用于肽合成的方法和组合物 1.简介
本发明首先涉及肽合成的方法，特别是相当于这里称为T-1249(SEQ ID NO：1)和T-1249肽的合成方法。该方法利用固相和液相合成方法来合成和将特定的肽片段组结合以得到所需要的肽。本发明进一步涉及可以作为所需肽(例如，T-1249)的合成中间体的单独的肽片段。本发明更进一步涉及这样的肽中间体片段组，它们可一起用于制备全长的T-1249和类T-1249肽。本发明更进一步涉及用于提纯肽的方法，特别是T-1249和类T-1249肽，以及作为合成目标肽的中间体的单独的肽片段。
2.背景技术
近来，人们已经识别出大量显示出抑制与细胞融合有关的过程的能力，且更重要地，还显示出有效的抗病毒活性的肽。见，例如，U.S.Pat.5,464,933；5,656,480；PCT申请公开号WO 94/28920；WO 96/19495。当这些肽开始被广泛地使用时，例如作为治疗法，就需要能够大规模的合成它们。
虽然已经存在用于肽合成的技术，(见，例如，Mergler等人，1988，Tetrahedron Letters 29：4005-4008；Mergler等人，1988，TetrahedronLetters 29：4009-4012；Kamber等人(编辑)，Peptides，Chemistry andBiology，ESCOM，Leiden，1992，525-526；和Riniker等人，1993，Tetrahedron Letters 49：9307-9320)，但目前还没有可以用于大规模地、商业化生产易纯化的肽例如T-1249的技术存在。
3.发明概述
本发明首先涉及肽合成的方法，特别是相当于这里称为T-1249(SEQ ID NO：1)和类T-1249肽的合成方法。此种方法利用固相和液相合成方法来合成和将特定的肽片段组结合以得到所需要的肽。一般地，本发明的方法包含特定侧链被保护的T-1249或类T-1249肽的肽片段中间体在固体载体上的合成，将保护的片段在溶液中偶合，形成保护的T-1249或类T-1249肽，随后脱侧链保护得到最终的T-1249或类T-1249肽。本发明的方法的一个优选实施方案涉及具有在SEQ ID NO：1中描述的氨基酸顺序的T-1249肽的合成。
本发明进一步涉及可以作为所需肽的合成中的中间体的单独的肽片段(例如，T-1249)。本发明的肽片段包含，但是不局限于，具有以下表1中所述的氨基酸序列的肽片段：
表1肽编号 氨基酸序列相应的T-1249的氨基酸序列的编号 (SEQ.ID NO：1) 1 WQEWEQKITALL (SEQ ID NO：2) 1-12 2 EQAQIQQEKNEYEL (SEQ ID NO：3) 13-26 3 QKLDKWASLWEW (SEQ ID NO：4) 27-38 4 QKLDKWASLWEWF (SEQ ID NO：5) 27-39 5 EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF (SEQ ID NO：6) 13-39 6 WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYEL (SEQ ID NO：7) 1-26 7 EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEW (SEQ ID NO：8) 13-38
本发明更进一步涉及可以作为所需肽合成中的中间体的特殊的肽片段组。根据本发明的肽片段组包含组1-6，如以下表2所示。
表2
组 氨基酸序列 相应的T-1249的
氨基酸序列的编号
(SEQ ID NO：1)
1 WQEWEQKITALL (SEQ ID NO：2) 1-12
EQAQIQQEKNEYEL (SEQ ID NO：3) 13-26
QKLDKWASLWEW (SEQ ID NO：4) 27-38
2 WQEWEQKITALL (SEQ ID NO：2) 1-12
EQAQIQQEKNEYEL (SEQ ID NO：3) 13-26
QKLDKWASLWEWF (SEQ ID NO：5) 27-39
3 WQEWEQKITALL (SEQ ID NO：2) 1-12
EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF
(SEQ ID NO：6) 13-39
4 WQEWEQKITALL (SEQ ID NO：2) 1-12
EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEW
(SEQ ID NO：8) 13-38
5 WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYEL
(SEQ ID NO：7) 1-26
QKLDKWASLWEW (SEQ ID NO：4) 27-38
6 WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYEL
(SEQ ID NO：7) 1-26
QKLDKWASLWEWF (SEQ ID NO：5) 27-39
本发明在某种程度上是基于发明人的意外发现，某些固相液相合成反应的结合可以使高纯度的T-1249和类T-1249肽第一次以高生产量和高产率大规模地生成制备。特别地，根据本发明的方法，T-1249和类T-1249肽可以一或多公斤的规模合成。已发现通过选择用于固相合成的本发明的特定T-1249肽片段，可以开拓高效固相偶合技术，而不必使用在通常的固相合成中所要求的3、4以至5倍过量氨基酸和试剂。本发明的方法在本发明的肽片段的固相合成中仅仅使用约0.5倍过量(约1.5当量)的氨基酸。氨基酸和试剂量的减少使本发明的方法适合于T-1249和类T-1249肽的大规模合成。
另外，发明人意外地发现某些肽片段可以在固相在负载约＞0.5mmol/克的固相树脂的情况下合成。这种负载在典型地固相肽合成中所实现的负荷范围0.25-0.35mmol/克树脂内显著地提高了生产量。而且，发明人发现在固相使用对酸极度敏感的树脂来合成选择的肽片段可以制备非常高纯度的肽片段。根据本发明不必使用色谱技术对所制备的肽片段纯化；片段可在使用前通过沉淀和/或研制做成，或以从树脂直接得到的形式使用。使用对酸极其敏感的树脂可以让所合成的本发明保护的肽从树脂上解离，而不伴随侧链保护基的除去。这样可以减少杂质，并可以以高纯度和收率合成包含10个氨基酸或更多氨基酸的肽。
根据本发明的方法通过高纯度的根据本发明制备的肽片段的偶合在液相合成的T-1249和类T-1249肽的杂质分布是由那些不偶合的片段组成，并且包含相当少量的根据常规技术，例如，仅仅是固相合成所合成的T-1249和类T-1249肽的十分相关的缺损类似物。因此，根据本发明制备的T-1249和类T-1249肽比那些根据传统方法制备的肽更容易纯化。特别地，根据本发明的方法制备的T-1249可以在一次通过色谱中纯化至＞90％的纯度。例如，根据本发明的方法，T-1249肽可以使用5英寸柱以400g或更多的量加以纯化。相反，使用常规的固相合成(SPPS)制备的T-1249很难纯化，要求通过多次色谱分离。举例来说，通过SPPS制备的T-1249，一般在8英寸柱上只能提纯10克或更少的纯原料。
出现于下面第9部分的实施例表明了T-1249全长肽的组合合成。通过本发明的方法，T-1249和类T-1249肽及其中间体可以按照一或多公斤的规模制备。
本发明人还出乎意料地发现由于液相合成后得到的T-1249的高纯度，使得肽例如T-1249及其它类T-1249肽，以及在此所述的某些肽片段可以使用大容量材料进行纯化。因此，本发明更进一步涉及用于提纯肽的方法，特别是T-1249和类T-1249肽，及作为合成目标肽的中间体的单独的肽片段。
3.1定义
在此使用的氨基酸符号是常规的，如下所示：
常见氨基酸的缩写
氨基酸 单字母符号 通用缩写
丙氨酸 A Ala
天冬酰胺 N Asn
天冬氨酸 D Asp
谷酰胺 Q Gln
谷氨酸 E Glu
异亮氨酸 I Ile
亮氨酸 L Leu
赖氨酸 K Lys
苯基丙氨酸 F Phe
丝氨酸 S Ser
苏氨酸 T Thr
色氨酸 W Trp
酪氨酸 Y Tyr
4.附图的简要说明
图1：T-1249三片段方法。该图描述了以下第8和9部分中列举的实施例所用的反应路线，用于全长T-1249的合成，使用组1的中间体肽片段为原料，如上面表2所示，并且描述了本发明方法的一个非限制性实施方案。
5.发明详述
5.1全长肽本发明涉及可用于合成T-1249肽的方法、肽片段、肽片段组。T-1249为一个具有39个氨基酸残基的多肽，其序列来源于HIV-1，HIV-2
和SIV gp41病毒多肽序列。T-1249具有以下氨基酸序列：
NH2-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-COOH
当然本发明的方法、片段和片段组及用于选择片段和片段组的技术可以用来合成除了T-1249的类T-1249片段。在此使用的术语“类T-1249”是指在国际公开申请号PCT/US 99/11212(于1999年5月20日申请)中列出的任何HIV或非HIV肽，在此全部引入作为参考。
除了上述的T-1249和类T-1249肽外，本发明的方法、片段和片段组可以用来合成具有修饰的氨基和/或羧基末端的肽。以T-1249为例，该肽可具有下面通式：
X-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z其中X代表氨基；疏水基选自苄氧羰基、丹磺酰和叔丁氧羰基；乙酰基；9-芴基-甲氧基-羰基(FMOC)；或大分子的载体，选自脂质-脂肪酸结合物(conjugate)、聚乙二醇和碳水化合物；且Z代表羧基；酰氨基；叔丁氧羰基；对硝基苄基酯基；或大分子的载体，选自脂质-脂肪酸结合物、聚乙二醇、和碳水化合物。在优选实施方案中，本发明的方法用来合成具有上述通式，其中X为乙酰基且Z为酰氨基的肽。用于添加这样的“X”和“Z”基团的技术为本领域技术人员所熟悉的技术。
在一种优选的方法中，T-1249和类T-1249肽及中间体可以使用在高和低pH值范围下稳定的任何非硅胶柱填充物(用于最大化装载容量)包含但不限于锆基填料、基于聚苯乙烯，聚丙烯酸或其它聚合物的填料加以纯化。例如，在非硅胶装载柱中填充显示宽的pH值范围，包含pH值大于7的、由Tosohaas(Montgomeryviile，PA)出售的柱填料。用这种原料填充的柱可以在低、中或高压色谱法中根据本领域熟知的标准技术操作。
于下面第9部分的实施例表明了通过以下第5.2部分所述的肽中间体的偶合而进行的T-1249肽的成功合成。
5.2肽中间体
本发明包括，但是不局限于，具有上述表1中所列特定氨基酸序列的T-1249和类T-1249肽的肽片段中间体，和列于表2的肽片段中间体组。这些肽中间体，特别是列于表2的片段组，可用于制备T-1249和类T-1249肽。
列于表1或2中的肽片段的任何一个或多个氨基酸残基侧链可以用标准的保护基例如叔丁基(t-Bu)，三苯甲基(trt)和叔丁氧羰基(Boc)保护。t-Bu基团为用于氨基酸残基Tyr(Y)、Thr(T)、Ser(S)，Glu(E)和Asp(D)的优选的侧链保护基；trt基团为用于氨基酸残基Gln(Q)和Asn(N)的优选的侧链保护基；且Boc基团为用于氨基酸残基Lys(K)和Trp(W)的优选的侧链保护基。
优选，本发明肽片段的Gln(Q)残基用三苯甲基(trt)基团保护。然而，如果要求任何本发明的肽片段在有机溶剂中具有较低的溶解性，则可能要从该片段的一个或多个谷酰胺残基中除去三苯甲基保护基。
优选，本发明每个肽片段的Asn(N)残基是被保护的。另外，优选Trp(w)残基用Boc基团保护。
根据列于上述表1中的式1-5肽的保护的肽片段包括，但不局限于列于以下表3中的化合物。
表3肽分子式 编号 分子式相应的T-1249的氨基酸序列的编号(SEQ ID NO：1) 1 Ac-WQEWEQKITALL-COOH (SEQ ID NO:2)1-12 2 FMOC-EQAQIQQEKNEYEL-COOH (SEQ ID NO:3)13-26 3 FMOC-QKLDKWASLWEW-COOH (SEQ ID NO:4)27-38 4a FMOC-QKLDKWASLWEWF-NH2 (SEQ ID NO:5)27-39 4b NH2-QKLDKWASLWEWF-NH2 (SEQ ID NO:5)27-39 5a FMOC-EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2 (SEQ ID NO:6)13-39 5b NH2-EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2(SEQ ID NO:2) (SEO ID NO:6)13-39
列于上述表3中的肽的任何一个或多个氨基酸残基的侧链可以用如上所述标准的保护基例如用t-Bu，trt和Boc保护。表3中的肽的典型的合成见以下第7和8部分，其中应用以下第5.3部分所讨论的常规技术。
5.3肽合成
正如以上的讨论，本发明的一些单独的肽片段优选使用固相合成技术制备，而本发明的其它肽优选使用固相和液相结合的合成技术制备，所述合成以制备在此所述的T-1249或类T-1249肽结束。然而，当然本发明的肽片段可能通过本领域众所周知的技术合成或制备。见，例如，Creighton，1983，Proteins：Structures and MolecularPrinciples，W.H.Freeman and Co.，NY，该文献在此全部引入作为参考。
本发明的肽还可以如下合成：连接该肽的氨基酸残基的一个或多个连接键为非肽键。这些可选择的非肽键可能利用本领域人员熟知的反应形成，并且可能包含但不局限于亚氨基、酯、酰肼、氨基脲和偶氮连接，略举数例。
在本发明的另一实施方案中，包含如上所述的序列的T-1249和类T-1249肽可以用在它们的氨基和/或羧基末端的另外的化学基团加以合成，以致于可以提高肽的，例如稳定性、反应性和/或溶解性。例如，可以在肽氨基末端增加疏水基例如苄氧羰基、丹磺酰基、乙酰基或叔丁氧羰基基团。同样地，可以在肽的氨基末端添加乙酰基或9-芴基甲氧基羰基基团。(见如上所述的T-1249的“X”修饰基团。)另外，可将疏水基，叔丁氧羰基或酰氨基可加到肽的羧基末端。类似地，可将对硝基苄基酯或苄基酯基可接到肽的羧基末端。(见如上所述的T-1249的“Z”修饰基团。)用于引入上述的修饰基团的技术为本领域技术人员所熟知的技术。
而且，T-1249和类T-1249肽可以通过合成以使它们的空间构型改变。例如，可以使用肽的氨基酸残基的一个或多个D-异构体合成，而不是通常的L-异构体。
更进一步，本发明肽的至少一个氨基酸残基可以被一个已公知的非天然氨基酸残基取代。诸如这些的改变都可以用来增加本发明肽的稳定性、反应性和/或溶解性。
T-1249或类T-1249肽的任一个可以被合成，以另外使大分子载体基团共价地连接到其氨基和/或羧基末端。上述的大分子载体基团可以包含，例如，脂质-脂肪酸结合物、聚乙二醇、碳水化合物或其它的肽。因此如果另外的肽基团是优选的，如上所述的T-1249的“X”修饰基团可以另外代表任一上述共价地连接到肽的氨基末端的大分子载体基团。同样地，如上所述的T-1249的“ Z”修饰基团可以另外代表如上所述的任一大分子载体基团。
优选，本发明的肽片段使用标准的FMOC规程通过固相肽合成(SPPS)技术合成。见，例如，Catpino等人，1970，J.Am.Chem.Soc.92(19)：5748-5749；Catpino等人，1972，J.Org.Chem.37(22)：3404-3409.在一优选实施方案中，本发明的肽片段的固相合成是在对酸极其敏感的固体载体上进行的，该固体载体包括，但不局限于，2-氯三苯甲基氯树脂(见，例如，Barbs等人，1989，Tetrahedrbn Letters30(30)：3943-3946)和4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸树脂(见，例如，Seiber，1987，Tetrahedron Letters 28(49)：6147-6150，和Richter等人，1994，Tetrahedron Letters 35(27)：4705-4706)。2-氯三苯甲基氯和4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸树脂可以从Calbiochem-Novabiochem公司，San Diego，CA购买。
在本文中描述了可以用于固相肽合成中的用于制备和树脂负载的常规的，非限制的方法。另外，在以下第6部分的实施例中描述了典型的树脂的制备方法。
树脂负载可以，例如，通过以下技术进行：将树脂，优选对酸极度敏感树脂例如2-氯三苯甲基树脂加入反应室中。用氯代溶剂例如二氯甲烷(DCM)洗涤树脂。排出溶剂，加入含有过量0.2-0.5当量的二异丙基乙胺(DIEA)的0.5-1.5当量氨基酸在约8-10倍体积的二氯乙烷(DCE)中的溶液。该氨基酸的N-末端应该是被保护的，优选用Fmoc保护，且该氨基酸的侧链应该在必要处或适当的地方被保护。该混合物用氮气鼓泡搅动2-24小时。
应注意氯代溶剂例如DCM或DCE可使2-氯三苯甲基树脂充分膨胀。
搅动后，树脂层排干并用DCM洗涤。树脂上的活性部位用9∶1MeOH：DIEA溶液末端封闭约20-30分钟。排干树脂层，用DCM洗涤四次并用氮气吹洗干燥得到负载的树脂。
Fmoc为用于氨基酸N-末端优选的保护基。根据要负载的氨基酸，其侧链可能被或不被保护。例如，当负载色氨酸(Trp)时，其侧链应该用Boc基团保护。然而，亮氨酸(Leu)的侧链不必保护。优选，谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)和丝氨酸(Ser)被保护为叔丁基醚或叔丁基酯，且色氨酸(Trp)和赖氨酸(Lys)以叔丁氧羰基氨基甲酸盐(Boc)加以保护。天冬酰胺(Asri)和谷酰胺(Gln)的酰胺侧链可用三苯甲基基团保护或不被保护。
带有或者没有所需侧链保护基的、用于负载到树脂上和肽合成中的Fmoc保护的氨基酸可由许多供应商提供，包括Senn或Genzyme公司。作为上述步骤的替换，可以购买已经负载了适当的氨基酸的树脂。
在以下第6部分的实施例中描述了典型的树脂制备方法。
固相肽合成技术可以根据例如，以下的非限制性的技术进行：将负载了的树脂加入反应室，并用一种溶剂，优选二氯甲烷(DCM；优选约10倍体积)处理，用氮气搅动或搅拌约15分钟以便膨胀树脂粒。DCM可使2-氯三苯甲基树脂充分膨胀。当树脂珠膨胀时，树脂在反应室中的体积将增加3-6倍，并且活性部位展开有利于反应。树脂膨胀后，从反应室排干溶剂。
通过用2等分的20％哌啶在N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)溶液每次处理树脂约十分钟可从末端胺或树脂上除去Fmoc(9-芴基-甲氧基羰基)保护基。每次所用20％哌啶在NMP溶液中的体积取决于反应进行的规模。然后用等分量的NMP洗涤树脂5-7次(约10倍体积)以除去Fmoc副产品(即二苯并亚甲基环戊二烯和其哌啶加合物)和残余的哌啶。
四氯苯醌试验可用于确定残余的吡啶是否被完全除去。四氯苯醌试液通过向约1毫升丙酮中加入一滴四氯苯醌甲苯饱和溶液制备。NMP洗液可以通过向四氯苯醌试液中加入一滴该洗液测试。蓝色或紫色是存在仲胺的阳性指示，表明残余的哌啶仍然存在。重复用NMP洗涤直至不再观测到蓝色或紫色。
同时，将要添加到树脂上的序列中后面的氨基酸活化以便在其羧基末端反应。每个氨基酸的氨基末端应该用Fmoc保护。根据要添加的氨基酸，其侧链可被或不被保护。优选，tyr(Y)、Thr(T)、Ser(S)、Glu(E)和Asp(P)的侧链用t-Bu保护，Gln(Q)和Asn(N)的侧链用trt保护，而Lys(K)和Trp(w)的侧链用Boc保护。Leu或Ile的侧链不必保护。
氨基酸可以如下活化。在室温下将Fmoc-保护的氨基酸(1.5当量)，1-羟基苯并三唑水合物(HOBT)(1.5当量)，和二异丙基乙胺(DIEA)(1.5当量)溶于一种极性，非质子传递溶剂例如N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基乙酰胺(DMAC)(约7.5体积)。将溶液冷却至0-5℃，而后加入O-苯并噻唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)或O-苯并噻唑-1-基四甲基四氟硼酸盐(TBTU)(1.5当量)，随后搅拌5-15分钟至溶解。活化在0-5℃进行以使氨基酸的外消旋作用减到最小是至关重要的。最后向冷的溶液中加入HBTU，因为活化和外消旋作用没有它不能进行。
将活化的氨基酸的溶液加到排干的树脂中，用DCM冲洗(大约2.5体积)。注意氨基酸的活化在NMP中进行是由于HBTU在DCM中不溶。然而，在此刻向反应中加入DCM以维持树脂粒的充分膨胀。反应在20-30℃用氮气泡搅动约1小时。用如下所述的定性茚三酮试验监控偶合结束。
为使用定性茚三酮试验检查反应是否完全，可以抽出2-20毫克树脂样品并用甲醇洗干净。向样品中加入3滴76％苯酚的乙醇溶液，4或5滴0.2mMKCN的吡啶溶液，和3滴0.28M的茚三酮乙醇溶液。该样品用乙醇稀释至约0.5毫升，并被放入约75℃的加热块中5-10分钟。蓝色或紫色为存在游离氨基的阳性指示，表明反应还没有完全。可以将样品进一步稀释至约3毫升以便更准确地测量浓缩的样品的变色程度。
如果在一小时后观察到茚三酮试验显阳性，可继续偶合反应一小时。如果茚三酮试验在3小时后仍显阳性，排干树脂，在大约10体积的NMP中洗涤一次，用0.5-1当量的活化的氨基酸重复偶合反应。
如果树脂在偶合周期之间存储过夜，可以将树脂层排干并在氮气氛下用NMP覆盖。也可以，排干树脂层，在氮气氛下存储，然后在继续进行下一个偶合周期之前用DCM洗涤使其达到要求的情况。如果完成的片段将在断裂之前存储过夜，应将树脂层用IPA洗涤至无NMP，因为在NMP中可发生显著的脱Fmoc保护反应。
判断偶合完成之后，排干树脂并用3等分量(大约10体积)的NMP洗涤。对于后面的肽片段的链节(即，氨基酸)重复此循环。继最终的偶联反应之后，树脂用4等分量(约10体积)的NMP洗涤，然后用2等分量(大约10体积)的DCM和2IPA洗涤。此树脂结合肽可以用氮气吹扫干燥或在烘箱中干燥。
通过固相合成技术合成的肽可以根据例如以下的非限制性技术解离和分离：该肽可以用本领域技术技术人员熟知的技术从树脂上解离。例如，可以用1％或2％三氟乙酸(TFA)的DCM溶液或1％和2％TFA的DCM溶液结合来解离该肽。还可以用乙酸(HOAC)、盐酸(HCl)或甲酸解离该肽。具体的解离试剂，溶剂和所需解离时间可取决于要解离的特定肽。解离后，解离的部分可进行标准的分离步骤以分离肽。一般地，可将解离部分合并，在真空下浓缩，而后用极性质子惰性溶剂重构，极性质子惰性溶剂例如乙醇(EtOH)、甲醇(MeOH)、异丙醇(IPA)、丙酮、乙腈(ACN)、二甲基甲酰胺(DMF)、NMD、DMAC、DCM等等，随后用抗溶剂例如水或己烷沉淀或结晶，并通过真空过滤收集。或者，该产品可以在肽分离后用有机溶剂或水研制。
实施例见以下第7.1-7.6部分，描述了如表1、2和/或3中所示肽中间体的固相合成。
为合成全长T-1249肽，可将上述的表1中的肽中间体偶合起来得到T-1149肽。例如，可将列于上述表2中的肽中间体组偶合起来以制备全长T-1249肽。从中间体肽片段合成全长T-1249的典型实施例见以下第9部分，且在图1中示意地描述。
在某些实施方案中，可按照三片段方法合成T-1249。“三片段方法”合成是指由三个T-1249中间体肽片段开始的T-1249合成反应路线，使用固相和液相合成技术合成并偶合成为全长T-1249肽。上述表2中所示中间体肽片段组1、2、3和4为优选组。图1描述了使用表2肽中间体组1合成全长T-1249的典型的三片段方法。对于此组，可注意到在片段偶合过程中氨基酸残基39(T-1249羧基的1-末端氨基酸残基)是被单独引入的。图1中的T-1249合成反应路线的顶点可通过第9.1部分的实施例证明。
本领域技术人员熟知的液相肽合成技术可以用于本发明的肽中间体片段的合成。以下第8部分的实施例描述了列于表1、2和/或3中的肽中间体的典型的液相肽合成。例如，在能显示宽的pH值范围，包含在高或低pH下pH稳定的非硅胶装载柱填充物中，为Tosohaas(Montgomeryviile，PA)出售的柱填充物。
6.实施例：树脂合成6.1.用于在2-CTC树脂上负载氨基酸的优选的典型方法
将对空气敏感的2-氯三苯甲基氯树脂(Senn Chemicals，批次A3573，1eq，12.0mmol，10.0g)加入到250毫升圆底烧瓶中，立即用准备好的FmocLeuOH(1.0eq.，12mmol，4.24g)和二异丙基乙胺(5eq.，60.0mmol，5.20mL)的DCM(10体积，100mL)溶液处理。淤浆被封端并搅拌3小时。过滤除去溶剂并用DCM(5体积，50毫升)洗涤树脂。树脂上的残余活性部位通过用9∶1 MeOH∶DIEA(5体积，5.0毫升DIEA和45毫升甲醇)处30分钟进行末端封端。除去溶剂并用3×5体积的DCM洗涤树脂。干燥树脂至恒重得到13.2克计算载荷为每克0.98mmol FmocLeuOH的负载的树脂。
此方法还可以用于在2-CTC树脂上负载FmocTrp(Boc)OH。
在此，在第6.2-6.3部分描述的为如下实施例，其中氯三苯甲基氯树脂被可以用于在此所述的肽和肽中间体固相合成的氨基酸所取代。本发明的所有肽和肽片段可以通过使用以下第6.2和6.3部分所述的负载过程通过固相肽合成法(SPPS)合成。6.2 Fmoc-Trp(Boc)-2-氯三苯甲基树脂的制备材料 MW eq. mmoles grams mL2-氯三苯甲基氯树脂 -- 1.0 25 25 --Fmoc-Trp(Boc)-OH -- 526.60 1.5 37.5 19.7二异丙基乙基胺(DIEA) 29.25 1.7 42.5 5.5 7.4二氯乙烷(DCE) -- -- -- -- 250二氯甲烷(DCM) -- -- -- -- 6×2509∶1甲醇∶DIEA -- -- -- -- 200方法：
将2-氯三苯甲基氯树脂(25g，1eq.)装入 500毫升肽合成容器并用250毫升DCM洗涤。排干树脂层，加入含有Fmoc-Trp(Boc)-OH(1.5eq)和DIEA(1.7eq)在10体积DCE中的溶液。用氮气泡搅动该混合物2小时。
排干树脂层并用250毫升DCM洗涤。树脂上的活性部位用200毫升9∶1 MeOH∶DIEA溶液末端封闭20分钟。排干树脂层，用4×250毫升DCM洗涤，并用氮气吹洗干燥得到34.3克负载的树脂。
通过从树脂上解离Fmoc-氨基酸进行定量HPLC分析，并用标准物进行对比试验。HPLC原料分析显示树脂负载量为0.68mmol/克。柱：Phenomenox Jupiter C18；300；5μ流速：1mL/min检测：UV在260nm流动相：A：0.i％TFA水溶液
B：0.1％TFA的乙腈溶液
65％B isocratic保留时间：约14分钟6.3 Fmoc-Leu-2-氯三苯甲基树脂的制备材料 MW eq. mmoles grams mL2-氯三苯甲基氯树脂 -- 1.0 250 250 -- Fmoc-Trp(Boc)-OH 353.42 1.5 375 132.5 --二异丙基乙基胺(DIEA) 129.25 1.7 425 55 75二氯乙烷(DCE) -- -- -- -- 2000二氯甲烷(DCM) -- -- -- -- 6×15009∶1甲醇∶DIEA -- -- -- -- 1500方法：
将树脂装入3L肽容器并用1.5DCM洗涤。排干树脂层，加入FmocLeuOH(1.5eq)和DIEA(1.7eq)在8体积DCE中的溶液。该混合物用氮气鼓泡搅动2小时。
排干树脂层并用1.5升DCM洗涤。树脂上的活性部位用1.5升9∶1MeOH∶DIEA溶液末端封闭30分钟。排干树脂层，用4×1.5升DCM洗涤，并用氮气吹洗干燥得到345克负载的树脂。
通过从树脂上解离Fmoc-氨基酸进行定量HPLC分析，并用标准物进行对比试验。HPLC原料分析显示树脂负载量为0.72mmol/克。柱：
Phenomenox Jupi ter C18；300；5μ流速：1mL/min检测：UV在260nm流动相：A：0.1％TFA水溶液
B：0.1％TFA的乙腈溶液
65％ B isocratic保留时间：约8分钟
7.实施例：肽的固相合成
列于以下第7.1-7.6部分的实施例，描述了如表1、2和/或3中所示肽中间体的固相合成。7.1用于固相肽合成(SPPS)的优选方法：一般步骤
在SPPS容器中装料FmocLeu-树脂(当量)。该树脂用5％哌啶DCM(7.5体积)处理，用氮气吹扫15-30分钟。排干溶剂，树脂用2×20％哌啶的NMP溶液(5体积)处理30分钟以除去Fmoc保护基。在用20％哌啶/NMP第二次处理之后，树脂用5-7×NMP(5体积)洗涤至四氯苯醌试验显阴性。
同时，将后续氨基酸(1.5当量)，HOBT(1.5当量)和DIEA(1.5当量)在3∶1NMP/DCM(10体积)中混合，直到在室温下全部溶解并冷却至0℃。加入HBTU，搅拌溶液10-15分钟至固体溶解，然后加入到树脂中。该悬浮液在氮气氛下搅动1-3小时。用定性茚三酮试验监控偶合结束。如果反应在3小时后仍不完全(茚三酮试验持续阳性)，应该排干反应器，并应该用新鲜的活化氨基酸溶液(0.5当量)重新进行偶合。通常在重新偶合30分钟-1小时后，可得到阳性的茚三酮试验。对于片段中其余氨基酸重复此循环。在片段构筑状态下，用于洗涤的溶剂体积可能需要从5体积增加。对于AcAA1-12OH，乙酸酐封端是通过用吡啶(5当量)，然后用乙酸酐(5当量)在3∶1NMP/DCM(10体积)溶液处理去Fmoc保护(HAA1-12-树脂)而进行的。继最终的偶合之后，用3×5-8体积的NMP洗涤树脂，然后用2×10体积的DCM洗涤，并在真空烘箱中在40℃干燥至恒重。7.2从树脂上解离肽的优选方法
以下方法描述了从树脂上解离肽AcAA1-120H的方法。然而，还可以用与此相同的方法解离本发明的其它肽片段。方法A：使用HOAc
树脂(1克，0.370mmol)用AcOH/MeOH/DCM(5∶1∶4，20体积，20毫升)的混合物处理，用氮气搅动1.5小时，并将溶液转入圆底烧瓶中，搅拌，并用水(20体积)处理。将得到的白色淤浆浓缩(旋转蒸发，40℃浴)除去DCM，过滤收集产品。干燥至恒重得到0.69克(74％)AcAA1-12OH，纯度87A％。如上二次处理树脂，提供另外0.08克(8.5％)纯度较小的(83面积％)AcAA1-12OH，建议所需反应时间略＞1.5小时。方法B：使用TFA
树脂(1wt，20克)用5-6×1.7体积的1％TFA的DCM溶液洗涤，每次3-5分钟。在含有吡啶(与洗液中的TFA的体积比1∶1)的烧瓶中收集1％TFA/DCM洗液。合并含有洗液的产品(600毫升，30体积)，蒸馏除去DCM至最小器皿体积(～原始体积的1/3)。调节真空度使器皿温度维持在15-25℃。加入乙醇(6.5体积)，并继续蒸馏直至除去DCM(通过蒸馏物的温度增加确定)。再次调节真空度使器皿温度维持在15-20℃。最终器皿体积应该在～8-9体积。将溶液冷却至5-10℃，于30分钟加入水(6.5体积)至沉淀出AcAA1-12OH。真空过滤收集固体，并用水(2-3体积)洗涤固体。淤浆在0-5℃搅拌30分钟，通过真空过滤收集固体并干燥至恒重，得到16.80克AcAA1-12OH，收率90％，纯度84面积％(A％)。7.3 AcAA1-12OH后处理的优选方法
在65℃下加热在70毫升甲醇(23.3体积)中的AcAA1-12OH(257-21-1，3.00克)，搅拌3小时。冷却至室温并搅动过夜。抽滤过滤并在真空烘箱中(40℃)干燥至恒重，得到2.43g(81％)，纯度90A％。HPLC条件：Vydac C8，cat.No.208TP54，5μ，300A，0.9mL/min.，280nm.A：0.1％TFA/水，
B：80％i-PrOH/20％乙腈和0.1％TFA的混合物
60-80％B/30min典型样品制备：将1mg溶于0.10ml NMP，用1mL乙腈稀释。在20μL环管中注射进样20μL。7.4 FmocAA13-26OH的SPPS合成和从树脂上的解离
FmocAA13-26的SPPS合成如上所述从6.5g负载量1.02mmol/克的FmocLeuo树脂开始进行。可按照解离方法A或B进行(169/137，收率60％，纯度85A％)。7.5 FmocAA13-26OH的优选的后处理方法
FmocAA13-26OH(3.60克，85A％)在15毫升(5体积)乙腈中在78℃加热。该淤浆用另外的溶剂处理，直至固体溶解(合计0.6毫升)。将溶液冷却至室温并搅拌7小时。抽滤过滤并干燥至恒重，得到2.6克(72％)，纯度95A％的FmocAA13-26OH。HPLC条件：Vydac C8，cat.No.208TP54，5μ，300A，0.9mL/min.，280nm.A：0.1％TFA/水，
B：80％i-PrOH/20％乙腈和0.1％TFA的混合物
60-80％B/30min典型样品制备：将1mg溶于0.10ml NMP中，用1mL乙腈稀释。在20μL环管中注射进样20μL。7.6 FmocAA27-38OH的SPPS合成和从树脂上的解离
FmocAA27-38OH的SPPS合成如上所述从10g负载量0.75mmol/克的FmocTrp(Boc)OR开始进行。可使用照解离方法B(169/120/1，收率78％，纯度87.9A％)。HPLC条件：Vydac C8，cat.No.208TP54，5μ，300A，0.9mL/min.，280nm.A：0.1％TFA/水，
B：80％i-PrOH/20％乙腈和0.1％TFA的混合物
60-80％ B/30min典型样品制备：将1mg溶于0.10ml NMP，用1mL乙腈稀释。在20μL环管中注射进样20μL。8.实施例：肽片段的液相合成
列于以下第8.1-8.4部分的实施例，描述了如表1、2和/或3中所示肽中间体的液相合成。8.1 通过HPheNH2至FmocAA27-38OH的液相偶合进行的片段Fmoc-AA27-39-NH2的制备
FmocAA27-39NH2可以通过将FmocAA27-38OH的羧基末端分别在DIEA和苯丙氨酸酰胺的存在下使用HBTU或TBTU和HOBT或HOAT转化为活化的HOBT或HOAT酯制备。该反应可在一极性，非质子传递溶剂例如DMF或NMP中，在0至25℃进行。反应完成后，加入醇类或水混性的溶剂和/或水，沉淀出FmocAA27-39NH2。实施例：
将FmocAA27-38OH(169-120-1，5.40克，1.98mmol，1.00当量)，HPheNH2(Bachem，0.390克，2.38mmol，1.20当量)，HOBT，H2O(0.330克，2.16mmol，1.10当量)溶于NMP(54毫升，10体积)中，用DIEA(0.16毫升，0.921mmol，1.10)处理，并在室温下搅拌直至溶解(大约30分钟)。该溶液用冰浴冷却(内部温度T＝2-3℃)，一次加入hbTU(0.827克，2.18mmol，1.10当量)，搅拌1小时，然后过夜。反应通过薄层色谱法监控(uv，10％MeOH/DCM，SM mid Rf，产品在上)。加入甲醇(54毫升，10体积)，然后于1小时期间滴加水(54毫升，10体积)形成能自由流动的固体，将其另外搅拌2小时，然后过滤收集。用1∶1水/甲醇(2×25毫升)洗涤滤饼。在真空烘箱中在40℃下干燥过夜，得到5.30克(93％)FmocAA27-39NH2，纯度81A％。HPLC分析还表明存在＜0.2％的原料FmoCAA27-38OH。ES pos＝2871(MH+)，ES neg＝2869(M-1).平均MW＝2870.HPLC 条件：Vydac C8，cat.No.208TP54，5μ，300A，0.9mL/min.，280nm.A：0.1％TFA/水，
B：80％i-PrOH/20％乙腈和0.1％TFA的混合物
60-80％B/30min典型样品制备：将1mg溶于0.10ml NMP，用1mL乙腈稀释。在20μL环管中注射进样20μL。8.2 通过除去FMOC基团制备片段HAA27-39NH2
Fmoc AA27-39NH2的Fmoc保护基可用碱例如哌啶或碳酸钾在有机溶剂例如DCM、DMF、NMP、甲基叔丁基醚(MTBE)、己烷或它们的混合物中除去。实施例：
将FmocAA27-39OH(257-25-1，4.00克，1.39mmol)悬浮在40毫升(10体积)的MTBE和10毫升(2.5体积)的庚烷中，然后用哌啶(0.75毫升，8.34mmol，5.5当量)处理。搅拌淤浆12小时，此时残余0.5％起始物料(HPLC检测)并加入20毫升(5体积)庚烷。搅拌能自由流动的淤浆1小时，然后抽滤过滤分离，并用1∶1 MTBE/庚烷洗涤3×7毫升(每次洗涤2体积)，在真空烘箱中在40℃干燥直至恒重，得到3.55克(96％)，纯度83A％的257-40-1。HPLC条件：Vydac C8，cat.No.208TP54，5μ，300A，0.9mL/min.，280nm.A：0.1％TFA/水，
B：80％i-PrOH/20％乙腈和0.1％TFA的混合物
60-80％B/30min典型样品制备：将1mg溶于0.10ml NMP，用1mL乙腈稀释。在20μL环管中注射进样20μL。8.3 通过片段Fmoc-AA13-26OH和HAA27-39NH2的溶液相偶合制备片段Fmoc-AA13-39-NH2
FmocAA13-39NH2可以通过将FmocAA13-26OH的羧基末端分别在DIEA和HAA27-39NH2的存在下使用HBTU或TBTU和HOBT或HOAT转化为活化的HOBT或HOAT酯制备。该反应可在极性，非质子传递溶剂例如DMF或NMP中，在0至25℃进行。反应完成后，加入醇类或水混性的溶剂和/或水，沉淀出FmocAA13-39NH2。实施例：
将FmocAA13-26OH(257-41-1，3.00克，0.8417mmol，1当量)，HAA27-39NH2(2.23克，0.8417mmol，1当量)，HOBT水合物(0.135克，0.884mmol，1.05当量)溶于DMF(25毫升，30分钟.)中，用冰浴冷却，并先用DIEA(0.23毫升，1.33mmol，1.50当量)然后用HBTU(0.335克，0.884mmol，1.05当量)处理并搅拌。1小时后反应基于起始原料的消耗(HBLC)完成90％，并升温至室温。4小时后，加入另外的HBTU(0.150克，0.395mmol，0.5当量)，并将反应搅拌过夜。滴加加入甲醇(50毫升)，而后滴加水(50毫升)使得胶质化，在室温搅拌16小时后固化为淤浆。过滤收集固体，用2×20毫升1∶1甲醇∶水洗涤，并干燥至恒重得到5.18克(99％)FmocAA13-39NH2，纯度60A％。固体含有各5A％的酸和胺起始原料。HPLC条件：Vydac C8，cat.No.208TP54，5μ，300A，0.9mL/min.，280nm.A：0.1％TFA/水，
B：80％i-PrOH/20％乙腈和0.1％TFA的混合物
60-80％B/30min典型样品制备：将1mg溶于0.10mlNMP，用1mL乙腈稀释。在20μL环管中注射进样20μL。8.4 通过除去Fmoc基团制备片段HAA13-39NH2
FmocAA13-39NH2的Fmoc保护基可用碱例如哌啶或碳酸钾在有机溶剂例如DCM、DMF、NMP、MTBE、己烷或它们的混合物中除去。实施例：
将FmocAA13-39OH(257-43-1，0.500克，0.0810mmol，1当量)悬浮在9毫升(18体积)的2∶1 MTBE/庚烷中30分钟，然后用哌啶(40μL，0.404mmol，5当量)处理。搅拌淤浆2小时此时残余40％的起始物料(HPLC检测)。加入另外的MTBE(3毫升，6体积)和哌啶(20μL，2.5当量)，搅拌淤浆直至残余＜1％起始物料(16小时)。抽滤过滤反应淤浆，用2×5毫升的1∶1 MTBE/庚烷洗涤，干燥至恒重，得到0.40克(90％)，纯度约60-70A％。HPLC条件：Vydac C8，cat.No.208TP54，5μ，300A，0.9mL/min.，280nm.A：0.1％TFA/水，
B：80％i-PrOH/20％乙腈和0.1％TFA的混合物
60-80％B/30min典型样品制备：将1mg溶于0.10mlNMP，用1mL乙腈稀释。在20μL环管中注射进样20μL。9.实施例：全长T-1249肽的合成
在此第9.1-9.2部分描述了应用肽中间体片段制备全长T-1249肽的实施例。
本部分的实施例表明从肽中间体片段可通过固相和液相合成技术偶合成功地制备全长T-1249肽。9.1 通过AcAA1-12OH与HAA13-39NH2的液相偶合制备片段AcAA1-39NH2
在这里描述的合成路线代表了T-1249三片段方法的顶点-如图1中示意地描述。AcAA1-39NH2可以通过将AcAA1-12OH的羧基末端分别在DIEA和HAA13-39NH2的存在下使用HBTU或TBTU和HOBT或HOAT转化制备活化的HOBT或HOAT酯。反应完成后，加入醇类或水混性的溶剂和/或水，沉淀出AcAA1-39NH2。实施例：
将HAA13-39(257-32-2，0.409克，0.0685mmol，1当量)，AcAA1-12OH(257-21-1，0.174克，0.0685mmol，1当量)，和HOBT水合物(0.013克，0.0822mmol，1.20当量)溶于DMF(6.0毫升，12体积，30分钟)中。该溶液用冰浴冷却，并先用DIEA(18μL，0.1028mmol，1.5当量)，然后用HBTU(0.031克，0.0822mmol，1.20当量)处理。在0℃下搅拌4小时后，滴加水(6毫升)。搅拌得到的淤浆1小时，然后抽滤过滤分离。在真空烘箱中在40℃干燥过夜，得到0.545克(94％)的257-33-1，纯度大约50A％。HPLC条件：Vydac C8，cat.No.208TP54，5μ，300A，0.9mL/min.，280nm.
A：0.1％TFA/水，
B：80％i-PrOH/20％乙腈和0.1％TFA的混合物
60-80％B/30min典型样品制备：将1mg溶于0.10ml NMP，用1mL乙腈稀释。在20μL环管中注射进样20μL。9.2 通过AcAA1-39NH2的侧链脱保护制备T-1249
本部分的实施例表明从肽中间体片段可通过固相和液相合成技术偶合成功的制备全长T-1249肽。尤其，在这里描述的合成路线代表了T-1249三片段方法的最终的脱保护步骤-如图1中示意地描述。优选，AcAA1-39NH2的侧链保护基通过使用95/5三氟乙酸/水和至多5wt/vol％的碳正离子清除剂例如二硫苏糖醇，二巯基乙烷或胱氨酸的酸解除去。T-1249粗品从脱保护溶液中通过加入醚类例如MTBE、乙醚或二异丙醚而沉淀出来。实施例：
将AcAA1-39NH2(257-33-1，0.120克)用1.5毫升新鲜制备的TFA∶DTT∶水(95∶5∶5)溶液处理，并在室温下搅拌4小时。加入MTBE(大约3毫升)，真空过滤收集沉淀。将细粉末在真空烘箱中干燥过夜。将该原料溶于3毫升含有1％HOAc的50％乙腈/水中，并放置15小时以便进行色氨酸的吲哚侧链的脱羧。直接分析该溶液，并发现与真正的T-1249共同洗脱出。HPLC测定纯度近似为60％。HPLC条件：Vydac C8，cat.No.208TP54，5μ，300A，0.9mL/min.，280nm.
A：0.1％TFA/水，
B：80％i-PrOH/20％乙腈和0.1％TFA的混合物
60-80％B/30min
典型样品制备：将1mg溶于0.10ml NMP，用1mL乙腈稀释。在20μL环管中注射进样20μL。
序 列 表<110>Kang等<120>用于肽合成的方法和组合物<130>7872-064<140>09/349,205<141>1999-07-07<160>8<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>39<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述：肽片段<400>1Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln 1 5 10 15Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Lys Trp
20 25 30Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe
35<210>2<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述：肽片段<400>2Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu 1 5 10<210>3<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述：肽片段<400>3Glu Gln Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu 1 5 10<210>4<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述：肽片段<400>4Gln Lys Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Glu Trp 1 5 10<210>5<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述：肽片段<400>5Gln Lys Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe 1 5 10 <210>6<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述：肽片段<400>6Glu Gln Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys 1 5 10 15Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe
20 25<210>7<211>26<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述：肽片段<400>7Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln 1 5 10 15Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu
20 25<210>8<211>26<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述：肽片段<400>8Glu Gln Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys 1 5 10 15Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Glu Trp
20 25