其上形成有表面处理层的玻片 【技术领域】
本发明涉及用于分析有遗传分析、诊断、治疗处理等用途的基因或蛋白等生物材料的玻片；也涉及应用该玻片分析基因、蛋白、多肽等生物材料的方法。背景技术
关于目前为止用于遗传分析等的玻片，那些由玻璃尖头(glass tips)制成的，并且经加工可使10000或更多的基因如DNA(脱氧核糖核酸)片段(DNA探针)附着于表面的玻片被广泛应用。
应用上述的尖头，举例来说，当想要测定DNA样品的碱基序列时，将成千上万的已研究清楚的，并且碱基序列互不相同的DNA片段附着于玻片，而使它们各自的位置也能被追踪；当荧光标记的DNA样品灌注于玻片上面时，这些DNA片段就与玻片附着的DNA片段(探针)中具有互补序列的探针进行杂交。杂交的部分作为玻片上的点能用荧光检测手段鉴定出来。因此，就能说明样品中的DNA片段的序列。
用于遗传分析的玻片，由于其上特定DNA碱基序列能容易地用上述的方法鉴定出来，已经应用于遗传分析如生物基因组分析，监控基因表达、基因组错配等，和如检测致癌基因地突变的遗传诊断或者药物开发。
运用上述的用于遗传分析的玻片，扩增DNA样品，并且经荧光辐射而分析判断出现在玻片上的样点。
然而在目前用于遗传分析的玻片中，玻片必须经预先处理，比如在分析上述的样点之前，玻片需被洗涤，这样操作使点印的DNA片段会被洗脱下来，因此在很多情况下，这些样点不能被清楚地检测。
本发明的目的是为了解决在遗传分析现有技术所用的玻片中荧光检测不清楚的问题。发明公开
本发明的玻片的特征在于玻璃表面上形成有特殊的表面处理层，而DNA探针、蛋白、多肽等生物材料能被置于该玻璃表面上，并且通过该处理层，点印的DNA片段、蛋白、多肽等能被牢固地固定在玻片表面而不会在洗涤中被洗掉，并且经荧光辐射能产生确定的荧光点。
也就是说，本发明的玻片的特征在于在玻璃基质表面形成于表面处理层。
在这样的玻片中，上述的表面处理层优选为金钢石，金钢石样碳或碳类型材料，或是它们的混合物，或是它们的叠合层(laminating layer)。
在这样的玻片中，当光波长在400nm至500nm之间时表面形成有上述金钢石样碳的玻片的光透射率优选为50％或更高。
在这样的玻片中，当光波长在600nm至700nm之间时表面形成有上述金钢石样碳的玻片的光透射率优选为70％或更高。
在这样的玻片中，上述表面处理层的厚度优选为1nm至1000nm。
在这样的玻片中，上述的金钢石样碳优选经离子化蒸汽淀积方法在含有1到99％体积的氢气和剩余的99到1％体积的甲烷气体的混合气中制备而成。
本发明的玻片的特征在于玻璃基质的背面形成有反射层。
本发明的玻片的特征在于寡核苷酸片段保留在上述的表面处理层上。
本发明的玻片的特征在于蛋白或多肽保留在上述的表面处理层上。
本发明的玻片可用于使用这种玻片分析如基因、蛋白、多肽等生物材料的方法。附图简述
图1是把探针固定于玻片上的概要图解实施本发明的最佳方式
本发明的玻片中，玻片表面形成有表面处理层，通过该处理层增强对基因、蛋白、多肽等生物材料的亲和性，因此这种玻片优先用于将DNA样品置于表面处理层上的大量分析中。
作为这种表面处理层，优选被有碳类型材料如金钢石样碳(DLC)，金钢石、石墨等的那些。
表面形成有碳类型材料如金钢石、金钢石样碳(DLC)、石墨等的表面处理层能牢固地捕获DNA探针。
也就是说，由于碳表现有好的化学稳定性，它能抵制固定DNA探针等过程中的反应发生。其原因被认为是当探针如DNA固定在碳层上时，它能与碳形成共价键，如图1所示，而能使DNA探针牢固地固定在玻片表面上。
而且，上述碳材料如金钢石样碳(DLC)、金钢石、石墨等同另一种材料，例如金属或陶瓷的混合物也可以用作表面处理层。
或者，上述碳类型材料如金钢石样碳(DLC)、金钢石、石墨等与其它材料构成的薄膜叠层材料也能用作表面处理层。
图1所示的被固定的探针在玻片表面几乎是竖直的，所以每单位表面积的固定密度得以增加。
任何合成的金钢石、高压制成的金钢石或天然金钢石都可以用作上述表面处理层的原材料。不管它们的结构是单结晶体还是多晶体。从生产性角度看，也优选用气相合成法，如微波等离子体CVD(化学蒸汽淀积)过程，形成金钢石薄膜。
或者，形成无定形的金钢石样碳薄膜作为玻璃基质上的表面处理层也是可能的，因为它与金钢石有相同的性能并且更经济。与金钢石或石墨相似，金钢石样碳由碳原子构成，并且由于它具有与金钢石相似的特性而被称为DLC。DLC的晶体结构是无定形的。
碳类型的材料如石墨也可以优先用作上述的表面处理层。金钢石有规则的四面体结构，由中心碳原子和四个角碳原子构成。由于形成sp3杂化轨道，使得金钢石是极度坚硬的立方体晶体。
关于碳类型材料，石墨或无定形碳为其中的例子。石墨是六角形晶体，具有通过π电子键形成的sp2杂化六角形网格层面结构。无定形碳没有确定的晶体结构，无定形碳也包括结晶程度低的微晶质碳。
此外，还有根据晶体的大小或排布程度，包括从无定形碳至石墨的中间结构的碳类型材料。这些材料没有确定的修饰点。本发明的碳材料包括石墨或无定形碳单体，石墨与无定形碳的混合物，以及那些具有无定形碳和石墨间中间结构的材料。
在本发明中，上述碳类型材料如金钢石、DLC、石墨等可用作表面处理层。
此外，DLC薄膜、金钢石薄膜、以及碳类型薄膜的交替叠合层也可用作本发明的表面处理层。
本发明的表面处理层的厚度虽没有特别的限制，但应在1-1000nm之间。厚度小于1nm的表面处理层由于太薄而不能给出均匀的层面，并且有时在玻璃基质表面产生不利的非包被部分。而另一方面，也不是优选超过1000nm的包被，因为表面处理层内的压力容易造成层面的剥离。
考虑到工业生产性，表面处理层的厚度优选10nm至500nm，更优选为30至200nm。
当用上述等离子体CVD过程处理时，表面处理层金钢石的形成速度可根据操作条件如反应罐内压力、偏电压(bias voltage)或基质温度等适当决定。
可以控制表面处理层中的金钢石浓度，例如，当DLC薄膜经等离子体CVD处理形成时，可通过调整作为替换气体的氮气的供给，以改变烃气体源中的氢/碳比例来实现。
当氮气供给提高时，DLC薄膜的氢气吸收量也增加，结果DLC中的金钢石浓度升高。相反，当氮气供应下降时，DLC薄膜的氢气吸收量也降低，结果DLC的金钢石浓度会相应下降。
在玻璃基质表面形成金钢石、DLC、石墨等表面处理层时，高频等离子CVD处理，离子化蒸汽淀积处理，电弧蒸汽淀积处理，激光蒸汽淀积处理等类似工艺都可应用。
在高频等离子CVD处理中，原料气体(甲烷)被产生于电极间的辉光放电以高达13-56兆赫的频率所降解，而在基质表面合成DLC薄膜。在离子化蒸汽淀积处理中，原料气体(苯)被钨丝产生的热离子(thermion)降解并离子化。DLC薄膜也可以在混合气体中以离子化蒸汽淀积处理形成，这种混合气体包含有1-99％体积的氢气和剩余的99-1％体积的甲烷气体。
DLC薄膜通常是黑色，但在本发明的玻片中，它优先为透明的薄膜。其原因是由于本发明通过测定玻片表面经辐射后的荧光强度来进行基因分析，因而光透射率是必需的。
本发明中，表面形成有表面处理层的玻片的光透射率在光波长为400-500nm(蓝光范围)时优选为50％或更大，更优选的为60％或更大。
另外，当光波长为600-700nm(红光区域)时，光透射率优选为70％或更大，更优选的为75％或更大。根据上述各自光区域的光透射率，荧光标记的强度就能被测定。
在生产具有这种光透射率的金钢石样碳时，比如用离子蒸气处理，提高烃气体和氢气混合气中的氢气含量会提高光透射率。
上述的离子化蒸汽淀积处理是由Weissmantel等设计的DLC薄膜形成方法，其中离子源包含阴极(热纤丝)，作为反向电极的阳极栅格，和包围它们的金属圆柱筒。
下面描述经离子化蒸汽淀积处理生产提高玻片表面光透射率的金钢石样碳的具体实施方案。
例如，厚度为10nm的金钢石样碳(DLC)薄膜形成于厚度为1mm的玻片上(Matsunaga Glass Co.，S-1112)。检测覆盖有DLC薄膜的玻片的光透射率，结果如下。DLC薄膜形成于没有氢气(体积比为0％)的气体环境中时，在400nm波长下(玻片的)光透射率为88.7％。当DLC薄膜形成于氢气体积比为1％的气体环境中时，玻片在400nm波长下光透射率为89.4％。此外，当DLC薄膜形成于氢气体积比为80％的气体环境中时，玻片在400nm光波下的光透射率为90.8％。如上所述，我们发现随着氢气比例的升高，光透射率增大。
若在700nm波长下测定光透射率，当DLC形成于没有氢气(体积比为0％)的气体环境中时，玻片的光透射率为90.0％；当DLC薄膜形成于氢气体积比为1％的气体环境中时，玻片的光透射率为90.8％。当DLC薄膜形成于氢气体积比为80％的气体环境中时，玻片的光透射率为92％。综上所述，我们发现，与在400nm波长下的测定相似，光波长为700nm时，光透射率随着氢气比例的升高而增加。
另一方面，没有表面处理层的玻片本身(空白)的光透射率在400nm的波长下为91.0％，在700nm的波长下为92％。
光透射率可由下面的公式计算得出：
光透射率T＝(I/I0)×100
I：空白的透过光强度
I0：形成有表面处理层时的透过光强度。
氢气的存在能增加透明度的原因被认为是存在氢气时包含有大量透明的sp3轨道，而缺乏氢气时会含有大量导致颜色的sp2杂化轨道。然而，氢气的含量优选为体积比1到50％，因为高含量的氢气延缓金钢石样碳薄膜的形成。
在电弧蒸汽淀积处理过程中，固体石墨材料(阳极蒸气源)和真空管(阴极)之间存在着直流电压，在真空中产生电弧放电，它能导致碳原子等离子体产生，其中通过向其上将形成薄膜的基质上加负偏电压而使碳离子向基质加速运动。
在激光蒸汽淀积处理过程中，例如，Nd：YAG(钇铝石榴石)激光器(脉冲振动)，光被辐射到石墨靶板上，融化的石墨聚集在玻璃基质表面形成薄膜。
另外，在表面形成有表面处理层的玻片背面形成如金属蒸发薄膜的反射层是适当的作法。
在玻片背面形成这样的反射层，当荧光从前表面被辐射时，能有效地增强荧光反射效率，使得荧光分析器的敏感性增强。也就是说，荧光点可以被清楚地观察到，并且在同一时间可以分析大量的荧光点。
形成于玻片背面的反射层优选由单层的钛(Ti)、金(Au)、铂(Pt)、铌(Nb)、WC等或者它们的复层制成。反射层的厚度优选100nm或更大，更优选为1000nm或更大，因为它必须被均一地覆盖在玻片的整个表面。这种反射层的形成通常能用真空蒸发方法(vaccum evaporation method)实现。此外，另一种目前已知的适合于形成上述反射层的技术如喷镀法(sputtering)，离子束蒸汽淀积处理及其他类似技术也可被适当地应用。
在本发明的玻片上，能放置大量生物材料，如基因，例如DNA探针，或蛋白等。因此，玻片表面应有多个微区，以便使一些寡核苷酸片段保留于一个微区中。优选应用这样的玻片。在单独的微区中，可以根据目的用途，没有任何特别限制地改变DNA探针的种类。
对于玻片的形状没有限制，例如它可以是薄膜、薄片的平板状，也可以是盘状。对于玻片的厚度和大小，也没有特殊限制，并且可以制成与传统应用的玻片同一范围的尺寸。
虽然用作玻片基质的玻璃材料的性质没有被特殊限制，但考虑到覆盖在基质表面的反应性材料的不同特点如亲和性，玻璃材料需作适当选择。
玻璃基质表面应特意地优选制成粗糙度为1-1000nmRa的粗糙表面。这样的粗糙表面能有效增加基质的表面积，有利于高密度地固定大量DNA探针。
能固定于本发明玻片上的寡核苷酸片段(探针)包括单链或双链DNA或RNA片段，并且对碱基的数目没有特殊限制。寡核苷酸片段的固定可通过在玻片表面形成化学键实现。例如，用金钢石样碳在玻片表面形成表面处理层时，玻片表面被活化，即经加工使之易与DNA形成化学键，并且能结合DNA末端碱基的氨基基团。
下面举例说明这种情况下玻片表面的活化。将固体支持物上的玻片在氯气中用紫外光照射，来氯化金钢石样碳薄膜的表面，然后在氨气中用紫外光照射以胺化，再用适当的酰基氯或二羧酸酐羧基化；在脱水条件下，末端羧基与碳二亚胺或二环己基碳二亚胺以及N-羟基琥珀酰亚胺缩合。在这个过程中，可能固定住一个基团，此基团能在烃基末端通过酰胺键附着活性酯基团如N-烃基琥珀酰亚胺酯。
因此，通过活化玻片表面，例如，成千上万的已阐明的DNA片段(探针)、蛋白、多肽等都能被保留于其上。
此外，也是可能在玻片上结合寡聚dT引物，并通过此寡聚dT引物，目标cDNA经逆转录反应延伸，同时被结合于玻片表面。
而且，大量的DNA链通过PCR被延伸并结合在玻片上。
DNA片段这样结合以后，荧光标记的DNA样品被灌注于其上；DNA样品与粘附在玻片上的DNA片段(探针)中具有互补序列的探针杂交；因此，样品中的DNA序列作为一个荧光点能被说明。
特别地，本发明中用于遗传分析的玻片，由于其背面有反射层，因此荧光点能被清楚地观察到。
如上所述，本发明的玻片与现有技术相比，能根据与现有技术相同的方式，对特定DNA的碱基序列作更加确切的分析和表征。本发明的玻片可用于分析生物基因组、监控基因表达和基因组错配等的遗传分析，也可用于如检测致癌基因突变等的遗传诊断，以及用于药物开发。在下面的例子中，将对本发明作进一步阐述。实施例1
用于遗传分析的玻片按下述提供。应用25mm(宽)×75mm(长)×1mm(厚)的玻璃基质。在这样的玻璃基质表面形成有厚度为25mm的DLC薄膜。DLC薄膜是在95％体积甲烷气和5％体积氢气的混合气中，经离子化蒸汽淀积处理在玻片表面形成的。
然后，对玻片的表面进行化学修饰和活化。
也就是说，玻璃基质的表面被氯化1分钟，胺化10分钟，再浸入酰基氯中10分钟。然后用超纯水洗涤，再浸入活化溶液中直接活化。活化溶液由1ml的1，4-二氧杂环己烷，25mg腈氨基氢(hydrogen cyanamide)和150mg的N-羟基琥珀酰亚胺组成，将它们溶解就得到了活化溶液。基质进一步用超纯水洗涤，然后在65℃晾干进行活化。
在经上述处理的玻片表面滴2ul浓度为500pomol/ml的FAMdA17溶液。这一步中，超纯水或1％甲醛用作缓冲液。
然后，玻片在65℃，水/甲醛(1/1)的气体环境中孵育1小时(晾干)。
对得到的用于遗传分析的玻片，测定荧光强度。在点样和干燥(65℃)后，用LAS-1000Plus仪器测定荧光强度1分钟，结果表明所得的数值比使用现有技术所用的玻片要好。
本发明中的玻片，在点样和干燥后的荧光强度好于现有技术中点样和干燥后的玻片。也就是说，在本发明的玻片中，被点加的如DNA或蛋白等生物片段保留在玻片上而未被洗脱掉，并且能清楚地检测到这些点。
相反，在现有技术的玻片中，被点加的如DNA或蛋白等生物片段被洗脱掉而不能保留在玻片上，并且那些点不能被清楚地检测到。实施例2
用于遗传分析的玻片按下述提供。采用25mm(宽)×75mm(长)×1mm(厚)的玻璃基质。厚度为500nm的金钢石薄膜合成于玻璃基质表面。在金钢石薄膜合成的过程中，采用激光削蚀(ablation)处理，此过程中碳原子在氧气氛中，从含有金钢石的靶位点散射并聚集。
随后，玻片表面以与实例1相同的方式被化学修饰及活化。对于得到的用于遗传分析的玻片，荧光强度的测定方法与实例1相同。本发明的玻片在点样和干燥后的荧光强度优于现有技术玻片。实施例3
用于遗传分析的玻片按下述提供。采用25mm(宽)×75mm(长)×1mm(厚)的玻璃基质。经喷镀处理，在玻璃基质表面形成石墨薄膜。碳原子在氩气氛中从含有石墨的靶子散射出来并聚集在基质表面形成25μm厚的石墨薄膜。
化学修饰、活化玻片表面的方式与实例1相同。对得到的用于遗传分析的玻片，采用与实例1相同的方法测定其荧光强度。本发明的玻片在点样和干燥后的荧光强度优于现有技术的玻片。产业可应用性
即使在本发明中采用旧的仪器或处理技术，与现有技术相比本发明的玻片能对DNA碱基序列进行更确切的分析和鉴定。
本发明的玻片能有效地用于如分析生物基因组、监控基因表达、基因组错配等的遗传分析中，或者用于对蛋白质等生物材料的分析中。
此外，本发明的玻片可用于如检测癌基因突变的遗传诊断或者药物的开发。