用苯、甲苯、二甲苯、苯酚等芳香族化合物。该菌株可以在焦化废水中很好的生长，并且可以高效降解其中的喹啉，借此可开发出相应的环保生物制剂，显示出很好的应用前景。

1.  恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT-ql-116 CGMCC No.2790。

2.  一种恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT-ql-116 CGMCC No.2790的培养方法，将焦化废水作为其培养基，在有氧条件下进行培养。

3.  如权利要求2所述的培养方法，其特征在于：所述焦化废水的pH为7.0—7.5，COD为1500～2000mg/L，喹啉含量70～110mg/L。

4.  如权利要求2所述的培养方法，其特征在于：培养温度为室温，培养时间为3～5天。

5.  恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT-ql-116 CGMCC No.2790在治理环境污染中的应用。

6.  如权利要求5所述的应用，其特征在于：利用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT-ql-116 CGMCC No.2790降解环境中的有机污染物。

7.  如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述有机污染物包括喹啉。

8.  恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT-ql-116 CGMCC No.2790在制备生物制剂中的应用。

一株喹啉降解菌及其培养方法和应用
技术领域
本发明涉及假单胞菌属的新菌株，该菌株的培养方法及该菌株在有机污染物降解中的应用。
背景技术
喹啉是含氮杂环化合物的典型代表，用途极其广泛，是多种医药、农产品、染料等生产中的重要原料和溶剂。环境中的喹啉主要来自煤气、化石燃料加工、煤焦油残余物和木材保存设施。此外，喹啉及其衍生物还是焦化废水、石油废水、制药废水等多种工业废水中的难降解有机污染物成分。有学者分别对2种焦化废水的有机物组成进行了分析，指出喹啉类化合物的含量仅次于苯酚类化合物而位居第二。喹啉及其衍生物可致癌、致畸、致突变性，且难于生物降解。由于喹啉含有1个电负性很强的氮原子使得其水溶性增强，因此这类化合物更易在环境中扩散和持久存在。已有调查发现在木馏油污染场所附近的地下水和土壤中喹啉及其羟基喹啉的浓度高达数个mg/L。除此之外，喹啉及其衍生物还存在于城市空气、烟草烟雾、海水和鱼的组织中，因此寻找有效去除喹啉的方法具有十分重要的意义。
污染物的去除方法很多，大致分为物理法、化学法和生物法。物理法和化学法虽然去除效率高，但是成本高，容易产生二次污染。生物治理具有成本低、二次污染轻、环境相容性好等优势，现已成为污染治理技术中的首选方案之一。决定生化处理工艺成功、有效、适用的因素，除了工艺条件和操作管理外，用于污染物降解、转化等过程的功能微生物群体的作用也是十分重要的。因此，对特种微生物的分离、筛选，对难降解有机物的降解特性和机理的研究已成为环境科学、生命科学中的研究热点。
关于喹啉的生物降解的研究自从20世纪90年代才开始有了详细的报道，包括降解菌株的分离、代谢途径和代谢基因的鉴定等等，但是，由于喹啉本身属于难降解有机杂环化合物，自然界中很难找到对其可以有效降解的微生物，故至今各国仍将喹啉作为难降解有机化合物加以重点研究和处理，希望找到一些有效的微生物对其加以控制，从而保证各种排放的工业废水中喹啉含量不至于对环境造成污染。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一株可有效降解有机污染物喹啉并用于环境污染治理的新菌株。
本发明所提供的用于环境污染治理的新菌株是恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT-q1-116，已于2008年12月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC，地址在中科院微生物所)，保藏编号为CGMCC No.2790。
恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT-q1-116 CGMCC No.2790可在普通细菌LB培养基及加喹啉(100mg/L)的无机盐筛选培养基上生长，菌落白色、呈圆形，光滑，湿润，有金属光泽。光学显微镜下观察其为G^-杆菌，极生多鞭毛。专性好氧，呼吸代谢；分解葡萄糖、木糖，氧化酶阳性。所述无机盐筛选培养基可为MM2培养基：Na₂HPO₄ 2g/L，KH₂PO₄1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L，微量元素液5.0ml/L；其中每1000ml微量元素液包括CaCl₂·2H₂O 0.0004g，FeSO₄·7H₂O 0.04g，MnSO₄·4H₂O 0.04g，ZnSO₄·7H₂O 0.02g，CuSO₄·5H₂O 0.005g，CoCl₂·6H₂O 0.004g，NaCl 1.0g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.005g。
恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT-q1-116 CGMCC No.2790在含有100mg/L喹啉的LB培养基中25℃，200rpm，培养18h～24h，活细胞数可达10⁹～10¹⁰cfu/ml；在含有不同浓度喹啉的筛选培养基中25℃，200rpm，培养18h～166h(随着喹啉浓度的提高，培养时间延长)，活细胞数可达10⁵～10⁷cfu/ml，喹啉几乎被降解完全。
本发明的第二个目的是提供恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT-q1-116 CGMCCNo.2790的一种特别培养方法，该培养方法将焦化废水作为其唯一碳源、能源和氮源。
本发明所提供的培养恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT-q1-116 CGMCC No.2790的方法，是将焦化废水作为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT-q1-116 CGMCC No.2790的培养基，在有氧条件下进行培养。
所述焦化废水一般pH为7.0—7.5，COD为1500～2000mg/L，喹啉含量70～110mg/L。
所述培养方法中的培养温度可为室温(25℃左右)。
所述培养方法中的培养时间可为3～5天。
本发明的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT-q1-116 CGMCC No.2790不仅可以有效降解高浓度喹啉(最高达到850mg/L)，这比文献已报道的任何一株喹啉降解菌的最大降解浓度(500mg/L)都高很多，而且还可降解苯、甲苯、二甲苯、苯酚等芳香族化合物，实验表明，该菌株在含有500mg/L以上喹啉的无机盐液体培养基中随着培养时间的延长能使培养液相继产生粉色、茶色或浅褐色，表明在降解的各个阶段有不同中间产物的生成。菌株对喹啉还具有很好的降解遗传稳定性，在不含喹啉的LB培养基中传代5次，将传代最后一次的菌接种到含500mg/L喹啉的MM2无机盐培养基中，在44h时即可把喹啉彻底降解。实验表明，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT-q1-116 CGMCC No.2790还可利用焦化废水作为其唯一碳源、能源、氮源进行生长。因此，本发明提供恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT-q1-116 CGMCC No.2790具有用于含有高浓度喹啉的污染环境的生物治理或生物修复的巨大潜力。
基于上述特点，本发明的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT-q1-116 CGMCCNo.2790可用于环境中有机污染物的治理，特别是能有效降解喹啉类化合物，并可借此开发出相应的环保生物制剂，具有较高的研究和应用价值。
生物材料的保藏
本发明的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT-q1-116于2008年12月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC，地址在北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.2790。
附图说明
图1恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT-q1-116 CGMCC No.2790在MM2降解培养基中的喹啉降解曲线。
图2恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT-q1-116 CGMCC No.2790在焦化废水中的生长曲线及对喹啉的降解曲线。
具体实施方式
通过借助以下实施例将更详细描述本发明，但应该明白，以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施例的限制。
下述实验方法如无特别说明均为常规方法，所有培养基中的溶剂均为水。
MM2培养基：Na₂HPO₄ 2g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L，微量元素液5.0ml/L；其中每1000ml微量元素液包括CaCl₂·2H₂O 0.0004g，FeSO₄·7H₂O 0.04g，MnSO₄·4H₂O 0.04g，ZnSO₄·7H₂O 0.02g，CuSO₄·5H₂O 0.005g，CoCl₂·6H₂O 0.004g，NaCl 1.0g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.005g。
喹啉的检测方法采用高效液相色谱(HPLC)法：
样品处理：在好氧降解过程中，每隔一定时间取样，水样在8000rpm下离心10min，上清经0.45μm滤膜过滤后用于喹啉的HPLC定量分析。
色谱仪为岛津LC-20A，色谱柱为大连依利特C18反向柱，250mm×4.6mm，粒度为5μm；流动相为60％(v/v)甲醇水溶液，流动相流速为1.0ml/min。测定波长230nm，保留时间6min左右。
实施例1、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT-q1-116 CGMCC No.2790的分离、纯化和鉴定
恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT-q1-116 CGMCC No.2790分离自北京市肖家河污水处理厂活性污泥中，具体富集、分离、纯化过程如下：
将采集的样品接种到含有喹啉的MM2分离培养基中，25℃，180rpm下振荡，喹啉浓度从初始的30mg/L逐渐增加至100mg/L，此期间每周增加一次喹啉的添加浓度。然后从驯化的富集液中取1ml培养液加入到含有300mg/L喹啉的MM2液体培养基中(装液量为20ml/100ml三角瓶)，置25℃摇床中200rpm培养。7天后发现培养液变成粉红色，表明喹啉在污泥的作用下被降解，生成有颜色的中间产物，此时对培养液中的菌进行涂板分离。将培养液分别稀释10⁵和10⁴倍，吸取100μl涂布到含有100mg/L喹啉的MM2无机盐培养基平板上，置25℃恒温培养箱中培养，直至长出明显可见的菌落，挑取单菌落划线到新的MM2无机盐培养基(含100mg/L喹啉)平板上进行纯化，最后获得生长良好的单菌落。对获得的菌株进行形态观察、生理生化鉴定和16SrRNA基因测序鉴定。结果表明该菌株可在普通细菌LB培养基及无机盐加喹啉(100mg/L)筛选培养基上生长，菌落白色、呈圆形，光滑，湿润，有金属光泽。光学显微镜下观察其为G^-杆菌，极生多鞭毛。专性好氧，呼吸代谢；分解葡萄糖、木糖，氧化酶阳性。最后经16SrRNA基因的部分序列的比对分析，将该菌株鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。将该菌株命名为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT-q1-116。该菌株已于2008年12月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2790。
实施例2、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT-q1-116CGMCC No.2790对污染物的降解谱
MM2作为基本培养基，以表1所示的有机污染物作为唯一添加的能源、碳源或氮源，采用固体培养的方式，在25℃、静置培养一周，观察菌落形成的情况。对苯、苯酚、甲苯、二甲苯、吡啶、氰化物、喹啉、咪唑等化合物的测试结果如表1所示。结果表明，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT-q1-11 6CGMCC No.2790的降解谱还是比较宽的，可以利用待试的所有芳香族化合物，对于含氮杂环化合物来说尤其对喹啉具有较高的降解活性。
表1 KT-q1-116对有机污染物的降解利用情况