通过两性体细胞的分离/融合,制造同种哺乳动物 雌、雄人工配子,并用它们两两结合成人工合子 本发明是一项全新的生物技术,具体一点讲是一项与哺乳动物的生殖及其应用工程密切关联的新技术,它提供了一种将成年哺乳动物两性个体体细胞的染色体一分为二或者减少一半,生成人工配子;然后用人工配子两两杂交成人工杂合子或者自交成双倍人工纯合子的方法。这些人工合子类似哺乳动物的自然受精卵,都将是重新启动了生长发育程序的新地生命机体,都将是具有分化全能性的初始胚胎干细胞,用它们可以分化发育出该种动物的各级干细胞、组织、器官和新个体。
本发明是一项专业性很强的原创性新技术,在许多人眼里有些不可思议,为了方便大家理解、检索、审查、使用本技术,兹将与本发明相关的一些基本概念和现有技术分别简述如下:
与本发明最为密切的概念有生殖、细胞(包括配子与合子)、染色体、DNA、基因、基因组、干细胞和细胞周期等。
所谓生殖,就是指已有的生物体繁殖新的个体。地球生命圈中大约有200万种生物,概括起来,生殖的方式共有无性生殖和有性生殖两种。不经过性细胞的结合直接由单亲产生子代叫做无性生殖,如1个细菌分裂成2个细菌,剪1截细树枝插在土中又长成1株新树苗。由双亲性细胞相互结合形成子代叫做有性生殖,绝大多数物种都行有性生殖,如植物花中的雌蕊授粉后结出果实和种子,种子播到地里长出新苗;如动物的卵受精后能发育成小动物。
自然状况下,绝大多数植物既可行无性生殖,又可行有性生殖。而在动物界,除了少数低等动物外,都只能通过有性生殖来繁殖后代。人类的食物及其他生活资料,绝大部分都是由动、植物直接或间接提供的。为了解决越来越多的人口的衣食住行问题,人们发明了各种各样的生物生殖及其应用技术,千方百计地提高动、植物的生产能力。为了医治人类自身的疾病和伤痛,人们又发明了种种人类人工生殖及其应用技术。我在这里强调了“应用”的字眼,是因为这些技术的目的,不仅仅是为了获得生物更多的个体,有时还要求产出生殖的半成品——动物、植物及人的组织和器官。
细胞是生物体的基本结构单位和功能单位。细胞的3大属性是我们必须了解的:1、除了病毒和嗜菌体之外,地球上几乎所有物种的机体都是由1个或多个细胞组成的。2、生命源于细胞,所有生物体都是通过细胞的活动来行使新陈代谢、对环境变化做出反应等等生命功能的;生物的生长发育、繁衍后代也都是细胞生长、分裂和分化的过程,连没有细胞的病毒和嗜菌体也得依赖宿主细胞生存。3、细胞源于细胞。不仅一切生物个体的生长发育和种群的增殖繁衍,都源于细胞的分裂,而且构成所有物种的形态和功能各异的细胞都是由共同的祖先(原始细胞)分裂、进化而来的。地球上的所有生物都存在着亲缘关系,都有相似的结构和遗传基因。
不同的细胞有数千万种,形状、大小千差万别,但从结构和功能来看,可以分为原核细胞和真核细胞两大类。原核细胞生物很少,总共不到6000种,都是单细胞的,没有细胞核,只能进行无性生殖,如细菌、蓝细菌和放线菌等。绝大多数物种是真核细胞生物,真核细胞生物是由原核细胞生物进化而来的,主要特征是有了细胞核。真核细胞生物少数只有一个细胞,绝大多数都是由许多细胞组成的。本发明所要讨论的是多细胞真核生物中的高等植物、动物和人。
高等动植物个体都有数以亿万计的细胞,而且细胞的也是多种多样的。譬如,我们人类的1个成年个体大约由100亿亿个细胞构成,不同的细胞达200多种。这么多的分工不同的细胞从哪儿来的呢?原来它们都是由1个初始干细胞——受精卵——繁殖、分化而来的。
行有性生殖的动植物体内的细胞,又可以分为体细胞和生殖细胞两大类。高等生物的生殖细胞与体细胞的首要区别在于:生殖细胞的细胞核中染色体一般是单倍的(1套,记作n),而体细胞的细胞核中染色体则一般是双倍的(2套,记作2n);这也是决定各自性状、功能的本质特征。自然条件下,同种或同属生物的两性生殖细胞之所以能够结合成一个新的生命,而两性体细胞却不能,根本原因就在于此。
雌性动物的生殖细胞叫做卵子,雄性动物的生殖细胞叫做精子,统称为配子,它们是双倍体的卵原细胞和精原细胞减数分裂而来的。卵子经过受精后形成双倍体的受精卵,才能生长发育成新的个体。由2个配子结合而成的双倍体细胞(包括受精卵)叫做合子,其中由异性配子结合而成的合子叫做杂合子,由同性配子结合而成的合子叫做纯合子。
染色体是细胞分裂时细胞核中能被碱性染料染色的一类物质,它是该种生物遗传基因的载体。通常,高等动植物体细胞内的染色体数目是恒定的,而且是成对存在的,称之为双倍体,用2n表示;双倍体产生的配子则只有1套染色体,称为单倍体,用n表示。
以人类为例,每1个体细胞里都有两套(2n)共46条染色体,其中一套来自父亲,一套来自母亲;而父、母生殖器里由精原细胞、卵原细胞减数分裂而来的生殖细胞,则只有一套(1n)染色体。父、母的生殖细胞结合后,便形成1个带有双套(父、母各一)染色体的受精卵,开始一个新的胚胎发育周期。1个小小的受精卵不仅可以分裂出100亿亿个体细胞,还能按照基因的指令分化成外观、功能完全不同的细胞,并分别构成不同的组织和器官。
DNA(脱氧核糖核酸)是一种双链螺旋状大分子,是构成染色体的主要成分。其主要功能有:1、跟组蛋白等形成染色体2、在细胞分裂过程中,通过自我复制从细胞向细胞传递;3、经过减数分裂和受精,从亲代个体向子代个体传递;4、作为模版转录为种种RNA(核糖核酸),再由RNA翻译合成蛋白质。
DNA由4种核苷酸即脱氧腺苷酸(dAMP)、脱氧鸟苷酸(dGMP)、脱氧胞苷酸(dCMP)、脱氧胸苷酸(dTMP)按一定顺序组成。而每种核苷酸又由碱基、脱氧核糖和磷酸基团3部分组成。其中碱基共有4种:腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。DNA上的核苷酸的数目有多有少,但极有规律:DNA的双链严格遵循A与T配对、G与C配对的互补性原则,所以一条DNA链上的核苷酸顺序决定了与之配对的DNA链上相应的核苷酸的顺序,这两条链呈反向平行关系。在DNA的复制过程中,每一条已经存在的DNA链都可以作为模版合成新链,新合成的双链仍然遵循碱基配对的原则,从而保证了复制的准确性。DNA分子的长度一般用互补核苷酸对[即碱基对(bp)]来表示,对于较大的DNA分子常用千碱基对(Kb)、兆碱基对(Mb)表示。
高等动植物的染色体由3种基本类型的DNA构成:1、负责编码可遗传基因信息的DNA。2、位于染色体管尖的端粒,它是控制细胞分裂进程和次数的生命时钟,同时起到保护DNA免遭吞噬、避免单个染色体相互缠绕造成遗传信息混乱的作用。端粒随着细胞分裂次数的增加而不断缩短,就像机械钟表的发条不断松弛一样。3、染色体的着丝点,它使得源染色体能够分裂出复制的染色体来,着丝点是由许多较短的DNA序列重复所构成,常常在染色体中部附近形成纽结。
细胞的分裂或融合过程,也是DNA的复制或融合过程。当DNA复制时,附着其上的基因也随着被复制,这就是物种繁殖的分子基础。
基因是DNA(有时是RNA)上有遗传意义的片段。基因的种类很多,不同的基因长短(即所含碱基对的多少)也各不相同。基因从功能上可分为结构基因和调控基因。结构基因可以转录(DNA→RNA)和翻译(RNA→蛋白质),调控基因只起调节、控制结构基因如何进行转录和翻译的作用。
原核生物的基因是1段连续的DNA片段。真核生物的基因则是1个嵌合体,包含着编码的(外显子)和不编码的(内含子)两部分。因能够表达的外显子被不能够表达的内含子一一隔开,真核生物的基因又被称为断裂基因。
基因是物种遗传信息的基本单位,是物种传宗接代及个体生长、分化、发育的依据,相当于物种生命程序中的一条条指令,它们决定着生物个体的生理特征和某些行为特征。基因的缺失或受损,将会导致该个体的生理缺陷或疾病。基因不是染色体上固定不变的静止结构,是可以分割、移动、置换、改变和修复的。
某一物种个体的细胞核中基因的总和,叫做这个物种的基因组。基因组包含了该物种所有不同的基因,可以说就是制造这一物种个体的并且指导该个体某些环境应激行为的完整的指令集。原始干细胞中的基因组,可以看作该个体浓缩了的全部生命程序。又因为基因组里同时记录了从地球原始生命进化到该物种的全部历史,生命程序是向前兼容的,高等生物生命程序里头总是包含着祖先们的生命印记。
不是愈高级的生命基因的种数愈多,而是基因的使用效率愈高。人类基因组只有3万多种基因,远比某些动、植物的少,就是最有力的说明。这3万多种基因由31亿多个碱基对构成,它们生成和控制着人类25万多种蛋白质,导演着人类生长、繁殖、衰亡的活剧。人类基因组图谱还只是人类遗传基因这部巨著的目录,各个基因的位置、组成、功能及其健康状况才是这部书的内容。一旦这些都搞清楚了,医生就可以通过这个目录去查阅患者的遗传信息,从分子水平根治相关的疾病。
人类基因组图谱的(初步)拟订,使过去“一种基因表达一种蛋白,一种蛋白行使一种职能”的观点不攻自破,自然生命的进化不是完全依赖增加基因来实现的,而主要是通过重组、重新编码、扩充功能、分工合作、丰富表达方式等充分利用原有基因资源的“技巧”,来塑造更高级的生命的;有时还恰恰相反,会在进化中剔除一些多余的基因。一种生命功能的实现,往往是一组基因的同时表达,一组蛋白质协同作用的结果。特别是染色体减半了的生殖细胞里的基因,更具以少胜多的活力和跟异性生殖细胞结合的势能。有理由认为,当两个人工异性配子相遇时,并不需要另寻特定基因产生特定的蛋白质使它们融合为一体,原有的基因会自然重组完成交融成合子的工作。
干细胞是指生物体中能够分化出其他细胞的细胞,它们亦是生物体细胞中的一大类。
干细胞在分化的不同阶段有着不同的分化发育潜能,也就是说,随着分化过程的不断推进,其所能分化出来的细胞种类也越来越少,直到最后成为不能再分化的普通体细胞。根据这种分化能力的不同,干细胞,可以分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。全能干细胞是能够分化出生物体所有细胞的细胞,多能干细胞是能够分化出某些组织或器官不同细胞的细胞,单能干细胞是只能分裂发育成一种细胞或者两种关系密切的细胞的细胞。以人为例,受精卵及其发育初期形成的卵裂球就是全能干细胞,它可以分化发育成一个完整的新个体,亦即这个新个体所有组织和器官里的200多种细胞;脐血和骨髓里的干细胞就是多能干细胞,它们能够分化出红血球、白血球、血小板等等细胞;而单能干细胞,在人体绝大部分组织和器官中都广泛存在,以保证新生的细胞不断替换老化衰亡的细胞,即使局部受伤组织还能再生。干细胞自然分化的不可逆转性在高等动物、特别是人类中表现得尤为突出。
是不是普通体细胞真的不具备分化的潜能了呢?多莉羊克隆成功作出了否定的回答!很可能是:在高等动物的生命过程中,某些细胞分化到一定阶段、发挥了特定功能后,它的分化潜能被生命程序关闭了。现代生物技术业已证明,动物细胞的分化潜能是可以人工逆转的,是可以从新被开启的。
通过细胞的生长、分裂和分化使细胞数量增加的过程,科学家把它叫做细胞周期。细胞周期大致分为G1、S、G2、M等4个阶段:G1期,细胞花10-12小时作复制DNA准备;S期,细胞将用6-8小时复制DNA;G2期,用3-4小时做细胞分裂的准备;M期,分裂成2个子细胞;随后子细胞准备下一轮DNA复制。细胞经历了一个周期的分裂后(除了卵裂球的子细胞之外),一般都要进入一个数天、数周、甚至数年的休眠间期,即G0期,才开始下一次分裂周期。细胞的生长和分裂过程,是完全按照基因书写的生命程序及其应对环境因素的需要进行的。
根据克隆动物供体和宿主细胞同期化的经验,可以推测:同在休眠期的两性体细胞最有可能分离/融合出完美的合子来。
与本发明相关的现有技术主要有克隆、体外受精—胚胎移植(俗称试管婴儿)、器官移植和干细胞工程等:
所谓克隆就是生物的人工无性生殖技术。
植物的人工克隆,古已有之,如利用植物的根、茎、叶及其部分的扦插技术,早已为农民熟练掌握和应用;上世纪中叶出现的单倍体育种,则是一种有性生殖与无性生殖相结合的技术,为了克服作物杂交后代的分离现象,科学家发明了将杂种一、二代的花粉或胚囊离体培养,单性发育成植株,然后加倍成优势稳定的品种,这种技术也得到了普及;现代用试管进行的植物组织和器管培养技术,也正在推广应用中。
哺乳动物的克隆上世纪末才取得实质性的进展,1996年7月在英国诞生的多莉羊宣告了哺乳动物克隆时代的到来。目前动物克隆的技术路线大体上是:先从供体动物体内取出1个体细胞,同时在同种雌性动物体内取出1个未受精的卵细胞,并去掉卵细胞中的核,再把供体细胞核植入卵细胞中;然后把这个带有供体细胞核的卵细胞放入动物子宫中,使之发育成只有供体动物遗传性状的个体或者组织与器管。这叫做核移植。
哺乳动物的克隆,从人类要达到的目的可分为经济性克隆和治疗性克隆,前者如克隆高产毛、蛋、奶、肉的畜禽,后者如克隆奶中含有人类所需蛋白质的转基因牛羊。依据克隆的结果又可分为生殖性克隆和治疗性克隆,前者如克隆濒危野生动物个体,后者如克隆人体器官和组织等。
除了核移植,动物克隆还有如下常用方法:
1、针刺法:用极细的玻璃丝刺穿未受精的动物卵细胞包膜的特定位置,可激发卵细胞分裂、发育。只在低等动物中有成功的例子,如青蛙。
2、理化法:让卵细胞暂时受精,在精核与卵核融合前去除精核,再将该卵置于含有细胞松弛素B的培养基中;等到卵细胞出现两个核时,再放入正常的培养基中,使两核融合产生双倍染色体,细胞即可分裂、发育。
3、双卵融合法:将两个未受精的卵细胞融合在一起,使之具有双倍的染色体,从而能进行正常的分裂和发育。2001年有报道,以色列科学家用这种方法克隆成功人类纯女性胚胎干细胞。我不赞成这类研究,但它证明了人体细胞减数分裂之后再融合形成双倍体,就能像受精卵一样正常分裂和发育。
克隆技术可以用来批量繁殖品质优良的纯种畜禽,也可以用来拯救熊猫一类的濒危动物,甚至可以使猛玛象一类已灭绝的动物复活;还可以克隆转基因动物工厂(生物反应器),专门为人类提供药用奶、蛋、血乃致移植用心、肝、肾等器官。克隆最大最积极的意义在于利用人类胚胎干细胞,复制人类自身的器官与组织,以更换患者重病或重伤的器官与组织。但是,无性生殖是一种低级生命发展形态,克隆技术违背了生命自然进化的规律,动物克隆后代完全照搬了单亲的基因型,基因未经重组,生命活力、免疫能力和环境适应能力减退,易发生灾难性突变,并且导致生物基因库逐步简单化,破坏物种的多样性。
现有的动物克隆方法,还无一例外地剥夺了1~2个卵细胞的受精和发育成个体的权利,并没有增加该物种的数量,而只能改变个体的质量;相反地,其存活率远不如自然繁殖高,不仅白白浪费了珍贵的动物卵细胞,而且造成了畸形克隆动物的痛苦。另外,发明人认为:不仅生物个体有生老病死,生物种群乃至整个生物界同样遵循诞生、发展、衰退、灭绝的自然规律。只有有性生殖才能延长高等生物的进化、发展过程,而克隆技术的推广必然会加快高等生物乃至生物界的衰亡和崩溃。
全人类已经形成共识,生殖性克隆只能应用于动植物,绝不能用于人类。一是因为克隆人技术相当复杂,差错率比一般动物更高,不管将来技术怎样成熟,造成畸形克隆人的几率总远高于正常克隆人;第二就算克隆出了生理上完全健全的克隆人,但是克隆人没有传统意义上的父亲、母亲和家庭,心理上很难跟自然人融恰在一起,将导致人类社会伦理体系的混乱,甚至崩溃;克隆人基因是单亲的简单复制,必然造成人类基因库的简单化、人口质量的退化、因基因突变引起的人种异化等等灾难性后果。又鉴于人体生殖性与医疗性克隆很难划清界限,许多国家都制定了法案,禁止一切与人类胚胎克隆有关的行为。
哺乳动物的体外受精—胚胎移植(In vitro fertilization-embryo transfer)术,早在19世纪就已取得成功,1890年英国科学家就把体外受精的安哥拉白色长毛兔4-细胞胚胎移植到英国短毛兔的子宫里,生产了6只安哥拉白色长毛兔。而人类的体外受精—胚胎移植(俗称试管婴儿技术)研究进行得较晚,1978年7月25日,第一例试管婴儿在英国出生。体外受精—胚胎移植是一种人工两性生殖技术,一般的操作步骤是:先用腹腔镜从母亲的卵巢里取出成熟卵子,同时准备好父亲的健康精子;再在无菌的试管里让精子跟卵子结合,并使其分裂、发育成早期胚泡;胚胎发育成4-细胞或8-细胞时植入女性子宫,让其继续生长、发育,直到分娩。现在,已有成千上万的“试管婴儿”生活在我们这个世界上。试管婴儿技术,为不育夫妇带来了福音,但是它要求双亲必须能够产生健康的精子和卵子,不可能满足所有不育症患者生儿育女的期望;如果借用他人的精子或卵子,从遗传学上来说,不能算是自己亲生的后代。
器官移植是挽救患者生命的有效方法之一,每年需要移植器官的人很多,而可供移植的器官却很少。目前移植用器官主要来源有4∶1、其他人捐献的组织和器官;2、异种动物,如转基因猪等的组织和器官;3、人造医用组织和器官;4、用干细胞(包括自体和他人的干细胞)定向培育的组织和器官。前3种来源的组织和器官,移植后都有不同程度的排异反应,安全隐患严重,且非常紧缺。惟有干细胞(特别是自体干细胞)几乎没有安全问题,是人类器官移植的最佳方式,但目前还在研究、开发之中。
干细胞工程的研究目的不外乎两个:一是利用胚胎或其他组织、器官里余存的干细胞,二是重新启动或扩充细胞的分化潜能。干细胞的研究和应用虽然起步才5~6年,但发展极快,已经形成一门独立的工程技术。干细胞工程是与本发明最为密切的现有技术,因为本发明最主要的目的就是广辟人与其他高等生物干细胞的来源。
目前,世界干细胞工程的主功方向是人体干细胞在再生医学上的应用研究。人体干细胞既可以作为药物注入人体,用以修复受损或患病的特定组织和器官;也可以定向培育成特定的组织或器官,为患者进行器官移植,将成为人类根治病伤、维护健康最有力的武器!
日本科学家已培养成功了人类神经干细胞,并进行了临床实验;美国科学家用干细胞培养成功了人类心脏组织;2001年11月,美国批准了首个慢性肉芽肿性疾病(CGD)的药物认证,干细胞产品走进了市场。此外,造血干细胞(包括脐血、骨髓、外周血干细胞)、血管干细胞、间叶系干细胞移植等都有成功的报道,可以预见未来10年内,人体皮肤、五官、软骨、肝、肾等等干细胞的移植都将广泛应用于临床。2002.6.英国《自然》杂志网络版报道:明尼苏达大学塞姆细胞研究所的研究人员,从成年鼠的骨髓里提取出一种多能干细胞,并在试管中培育。虽然这些细胞增殖了上百倍,其分裂、分化能力还没有出现衰减的迹象;尤为有意义的是,在这些细胞群落中产生了能够阻止衰老的端粒转移酶。科研人员把这些细胞注入老鼠的早期胚胎中,这些细胞竟分化为老鼠身体的大部分细胞类型来。据检测,一些实验鼠身上有40%的组织和器官是由这种骨髓干细胞发育而成的。这一实验证明了哺乳动物的多能成年干细胞,有时同样具有胚胎干细胞的分化能力。老鼠跟人类的基因组很相似,可以推想,人类的干细胞乃至整个体细胞也具有同样的可开发潜能。经济学家们预测未来15年内,干细胞工程将形成一个数百亿美元的产业。
但是,目前干细胞的主要来源是异体的胚胎、脐血和骨髓,不仅资源稀缺,还可能产生免疫排斥反应:为了解决来源问题,科技界寄希望于克隆人体胚胎,这又带来了严重的社会伦理问题。
胚胎干细胞(包括卵裂球)能够分化成各种组织和器官是个不争的事实,但是成熟干细胞是否具有多能性还需进一步探索。2002新年伊始,苏格兰和美国科学家对成熟干细胞分化能力提出了质疑,经过实验,他们认为成熟干细胞是通过与已有的细胞融合形成其他组织的,并非分化出来了新的细胞。此论如果属实,成熟干细胞在组织修复和再生医学上的实用性将大打折扣。但是这一理论却反证了本发明提出的体细胞分离/融合的可能性。
能否利用人类胚胎进行医疗干细胞研究,是当今世界争论得又一最为激烈的问题:赞成者认为此乃今后治疗诸多疑难病症希望之所在,反对者则以为胚胎虽小也是生命,在法律上应予保护。笔者认为卵裂球在演化成胚囊之前还不成其为人,应可用做医疗干细胞,但不能褫夺正常受精卵发育成个体的生命权,最好也不要通过克隆技术取得人体胚胎干细胞,以避免与社会伦理发生冲突,杜绝克隆人的出现。
能不能开辟干细胞的新来源呢?能!那就是本发明提出的体细胞分离/融合技术。
依据近年基因工程和干细胞工程的研究成果,可以推测:一个动物体细胞(特别是干细胞)的染色体,一旦一分为二或者减半,即具有了与其他单倍体细胞结合的势能,具有了类似性细胞的功能,可称为人工配子;在适宜的环境条件下,2个人工配子能够结合成1个双倍体的细胞,将具有受精卵的类似功能,可以叫做人工合子。
本发明是一种能大量制造哺乳动物胚胎干细胞的技术。本发明的主要用途有10∶1、生产人体各级干细胞,供人类再生医疗之用。2、为不孕夫妇生育自己的后代服务,但须严格禁止普通人繁育后代。3、生产动物干细胞,救治应该救治的动物,亦即不能用于救治危害人类和生态环境的动物。4、批量培育、生产重要经济动物杂交新品种,但发明人反对用于远缘动物杂交。5、纯化优良动物品种。6、繁衍濒危动物以及生态平衡和环境保护用动物。7、应用人工动物杂合子或纯合子,大批量定向培养动物的某些组织(如鸡肫、羊肝、牛黄、鸡内金等),作为人类的高营养价食品或特效药。8、为生物蛋白组的研究和开发、蛋白质的重组以及DNA药物(包括寡核苷酸药物、基因疫苗等)的重组,提供取之不尽的原料。不仅有望根治包括癌症、艾滋病在内的人类大多数疾病,还能为人类开辟丰足的营养全面、鲜美可口的新食品。9、为生物计算机的元器件提供充足的原材料。10、为研究开发其他生物材料(如染料、粘接剂、清污剂等)和生物能源(如油脂、乙醇等),提供丰富的资源。
本发明可以推广应用到植物、鱼类、爬行动物、鸟类(包括家禽)、昆虫(如蜜蜂、蚕等)的育种和生产中去,本发明不把这些领域列入保护范围,是为了让有关专家能够更自由地从事这些方面的研究。但需警醒:不得用于有害或不利于生态平衡的动植物的培育和生产。
本发明还能为种属之间的生物杂交提供更便捷、更可靠、更经济的手段,但发明人不主张人工创造新的生物,因此不希望将本发明应用于远缘生物杂交。本分明同样可以用于微生物的杂交,但用于微生物领域是极其危险的,本发明人声明不得应用本技术制造新的微生物,因为即使最初的成果可能会给人类带来好处,但很难控制新微生物的扩散而会弄得不可收拾;同时也很难抑制有害微生物的出现,长远来看最终必然产生灾难性的后果。
在描述本发明的实际内容之前,我们先来看看哺乳动物配子的自然发生、配子自然受精成为合子以及合子分裂发育的过程;
动物的性别分化是由染色体来决定的。一般来说,每种动物的细胞核里都有n-1对常染色体和1对性染色体。以人为例,每个细胞核中有22对常染色体,1对性染色体。其中常染色体男女相同,性染色体各不相同。女性的性染色体为××,男性的性染色体为XY。(参阅附图1)
哺乳动物的配子是由双倍体的卵原细胞或精原细胞减数分裂而来的。1个卵原细胞和1个精原细胞,通常要经过2次分裂生成4个卵子和4个精子。有2种分裂方式:前减数分裂和后减数分裂。大多数动物行前减数分裂,即第一次分裂时染色体数目减半(2n-n),第二次分裂时染色体数目不变(n→n)。又以人为例,双倍体(2n)的卵原细胞,首先减数分裂为单倍体(n)的初级卵母细胞,每个卵母细胞再经普通有丝分裂生成4个单倍体的雌配子,通常只有其中1个能够发育,另外3个(称为极体)将自行消亡;双倍体的精原细胞,首先减数分裂为单倍体的初级精母细胞,每个精母细胞再经普通有丝分裂生成4个单倍体的雄配子。因为男性的性染色体分为2种,第一次减数分裂时就形成了2种不同的精母细胞,一种含有Y染色体,若与卵子结合将发育成男性;另一种含有X染色体,若与卵子结合将发育成女性;它们再经有丝分裂,将分别生成2个成男精子和2个成女精子。(参阅附图2)
精子形如蝌蚪,原因在于:1、要跟众多的同类竞争(动物每次射精都会有数以万计百万计的精子),抢先游到输卵管同卵细胞结合;2、要用头部去顶卵的包膜。
其实精子的形状如何并不重要,只要有外力帮助它同卵子结合,什么样子都是可以的,重要的是它的染色体必须是单倍的。
单倍体的精子与单倍体的卵子结合——受精——成为双倍体的合子,基因重组(含有父母的各一半基因),成为1个重新编写了生命程序的初始全能干细胞、1个新生命的起点。
哺乳动物卵的外围通常都有几层包膜,精子必须冲破这些包膜才能进入卵子。当精子同卵子接触时,顶体(头部)被激活,分泌出顶体酶(Acrosin)把卵包膜消化出一条通道,使精核进入卵内,向卵核靠拢,当两核融合后,宣告受精成功,精子和卵子结合成为1个细胞——合子,即行第一次卵裂,标志着动物胚胎发育的开端。
自然受精具有严格的选择性:1、精子一般只进入同种动物的卵子,卵子也决不让异种精子随意闯入;2、一旦有了精子进入卵子,卵包膜就不再让其他同物种的精子入内。这样的机制,既保证了生育的健康,也保证了物种的纯洁。可见,动物杂交非自然不能为也,而是自然对乱交和无序的一种限制也!所以,人工干预生命千万不可肆无忌惮。
一经卵裂,合子就进入了发育期。合子不断分裂,先后形成实心的桑椹胚和空心的囊胚,细胞的分化能力逐步降低,由全能干细胞逐渐演化为多能干细胞;囊胚细胞不断分裂,先后分化出外胚层、内胚层和脊索中胚层,这一时期新生的细胞都是多能干细胞;3胚层不断增殖,由外胚层分化出神经系统和皮肤等,由中胚层分化出心、血管、血液、骨骼、肌肉、生殖系统等,由内胚层分化出消化系统等,这一时期多能干细胞逐渐演化为单能干细胞;各组织、器官进一步分化、生长、关联,逐步形成胎儿,这一时期新生的细胞多为单能干细胞,但在某些组织(如血液、骨髓)里还存余着一些多能干细胞。
了解了哺乳动物的配子、合子的自然发生、受精和发育过程,就不难理解本发明的主要内容了。
本发明的主要内容是:先将选取来的同种哺乳动物(包括人)两性个体的体细胞(包括各级干细胞)分离成单倍体的人工配子,然后融合成人工合子(两两杂交成杂合子或自交成纯合子)。附图3给出了通用的流程示意图。
下面对照附图3,具体说明一下人工配子、人工合子的一般生成步骤:
第一步,选择同种雌、雄供体动物(包括人)各1个(头)。如果是生产用,应该选取年轻、健壮、没有遗传疾病的动物为供体;如果是医疗用,则应该选取自体或者父母、兄弟、姐妹为供体。
第二步,从雌、雄供体身上,各选取新生、健壮的体细胞(最好是再生能力强的组织或器官中的多能、单能干细胞)若干个。
第三步,对每个细胞的细胞膜、细胞质、细胞核(特别是核内染色体及染色体上的DNA)进行全面检测,清除并灭活所有受损伤、有缺陷的细胞,仅仅保留完全健康的细胞。
第四步,分离染色体。最理想的是,将两性体细胞各自完整地一分为二,使之成为类似两性生殖细胞的单倍体细胞,我把它们叫做零损伤人工配子(参阅附图4)。但是这需要将细胞完全剖开,对细胞的损伤太大,会使大量细胞质流溢,从而使两个配子都难以存活或不能正常发育。
在目前分离技术尚未成熟时,最保险的方法还是用特制的吸取器插入细胞之中,仔细地把核中的1套(n个)染色体完全、干净地吸出并高温杀灭清除之,以保证两性体细胞的一半分离成健全无损的单倍体的配子(参阅附图5)。这样生成的配子姑且叫做保守人工配子。
上面提到的特制的吸取器可由Renou氏吸卵器改进微缩而来,Renou氏吸卵器的结构如附图6所示。吸取器是实施本发明最主要的工具之一,它的用途很多,不仅可以穿刺细胞膜、核膜,抽吸并清除无用或受损的染色体以及其他细胞器、细胞、细胞群、早期胚胎等;还能选取有用的染色体以及其他细胞器、细胞、细胞群、早期胚胎等,它主要是通过真空泵的负压作用来实现这些功能的。基因工程发展到今天,类似的超微、超精细工具和办法很多,可依据具体情况选择使用。
第五步,对人工配子的细胞膜、细胞质、细胞核和活力进行全面、细致的检测,舍弃所有不合格的人工配子并加以高温灭活。对于合格的人工配子必须做到需要多少保留多少,并且一个一个单独保存在试管里,严加控管,避免它(它们)相互或者与正常、非正常细胞融合生成畸形胚胎。
第六步,同期化。来自不同性别、不同个体的人工配子,生长周期不一定同步,这就需要用降温或饥饿(暂时中断养料)的方法,把它们都调控在休眠期内。
第七步,融合。先配备适当的、并掺入了顶体酶的液体培养基,盛入特定的容器中;然后把准备配对的人工配子两两置于同一个容器里,并且不停地轻微震荡,待人工配子复苏后,减少震荡频率。在环境的刺激下,配子产生寻求结合伙伴的化学信号并逐渐靠拢,借助顶体酶的作用,两细胞接触点的细胞膜溶解,2个核逐步融合为1个核,形成双倍体的人工合子。假如融合不很顺利,可以人工穿刺两细胞的细胞膜,并令其在穿刺处相互接触,以帮助其融合。
人工配子的融合有3个方向,各有用途,应根据不同需要来选择:1、异性配子杂交为杂合子,这是最有生长优势、最少伦理问题的人工合子,可广泛用于不孕夫妇生育亲生后代,人类医用干细胞、组织和器官的培养,牲畜的育种和生产,珍稀动物繁殖,食用和医用动物干细胞、组织和器官的培养和生产等等。2、同性同源(同一个体)配子自交为纯合子,这叫做无性纯系繁殖,结果类似克隆,应严格禁止用于人类生殖,但用于自体医用干细胞、组织和器官的培育具有非常积极的意义,是人类再生医疗最有前途的一种途径;另外可用于野生动物抢救性繁育,牲畜的良种纯化,食用动物器脏的生产等。3、同性异源(同性的不同个体)配子互交为杂合子,同样的理由,也应该严格禁止用于人类生殖,但可用于有血缘关系的患者的医用干细胞、组织和器官的培育,也可用于野生动物抢救性繁育,牲畜的良种纯化,食用动物器脏的生产等。
第八步,对人工合子的细胞膜、细胞质、细胞核和活性一一进行全面、细致的检测,将有缺陷及生命力不强的合子高温灭活清除之;保留健全而有生命力的合子。
第九步,将合格的人工合子,一个一个单独地存放在盛有寡营养培养基的试管中,低温保存,令其在调用前保持休眠状态。至此,利用同种哺乳动物两性体细胞分离/融合方法制造人工合子的工作宣告完成。
综合来看,本发明包含两大系列:1、将异源(即不同个体)动物体细胞的染色体一分为二,再两两杂交成合子,简称体细胞杂合。其中又可分为两类:两性杂合和同性杂合。同性杂合又分为雌—雌杂合与雄—雄杂合两种杂合子。2、将同源(即同一个体)动物体细胞的染色体一分为二,再两两融合成纯合子,简称体细胞纯合。纯合也可以分为雌—雌纯合与雄—雄纯合两种纯合子。如下表所示:
将异源体细胞的染色体进行分离/杂合,如果成功,肯定会形成一个新的生命。那么,将同源体细胞的染色体进行分离/纯合又有什么意义呢?有!这一过程将不是简单重复生成1个成熟的体细胞,它将生成1个全新的合子,这个新细胞的端粒将完全得到恢复,生命时钟的发条将重新上紧,生命程序将获得重新编制和新一轮运行,所有基因的功能将重新开启,免疫机制将全面复苏,原来的衰老因素如氧化自由基等不是被清除就会不再起作用……总之,它将是1个全能的干细胞,在再生医疗上的自体或亲体干细胞、组织、器官移植方面大有用武之地。
下面我们特别要讲一讲培养基的制备:培养基是配子、合子以及早期胚胎在哺乳动物体外生长、分化、发育的必要条件,是模拟母亲体内营养条件的人工环境。为了保障配子、合子及早期胚胎的生存和正常发育,培养基应满足如下要求:
1、要有适当离子浓度的生理盐水,替代体液和血浆中的无机成分,以保持恒定的氢离子浓度和渗透压。
2、要有碳水化合物作为生命活动的能源,一般采用适当浓度的葡萄糖或乳酸钠、丙酮酸钠、乳酸钙等。
3、加入适量的肌醇、叶酸、烟酰胺、泛酸钙、核黄素、胸苷、维生素H、维生素12等辅酶和维生素,以利新陈代谢。
4、实时加入适量幼壮哺乳动物血清或脐血清,作为蛋白质的补充来源。
5、加入适量而又比例恰当的各种氨基酸,以利蛋白质的合成。
6、加入适量的青霉素、链霉素等抗菌素,以防止培养基感染细菌。
配子与合子的不同发育期,培养基的成分和比例应有所不同。这一点,卢惠霖教授在《人类生殖与生殖工程》一书中介绍的“常用培养基的成分(参见附图7)”和“体外发生中的培养基(参见附图8)”,可资借鉴。“常用培养基的成分”给出了国际上4种权威“试管婴儿”的体外培养基的基本成分,“体外发生中的培养基”则给出了受精期、卵裂期和成熟期的6种权威微调方案的成分和比例,都是经过长期考验的行之有效的培养基方案,可稍加改进甚至直接用于人类的人工配子、人工合子和早期胚胎的体外培养;加以调整后也可以用于其他哺乳动物的人工配子、人工合子和早期胚胎的体外培养。
至于怎样应用人工合子培育或生产哺乳动物的个体或者干细胞、组织和器官,虽然不属于本发明的保护范围,在这里还是给出了通用的应用流程图,谨供研究和使用者参考,见附图9。
下面对照附图9,简述一下应用人工合子生产哺乳动物(包括人)的个体、干细胞、组织和器官的一般步骤:
第一步,根据生产或医疗的需要,调取适配的冷藏人工合子,加以解冻,使其复苏。
第二步,对调出的合子严格进行检测,有缺陷、没活力的一律高温灭活清除之;只保留健全有生命力的人工合子,备用。
第三步,体外孵育。先模拟相应动物卵裂期子宫中的营养状况制成早期胚胎液体培养基,盛于无菌器皿中,然后把人工合子置于其中,持续轻微震荡,使其生长、分裂。
第四部,对早期分裂的合子进行同步观察和检测,发现异样,即行补救或清除,只保留发育健全的裂球或胚泡,杜绝畸形胚胎的发生。
第五步,当合子发育到2-细胞、4-细胞或8-细胞时期,可朝两个方向移植:1、植入同种雌性动物的子宫中,由人类同性配子结合而成的合子发育物禁止植入子宫。此时,不仅要求植入的胚胎具有相当的发育能力,也要求母亲或代理母亲的子宫内膜发生妊娠变化,有条件接受植入的胚胎并助长其分化发育。2、根据需要转移到特定形状、特定微滴培养基的容器中进行定向培育。培养基不仅需要适时补充适量的营养物质,还应掺入促进细胞分化的因子(如ACTIVIN)。
第六步,在母腹或培养器皿中,新生命由桑椹胚、囊胚逐渐分化出外胚层、内胚层、脊索中胚层,统称原肠胚。这一时期,一定要跟踪检测新生命发育的每一步,不仅要随时调整、补充适量的营养物质,还要随时清除、灭活先天畸形的胚胎,只能让正常的胚胎继续存活与发育。
第七步,如果培养的目标是干细胞或特定组织,此时则可以将胚胎移出子宫或原培养器皿,放入特定的容器和培养基中进行定向培育;否则,仍让其在子宫或原培养器皿中继续发育。
第八步,原肠胚不断增殖,由外胚层逐渐分化出神经系统和皮肤等,由中胚层逐渐分化出心、血管、血液、骨骼、肌肉、生殖系统等,由内胚层逐渐分化出消化系统等,这一发育阶段叫做神经胚时期。此时更应该密切监测胚胎的发育过程,随时调整、补充营养,随时清除、灭活畸形胚胎,严格把关,只让正常胚胎继续发育、生长。
第九步,如果培养的目标是特定的器官,此时应把胚胎移出子宫或原培养器皿,放入特定的培养基和容器中定向培养,适当时候,把培养成的组织附着在用生物降解材料做成的定型骨架上,直到长成所需的器官;如果培养目标是哺乳动物(包括人)的新的个体,则让其继续在母腹中生长发育,直到形成胎儿。这一时期,同样也要严格进行检测,发现畸形细胞、组织、器官,即行清除与灭活;若胎儿畸形,应及早地发现,及时予以补救和引产;以保证最后生产出来健全的干细胞、组织、器官,或者分娩出来健全的新个体。
本分明不仅是创造人工生命的新途径,更是大批量生产哺乳动物的干细胞、组织和器官的新来源,同现有技术相比,有如下优点:
1、本发明是一种全新的人工生殖技术,可以广泛用来繁育哺乳动物的新个体,特别是可以为没有生育能力的人类夫妇生育亲生子女服务。
诚然,哺乳动物的体外受精—胚胎移植技术与克隆技术,也能生成人和其他哺乳动物的新个体。但是,体外受精-胚胎移植必须使用稀缺而珍贵的动物精子和卵子,而且对不能产生健康精子和卵子的夫妇爱莫能助。动物克隆则违背了自然生殖的法则,其后代相当于单亲生命程序的再次启动,基因未曾重新编码,不仅没有自己的体貌和性征,弱化了自然生态系统的多样性,而且对动态变化中的环境的适应能力和免疫力减退,易夭折,也易发生灾难性的突变生成畸形怪物。核移植是目前动物克隆的主要方法,系将克隆对象体细胞核中的DNA导入已经抽去DNA的受体卵细胞之中。为了让这个人工细胞发育,必须诱使这套DNA中的所有已经关闭了的基因(生命程序中的全部指令)重新开启并获得有效、正确地表达,以指示卵子分裂形成一个与克隆对象性状相同的新个体。恰恰相反,被移植的体细胞核由于要进行脚色换位,放弃原先的程序表述方式,采取与胚胎细胞核相同的表达方式,在这一过程中,往往有一些关键基因(如Oct4)的功能得不到正常表达,而使克隆功败垂成。就目前的技术水平来说,90%以上的动物克隆将出现基因异常。有人统计,2001年底之前全世界所做的10000多例动物克隆实验中,只有124条生命降生,其中不到一半能活到成年,而这些存活着的动物绝大部分不是畸形就是有生理缺陷;另外,这些克隆动物能不能正常繁殖后代,后代的性状能不能稳定也不可预测。克隆更不能用于人类的生殖,因为克隆人的差错率比一般动物更高,造成畸形克隆人的几率总远高于正常克隆人;同时必然会造成人类基因库的简单化、人口质量的退化、因基灾变等等恶果;还将引起人类社会伦理体系的混乱。
本发明的核心内容——杂合子——是一种人工两性生殖技术,与自然两性生殖背离不是太远,较其他人工生命技术更顺应自然生命发展的方向,更少伦理问题。由它发育而成的新个体(包括人)都是双亲基因的重组,同时控制生命进程和节律的生物钟——染色体端粒也得到完整地重建,不仅获得了与其他同种个体相区别的体貌、体能和体征,也比其亲代具有更强的环境适应能力、生长势、免疫力和生产力;基因重组大大丰富了物种的遗传内容,增加了健康变异的几率,使该物种乃至生物界朝着多样性的方向发展。
2、自然状态下,哺乳动物单倍体的卵子受精以后,接受了来自精子的单倍染色体而成为双倍体,这时就完成了1个新的生命程序(基因组)的编写,从此开始了它的分化、发育、生长、衰亡的生命历程。正常状态下,从受精卵到胚胎到成年个体直到死亡,其基因组里的基因就犹如计算机程序里的语句依次启动和工作,开启和表达在前的基因完成任务后又启动其他基因进行表达,并自行关闭;如此顺序执行,直到所有基因都完成自己的任务为止。当然,其中有些基因是可循环表达的语句,但完成其使命之后即自行关闭。还有一些基因关闭后可在环境的刺激下复苏,完成任务后也会自行关闭。上述生命进程的每一步,都是由染色体上的端粒精确控制的,细胞每分裂一次,相应的端粒就会缩短一点儿,当端粒不能再缩短时,相应的细胞也就到了寿终正寝的时候了(假如某个基因开启后不能正常关闭,不是端粒出了问题,就有可能本身是病态或致癌基因)。这一机制,可以限制个体生命的无限延长,保障物种的繁衍和发展。但是,作为个体的人或其他动物在遭受危重病伤时,严重受损的组织或器官难以再生和康复。本发明可以使哺乳动物的细胞分化发生逆转,为人类和其他哺乳动物的再生医疗提供充足而便宜的自体或亲体的干细胞、组织和器官。
诚然,传统器官移植技术、干细胞工程和克隆技术也能为患者提供医用干细胞、组织和器官。但是,传统器官植所用的器官主要来源于他人的捐献和异种动物,不仅数量少,而且排异反应严重,使用者往往有生命危险;目前人体医用干细胞主要源于人体自然胚胎、组织余存的多能干细胞或克隆胚胎,不仅稀缺、有排异反应,还存在许多难以消解的伦理问题;医疗性克隆与生殖性克隆的界限很难区分,如果控制不力,势必出现违法制造的克隆人。而应用本发明提供的人体干细胞、组织和器官情况就大不一样了,譬如某个人需要移植某个器脏,即可以将其父母、兄弟、姐妹的体细胞染色体减半杂交成合子,也可以用他(她)自身的2个体细胞染色体减半再融合成纯合子,然后在特定条件下定向培育成那种器官,植入其体内,既没有论理问题,也无免疫排斥之虑,而且资源应有尽有。
3、本发明也应统属在基因工程之下,但它不同于对单个或部分基因进行操作的转基因技术等,而是对整套染色体上的所有基因进行整体操作,自然更少损伤DNA片段、更安全、成功率更高,经济成本更低,伦理问题更少,生态危害更小一些。当然,使用本发明制造动物(包括人)的杂交合子或纯合子也将有一定的出错率,也会产生一定数量的畸形或有缺陷胚胎,这可以通过层层检测在早期就予以淘汰。动物的体细胞数以亿亿计,可谓用之不竭,这样的淘汰成本是很低的。
本发明毕竟是对自然生命进程的一种人工干预,有利也有弊,其社会经济效益是难以估量的,但不宜滥用,否则危害也将是极大的。因此,有必要深入研究由本发明带来的社会伦理问题。应该指出:只有自然生殖才是动物(包括人类)的最好、最合理的繁衍方式。发明人希望本发明只用于经济动物的选育和纯化,拯救濒危或珍稀动物,生产医疗用动物和人体干细胞、组织和器官,让真正丧失生育能力的夫妇生育自己的后代。发明人不赞成用本技术工厂化生产经济动物,更反对用本技术代替人类的自然生殖。应该制定相关的法律,禁止应用人工配子自交合成双倍纯合子或多倍纯合子的方法进行人类生殖实验和实践;应用人工两性配子交合成正常配子的人类生殖实验和实践,也仅仅只限于为的确没有生育能力的夫妇服务;本发明用于动、植物个体或组织器官的培育也应该有严格的限制,都应该以不破坏自然生态平衡、不污染自然生态环境为依归,只有这样才能减轻发明人因发明此项技术带来的惶恐和不安。
附图1为人类男女正常体细胞染色体的对照图,男女体细胞染色体都是双倍的,各有22对常染色体,1对性染色体。22对常染色体男女都一样,不同的只有性染色体,女性的2个性染色体都是X染色体;男性的性染色体则1个是X染色体,另1个是Y染色体。通常,其他哺乳动物的体细胞只是常染色体的对数跟人类不同,性染色体的构成跟人类基本相同。
附图2为人类男女性细胞染色体的对照图,男女性细胞染色体都是单倍的,各有22个常染色体,1个性染色体。女性的性细胞只有一种,也就是其性染色体只有一种,即X染色体,它不能决定后代的性别。而男性的性细胞有两种,一种是成女性细胞,因为其性染色体为X,与女性性细胞结合将发育成女性个体;一种是成男性细胞,因为其性染色体为Y,与女性性细胞结合将发育成男性个体。通常,其他哺乳动物的性细胞只是常染色体的个数跟人类不同,性染色体的构成跟人类基本相同。
附图3给出了本发明的核心技术——把两性体细胞先分离成人工配子,再两两融合成人工合子的流程示意图。其中的圆圈图形只能当作哺乳动物体细胞的通用标记,而不能视作具体的细胞,因为一没有绘出细胞膜、细胞核和细胞质,只有象征性的染色体。二也没有画出某一动物的完整的染色体来,只用两对黑、白染色体分别代表所有雄、雌哺乳动物每个细胞中的n-1对常染色体;用1对标了符号的黑白染色体,分别代表所有雄、雌哺乳动物每个细胞中的1对性染色体。
附图4是用零损伤法生成人工配子的示意图。
附图5是用保守法生成人工配子的示意图。
附图6是Renou氏吸卵器结构示意图,可资改进、微缩成本发明专用的吸取器。
附图7是上世纪80年代以来,国际上通行的4种“试管婴儿”的培养基方案,可作为制订各种哺乳动物配子、合子和早期胚胎的培养基的参考。
附图8是上世纪80年代以来,国际上通行的6种“试管婴儿”的不同发育期的培养基微调方案,可作为制订各种哺乳动物受精期、卵裂期和胚胎期培养基微调的参考。
附图9是应用人工合子培育哺乳动物干细胞、组织、器官和新个体的一般参考流程图。
下面以人为例,讲述一下实现本发明的最好方式:
一、先要作好实施本发明的物质准备:
1、设备:
本发明自始至终都要在无菌环境中操作,并且要同步跟踪监测,因此必须具备如下设备:
无菌室 无菌培养箱 灭菌溶液 火焰灯 紫外灯 高压锅或自动炉 微波炉 通风柜 离心机 冰箱 接种针 试管 烧瓶 烧杯 量筒 微滴培养皿 微型离心管 微型滤板 吸量器以及其他玻璃和塑料器皿 滚筒 轨迹震荡器 光度计 紫外光透照光源液体闪烁计数器 盖革计数器 折射计 天平 pH计 定时器 搅拌器 干燥器 盘子 盆子 夹子 滤纸 硝酸纤维素滤膜 电泳仪 注射器 针头 手套 热封器 不同尺寸的特制吸取器 腹腔镜超声扫描仪 超高倍显微镜 高纯度无菌水等
2、培养基;
(1)配子培养基:可采用附图7所示的“常用培养基的成分”表中的1种基本培养基,加上附图8所示的“体外发生中的培养基”中的受精期培养基,复合而成(最好是每种都试一试)。例如在HamF10基本培养基中加入牛血血清蛋白(5mg/ml)。
(2)合子培养基:可采用附图7所示的“常用培养基的成分”表中的1种基本培养基,加上附图8所示的“体外发生中的培养基”中的卵裂期培养基,复合而成(最好是每种都试一试)。例如在HamF10基本培养基中加入人脐带血清15%,并可考虑加入微量的顶体酶。
二、操作步骤(参照附图3):
1、无菌条件下,借助超高倍电子显微镜和吸取器等工具,在男性和女性供体的健康而且再生能力强的组织上各选取体细胞(最好是干细胞)若干个,用消毒液洗涤干净,一个一个单独放入盛有配子培养基的微滴培养皿中。
2、借助紫外光透照光源、超高倍显微镜、超声扫描仪等设备对每个体细胞的细胞膜、细胞质、细胞核(包括染色体、DNA等)和活性一一进行严格地检测,剔除、灭活有缺陷的活力低的体细胞,保留健全的生命力强的体细胞。
3、将单个的体细胞移放到无菌的广口烧瓶中,在超高倍显微镜下,用微型吸取器插入细胞核中,将其中的一套(23个)染色体完整、干净地吸出并高温灭除掉。如此将所有体细胞一一分离成为单倍体的人工配子,并一个一个单独放入盛有配子培养基的微滴培养皿中。
4、对每个人工配子的细胞膜、细胞质、细胞核和活性等一一进行全面、细致地检测,去除受损的,保留健全的。
5、把温度控制在0~4℃,并且停止供应养分,强迫所有人工配子都进入休眠状态。
6、常温下,将进入了休眠期的人工配子一对一地放进盛有合子培养基的微滴培养皿中,并将所有培养皿搁置在轨迹震荡器上,持续轻微地震动,使两配子逐渐靠拢,借助顶体酶的作用,两细胞接触点的细胞膜溶解,2个核逐步融合为1个核,形成双倍体的人工合子。假如融合不很顺利,可以人工穿刺两细胞的细胞膜,并令其在穿刺处相互接触,以帮助其融合。
这样生成的人工合子有3种类型:1、异性配子杂交而成的杂合子,这是最有生长优势、最少伦理问题的人工合子,可用于不孕夫妇生育亲生后代,人类医用干细胞、组织和器官的培养;2、同性同源(同一个体)配子自交而成的纯合子,包括雌—雌纯合子与雄—雄纯合子,应严格禁止用于人类生殖,但用于自体医用干细胞、组织和器官的培育,是最有希望的一种再生医疗途径;3、同性异源(同性的不同个体)配子互交而成的杂合子,包括雌—雌杂合子与雄—雄杂合子,也应该严格禁止用于人类生殖,但可用于有血缘关系的患者的医用干细胞、组织和器官的培育。
7、对每个人工合子的细胞膜、细胞质、细胞核和活性等一一进行全面、细致地检测,将有缺陷及生命力不强的合子高温灭除掉,保留健全而有生命力的合子。
8、将合格的人工合子,一个一个单独地存放在盛有少营养培养基的试管中,低温保存,令其在调用前保持休眠状态。到此,利用两性体细胞分离/融合的方法制造人类人工合子的工作宣告完成。
利用两性体细胞分离/融合的方法,制造其他哺乳动物的人工合子的程序,跟人类的完全一样,只需调整调整培养基、温度等参数即可。
至于怎样利用人工合子培育和生产哺乳动物(包括人类)的干细胞、组织、器官和新个体,因为不属于本发明范围,在此就不详细叙述了。
附言:
本发明的原始冲动萌芽于发明人的初中时代,至今已30多年,当年在课堂上刚刚接触动物生殖知识时,我就向老师提问:能不能将人的体细胞染色体减半变成生殖细胞?被老师称之为“田氏奇谈怪论”之一。这一想法一直耿耿于心,随着知识渐渐地丰富,懂得了人为干预自然生命的危害性,始终不敢深入研究。年初闻某些科学狂人,执意冒天下之大不讳进行克隆人实验。我想:本发明比克隆技术更接近自然生命过程,同时只有本发明是反击和抵消克隆人技术的最好武器,于是决定申请本专利。