中乌头碱酯化衍生物及其盐的合成与应用.pdf

本发明公开了一种乌头属植物中天然二萜生物碱中乌头碱的酯化衍生物及其盐(化合物结构如图)的合成方法和应用，属于杀虫药物合成技术领域。该化合物酯化衍生物及其盐的制备方法是将中乌头碱溶解于干燥吡啶，加入酯化试剂进行化学反应后，碱化处理、氯仿萃取、旋蒸浓缩得到中乌头碱的酯化衍生物，再通过直接滴加酸液的方法得到其化合物的盐。此合成方法简便、成本较低、转化率高。合成得到的化合物具有较好的杀虫活性，可用于开发杀虫农药。式中R1为乙酰基、丙酰基、苯甲酰基、正己酰基、甲烷磺酰基、对氯苯甲酰基等烷酰基、脂肪酰基、磺酰基或芳香酰基；R2为氢原子或乙酰基、丙酰基、苯甲酰基、正己酰基、甲烷磺酰基、对氯苯甲酰基等烷酰基、脂肪酰基、磺酰基或芳香酰基；R3为氢原子或乙酰基、丙酰基、苯甲酰基、正己酰基、甲烷磺酰基、对氯苯甲酰基等烷酰基、脂肪酰基、磺酰基或芳香酰基。

1、  中乌头碱酯化衍生物及其盐，为具有如下通式的化合物及其盐。

式中R₁为乙酰基、丙酰基、苯甲酰基、正己酰基、甲烷磺酰基、对氯苯甲酰基等烷酰基、脂肪酰基、磺酰基或芳香酰基；R₂为氢原子或乙酰基、丙酰基、苯甲酰基、正己酰基、甲烷磺酰基、对氯苯甲酰基等烷酰基、脂肪酰基、磺酰基或芳香酰基；R₃为氢原子或乙酰基、丙酰基、苯甲酰基、正己酰基、甲烷磺酰基、对氯苯甲酰基等烷酰基、脂肪酰基、磺酰基或芳香酰基。

2、  如权利要求1所述的中乌头碱酯化衍生物的合成方法，其特征在于将中乌头碱与摩尔比1：1～1：5的酯化试剂在室温或冰浴的吡啶中反应6～30小时合成乌头碱型生物碱的酯化衍生物。或者直接用酯化试剂做溶剂，添加对甲苯磺酸作为催化剂进行酯化修饰合成反应。用饱和碳酸钠水溶液碱化反应液至pH值为8～10，后将生物碱转移到氯仿中，氯仿以减压蒸馏的方式回收利用。得到单一生物碱酯化衍生物或生物碱混合物。得到的混合物再通过重结晶或硅胶柱层析等方法进行提纯。

3、  如权利要求2所述的中乌头碱的酯化衍生物合成方法，其特征在于所述酯化试剂为乙酸酐、丙酸酐、邻氯苯甲酰氯、对氯苯甲酰氯、苯甲酰氯、正己酰氯等酸酐或酰氯。以酯化试剂做为溶剂的仅适用于以酸酐作为酯化试剂，并同时酯化修饰2个以上羟基或对同一生物碱进行两种以上酯化修饰的情况。

4、  如权利要求1所述的中乌头碱的酯化衍生物的盐的合成方法，其特征在于将如权利2或3所述获得的中乌头碱酯化衍生物溶于溶剂中，滴加无机酸或有机酸可直接获得其化合物的盐。

5、  如权利要求书1所述的中乌头碱酯化修饰衍生物及其盐的应用，其特征是作为杀虫药物应用。

中乌头碱酯化衍生物及其盐的合成与应用
(一)技术领域
本发明涉及到中乌头碱酯化衍生物及其盐的合成方法及杀虫应用，属于杀虫药物合成技术领域。
(二)技术背景
中乌头碱是毛茛科乌头属植物乌头子根(中药附子)中提取分离得到的一种C-19型二萜生物碱，其结构式如图(I)所示。中药附子已有二千多年的药用历史，其功效主要有镇痛、强心、回阳救逆等，同时发现其具有良好的杀虫活性。随着绿色环保的植物源杀虫剂研究的兴起，乌头属类植物中生物碱的杀虫活性被越来越多的人发现和重视。

研究发现，附子及其二萜生物碱对多种农作物害虫具有较好的杀虫效果。丁伟等发现乌头的乙醇、乙醚提取物对粘虫具有一定的防效。杜晓英等发现乌头甲醇提取物对赤拟谷盗、家蝇具有一定的毒杀和趋避活性。余大刚还将乌头液作为配方之一申请了复配中草药农药的专利。高占林发现北乌头(Aconitum kusnezoffii)的丙酮浸液对禾谷缢管蚜、绣线菊蚜和菜缢管蚜具有较高的生物活性，对吡虫啉和氧化乐果均表现明显增效。陈立等研究发现，瓜叶乌头对小菜蛾和斜蚊夜蛾有明显杀虫活性。王海丽等发现露蕊乌头甲醇提取物对纹夜蛾的拒食活性约为72％。
二萜生物碱为附子的杀虫活性部位。马建列等发现附子浸渍液(主要成分为二萜生物碱)对桃蚜、菜青虫、卫矛尺蠖等害虫具有较好的防治效果。刘长仲等发现乌头生物碱对桃蚜具有较好的毒杀作用和防治效果。郝俊良等通过田间药效实验，结果显示0.15％乌头总碱作为杀虫剂对蚜虫和菜青虫等均有较高的杀伤力。蒋宏华等对0.15％的乌头碱乳油800倍液(浓度为1.9ppm)的田间药效试验表明，它与10％氯氰菊酪乳油2000倍液(浓度为50ppm)对菜青虫的防效相当。Jennings KR等发现甲基牛扁亭碱(Methyllycaconitine)具有较强的杀虫活性，它可与昆虫的胆碱受体高效结合。Ulubelen A等发现二萜生物碱对昆虫具有较强的驱避作用。西班牙的Reina M和Gonza′lez-Coloma A等在天然二萜生物碱的杀虫活性方面进行了较为详细的研究。他们将从乌头属(Aconitum)、翠雀属(Delphinium)和飞燕草属(Consolida)植物中分离得到的23种二萜生物碱(C₂₀)和44种降二萜生物碱(C₁₉)，对灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis)和马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)进行拒食和毒杀活性研究，结果表明不同结构的二萜生物碱对不同的昆虫表现出不同的杀虫活性，C₁₉降二萜生物碱比C₂₀二萜生物碱具有更强的活性，其中对马铃薯甲虫拒食活性最强的是diacetylcardiopetaline、18-hydroxy-14-O-methylgadesine和14-O-acetyldelectinine，对灰翅夜蛾拒食活性最强的是19-oxodihydroatisine(EC₅₀<0.2μg/cm²)，对马铃薯甲虫的毒杀活性最强的是乌头碱(aconitine)。
近年来，国内外对于二萜生物碱的杀虫活性研究多集中在对生物总碱粗体物和提取分离得到的天然二萜生物碱的杀虫活性的研究。对二萜生物碱进行结构修饰(或结构改造)研究虽已开展多年，但都主要针对其医药用途的活性为研究点，以改变其杀虫活性为目的的研究并未见报道。如四川大学华西药学院王锋鹏课题组对二萜生物碱的发现、结构改造及其抗肿瘤和镇痛等药理活性进行了较为深入的研究。其中，王建莉对高乌甲素和草乌甲素的N原子、C₈位和C₁₄位进行了结构修饰，探讨了C₁₉二萜生物碱结构修饰的化学反应方法和规律。西北师范大学高黎明等运用氧化剂KMnO₄对天然二萜生物碱talatisamine(它拉乌头胺)的结构进行改造，得到了内酰胺型、亚胺型和酰化型等4个非天然产物。中国药科大学药物化学研究室王如斌等对关付甲素酰化修饰后发现其乙酰化、丙酰化及邻氯苯甲酰化的关付甲素衍生物对乌头碱诱发的大鼠心律失常有明显的保护作用。
中乌头碱是乌头型C₁₉二萜生物碱，通过杀虫活性测试发现其对稻飞虱和蚜虫有杀虫活性。其结构、杀虫活性和毒性之间的关系密切，取代基种类和数目不同、取代基位置的差异等均可引起它们的杀虫活性和毒性变化。根据其C₃位、C₁₃位、C₁₅位有羟基的特点，可对其进行酯化修饰，改变其杀虫活性。
国内外的研究结果表明，附子及其二萜生物碱对多种农作物害虫具有较好的杀虫效果，但中乌头碱结构修饰及其修饰产物的杀虫活性研究未见报道。因此，附子中的乌头型二萜生物碱是农药先导化合物结构创新和优化研究的一类很有希望、有苗头的天然植物活性成分，可作为新型高效低毒的生物杀虫农药进行研发。
(三)发明内容：
1、发明的目的：提供一种具有杀虫活性的中乌头碱酯化衍生物的合成方法。
2、技术方案：实现本发明采用的手段是将中乌头碱溶于吡啶，加入酯化试剂，在冰浴或室温条件下反应，即可合成酯化衍生物；或者直接以酯化试剂作为溶剂进行反应，合成酯化衍生物。
本发明将中乌头碱溶于吡啶，与摩尔量1～5倍的酯化试剂反应6～30小时即可生成酯化衍生物。使用的酯化试剂有乙酸酐、丙酸酐、甲烷磺酰氯、邻氯苯甲酰氯、对氯苯甲酰氯、苯甲酰氯、正己酰氯等酸酐或酰氯。碱化反应体系pH值至8～10。采用的萃取方法，将生物碱全部转移到小极性溶剂层中。溶剂通过减压蒸馏的方式用旋转蒸发仪进行回收。得到的产品可能是单一化合物，只需要进行简单的纯化处理，如重结晶；产品也可能是多种酯化的生物碱混合物，应根据极性的差异对其进行柱层析分离。所有的生物碱利用红外色谱、电子轰击电离质谱、核磁共振等波谱联合进行表征和分析。
化合物溶于溶剂中，滴加无机酸或有机酸可直接获得其盐。
(四)具体实施：
实施例1：
在常温下，按摩尔比1：3称取中乌头碱：丙酸酐。先将中乌头碱溶于0.5ml干燥吡啶中，再加入丙酸酐，磁力搅拌10h后，在冰浴条件下缓慢滴加饱和碳酸钠溶液调反应液pH值到9.0，5mL氯仿萃取三次，合并氯仿层；萃取得到的氯仿层用水洗三次，饱和氯化钠水溶液洗三次后用无水硫酸钠干燥12h后，减压蒸干氯仿。得到较纯的丙酰化中乌头碱。
采用浸虫法测试中乌头碱衍生物对小菜蛾的杀虫活性：自室外采集的小菜蛾，挑选体型较为一致的3龄幼虫，放入培养皿内，每皿10头。将供试化合物用少量丙酮、甲醇混合液(1:1)溶解后，用含0.1％土温-80的水溶液分别配成100g/L和1000g/L的供试液，将挑选出的试虫倒入漏勺内，浸入药液5秒钟后取出，倒在滤纸上爬行数秒钟，以吸取多余的药液，放入培养皿内，饲以新鲜小白菜叶。处理后的试虫置于26℃恒温下，24h后观察，以解剖针轻触虫体，不动为死亡。
丙酰化修饰的中乌头碱衍生物在浸虫法实验中100mg/L时3龄小菜蛾的死亡率为30％，1000mg/mL时3龄小菜蛾的死亡率为70％；500mg/L时蚜虫的死亡率为20％。
产物测得溶点为：118～120℃；
产物结构用质谱检测证实，EI-MS m/z：688(M⁺)。
核磁检测，¹H-NMR(CDCl₃，600MHz)δ(ppm)：8.03(2H，d，J＝5.76Hz，Ar-H)，7.57(1H，dd，J₁＝7.14Hz，J₂＝14.64Hz，Ar-H)，7.45(2H，dd，J₁＝7.92Hz，J₂＝15.6Hz，Ar-H)，4.90(2H，ddd，J₁＝5.40，J₂＝13.14Hz，J₃＝26.82Hz H-14)，4.47(2H，dd，J₁＝2.88Hz，J₂＝5.22Hz，15-Hβ)，4.34(1H，d，J＝2.88Hz，OH-15α)，4.08(1H，d，J＝7.14Hz，H-6)，3.88(1H，s，OH-13β)，3.79(1H，d，J＝8.88Hz，H-3)，3.27(3H，s，OCH₃)，3.20(3H，s，OCH₃)，3.19(3H，s，OCH₃)，3.13(1H，dd，J₁＝6.90Hz，J₂＝10.80Hz，H-1)，3.09(1H，s，H-17)，2.36(3H，s，N-CH₃)，1.40(3H，s，OAc)，1.16(3H，t，J＝7.50Hz，O＝CCH₂CH₃).
实施例2：
在常温下称取中乌头碱101.8mg，溶于吡啶5ml中，冰浴下加入对氯苯甲酰氯0.5ml，反应14h，冰浴条件下用饱和碳酸钠碱化处理反应液直到反应液pH值为9.6，氯仿3×6mL萃取，合并氯仿层，并用分别用水和饱和氯化钠水洗氯仿层，无水硫酸钠干燥12h后，减压蒸馏回收氯仿。得到粗品126.8mg，硅胶5g柱层析V(氯仿)：V(甲醇)＝20：1，洗脱剂中添加1％三乙胺得到产品68.1mg，收率46.5％白色粉末装的丙酰化3位羟基后再乙酰化13、15位羟基的中乌头碱酯化修饰衍生物。
用分析天平(0.0001g)称取一定质量的原药，加含有0.1％吐温一80的溶剂(DMF)，配制成5％制剂。称取一定质量的制剂，加蒸馏水(点滴法稀释用丙酮)稀释配制成测定所需浓度的药液。根据创制农药生物活性评价SOP(杀虫剂卷)，普筛浓度选择500mg/L。
采用培养皿苗虫定量喷雾法测定化合物对水稻褐飞虱筛选：将水稻苗用白石英沙固定于培养皿内，接用CO₂麻醉3龄中期若虫，置于POTTER喷雾塔下喷雾。喷雾后用透明塑料杯罩住，标记后放于观察室内。72h后检查结果。对氯苯甲酰化修饰的中乌头碱衍生物在500mg/L时3龄稻飞虱有较好毒杀活性。
采用浸渍法测定化合物对苜蓿蚜的杀虫活性：将蚕豆叶片剪去两端，背面朝上放在小块棉花上，置于塑料培养皿内，加少量水，接苜蓿蚜成蚜以产若蚜。24h后去除成蚜，继续培养2d后将叶片在药液中充分浸润5s后，重新置于棉花上，自然凉干。24h后检查结果。对氯苯甲酰化修饰的中乌头碱衍生物在培养皿苗虫定量喷雾法实验中500mg/L时3龄的苜蓿蚜死亡率为30％。
产物测得溶点为：93-96℃；
产物结构用质谱检测证实，EI-MS m/z：908M⁺)；
核磁检测，¹H-NMR(CDCl₃，600MHz)δ(ppm)：8.09(2H，d，J＝7.38Hz)，7.98(2H，d，J＝8.64Hz，Ar-H)，7.93(2H，d，J＝8.64Hz，Ar-H)，7.59(1H，dd，J₁＝7.80Hz，J₂＝14.82Hz，Ar-H)，7.47(2H，dd，J₁＝7.80Hz，J₂＝15.42Hz，Ar-H)，7.43(2H，d，J＝8.64Hz，Ar-H)，7.34(4H，m，Ar-H)，4.58(1H，dd，J₁＝2.76Hz，J₂＝5.16Hz，15-Hβ)，4.34(1H，d，J＝2.82Hz，OH-15α)，4.14(1H，d，J＝6.84Hz，H-6)，3.87(1H，d，J＝9.00Hz，H-3)，3.52(3H，s，OCH₃)，3.28(3H，s，OCH₃)，3.25(1H，s)，3.23(3H，s，OCH₃)，3.12(3H，s，OCH₃)，3.02(1H，d，J＝8.82Hz)，2.95(2H，s)，2.43(3H，sN-CH3)，2.38(1H，d，J＝6.78Hz)，1.45(3H，s，OAc).
实施例3：
在常温下，称取中乌头碱92.4mg，溶于干燥吡啶中，冰浴条件下滴加正己酰氯0.3mL反应15h，冰浴条件下用饱和碳酸钠碱化处理反应液直到反应液pH值为9.0，氯仿3×6ml萃取，合并氯仿层，并分别用水、饱和氯化钠水溶液洗氯仿层，无水硫酸钠干燥12h后，减压蒸馏回收氯仿。得到粗品103.2mg，过柱(V(石油醚)：V(乙酸乙酯＝95：5)得产品63.2mg，白色粉末状中乌头碱正己酰化衍生物。收率59.2％
采用浸渍法测定化合物对苜蓿蚜的杀虫活性：将蚕豆叶片剪去两端，背面朝上放在小块棉花上，置于塑料培养皿内，加少量水，接苜蓿蚜成蚜以产若蚜。24h后去除成蚜，继续培养2d后将叶片在药液中充分浸润5s后，重新置于棉花上，自然凉干。24h后检查结果。正己酰化修饰的中乌头碱衍生物在500mg/L时3龄稻飞虱有较好的毒杀活性。
产物测得溶点为：76-78℃。
产物结构用质谱检测证实，EI-MS m/z：730(M⁺)
核磁检测，¹H-NMR(CDCl₃，600MHz)δ(ppm)：8.03(2H，d，J＝7.20Hz，Ar-H)，7.57(1H，dd，J₁＝7.29Hz，J₂＝14.58Hz，Ar-H)，7.45(2H，t，J＝7.80Hz，Ar-H)，4.90(2H，ddd，J₁＝4.98Hz，J₂＝12.18Hz，J₃＝23.22Hz，14-Hβ)，，4.47(1H，dd，J₁＝2.82Hz，J₂＝4.98Hz，H-15β)，4.35(1H，d，J＝2.82Hz，OH-15α)，4.07(1H，d，J＝7.20Hz)，3.88(1H，s，OH-13β)，，3.79(1H，d，J＝8.82Hz)，3.73(3H，s，OCH₃)，3.31(1H，d，J＝5.22Hz)，3.27(3H，s，OCH₃)，3.20(6H，d，J＝4.80Hz，2×OCH₃)，3.13(1H，dd，J₁＝6.78Hz，J₂＝10.8Hz)，3.09(1H，s)，2.94(3H，m)，2.89(1H，s)，2.64(1H，d，J＝11.20Hz)，2.42(1H，m)，2.36(3H，s，N-CH₃)，1.40(3H，s，OAc)，1.66-1.26(8H，m，O＝C(CH₂)₄CH₃)，0.90(3H，dd，J₁＝7.02Hz，J₂＝13.80Hz，O＝C(CH₂)₄CH₃).
实施例4：
将100mg中乌头碱溶于2mL的干燥吡啶溶液中，加入甲烷磺酰氯0.05mL，常压下室温反应，薄层色谱监测，大约20小时反应完全。将反应液倒入3mL冰水中，氨水调节pH值为9.2后，用氯仿萃取3次，(5mL/次)，萃取液用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏得到白色固体122mg，产率约为100％。
采用浸渍法测定化合物对苜蓿蚜的杀虫活性：将蚕豆叶片剪去两端，背面朝上放在小块棉花上，置于塑料培养皿内，加少量水，接苜蓿蚜成蚜以产若蚜。24h后去除成蚜，继续培养2d后将叶片在药液中充分浸润5s后，重新置于棉花上，自然凉干。24h后检查结果。正己酰化修饰的中乌头碱衍生物在500mg/L时对3龄稻飞虱有较高毒杀活性。
产物结构用质谱检测证实，EI-MS m/z：788.3(M⁺)
核磁检测，¹H-NMR(CDCl₃，600MHz)δ(ppm)：8.06-7.46(5H，m，Ar-H)，5.23(1H，d，J＝5.2，H-14β)，4.75(1H，DD，J₁＝12.8，J₂＝6.7，3-H)，4.51(1H，dd，J₁＝7.7，J₂＝1.8，H-15β)，4.26(1H，d，J＝2.94，OH-15α)，3.71，3.31，3.27，3.20(each 3H，s，3×OCH₃)，3.10，3.02(each 3H，s，2×SO₂-CH₃)，2.33(3H，s，N-CH₃)，1.37(3H，s，OAc).
实施例5：
将中乌头碱100mg溶于吡啶中，滴加盐酸，得到中乌头碱的盐酸盐92mg。乙酸乙酯萃取并重结晶，得到盐酸盐白色针状晶体。熔点176-178℃。
采用培养皿苗虫定量喷雾法测定化合物对水稻褐飞虱筛选：将水稻苗用白石英沙固定于培养皿内，接用CO₂麻醉3龄中期若虫，置于POTTER喷雾塔下喷雾。喷雾后用透明塑料杯罩住，标记后放于观察室内。72h后检查结果。对氯苯甲酰化修饰的中乌头碱衍生物在500mg/L时3龄稻飞虱有较高毒杀活性。
实施例6：
将中乌头碱100mg溶于吡啶中，滴加氢溴酸，得到中乌头碱的溴酸盐85mg。乙酸乙酯萃取并重结晶，得到溴酸盐白色针状晶体。熔点172-173℃
采用培养皿苗虫定量喷雾法测定化合物对水稻褐飞虱筛选：将水稻苗用白石英沙固定于培养皿内，接用CO₂麻醉3龄中期若虫，置于POTTER喷雾塔下喷雾。喷雾后用透明塑料杯罩住，标记后放于观察室内。72h后检查结果。对氯苯甲酰化修饰的中乌头碱衍生物在500mg/L时3龄稻飞虱有较高毒杀活性。