姬松茸的发酵工艺及其多糖肽的生产方法 【技术领域】
本发明属生物工程技术领域。具体涉及一种姬松茸的发酵工艺及其多糖肽的生产方法。背景技术
姬松茸又称巴西蘑菇、小松菇，是一种珍锋稀食用真菌。其子实体内含有多糖和甾醇类等多种活性成份以及各种微量元素、人体必需的多种氨基酸，对肿瘤、痔疮、神经痛具疗效，还具有降血脂和降胆固醇的作用，是一种很有开发前途的药用真菌。在美国、日本多项研究成果申报了专利。
姬松茸的主要活性成份是姬松茸多糖，多糖组份中以葡萄糖为主，以具有β-(1→6)侧链的β-(1→3)葡聚糖为主要结构。研究结果表明，姬松茸多糖主要通过激活机体免疫系统，增强巨噬细胞的吞噬作用，刺激干扰素的形成，激活机体内自然杀伤细胞，促进免疫球蛋白、白细胞介素的生成，提高淋巴细胞的转化率等而发挥其抗肿瘤作用，在基因水平上有较强的抗化学诱变作用，可用于慢性乙型肝炎及恶性肿瘤放化疗后乏力，白细胞减少，免疫功能降低的综合治疗。发明内容
本发明地目的在于改进生产工艺，提高菌丝体的得率和多糖肽的产量。
本发明提供了一种姬松茸的发酵工艺及其多糖肽的生产方法。该方法包括下列步骤：(1)姬松茸的育种与特征
用组织分离法获得姬松茸纯菌株AB103，将其接种在PDA或麦芽汁固定斜面培养基上，于25～28℃恒温培养7～10天后，置于4℃左右的冰箱中保存备用。采用紫外诱变法对菌丝细胞进行诱变，紫外照射距离为20～30cm，照射时间为5～15秒。初筛诱变株在固体培养基上的菌丝体生长能力，复筛诱变株在液体培养基中菌丝体生长量和多糖肽产量，获得优质菌株AB103-51。该菌株分类命名为巴西蘑菇(姬松茸)Agaricus blazei，该菌株已于2002年7月16日保存于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心的编号为CGMCCNo.07722001325B。并于2002年7月16日检测结果为存活。
固体培养用40～50％的稻草(或木屑、棉子壳)、1％的蔗糖或葡萄糖、10～20的麸皮或米糠、1％的石膏或碳酸钙，加水拌匀，含水量60％，PH自然，瓶装，在1.5kg/m2的压力下灭菌1小时，冷却后，在无菌操作下摇瓶种子接种于固体培养基内，培养温度22～26℃，20～30天菌丝体布满全瓶。原基萌发后，降低栽培温度22～25℃，保持适当湿度、光照和通风，30～40天后，子实体成熟；(2)菌株的发酵工艺流程
本发明采用通气发酵法生产姬松茸菌丝体，发酵培养基成本低廉，发酵周期短。发酵工艺流程如下：
斜面菌种或茄瓶菌种→摇瓶种子→50-100L3种子罐(一级)→500-1000L3种子罐(二级)→5000-10吨发酵罐。
摇瓶种子的装量75～150ml/250ml或150～150ml/250ml培养基，往复式摇床振荡速度80～150次/分，或旋转式摇床振荡速度100～200转/分，培养温度24～28℃。培养时间2～3天。种子罐和发酵罐投料量50～70％，接种量8～10％，搅拌速度100～200rpm，通气量1∶0.5～1∶1v/vmin，发酵培养时间4～7天。随着发酵培养时间延长，培养基由混浊逐渐变清。发酵液中还原糖、氨态氮、PH都逐渐降低，菌丝体生物量不断增加，至第5～6天时多糖肽产量达最高时终止发酵。(3)姬松茸多糖肽的提取
本发明所述姬松茸AB103-51的多糖肽提取工艺是：姬松茸发酵液用沙芯漏斗抽滤，分离发酵液和菌丝体，工厂可用板框机分离发酵液与菌丝体。将湿菌丝体加10～20倍水浸泡过夜，用90～100℃水浴回流提取2～5小时，过滤，将滤液浓缩后加2～5％倍的95％乙醇0～4℃沉淀8～10小时，干燥得姬松茸多糖肽。
本发明所述经组织分离法得到的AB103菌种，子实体肉质，多数单个，个别丛生。菌盖半球形至平展，直径3～10cm，浅褐色至棕褐色，菌盖表面有纤维状鳞片，边缘有菌幕碎片。菌柄近圆柱形生于菌盖中央，初期为实心，中后期疏松至空心。菌环易脱落。担孢子浅红色至棕褐色，光滑，短椭圆形。菌丝分枝，有横隔，无锁状联合。物理诱变所得的菌株AB103-51在固体木屑麸皮培养基上培养，其子实体形态与天然实体相同。
本发明所述姬松茸菌株AB103-51的培养性状是：①接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，温度24～28℃，生长旺盛，菌丝体纯白色、绒状，接种十天菌落直径达15-20mm。②接种在木屑培养基上，其培养特征如上所述。③在摇瓶振荡培养时，用往复式摇床，振荡速度80～150次/分，或旋转式摇床，振荡速度100～200转/分，形成菌株，当菌大量形成时，发酵液由混浊变清，粘度逐渐增加，散发浓郁果香味。④在发酵培养基中，培养5～6天时，菌丝体生长和多糖肽产量达到最高，可终止发酵。
姬松茸菌丝体多糖肽的特征是：①多糖肽，多糖含量为20～40％，蛋白质含量为15～30％。②灰色至灰褐色粉末。③主要成份都是β-葡聚糖。④红外吸光谱峰位是883～892cm-1。
上述工艺过程使用的培养基成分和各种溶剂均无毒性，发酵生产的姬松茸菌丝体和姬松茸多糖肽，经国家规定的急性毒性试验和慢性毒性试验证明，本发明的产中品均无毒性。长期使用本产品不仅不会产生任何毒副作用，反而能增加机体的免疫功能。
从上述发明方法所获得的姬松茸菌丝体和多糖肽能明显促进腹腔巨噬细胞的吞噬功能，能抵抗由环磷酰胺引起的白血球下降和食欲减退；能提高荷瘤机体的免疫球蛋白、补体和血清溶血素的含量；能抑制肿瘤细胞的生长。可用于临床抗肿瘤，减轻肿瘤病人化疗和放疗所引起的副作用，如恶心呕吐、食欲不振、白细胞降低等症状，提高生存质量。并可作为亚健康人士提高机体免疫功能的保健品。
本方法发酵周期短，生产成本低，产品菌丝体和多糖肽安全无毒。从姬松茸菌丝体中提取的多糖肽具有调节机体免疫功能，抑制肿瘤细胞生长，对化疗和放疗的肿瘤病人的恶心呕吐、食欲不振、白细胞降低等症状有明显改善作用，是一种新型的生物免疫调节剂。具体实施方式实施例1
姬松茸子实体经组织分离，获得纯种，将纯种进行斜面低温保藏或液氮保存，接种在PDA斜面培养基上，24～26℃培养7～10天。
PDA配方如下：
马铃薯 200g
葡萄糖 20g
琼脂 20g
水 1000ml
铃薯去皮，切块，加水煮沸20～30分钟后，4层纱布过滤，取汁。
将斜面菌种接种在装有100ml液体培养基的500ml三角瓶中，振荡培养。采用往复式摇床(振荡速度80～150次/分)或旋转式摇床(振荡速度100～200转/分)，振荡培养度24～28℃。培养第二天出现小菌球，镜检菌丝生长繁茂、多分枝、具横隔、五色、透明、具锁状联合，发酵至第5～7天发酵液粘稠，此时菌丝体生长量最大，多糖肽产量最高，可终止发酵。
发酵培养基配方如下：
淀粉 3％
麸皮 0.3％
蔗糖 1％
酵母粉 0.2％
硫酸镁 0.05％
磷酸二氢钾 0.1％
发酵液经离心后，得姬松茸菌丝体，加水10倍后，用细胞捣碎机打碎细胞，然后加90℃热水回流提取3～5小时，将提取液再经真空薄膜浓缩，取1份浓缩加3份95％乙醇，在0～4℃条件下醇析8小时。经真空干燥或冷冻干燥后即可获得褐色粉末状的姬松茸多糖肽。取多糖肽加水(1∶100重量比)溶解后，用葡萄糖凝胶(Sdphadex-G75)进行层析分离，用紫外吸收法和酚硫酸测定层析液的多糖和多肽，样品在收集试管中出现多糖和多肽，证明是姬松茸多糖肽。实施例2
姬松茸子实体经组织分离，获得纯种，将纯种进行斜面低温保藏或液氮保存，接种在综合PDA斜面培养基上，24～26℃培养7～10天。
综合PDA配方如下：
马铃薯 200g
蔗糖 20g
麸皮 100g
KH2PO4 3g
MgSO47H2O 1.5g
琼脂 20g
水 1000ml
马铃薯去皮，切块，加水煮沸20～30分钟后，4层纱布过滤，取汁。麸皮加水煮沸20～30分钟后，4层纱布过滤，取汁。
将斜面菌种接种在装有100ml种子培养基的500ml三角瓶中，振荡培养。采用复式摇床(振荡速度80～150次/分)或旋转式摇床(振荡速度100～200转/分)，振荡培养温度24～28℃。二天后以压差法移种入50～100L种子罐内，罐装量70％(v/v)，接种量10％(v/v)，通气培养2天后移入500～1000L发酵罐。发酵罐装量70％(v/v)，接种量10％(v/v)，罐温24～30℃，通气量1∶1(v/v)机械搅拌速度100～200rpm。发酵至第5～7天发酵液粘稠，此时菌丝体生长量最大，多糖肽产量最高，可终止发酵。
种子培养基配方如下：
玉米粉 3％
淀粉 2％
磷酸二氢钾 0.1％
硫酸镁 0.05％
发酵培养基配方如下：
淀粉 3％
麸皮 0.3％
蔗糖 1％
酵母粉 0.2％
硫酸镁 0.05％
磷酸二氢钾 0.1％
发酵液经板框压滤后，得姬松茸菌丝体，加水10倍后，用细胞捣碎机打碎细胞，然后加95℃热水回流提取4小时，将提取液真空薄膜浓缩，加水3倍体积的95％乙醇，低温醇析。醇析物用无水丙酮和无水乙醚分别洗涤3次，于50℃下烘干，获得褐色粉末状的姬松茸多糖肽。取多糖肽加水(1∶100重量比)溶解后，用两块硅胶薄析进行TLC层析，分别用茚三酮和茴香醛显色，两块板显示的Rf值一致，证明所提取的样品为姬松茸多糖肽。