表达增强型绿色荧光蛋白基因的鸭瘟病毒重组疫苗株RDEVTKEGFP及其构建方法和应用.pdf

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1、10申请公布号CN104312982A43申请公布日20150128CN104312982A21申请号201410474947622申请日20140917CGMCCNO945620140708C12N7/01200601C12N15/85200601A61K39/245200601A61K39/295200601A61K39/29200601A61K39/215200601A61K39/17200601A61P31/14200601A61P31/22200601C12R1/9320060171申请人中国农业科学院哈尔滨兽医研究所地址150001黑龙江省哈尔滨市南岗区马端街427号72发明人刘胜。

2、旺李慧昕韩宗玺孔宪刚74专利代理机构北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司11139代理人孙皓晨马鑫54发明名称表达增强型绿色荧光蛋白基因的鸭瘟病毒重组疫苗株RDEVTKEGFP及其构建方法和应用57摘要本发明公开了一种表达增强型绿色荧光蛋白EGFP基因的鸭瘟病毒重组疫苗株RDEVTKEGFP及其构建方法和应用，其中所述疫苗株RDEVTKEGFP的微生物保藏号是CGMCCNO9456。本发明利用重组克隆技术，将包含增强型绿色荧光蛋白EGFP和SCMV启动子序列的基因片段SCMVEGFP插入到鸭瘟病毒的TK基因区中，构建获得在TK基因相应位置插入SCMVEGFP表达盒的重组EGFP鸭瘟病毒，该重组。

3、病毒稳定表达EGFP基因。本发明还涉及构建稳定表达其他禽类病原外源基因的重组鸭瘟病毒疫苗株的方法，以及重组鸭瘟病毒疫苗株在制备预防鸭瘟和其他禽类传染病的疫苗中的应用。83生物保藏信息51INTCL权利要求书2页说明书9页序列表3页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书9页序列表3页附图1页10申请公布号CN104312982ACN104312982A1/2页21一种构建表达增强型绿色荧光蛋白EGFP基因的鸭瘟重组病毒株的方法，其特征在于在TK基因3端HPAI位点插入了包含SCMV启动子和增强型绿色荧光蛋白EGFP基因序列的基因片段SCMVEGFP，构建获得。

4、在TK基因相应位置插入SCMVEGFP表达盒的鸭瘟重组病毒株。2如权利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步骤1PCR扩增获得鸭瘟病毒基因组TK及其两侧的侧翼序列，并将可供病毒识别的真核启动子SCMV启动子以及EGFP基因插入TK基因的3端HPAI位点，构建获得含有EGFP表达盒的重组转移载体，命名为PTKEGFP；2提取鸭瘟病毒的完整基因组DNA；3利用步骤1中获得的重组转移载体PTKEGFP与步骤2中获得的鸭瘟病毒基因组DNA共转染次代鸡胚成纤维细胞CEF，通过荧光显微镜筛选表达绿色荧光蛋白的病毒，再经过病毒蚀斑纯化，获得单一的稳定表达EGFP的鸭瘟重组病毒株RDEVTKEGFP。3如权利。

5、要求2所述的方法，其特征在于步骤1中重组转移载体PTKEGFP是通过以下方法构建得到的1根据DEV病毒基因组TK基因序列及其侧翼序列，应用OLIGO60软件设计1对引物，引物序列如下T1上游5GACGTGTTGGCATCGGTTC3T4下游5AAACAAATAGGGAGTAGCGAAGG32应用所述引物扩增DEVTK基因及其侧翼序列，并将其克隆至PMD18TSIMPLE载体中，构建质粒PTK；将包含SCMV启动子和增强型绿色荧光蛋白EGFP基因序列的基因片段SCMVEGFP插入载体PTK中的HPAI位点，构建转移载体PTKEGFP，优选的，所述SCMV启动子来源于PCS2质粒，优选的，在EGF。

6、P基因两端加入了HINDIII和STUI限制性内切酶位点，可通过该位点将EGFP替换为其他外源基因。4如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的包含SCMV启动子和增强型绿色荧光蛋白EGFP基因序列的基因片段SCMVEGFP的核苷酸序列如SEQIDNO2所示，扩增获得的DEVTK基因及其侧翼序列的核苷酸序列为SEQIDNO1所示。5按照权利要求14任一项所述的方法制备得到的表达增强型绿色荧光蛋白EGFP基因的鸭瘟重组病毒株。6一种稳定表达增强型绿色荧光蛋白EGFP基因的鸭瘟重组病毒株，其特征在于所述的鸭瘟重组病毒株，命名为RDEVTKEGFP株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，。

7、其微生物保藏号是CGMCCNO9456。7权利要求5或6所述的鸭瘟重组病毒株在制备预防鸭瘟或在制备预防鸭瘟及其它禽类传染病的重组鸭瘟疫苗中的应用，包括将权利要求5或6所述的表达增强型绿色荧光蛋白EGFP基因的鸭瘟重组病毒株的增强型绿色荧光蛋白EGFP基因替换为导致其他禽类传染病的病毒的基因，优选的，所述的其它禽类传染病包括能够引起包括鸭、鹅在内的雁形目禽类以及鸡的病毒性传染病。8根据权利要求7所述的应用，其中所述的导致其他禽类传染病的病毒的基因包括禽流感病毒HA基因、新城疫病毒HN基因。9一种用于预防鸭瘟以及禽流感的二价疫苗，其特征在于含有稳定表达禽流感病毒权利要求书CN104312982A2。

8、/2页3HA基因的鸭瘟重组病毒株，所述的含有稳定表达禽流感病毒HA基因的鸭瘟重组病毒株通过以下方法构建得到将权利要求5或6所述的表达增强型绿色荧光蛋白EGFP基因的鸭瘟重组病毒株的增强型绿色荧光蛋白EGFP基因替换为禽流感病毒HA基因，即得。10一种用于预防鸭瘟以及新城疫的二价疫苗，其特征在于含有稳定表达新城疫病毒HN基因的鸭瘟重组病毒株，所述的含有稳定表达新城疫病毒HN基因的鸭瘟重组病毒株通过以下方法构建得到将权利要求5或6所述的表达增强型绿色荧光蛋白EGFP基因的鸭瘟重组病毒株的增强型绿色荧光蛋白EGFP基因替换为新城疫病毒HN基因，即得。权利要求书CN104312982A1/9页4表达增。

9、强型绿色荧光蛋白基因的鸭瘟病毒重组疫苗株RDEVTKEGFP及其构建方法和应用技术领域0001本发明涉及重组病毒疫苗株，尤其涉及一种能够稳定表达外源基因的重组鸭瘟病毒株RDEVTKEGFP及其构建方法和应用，本发明属于生物医药领域。背景技术0002鸭瘟又称鸭病毒性肠炎DUCKVIRALENTERITIS，DVE，是由鸭瘟病毒又称鸭肠炎病毒DUCKENTERITISVIRUS，DEV引起的鸭、鹅及多种雁形目禽类感染的一种急性、热性、接触性传染病。其主要特点是流行广泛，传播迅速，发病率及死亡率高，不同日龄的鸭均易感，给养鸭业造成巨大经济损失，是危害养鸭业的重要疫病之一。0003鸭瘟病毒的自然感染仅。

10、限于雁形目的鸭科成员鸭、鹅、天鹅等。传染源主要是病鸭、病鹅、带毒的家禽及野生水禽。水是本病的自然传播媒介，吸血昆虫可能是本病潜在的传播媒介。感染该病的康复禽有可能成为带毒者，并周期性排毒。鸭瘟病毒与其它疱疹病毒一样，DEV的潜伏和激活都可以引起该病在家养和迁徙水禽中爆发。病毒的感染与品种、年龄和性别无关，成年鸭感染率较幼鸭高。但近年来发现DEV的感染朝低龄化方向发展，且鹅的感染率不断增高，发病率和死亡率多在80以上。鸭瘟病毒只有一个血清型。免疫接种是防治该病的最有效手段。目前国内外预防鸭瘟使用较广泛的是弱毒疫苗，此类疫苗具有免疫效果好、免疫保护力产生快的特点，在高发季节来临前给鸭群进行免疫注射。

11、能有效预防该病。当疫情发生时，在开始初期应当立即对于鸭群中未出现症状的鸭进行紧急免疫接种，可以防止疫病的进一步扩散，对于控制疫情、降低经济损失具有显著效果。然而，随着畜禽集约化养殖业的发展，单价疫苗已显示出其一定的弊端，多次免疫的防控措施费时费力，多价联合疫苗便成为养殖业最受欢迎的疫病防控产品，因而开展禽病多价联合疫苗成为必然选择。0004DEV为疱疹病毒，其基因组为双股线性DNA，大小约为168KB，由共价结合的两个区域组成，包括长独特区UL和短独特区US。2009年LI等首次报道DEVVAC株的全基因组序列，同年，LIU等报道了由DEVVAC株致弱株DEVCLONE03大多数ORF序列LI。

12、UETAL,2009。序列分析表明DEVVAC基因组的构型为D型基因组LIETAL,2009，基因组结构为ULIRSUSTRS。共包括78个开放读码框ORF，其中有65个ORF位于UL区，11个ORF位于US区，另外2个ORFICP4和IE180则分别位于IRS区和TRS区WUETAL,2012。0005疱疹病毒基因组包含大量的复制非必需基因，包括TK、GC、GG、GK、US1、US2、US10、UL41、UL42、US7和US8等。在相关研究中将外源基因插入或替代疱疹病毒的非必须基因，构建重组病毒疫苗，这被认为是一种良好的重组活疫苗病毒载体，目前有关疱疹病毒作为载体的报道包括伪狂犬病载体、传。

13、染性喉气管炎病毒载体、马力克氏病毒载体以及火鸡疱疹病毒载体等。随着鸭瘟病毒研究的不断加深，以DEV为病毒活载体受到更加广泛的关注，DEV作为载体的优势在于该病毒宿主范围较窄，对鸡、火鸡、鸽和哺乳动物均无致病性，不会说明书CN104312982A2/9页5对非宿主动物和人的健康安全造成影响。鸭瘟病毒可在非自然宿主如鸡体内一过性复制而带动外源基因的表达，因此利用鸭瘟病毒作为载体表达鸡源病原的保护性抗原，是开发DEV病毒活载体疫苗的新思路，具有重要的应用前景。目前，针对DEV病毒载体研究进展顺利，WANG利用BAC技术将H5N1亚型禽流感病毒HA基因插入至鸭瘟病毒GC基因中，成功构建表达表达H5N1。

14、亚型禽流感病毒HA基因的重组鸭瘟病毒WANGETAL,2011。LIU等将H5N1亚型禽流感病毒HA基因插入鸭瘟病毒UL41基因中以及US7与US8基因之间，构建两株表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因的重组鸭瘟病毒，免疫鸭群后均可以对DEV和H5N1亚型禽流感病毒产生免疫保护LIUETAL,2011。但是，目前利用DEV非必须基因TK位点开展外源基因的重组病毒构建和应用均未见报道。发明内容0006本发明所要解决的技术问题之一是提供一种构建表达增强型绿色荧光蛋白EGFP基因的鸭瘟病毒重组疫苗株的方法；0007本发明所要解决的技术问题之二是提供一种有所述方法制备得到的表达增强型绿色荧光蛋白EGFP。

15、基因的鸭瘟病毒重组疫苗株；0008本发明所要解决的技术问题之三是提供所述鸭瘟病毒重组疫苗株在制备预防鸭瘟的重组鸭瘟疫苗中的应用。以及所述的鸭瘟重组病毒株在制备预防鸭瘟以及其它禽类传染病的重组疫苗中的应用。0009本发明所要解决的技术问题是通过以下技术手段来实现的0010本发明的一种构建表达增强型绿色荧光蛋白EGFP基因的鸭瘟重组病毒株的方法，其特征在于在TK基因3端HPAI位点插入了包含SCMV启动子和增强型绿色荧光蛋白EGFP基因序列的基因片段SCMVEGFP，构建获得在TK基因相应位置插入SCMVEGFP表达盒的鸭瘟重组病毒株。0011在本发明中，优选的，构建表达增强型绿色荧光蛋白EGFP。

16、基因的鸭瘟重组病毒株的方法包括以下步骤00121PCR扩增获得鸭瘟病毒基因组TK及其两侧的侧翼序列，并将可供病毒识别的真核启动子SCMV启动子以及EGFP基因插入TK基因的3端HPAI位点，构建获得含有EGFP表达盒的重组转移载体，命名为PTKEGFP。00132提取鸭瘟病毒的完整基因组DNA；00143利用步骤1中获得的重组转移载体PTKEGFP与步骤2中获得的鸭瘟病毒基因组DNA共转染次代鸡胚成纤维细胞CEF，通过荧光显微镜筛选表达绿色荧光蛋白的病毒，再经过病毒蚀斑纯化，获得单一的稳定表达EGFP的鸭瘟重组病毒株RDEVTKEGFP。0015其中，优选的，步骤1中重组转移载体PTKEGFP。

17、是通过以下方法构建得到的00161根据DEV病毒基因组TK基因序列及其侧翼序列，应用OLIGO60软件设计1对引物，引物序列如下0017T1上游5GACGTGTTGGCATCGGTTC30018T4下游5AAACAAATAGGGAGTAGCGAAGG300192应用所述引物扩增DEVTK基因及其侧翼序列，并将其克隆至PMD18TSIMPLE载体中，构建质粒PTK；将包含SCMV启动子和增强型绿色荧光蛋白EGFP基因序列的基因说明书CN104312982A3/9页6片段SCMVEGFP插入载体PTK中的HPAI位点，构建转移载体PTKEGFP，优选的，所述SCMV启动子来源于PCS2质粒，优选的。

18、，在EGFP基因两端加入了HINDIII和STUI限制性内切酶位点，可通过该位点将EGFP替换为其他外源基因。0020在本发明中，优选的，所述的包含SCMV启动子和增强型绿色荧光蛋白EGFP基因序列的基因片段SCMVEGFP的核苷酸序列如SEQIDNO2所示图2，扩增获得的DEVTK基因及其侧翼序列的核苷酸序列为SEQIDNO1所示图1。0021进一步的，本发明还提出了按照所述的方法制备得到的表达增强型绿色荧光蛋白EGFP基因的鸭瘟重组病毒株。0022在本发明的一个具体实施例中，一种稳定表达增强型绿色荧光蛋白EGFP基因的鸭瘟重组病毒株，命名为RDEVTKEGFP株，分类命名为DUCKANAT。

19、IDHERPESVIRUS，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏日期为2014年7月8日，其微生物保藏号是CGMCCNO9456。0023更进一步的，本发明还提出了所述的鸭瘟重组病毒株在制备预防鸭瘟或在制备预防鸭瘟及其它禽类传染病的重组鸭瘟疫苗中的应用，包括将所述的表达增强型绿色荧光蛋白EGFP基因的鸭瘟重组病毒株的增强型绿色荧光蛋白EGFP基因替换为导致其他禽类传染病的病毒的基因，优选的，所述的其它禽类传染病包括能够引起包括鸭、鹅在内的雁形目禽类以及鸡的病毒性传染病。0024优选的，所述的导致其他禽类传染病的病毒的基因包括。

20、禽流感病毒HA基因、新城疫病毒HN基因。0025在本发明优选的实施方案中，利用构建的重组转移载体将EGFP基因替换为其他基因如禽流感病毒HA基因或新城疫病毒HN基因等，与TK基因缺失表达EGFP重组鸭瘟病毒基因组共转染鸡胚成纤维细胞CEF，获得稳定表达其他外源基因禽流感病毒HA基因或新城疫病毒HN基因等的鸭瘟重组病毒株。0026在本发明的一个具体实施例中，公开了一种用于预防鸭瘟以及禽流感的二价疫苗，其特征在于含有稳定表达禽流感病毒HA基因的鸭瘟重组病毒株，所述的含有稳定表达禽流感病毒HA基因的鸭瘟重组病毒株通过以下方法构建得到将所述的表达增强型绿色荧光蛋白EGFP基因的鸭瘟重组病毒株的增强型绿。

21、色荧光蛋白EGFP基因替换为禽流感病毒HA基因，即得。0027在本发明的另一个具体实施例中，公开了一种用于预防鸭瘟以及新城疫的二价疫苗，其特征在于含有稳定表达新城疫病毒HN基因的鸭瘟重组病毒株，所述的含有稳定表达新城疫病毒HN基因的鸭瘟重组病毒株通过以下方法构建得到将所述的表达增强型绿色荧光蛋白EGFP基因的鸭瘟重组病毒株的增强型绿色荧光蛋白EGFP基因替换为新城疫病毒HN基因，即得。0028本发明弱毒株应用范围较宽，例如，可应用于制备成预防鸭瘟或其他禽类病原的多价联合疫苗活苗或灭活疫苗等。附图说明0029图1为本发明重组鸭瘟病毒株基因组TK基因插入位点及缺失的TK核苷酸序列；0030图2为本。

22、发明重组鸭瘟病毒株基因组TK基因内部插入的SCMV启动子和增强型绿说明书CN104312982A4/9页7色荧光蛋白EGFP的基因序列；0031其中下划线序列为SCMV启动子的基因序列，灰色字体所示的序列为增强型绿色荧光蛋白EGFP的基因序列。具体实施方式0032下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。0033实施例1转移载体的构建0034根据DEV病毒基因。

23、组TK基因序列及其侧翼序列GENBANK登陆号为AY963569，应用OLIGO60软件设计1对引物，引物序列如下0035T1上游5GACGTGTTGGCATCGGTTC30036T4下游5AAACAAATAGGGAGTAGCGAAGG30037首先应用引物T1上游和T4下游扩增DEVTK基因及其侧翼序列SEQIDNO1所示，并将其克隆至PMD18TSIMPLE载体中，构建质粒PTK；将带有SCMV启动子的EGFP表达盒SEQIDNO2所示插入载体PTK中的HPAI位点图1所示，构建转移载体PTKEGFP。其中，所述SCMV启动子来源于PCS2质粒，并且在扩增时在EGFP基因两端加入了HIND。

24、III和STUI限制性内切酶位点，可通过该位点将EGFP替换为其他外源基因。0038实施例2鸭瘟病毒基因组的提取0039将DEVCLONE03细胞毒以0001个MOI接种于铺满CEF单层的5ML细胞瓶中鸡胚成纤维细胞的制备参照体外培养的原理与技术操作薛庆善，2001，37吸附2H，弃掉病毒液，换DMEM细胞维持液含2FBS，待细胞病变达到8090后，弃掉细胞维持液，加入细胞消化液1860LSTE；100L10SDS；40L蛋白酶K20MG/ML，37消化过夜，加入等体积酚抽提一次，等体积酚氯仿11抽提一次，加入等体积氯仿抽提一次；加入1/10体积NAAC3M，PH52，25倍体积无水乙醇，置于。

25、20沉淀过夜，4离心15MIN，风干后加入适量去离子水溶解病毒基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳检测基因组的完整性，储存于20备用。0040实施例3转染0041DAY1准备细胞0042预先将CEF细胞传代并铺于5ML细胞瓶中，372恒温培养箱培养。0043DAY2转染00441于转染前34H更换细胞培养液00452转染体系A液18L2MCACL2，10GDNA转移载体与病毒基因组比例为31，加去离子水补足体积至150L。B液150L2HEPESBUFFEREDSALINEHBS00463用移液器将A液逐滴加入B液，在加A液的同时利用另一个移液器向B液中缓慢吹入空气，此过程应在12MIN之内完成。00。

26、474将AB混合液置于室温孵育30MIN。00485将混合液加入细胞培养液中。说明书CN104312982A5/9页800496将细胞置于372恒温培养箱培养中继续培养。0050DAY3更换细胞培养液并对细胞进行休克00511更换细胞培养液。00522用1PBS轻洗细胞2次。00533利用DMSO对细胞进行休克。00541用1PBS配制15DMSO。00552将2MLDMSO休克液加入轻洗后的细胞中。00563室温孵育25MIN。00574弃掉DMSO加入新鲜的细胞培养液。00584将细胞置于375CO2恒温培养箱培养中继续培养。00591用1PBS配制15DMSO休克液。00602将2MLD。

27、MSO休克液加入轻洗后的细胞中。00613室温孵育25MIN。00624弃掉DMSO休克液加入新鲜的细胞培养液。0063细胞置于37，5CO2恒温培养箱培养中继续培养。每天观察至出现细胞病变CPE，荧光显微镜下观察是否有表达绿色荧光蛋白的CPE，待CPE达到8090后收获病毒，反复冻融3次，作为蚀斑纯化的种毒，储存于70备用。0064实施例4重组病毒的筛选及鉴定0065将收获的含有重组病毒的病毒液用无血清DMEM做101104稀释，将生长良好的CEF细胞单层用PBS轻洗3次，加入病毒稀释液，37孵育2H后，吸弃病毒液，加入DMEM培养基含1低熔点琼脂糖，10FBS，室温放置30MIN培养基凝固。

28、后，移入375CO2恒温箱中继续培养。待蚀斑出现后，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达进行重组病毒蚀斑的筛选，待蚀斑增长至合适大小，挑取表达荧光蛋白的蚀斑于无血清DMEM中，反复冻融三次后，再次接种于CEF细胞继续进行蚀斑纯化。重复以上步骤，经过3轮蚀斑纯化，获得纯净的重组病毒。将纯化的重组病毒反复冻融三次，取200L病毒液提取重组病毒基因组，方法如下取200L病毒液，加入5L蛋白酶K20MG/ML和20L10SDS，置于56水浴消化2H；等体积酚氯仿11抽提一次，加入等体积氯仿抽提一次；加入1/10体积NAAC3M，PH52和25倍体积无水乙醇，置于2015MIN后，4，离心15MIN收集。

29、病毒基因组，加入适量去离子水溶解后，以该重组病毒基因组为模板，利用引物T1T2对重组病毒进行PCR初步鉴定，PCR产物经09琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收目的片段，将其克隆至PMD18T载体，经筛选鉴定后阳性质粒进行测序，结果与SEQIDNO2所示序列一致，说明构建成功。0066实施例5重组病毒稳定性的测定00671、生长稳定性复制动力学/一步生长曲线0068将预先制备好的CEF细胞传代并铺于12孔细胞培养板中，计算细胞数量。待细胞长成单层后，将重组病毒以0001个MOI接种于生长良好的CEF单层，37孵育2H，弃掉病毒液，加入DMEM细胞维持液含2FBS置于375CO2恒温培养箱培养。分别于。

30、12H、24H、36H、48H、60H、72H、84H、96H后收获病毒，每个时间点做3个平行重复，反复冻融三次，20贮存备用。说明书CN104312982A6/9页90069将不同时间点收获的病毒液做101107倍稀释。将病毒原液与无血清DMEM细胞培养液以110的比例充分混匀。吸取100L病毒稀释液加入至装有900L无血清DMEM细胞培养液的EP管中，重复以上步骤直至病毒稀释至107倍，将病毒稀释液接种于预先铺满CEF单层的96孔细胞培养板中，每个稀释度8个重复，37孵育2H，弃掉病毒液，每孔加入100L的DMEM细胞维持液含2FBS。每个时间点收获的3个不同孔的病毒液按照以上方法进行平行。

31、测定。12H后开始观察细胞病变情况，连续观察，7D后判定结果。按照KARBER法计算病毒的TCID50。统计所有时间点病毒液的TCID50，同时对亲本病毒DEVCLONE03的生长规律进行平行测定，以0001个MOI接种于生长良好的CEF单层，分别于接种后12H、24H、36H、48H、60H、72H、84H、96H后收获病毒，每个时间点做三个平行重复。经测定，RDEVTKEGFP在72H收获的重组病毒滴度最高，为1068TCID50/ML，随着感染时间的增加，病毒的复制对细胞的损伤越来越大，活细胞数目逐渐减少，导致病毒的复制由于宿主细胞的死亡而受到抑制，病毒滴度在72H达到最高后逐渐下降。亲。

32、本病毒DEVCLONE03在72H收获的滴度达到最高，为1079TCID50/ML，随着感染时间的增加，其滴度逐渐下降。可见RDEVTKEGFP重组病毒增殖滴度较亲本野毒稍有下降，但其滴度仍可达到1068TCID50/ML。00702、重组病毒遗传稳定性测定0071将重组病毒接种于CEF细胞连续传代。将重组毒以0001MOI接种CEF细胞，37，5CO2孵育2H，弃掉病毒液，加入DMEM细胞生长维持液含2FBS。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，当CPE达到8090时收获病毒。连续传代至25代，每5代进行鉴定。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，并提取病毒基因组DNA进行PCR鉴定和序列测定。

33、，结果表明，重组病毒经连续传代均能保持遗传稳定性。0072本发明的一种稳定表达增强型绿色荧光蛋白EGFP基因的鸭瘟重组病毒株，命名为RDEVTKEGFP株，分类命名是DUCKANATIDHERPESVIRUS，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏日期为2014年7月8日，其微生物保藏号是CGMCCNO9456。0073本发明将外源基因插入鸭瘟病毒TK基因内部，以EGFP基因为报告基因，在报告基因插入的同时造成TK基因的缺失，构建表达绿色荧光蛋白的TK缺失鸭瘟重组病毒。为了验证本发明作为重组模式病毒在TK基因内部插入其他外源基。

34、因的可能性与表达蛋白的有效性，通过本发明构建重组病毒的方法相继构建了稳定表达禽多种疫病病原免疫原基因，如禽流感病毒HA基因、新城疫病毒HN基因，并将不同重组病毒作为抗原免疫上述病原宿主动物均激发产生相应病原免疫原蛋白的抗体，说明利用本发明获得的稳定表达其他外源基因的重组鸭瘟病毒株和构建稳定表达其他禽类病原外源基因的重组鸭瘟病毒疫苗株的方法，能够制备获得预防鸭瘟和其他禽类传染病的重组疫苗，具有广泛应用价值。为印证本发明获得的重组病毒株和构建方法在制备预防鸭瘟和其它禽类传染病的重组鸭瘟疫苗中的应用，通过以下实施例和实验例来进一步阐述本发明的应用，但应该理解的是，以下实施例和实验例只是举例说明的目的。

35、，并不意味着限制本发明的范围和精神。0074实施例6稳定表达禽流感病毒HA基因的重组病毒的构建及免疫效力评价00751、稳定表达禽流感病毒HA基因的重组病毒的构建0076携带禽流感病毒HA基因的质粒由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所构建并保存，应用OLIGO60软件设计HA基因引物，上游引物引入HINDIII位点，下游引物引入STU说明书CN104312982A7/9页10I位点。利用限制性内切酶HINDIII和STUI处理PTKEGFP转移载体，敲除EGFP基因，质粒骨架仍带有TK侧翼序列和可供病毒识别的真核启动子SCMV启动子，将预先处理的带有HINDIII和STUI粘性末端的禽流感病毒HA。

36、基因插入PTK骨架中，构建含有HA表达盒的转移载体PTKHA。具体地，利用HINDIII和STUI对PTKEGFP质粒和HA片段进行酶切处理，反应体系30LDH2O17L，10HBUFFER3L，XHOI和NOTI各1L，质粒8L，37水浴2H后，经09琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，采用DNA凝胶回收试剂盒OMEGA纯化回收目的DNA片段。将酶切后的载体和HA片段链接，反应体系为10T4DNALIGASEBUFFER1L，T4DNA连接酶1L，载体15L,目的片段65L，16连接过夜。链接产物转化大肠杆菌TG1，鉴定并筛选阳性克隆，提取阳性质粒并经克隆测序，保证序列无。

37、误。0077将RDEVTKEGFP重组病毒以0001个MOI接种于铺满CEF单层的5ML细胞瓶中，37孵育2H，弃掉病毒液，换DMEM细胞维持液含2FBS，待细胞病变达到8090后，弃掉细胞维持液，加入细胞消化液1860LSTE；100L10SDS；40L蛋白酶K20MG/ML，37消化过夜，加入等体积酚抽提一次，等体积酚氯仿11抽提一次，加入等体积氯仿抽提一次；加入1/10体积NAAC3M，PH52，25倍体积无水乙醇，置于20沉淀过夜，4离心15MIN，风干后加入适量去离子水溶解RDEVTKEGFP基因组DNA。0078采用转染试剂，将转移载体PTKHA与RDEVTKEGFP基因组DNA共。

38、转染至CEF细胞，方法同实施例3，获得鸭瘟重组禽流感HA重组病毒RDEVTKHA，重组病毒的筛选和纯化方法同实施例4，对重组病毒的鉴定则利用引物T1T2进行鉴定。同时将重组病毒接种生长良好的CEF单层，在感染后6H、12H、24H、48H、72H分别收获细胞，弃掉上清，PBS轻洗三次，加入RIPA，置于冰上裂解20MIN后，用细胞刮将细胞刮下，加入1/4体积5SDS上样缓冲液，沸水浴煮沸10MIN，冰上放置5MIN，进行蛋白质的SDSPAGE电泳，完毕后按照常规WESTERNBLOT方法将转膜滤纸和硝酸纤维膜NC膜剪成与凝胶同样大小，按照滤纸、NC膜、凝胶、滤纸的顺序依次叠放在一起，排净气泡，。

39、置于半干电转仪中NC膜侧位于阳极、凝胶侧位于阴极，40MA、300V转印90MIN，取出NC膜，经丽春红染色确定转印效果，将转印成功的NC膜置于含5脱脂乳的PBS中，37封闭1H，PBST洗涤3次，每次10MIN；以鸡抗禽流感HA抗体1300为一抗，37孵育2H后，PBST洗涤3次，每次10MIN；以兔抗鸡IGGHRP15000为二抗，37孵育2H后，PBST洗涤3次，每次10MIN，DAB显色，待检测的目的片段显色后，终止反应。结果显示，在重组病毒RDEVTKHA感染CEF细胞48H后可检测到禽流感病毒HA基因的表达，72H后HA基因的表达量更多，而接种亲本毒株的CEF细胞和CEF细胞未检测。

40、到相应的蛋白。0079实施例还依照实施例5的方法对重组病毒RDEVTKHA进行了生长稳定性和遗传稳定性的测定，发现重组病毒RDEVTKHA经连续传代能保持遗传稳定性，并持续表达禽流感病毒HA蛋白。00802、重组病毒RDEVTKHA接种鸭后的免疫效力评价008121试验材料0082211RDEVTKHA株重组病毒由本研究团队构建并在CEF细胞增殖，野生鸭瘟强毒由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存鉴定。0083212SPF试验鸭来自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。说明书CN104312982A108/9页11008422试验方法0085将RDEVTKHA株重组病毒以01ML肌肉注射接。

41、种15只4周龄SPF鸭，另外15只作为对照，接种后7天其中10只免疫鸭和10只对照鸭分别肌肉注射途径攻击致死剂量的DEV强毒株；剩余的5只免疫鸭和5只对照鸭分别采集血清测定流感病毒的血凝抑制价。008623、试验结果0087231RDEVTKHA株重组病毒对DEV强毒的免疫保护0088用重组病毒免疫鸭后7天，所有免疫组鸭均对强毒攻击产生完全保护，而10只对照组鸭在攻毒后6天之内均死亡详见表1。0089表1RDEVTKHA株重组病毒免疫鸭对DEV的免疫保护试验结果00900091232RDEVTKHA株重组病毒免疫血清针对禽流感的抗体测定结果0092用重组病毒免疫鸭后7天，免疫组鸭均产生针对禽流。

42、感病毒的抗体，血凝抑制价测定结果见表2。0093表2RDEVTKHA株重组病毒免疫鸭后血清中禽流感病毒血凝抑制价测定00940095试验结果表明，以本发明以重组病毒构建方法构建的鸭瘟重组禽流感病毒HA基因获得的重组病毒作为疫苗不仅能够对鸭瘟强毒产生完全保护，而且能够产生针对禽流感病毒的抗体，说明本发明具有良好的应用价值。0096实施例7稳定表达新城疫HN基因的重组病毒的构建及免疫效力评价00971、稳定表达新城疫HN基因的重组病毒的构建0098按照本发明构建重组病毒方法，具体地按实施例6针对本研究团队克隆的鸡新城疫CK/CH/HLJ/1/06株病毒HN基因设计引物，上游引物引入XHOI位点，下。

43、游引物插入NOTI位点。利用限制性内切酶XHOI和NOTI构建含有HN蛋白表达盒的克隆载体，应用引物P6和PBUPPER扩增含有HN表达盒的片段，插入到PTK载体的NCOI位点，构建转移载体PTKHN。依照实施例3和6，获得鸭瘟重组鸡新城疫病毒HN蛋白重组病毒RDEVTKHN，重组病毒的筛选和纯化方法同实施例4，重组病毒感染细胞后的裂解产物经WESTERNBLOT方法鉴定，能够与鸡新城疫阳性血清反应。实施例还依照实施例5的方法对重组病毒RDEVTKHN进行了生长稳定性和遗传稳定性测定，发现重组病毒RDEVTKHN经连续传代均能保持遗传稳定性，并持续表达鸡新城疫病毒HN蛋白。00992、重组病毒。

44、RDEVTKHN接种鸡后的免疫效力评价说明书CN104312982A119/9页12010021试验材料0101211RDEVTKHN株重组病毒由本研究团队构建并在CEF细胞增殖，鸡新城疫强毒北京株由本研究团队保存。0102212SPF试验鸡来自中国农科院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。010322试验方法0104将RDEVTKHN株重组病毒分别以01ML肌肉注射接种10只15日龄SPF鸡，另外5只作为对照，免疫后14天分别将免疫鸡和对照鸡攻击新城疫强毒北京株观察14天，统计发病和死亡情况。010523试验结果0106RDEVTKHN株重组病毒接种鸡后14天，免疫组鸡均产生了针对新城疫病毒的抗体，强毒攻击保护率达到10/10，而对照组鸡则在攻毒后10天全部死亡。详见表3。0107表3RDEVTKHN株重组病毒免疫鸡后对新城疫强毒的免疫保护结果01080109试验结果表明，以本发明以重组病毒构建方法构建的鸭瘟重组鸡新城疫病毒HN基因获得的重组病毒作为疫苗免疫鸡能够产生针对新城疫病毒的抗体，说明本发明具有良好的应用价值。说明书CN104312982A121/3页1300010002序列表CN104312982A132/3页140003序列表CN104312982A143/3页15序列表CN104312982A151/1页16图1图2说明书附图CN104312982A16。