采用CRISPR/CAS系统的植物基因组的工程改造.pdf

用于采用本文所述的成簇且规律间隔的短回文重复序列/CRISPR-相关的(CRISPR/Cas)系统进行基因靶向的材料和方法。

1.  一种修饰植物细胞中的基因组物质的方法，所述方法包括：
(a)向所述细胞引入包含crRNA和tracrRNA或嵌合型cr/tracrRNA杂合体的核酸，其中，所述crRNA和tracrRNA或所述cr/tracrRNA杂合体靶向至对所述植物细胞为内源性的序列；和
(b)向所述细胞引入Cas9核酸内切酶分子，该Cas9核酸内切酶分子诱导所述crRNA和tracrRNA序列靶向的序列处或附近的双链断裂，或诱导所述cr/tracrRNA杂合体靶向的序列处或附近的双链断裂。

2.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引入步骤包括：向所述植物细胞递送编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码所述crRNA和tracrRNA或所述cr/tracrRNA杂合体的核酸，并且其中，所述递送通过DNA或RNA病毒进行。

3.  如权利要求2所述方法，其特征在于，所述DNA病毒是双生病毒。

4.  如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述RNA病毒是烟草脆裂病毒。

5.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引入步骤包括：向所述植物细胞递送T-DNA，所述T-DNA包含编码所述Cas9核酸内切酶的核酸序列和编码所述crRNA和tracrRNA或所述cr/tracrRNA杂合体的核酸序列，并且其中所述递送通过农杆菌(Agrobacterium)或剑菌(Ensifer)进行。

6.  如权利要求5所述的方法，其特征在于，编码所述Cas9核酸内切酶的核酸序列操作性连接至启动子，所述启动子是组成型、细胞特异型、诱导型或被自杀外显子的可变剪接激活的启动子。

7.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引入步骤包括：微粒轰击编码Cas9的核酸和所述crRNA和tracrRNA或所述cr/tracrRNA杂合体。

8.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物细胞来自单子叶植物。

9.  如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述单子叶植物是小麦、玉米、水稻或狗尾草。

10.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物细胞来自双子叶植物。

11.  如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述双子叶植物是番茄、大豆、烟草、马铃薯、木薯或拟南芥。

12.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：在所述引入 步骤之后筛选所述植物细胞，以确定所述crRNA和tracrRNA或所述cr/tracrRNA杂合体靶向的序列处或附近是否已发生双链断裂。

13.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括从所述植物细胞再生植物。

14.  如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：杂交繁育所述植物以获得遗传上所需的植物株系。

15.  一种植物细胞，其包含编码与SEQIDNO:12具有至少80％的序列相同性的多肽的核酸。

16.  一种植物细胞，其包含编码如下多肽的核酸：所述多肽包含与SEQIDNO:12的氨基酸810-872具有至少80％的序列相同性的氨基酸序列。

17.  一种病毒载体，其包含编码Cas9多肽的核苷酸序列。

18.  如权利要求17所述的病毒载体，其特征在于，所述载体包含编码如下多肽的核苷酸序列：所述多肽包含与SEQIDNO:12具有至少90％相同性的氨基酸序列。

19.  如权利要求17所述的病毒载体，其特征在于，所述病毒是烟草脆裂病毒或双生病毒。

20.  一种T-DNA，其包含编码如下多肽的核酸序列，所述多肽包含与SEQIDNO:12的氨基酸810-872具有至少80％的序列相同性的氨基酸序列。

21.  一种包含如权利要求20所述的T-DNA的农杆菌(Agrobacterium)菌株。

22.  一种使Cas蛋白在植物细胞中表达的方法，所述方法包括：提供包含T-DNA的农杆菌(Agrobacterium)或剑菌(Ensifer)载体，所述T-DNA包含编码如下多肽的核酸序列，所述多肽包含与SEQIDNO:12的氨基酸810-872具有至少80％的序列相同性的氨基酸序列，其中，该多肽编码序列操作性连接至启动子；
使所述农杆菌(Agrobacterium)或剑菌(Ensifer)载体与所述植物细胞接触；和
使所述核酸序列在所述植物细胞中表达。

23.  如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述启动子是诱导型启动子。

24.  如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述诱导型启动子是雌激素诱导型启动子。

25.  如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使所述植物细胞与编码向导RNA的核酸接触，所述向导RNA与Cas蛋白相关联。

26.  如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述植物细胞是原生质体。

采用CRISPR/Cas系统的植物基因组的工程改造
相关申请的交叉参考
本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请序列号61/790,694的优先权。
有关联邦资助的研究的声明
本发明得到政府的支持，在国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的GM834720和国家自然基金会(NationalScienceFoundation)授予的DBI0923827的资助下完成。政府对本发明拥有某些权利。
技术领域
本发明涉及用于在植物中基因靶向的材料和方法，具体而言，涉及采用CRISPR/Cas系统进行基因靶向的方法。
背景
允许在活细胞中精确修饰DNA序列的技术对于基础和应用研究而言均具有价值。精确基因组修饰–靶向诱变或基因靶向(GT)–依赖靶细胞的DNA-修复机制。对于靶向诱变，序列-特异性核酸酶(SSN)介导的DNA双链断裂(DSB)通常被易于出错的非同源末端连接(NHEJ)通路修复，导致断裂位点处的突变。另一方面，如果供体分子与SSN共同递送，后续DSB可能会刺激所述断裂位点附近的序列与供体分子上存在的序列之间的同源重组(HR)。因此，供体分子携带的任何经修饰的序列将被稳定地整合进入基因组(称为GT)。意于在植物中进行GT的尝试常常受困于极低的HR频率。大多数情况下，供体DNA分子通过NHEJ不合理地整合。该过程的发生与同源“臂”的大小无关；使同源长度增加至约22kb，导致GT的增强不显著(Thykjaer等，PlantMolBiol，35:523-530，1997)。然而，伴随SSN引入DSB能够通过HR大幅提高GT频率(Shukla等，Nature 459:437-441，2009；和Townsend等，Nature459:442-445，2009)。
发明内容
本发明部分基于如下发现：可采用成簇且规律间隔的短回文重复序列(ClusteredRegularlyInterspersedShortPalindromicRepeats)/CRISPR-相关的(CRISPR/Cas)系统来进行植物基因组工程改造。所述CRISPR/Cas系统为在基因组DNA中的选定位点处产生修饰提供了相对简单、有效的手段。CRISPR/Cas系统可用于产生靶向的DSB或单链断裂，并且能够用于(不限于)：靶向诱变、基因靶向、基因替换、靶向缺失、靶向倒位、靶向易位、靶向插入，和通过共表达多重靶向RNA导向的单细胞中的多重DSB进行的多重基因组修饰。该技术可用于提高植物中功能性遗传学研究的速度，以及用于工程改造出具有改善的特点的植物，所述改善特点包括，营养质量增强、抗病和抗应激性提高，以及市场价值化合物的产量提高。
一方面，本发明涉及用于对植物细胞中的基因组物质进行修饰的方法。所述方法可包括：(a)向所述细胞引入一核酸，所述核酸包含crRNA和tracrRNA或嵌合型cr/tracrRNA杂合体，其中所述crRNA和tracrRNA或所述cr/tracrRNA杂合体靶向至对该植物细胞为内源性的序列；和(b)向该细胞引入Cas9核酸内切酶分子，其诱导所述crRNA和tracrRNA序列靶向的序列处或附近的双链断裂，或诱导所述cr/tracrRNA杂合体靶向的序列处或附近的双链断裂。所述引入步骤可包括：向所述植物细胞递送编码所述Cas9核酸内切酶的核酸，和编码所述crRNA和tracrRNA或所述cr/tracrRNA杂合体的核酸，其中，所述递送通过DNA病毒(例如，双生病毒)或RNA病毒(例如，烟草脆裂病毒)。所述引入步骤可包括向所述植物细胞递送T-DNA，所述T-DNA包含编码所述Cas9核酸内切酶的核酸序列和编码所述crRNA和tracrRNA或所述cr/tracrRNA杂合体的核酸序列，其中所述递送通过农杆菌(Agrobacterium)或剑菌(Ensifer)进行。编码所述Cas9核酸内切酶的核酸序列可操作地连接至启动子，所述启动子是组成型(例如，花椰菜花叶病毒35S启动子)、细胞特异型、诱导型或通过自杀外显子(suicideexon)的可变剪接激活的启动子。所述引入步骤可包括：微粒轰击编码Cas9的核酸，以及所述crRNA和tracrRNA或所述cr/tracrRNA杂合体。编码所述Cas9核酸内切酶的核酸序列能操作性地连接至启动子，所述启动子是组成型、细胞特异型、诱导型或通过自杀外显子的可变剪接激活的启动子。所述植物细胞可来自单子叶植物(例如，小麦、玉米、水稻或狗尾草)或来自双子叶植物(例如，番茄、大豆、 烟草、马铃薯、木薯或拟南芥)。所述方法还可包括：在引入步骤之后筛选所述植物细胞，以确定在所述crRNA和tracrRNA或所述cr/tracrRNA杂合体靶向的序列处或附近是否已发生双链断裂。所述方法还可包括从所述植物细胞再生植物，并且在一些实施方式中，所述方法可包括：杂交繁育所述植物以获得遗传上所需的植物株系。
在另一个方面，本发明涉及一种细胞，该细胞包含编码多肽的核酸，所述多肽与SEQIDNO:12具有至少80％的序列相同性，还涉及一种植物细胞，所述植物细胞包含编码多肽的核酸，所述多肽具有与SEQIDNO:12的氨基酸810-872具有至少80％的序列相同性的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明涉及一种病毒载体，其包含编码Cas9多肽的核苷酸序列。所述病毒载体能够包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽的氨基酸序列与SEQIDNO:12具有至少90％相同性。所述病毒载体可来自烟草脆裂病毒或双生病毒。
在另一个方面，本发明涉及一种T-DNA，所述T-DNA包含编码多肽的核酸序列，所述多肽具有与SEQIDNO:12的氨基酸810-872有至少80％的序列相同性的氨基酸序列。本发明还涉及一种农杆菌(Agrobacterium)菌株，其包含所述T-DNA。
另一方面，本发明涉及一种用于在植物细胞中表达Cas蛋白的方法。所述方法可包括：提供一种农杆菌(Agrobacterium)或剑菌(Ensifer)载体，所述载体包含T-DNA，所述T-DNA包含：编码具有与SEQIDNO:12的氨基酸810-872具有至少80％的序列相同性的氨基酸序列的多肽的核酸序列，其中该多肽编码序列操作性地连接至启动子；使所述农杆菌(Agrobacterium)或剑菌(Ensifer)载体与植物细胞接触；和，使所述核酸序列在所述植物细胞中表达。所述启动子可以是诱导型启动子(例如，雌激素诱导型启动子)。所述方法还可包括：使所述植物细胞与编码向导RNA的核酸接触，所述向导RNA与Cas蛋白相关联。所述植物细胞可以是原生质体。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同。虽然与本文所述类似或等同的方法和材料可用来实施本发明，但在下文描述合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用全文纳入本文。在抵触的情况下，以本说明书(包括定义在内)为准。此外，材料、方法和实施例都仅是说明性 的，并不意在构成限制。
在附图和以下描述中详细说明了本发明的一种或多种实施方式。通过说明书和权利要求书，不难了解本发明的其它特征、目的和优点。
附图说明
图1是pMDC32质粒(标准T-DNA表达质粒)的示意图，其包含Cas9编码序列和cr/tracrRNA杂合序列。该质粒的核苷酸序列示于SEQIDNO:6。
图2是pFZ19质粒(雌激素-诱导型T-DNA表达载体)的示意图，其包含Cas9编码序列和cr/tracrRNA杂合序列。该质粒的核苷酸序列示于SEQIDNO:7。
图3是pNJB121质粒(双生病毒-复制子T-DNA载体)的示意图，其包含Cas9编码序列和cr/tracrRNA杂合体。该质粒的核苷酸序列示于SEQIDNO:8。
图4A-4D提供证据显示植物细胞中的CRISPR/Cas功能，其中Cas9编码序列和cr/tracrRNA杂合体通过农杆菌(Agrobacterium)或双生病毒复制子递送。图4A说明载有植物密码子最优化的Cas9序列的T-DNA。所述cr/tracrRNA杂合体(称为sgRNA)置于拟南芥AtU6-26启动子(PU6)的下游。“棒棒糖(lollypop)”指示对于复制酶(Rep)介导的复制而言具有重要性的长基因间区段(LIR)。灰色方框代表同样对于复制子功能具有重要性的短基因间区段(SIR)。未标记的灰色箭头是35S启动子，其能够在复制子环化之后驱动Cas9表达。Cas9表达也可通过LIR驱动，其具有启动子功能。所述的整个构建体被称为LSLT-DNA。图4B是包含PCR产物的琼脂糖凝胶照片，证明植物细胞中双生病毒复制子的环化。采用PCR引物(图4A中的小箭头)从携带所述复制子的农杆菌(Agrobacterium)T-DNA感染的细胞扩增DNA。仅在编码双生病毒复制酶(pRep)的存在下发生复制子的环化和和扩增。图4C显示，在烟草(Nicotianatabacum)SurA/SurB基因座处，缺失Cas9-诱导的突变。烟草叶组织用图4A所示的包含pREP和LSLT-DNA的两种农杆菌(Agrobacterium)菌株进行注射器浸润；进行该处理以测试采用双生病毒复制子的CRISPR/Cas9介导的诱变。或者，叶组织用仅包含LSLT-DNA的单一农杆菌(Agrobacterium)菌株浸润；进行该处理以测试通过标准农杆菌(Agrobacterium)T-DNA递送进行的CRISPR/Cas9介导的诱变。浸润后五天，基因组DNA经分离，并用作PCR反应的模板，该PCR反应设计以扩增SurA/SurB中的Cas9靶位点。所得的复制子用AlwI消化，通过凝胶电泳分离条带。图4D显示来自用LSLT-DNA和pREPT-DNA转化的样品中的切割抵抗性复制子的序列(SEQIDNO:1-5)。 PAM，原型间隔子邻近基序(protospaceradjacentmotif)。
图5是编码非功能性荧光蛋白(YFP)的报告质粒的示意图。
图6是显示采用YFP报告质粒证明原生质体中CRISPR/Cas功能的荧光水平。制备烟草原生质体并用不同构建体转化，以测试CRISPR/Cas9的靶向切割，并通过流式细胞术检测YFP荧光。柱1显示用YFP报告子和表达Cas9的构建体以及由AtU6-26启动子表达的cr/tracrRNA转化的细胞中观察到的荧光水平。柱2显示用报告子、Cas9和由At7SL2-2启动子表达的cr/tracrRNA转化的细胞中观察到的荧光水平。柱3显示仅用报告子转化的细胞中观察到的荧光(阴性对照)；柱4显示用表达YPF的构建体转化的细胞中的荧光(阴性对照)。
发明详述
对植物进行高效的基因组工程改造能够通过在待修饰的DNA序列中导入靶向的双链断裂(DSB)来实现。该DSB激活细胞DNA修复通路，能够对其进行控制以在断裂位点附近获得所需的DNA序列修饰。可采用序列特异性核酸酶(SSN)来引入靶向的DSB，所述序列特异性核酸酶是一类特殊化的蛋白质，其包括转录活化剂样(TAL)效应物核酸内切酶、锌指核酸酶(ZFN)，和寻靶核酸内切酶(HE)。对于特异性DNA序列的识别通过与SSN编码的特异性氨基酸的相互作用来实现。在开发TAL效应物核酸内切酶之前，工程改造SSN的一大挑战是结合至DNA序列的氨基酸之间的不可预测的内容依赖性。尽管TAL效应物核酸内切酶大大降低了该难度，其较大尺寸(各TAL效应物核酸内切酶单体平均包含2.5-3kb的编码序列)和反复的性质阻碍了其在注重载体大小和稳定性的应用中的使用(Voytas,AnnuRevPlantBiol,64:327-350,2013)。
本发明部分基于如下发现：CRISPR/Cas系统在植物基因组工程改造中可用作简单、有效的工具。CRISPR/Cas分子是原核获得性免疫系统(其利用RNA碱基配对来指导DNA切割)的组分。指导DNADSB需要如下两种组分：Cas9蛋白，其作为核酸内切酶，和CRISPRRNA(crRNA)以及示踪RNA(tracrRNA)序列，其协助指导Cas9/RNA复合物靶向DNA序列(Makarova等，NatRevMicrobiol，9(6):467-477，2011)。对于单一靶向RNA的修饰可足以改变Cas蛋白的核苷酸靶标。在一些情况中，crRNA和tracrRNA可被工程改造为单一cr/tracrRNA杂合体，以指导Cas9切割活性(Jinek等，Science，337(6096):816-821，2012)。所述 CRISPR/Cas系统可用于细菌、酵母、人类和斑马鱼，如他处所述(参见例如，Jiang等，NatBiotechnol，31(3):233-239，2013；Dicarlo等，NucleicAcidsRes，doi:10。1093/nar/gkt135，2013；Cong等，Science，339(6121):819-823，2013；Mali等，Science，339(6121):823-826，2013；Cho等，NatBiotechnol，31(3):230-232，2013和Hwang等，NatBiotechnol，31(3):227-229，2013)。
先前并没有证明所述CRISPR/Cas系统在植物中的作用。该CRISPR/Cas系统源自具有相对小基因组的原核细胞，其中Cas9在显著RNA酶III活性的存在下于细胞中稳定表达。因此，当本文所述的植物细胞作用起始时，并不确定Cas9转基因的表达是否在植物细胞中可行，以及Cas9是否会与植物内容中的RNA-向导以及RNA酶III活性正确合作。此外，植物细胞中异源蛋白质的表达一般存在难度，这归因于不同密码子的采用。此外，预计植物中的Cas9表达会产生一些毒性，因为植物基因组较大，这会增加基因组DNA的非特异性切割的可能性，可能会诱导该细胞的基因毒性。本文报告的所述CRISPR/Cas9系统与包含10-20个核苷酸的特定识别序列发挥作用，其特异性小于大多数其它稀切核酸内切酶系统，例如TAL效应物核酸内切酶、大范围核酸酶，和锌指核酸酶。
如本文所述，CRISPR/Cas系统可用于产生靶向的DSB或单链断裂，并且能够用于(不限于)：靶向诱变、基因靶向、基因替换、靶向缺失、靶向倒位、靶向易位、靶向插入，和通过共表达多重靶向RNA导向的单细胞中的多重DSB进行的多重基因组修饰。该技术可用于提高植物中功能性遗传学研究的速度，以及用于工程改造出具有改善的特点的植物，所述改善特点包括，营养质量增强、抗病和抗应激性提高，以及市场价值化合物的产量提高。可在植物叶组织中通过向报告基因和内源性基因座靶向DSB来进行概念验证实验。然后，可将该技术适用于原生质体和完整植物，以及基于病毒的递送系统。最终，通过向相同基因组中的多个位点靶向DSB可显示多重基因组工程改造。
一般而言，本文所述的系统和方法包括至少两种组分：RNA(crRNA和tracrRNA或单一的cr/tracrRNA杂合体)，其与植物细胞中的特定序列(例如，植物基因组中或染色体外质粒中，例如报告子)互补(并因而靶向至)该特定序列，和Cas9核酸内切酶，其能够在靶序列切割植物DNA。代表性的Cas9编码序列示于SEQIDNO:6的核苷酸9771-14045(以及SEQIDNO:7的核苷酸4331-8605，和SEQIDNO:8的核苷酸9487-13761)。在一些情况中，系统还可包括含有靶向至植物序列的供体序列的核酸。所述核酸内切酶可造成所需基因座(或多个 基因座)位置处的靶标DNA双链断裂，而所述植物细胞能够利用供体DNA序列来修复该双链断裂，由此将修饰稳定地纳入所述植物基因组。
Cas9蛋白包含两个不同活性位点–RuvC-样核酸酶结构域和HNH-样核酸酶结构域，在DNA链的相对位点上产生位点特异性切口(Gasiunus等，ProcNatlAcadSciUSA109(39):E2579-E2586，2012)。RuvC-样结构域处于Cas9蛋白的氨基末端附近，并且认为会切割与crRNA不互补的靶DNA，而HNH-样结构域位于所述蛋白质中间，并且认为会切割与crRNA互补的靶DNA。来自嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)的代表性的Cas9序列示于SEQIDNO:11(也可参见UniProtKB编号Q03JI6)，而来自化脓链球菌(S.pyogenes)的代表性的Cas9序列示于SEQIDNO:12(也可参见UniProtKB编号Q99ZW2)。因此，本文所述的方法可采用编码Cas9多肽的核苷酸序列进行，所述Cas9多肽具有SEQIDNO:11或SEQIDNO:12所示序列。然而，在一些实施方式中，本文所述的方法能够采用编码Cas9功能性变体的核苷酸序列进行，所示Cas9功能性变体与SEQIDNO:11或SEQIDNO:12具有至少80％(例如，至少85％，至少90％，至少95％或至少98％)的序列相同性。此外，Cas9可分为两个部分，一部分包含HNH结构域，另一部分包含RuvC结构域。所述HNH结构域本身，与RNA-向导相关联，可具有一些切割活性，因此，本发明还设想采用包含HNH结构域的Cas9多肽，所述HNH结构域与SEQIDNO:11中的HNH结构域(例如，SEQIDNO:11的氨基酸828-879)或SEQIDNO:12中的HNH结构域(例如，SEQIDNO:12的氨基酸810-872)具有至少80％(例如，至少85％，至少90％，至少95％或至少98％)的序列相同性。
如下所述测定特定核酸或氨基酸序列与特定序列识别号所指示的序列之间的序列相同性百分比。首先，使用来自含有BLASTN版本2.0.14和BLASTP版本2.0.14的BLASTZ独立版本的BLAST2序列(Bl2seq)程序比较核酸或氨基酸序列与特定序列识别号所指示的序列。该BLASTZ独立版本可在fr.com/blast或ncbi.nlm.nih.gov在线获取。解释如何使用Bl2seq程序的说明书可参见BLASTZ附带的自述文件。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法在两种序列之间进行比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。为比较两种核酸序列，如下所述设置选项：-i设为含有待比较的第一核酸序列的文件(如C:\seq1.txt)；-j设为含有待比较的第二核酸序列的文件(如C:\seq2.txt)；-p设为blastn；-o设为任何需要的文件名(如C:\output.txt)；-q设为-1；-r设为2； 且所有其他选项都设为其默认设置。例如，以下命令可用于生成含有两种序列之间比较的输出文件：C:\Bl2seq-ic:\seq1.txt-jc:\seq2.txt-pblastn-oc:\output.txt-q-1-r2。为比较两种氨基酸序列，如下所述设置Bl2seq的选项：-i设为含有待比较的第一氨基酸序列的文件(如C:\seq1.txt)；-j设为含有待比较的第二氨基酸序列的文件(如C:\seq2.txt)；-p设为blastp；-o设为任何需要的文件名(如C:\output.txt)；且所有其他选项都设为其默认设置。例如，以下命令可用于生成含有两种氨基酸序列之间比较的输出文件：C:\Bl2seq-ic:\seq1.txt-jc:\seq2.txt-pblastp-oc:\output.txt。如果两种比较的序列具有同源性，则指定的输出文件会以经比对序列的形式显示那些同源区域。如果比较的两种序列不具有同源性，则指定的输出文件不会显示经比对的序列。
一旦进行比对，即通过对两种序列中存在相同核苷酸或氨基酸的位置的数目进行计数来测定匹配的数目。将匹配的数目除以鉴定的序列(如SEQIDNO:11)中所列序列长度或连接的长度(如来自鉴定的序列中所列序列的100个连续核苷酸或氨基酸残基)，随后将结果值乘以100，从而测定序列相同性百分比。例如，与SEQIDNO:11中所列序列比对时具有1300个匹配的氨基酸序列与SEQIDNO:11中所列序列具有93.7％相同性(即1300÷1388x100＝93.7)。应注意序列相同性百分比值四舍五入至小数点后第一位。例如，75.11、75.12、75.13和75.14向下四舍五入至75.1，而75.15、75.16、75.17、75.18和75.19向上四舍五入至75.2。还应注意，长度值始终是整数。
本文中所用术语“功能性变体”意指蛋白质或蛋白质结构域的催化活性突变体。所述突变体可与亲本蛋白质或蛋白质结构域具有相同的活性水平，或具有高于或低于亲本蛋白质或蛋白质结构域的活性水平。
可采用，例如，生物弹射轰击，将包含所示crRNA、tracrRNA、cr/tracrRNA杂合体、核酸内切酶编码序列，以及供体序列(可行时)的构建体递送至植物、植物部分或植物细胞。或者，可采用农杆菌(Agrobacterium)介导的转化递送该系统组分。在一些实施方式中，所示系统组分可在如下载体中递送：病毒载体(例如，来自DNA病毒的载体，例如但不限于，双生病毒(例如，卷心菜卷叶病毒、菜豆黄矮病毒病毒、小麦矮病毒、番茄卷叶病毒、玉米条纹病毒、烟草卷叶病毒或番茄金花叶病毒)或纳米病毒(例如，蚕豆坏死黄化病毒)；或者来自RNA病毒的载体，例如但不限于，烟草脆裂病毒(例如，烟草响叶病毒，烟草花叶病毒)、马铃薯X病毒组(例如，马铃薯X病毒)或大麦病毒(例如，大麦条纹花 叶病毒)。
在植物、植物部分或植物细胞被核酸内切酶编码序列和crRNA以及tracrRNA或cr/tracrRNA杂合体(在一些情况中，供体序列)感染或转染后，可采用任何合适方法来测定在靶位点是否已发生GT或靶向诱变。在一些实施方式中，表型变化可指示供体序列已被纳入靶位点。还可采用基于PCR的方法来确定基因组靶位点是否包含靶向突变或供体序列，和/或在所述供体的5’和3’端是否已发生精确重组。检测靶向突变的一种方法，本文中称作“PCR消化”，描述于Zhang等(ProcNatlAcadSciUSA107；12028:-120332010)。用于检测精确重组的方法包括，采用与供体序列具有同源性的探针的southern印迹。
在一些实施方式中，本文提供的方法可包括：向植物、植物部分或植物细胞引入核酸，所述核酸包括crRNA和tracrRNA或嵌合型cr/tracrRNA杂合体，其中所述crRNA和tracrRNA或所述cr/tracrRNA杂合体靶向至对所述植物细胞为内源性的核苷酸序列，和还向所述植物、植物部分或植物细胞中引入Cas9核酸内切酶分子(例如，Cas9多肽或其部分，例如包含HNH结构域的Cas9多肽的部分，或编码Cas9多肽或其部分的核酸)，其中所述Cas9核酸内切酶分子在所述crRNA和tracrRNA序列(或所述cr/tracrRNA杂合体)靶向的序列处或附近包含双链断裂。
用于本文提供的方法的植物、植物部分和植物细胞可来自任何植物物种。例如，在一些实施方式中，本文提供的方法可采用单子叶植物、其部分或其细胞。示例性的单子叶植物包括但不限于，小麦、玉米、水稻、兰科植物、洋葱、芦荟、真百合(truelily)、杂草(例如、狗尾草)、木质灌木和树(例如、棕榈和竹子)，以及食用植物，例如菠萝和甘蔗。示例性的双子叶植物包括但不限于，番茄、木薯、大豆、烟草、马铃薯、拟南芥、玫瑰、三色堇、向日葵、葡萄、草莓、南瓜、菜豆、豌豆，和花生。
在一些实施方式中，本文所述的方法可包括筛选所述植物、植物部分或植物细胞，以确定在所述crRNA和tracrRNA或所述cr/tracrRNA杂合体靶向的序列处或附近是否已经出现DSB。例如，Zhang等.(同上)所述的PCR-消化试验可用于确定DSB是否已经出现。其它有用的方法包括但不限于，T7试验、Surveyor试验，和Southern印迹(限制酶结合序列是否存在于预定的切割位点处或附近)。
此外，在其中采用植物部分或植物细胞的一些实施方式中，本文提供的方 法可包括，从所述植物部分或植物细胞再生植物。所述方法还可包括繁育所述植物(例如，其中引入核酸的植物或将植物部分或植物细胞用作起始材料再生后获得的在植物)，以获得遗传上所需的植物株系。用于再生和繁育植物的方法已在本领域中成熟建立。
本文中还提供植物、植物部分和植物细胞，其包含编码Cas9多肽的核酸，所述Cas9多肽具有与SEQIDNO:11或SEQIDNO:12所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％，至少90％，至少95％或至少98％)的相同性的氨基酸序列，或者编码Cas9多肽的核酸，所述Cas9包含与SEQIDNO:11的氨基酸828-879或SEQIDNO:12的氨基酸810-872具有至少80％(例如，至少85％，至少90％，至少95％或至少98％)的相同性的氨基酸序列。
本发明还提供包含编码Cas9多肽的核苷酸序列的病毒载体。例如，病毒载体可包括编码多肽的核苷酸序列，所述多肽具有与SEQIDNO:11或SEQIDNO:12中所示氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％，至少90％，至少95％或至少98％)相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，病毒载体可具有编码Cas9多肽的核苷酸序列，所述Cas9多肽包含与SEQIDNO:11的氨基酸828-879或SEQIDNO:12的氨基酸810-872具有至少80％(例如，至少85％，至少90％，至少95％或至少98％)序列相同性的氨基酸序列。所述载体可来自任何合适类型的病毒，例如烟草脆裂病毒或双生病毒。
本文中还提供包含编码Cas9多肽的核酸序列的T-DNA分子，所述Cas9多肽具有与SEQIDNO:11或SEQIDNO:12所示氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％，至少90％，至少95％或至少98％)相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，T-DNA可包括编码Cas9多肽的核苷酸序列，所述Cas9多肽包含与SEQIDNO:11的氨基酸828-879或SEQIDNO:12的氨基酸810-872具有至少80％(例如，至少85％，至少90％，至少95％或至少98％)序列相同性的氨基酸序列。
本发明还提供包含本文所述的T-DNA的农杆菌(Agrobacterium)菌株。
此外，本发明提供用于在植物、植物部分或植物细胞中表达Cas蛋白的方法。所述方法可包括，例如，(a)提供包含T-DNA的农杆菌(Agrobacterium)或剑菌(Ensifer)载体，所述T-DNA包含编码Cas9多肽的核酸序列，所述Cas9多肽具有与SEQIDNO:11或SEQIDNO:12具有至少80％(例如，至少85％，至少90％， 至少95％或至少98％)序列相同性的氨基酸序列，其中该Cas9编码序列操作性地连接至启动子，(b)使所述农杆菌(Agrobacterium)或剑菌(Ensifer)载体与植物、植物部分或植物细胞接触，和(c)在所述植物、植物部分或植物细胞中表达所述核酸序列。所述启动子可以是，例如，组成型启动子(例如，CaMV35S启动子)，诱导型启动子(例如，雌二醇-诱导的XVE启动子；Zuo等，PlantJ24:265-273，2000)，细胞特异型启动子或通过自杀外显子的可变剪接激活的启动子。在一些实施方式中，所述方法还可可包括使所述植物、植物部分或植物细胞接触编码向导RNA的核酸，所述向导RNA与Cas蛋白相关联，以及，表达所述向导RNA。
以下实施例进一步描述了本发明，这些实施例并不限制权利要求书所述的本发明范围。
实施例
实施例1–用于表达CRISPR/Cas组分的质粒
为了证明所述CRISPR/Cas系统在植物中的基因组编辑功能性，构建质粒以编码Cas9、crRNA和tracrRNA、cr/tracrRNA杂合体，和用于表达crRNA、tracrRNA或cr/tracrRNA杂合体的RNA聚合酶III启动子(例如，AtU6-26或At7SL-2)。植物密码子最优化的Cas9编码序列经合成并克隆进入多位点Gateway进入型质粒。此外，由RNA聚合酶III(PolIII)启动子AtU6-26和At7SL2-2驱动的crRNA和tracrRNA或cr/tracrRNA杂合体经合成并克隆进入第二多位点Gateway进入型质粒。未能够有效重建所述crRNA序列(用于再导向CRISPR/Cas介导的DSB)，向crRNA核苷酸序列中插入反向IIS型限制酶位点(例如，BsaI和Esp3I)。通过采用合适的IIS型限制酶进行消化，可采用寡核苷酸将靶序列高效克隆进入crRNA序列。将用于Cas9和用于从RNA聚合酶III启动子(AtU6-26或At7SL2-2)表达所述crRNA和tracrRNA或所述cr/tracrRNA杂合体的进入型质粒重组进入pMDC32(标准T-DNA表达质粒，具有2x35S启动子；图1和SEQIDNO:6)、pFZ19(雌激素-诱导型T-DNA表达载体；图2和SEQIDNO:7；Zuo等，PlantJ.24(2):265-273，2000)，和pNJB121(双生病毒-复制子T-DNA载体；图3和SEQIDNO:8)。
实施例2–体细胞植物组织中的CRISPR/Cas活性
为了证明CRISPR/Cas系统作为SSN发挥作用的能力，修饰双生病毒-复制子T-DNA载体，pNJB121，以编码Cas9和cr/tracrRNA杂合体序列(图4A)。靶向RNA序列(由crRNA中的核苷酸序列编码；负责指导Cas9切割)设计为与内源性SuRA和SuRB基因中的序列同源。crRNA与SuR基因座匹配的靶向部分的序列是5’-GUGGGAGGAUCGGUUCUAUA(SEQIDNO:9；5’G不与SuR基因座匹配，但是RNA聚合酶III转录所需的)。尽管pNJB121是双生病毒-复制子，在不存在复制酶(Rep)的情况下，无扩增发生。因此，在Rep不存在的情况下，pNJB121是标准T-DNA载体，且无复制子形成。该修饰的pNJB121质粒通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)递送至烟草(Nicotianatabacum)叶组织。浸润后五天，采用PCR-消化评估SuRA/SuRB序列的Cas9介导的突变(图4C)。对应的靶序列处突变的存在指示CRISPR/Cas系统在植物叶细胞中的功能性。
实施例3–原生质体中的CRISPR/Cas活性
为了进一步证明CRISPR/Cas系统在植物中的活性，评估拟南芥(thaliana)和烟草(Nicotianatabacum)原生质体中的DNA序列的靶向诱变。靶向crRNA序列重新设计为与内源性ADH1或TT4基因(拟南芥)中存在的序列同源，或整合gus:nptII报告基因或SuRA/SuRB(烟草)。原生质体从拟南芥和烟草叶组织分离，并分别用编码Cas9和ADH1-或TT4-靶向crRNA的质粒，和编码Cas9和gus:nptII-或SuRA/SuRB-靶向crRNA的质粒转染。转染后5-7天提取基因组DNA，并评估对应的靶序列处的突变。在ADH1、TT4、gus:nptII或SuRA/SuRB基因中检测到突变指示CRISPR/Cas系统在植物原生质体中靶向内源性基因的功能性。
在初始研究中，评估了所述CRISPR/Cas系统切割染色体外报告质粒的能力，采用的是与Zhang等所述类似的方法(PlantPhysiol161:20-27,2013)。所述报告质粒编码非功能性荧光蛋白(YFP；图5和SEQIDNO:10)。YFP表达被侧接Cas9/crRNA复合物的靶序列的内部编码序列的直接重复所干扰。靶向DSB在Cas9/crRNA靶序列处的生成导致直接重复序列的重组，由此恢复了YFP基因功能。来自烟草SuRA/SuRB基因座的序列被克隆进入直接重复之间的YFP报告子。然后产生靶向该位点的cr/tracrRNA杂合体构建体。靶向SuR基因座的crRNA的部分的序列是5’-GUGGGAGGAUCGGUUCUAUA(SEQIDNO:9；同样地所述5’G不匹配SuR基因座，但是RNA聚合酶III转录所需的)。烟 草(Nicotianatabacum)原生质体用编码Cas9、cr/tracrRNA杂合体，和YFP报告子的质粒转化，并且通过流式细胞术监测到了因CRISPR/Cas核酸酶活性所致的YFP表达的恢复。采用编码YFP的阳性对照质粒，94.7％的细胞被转化并表达YFP(图6，柱4)。用单独报告子转化的细胞给出仅稍高于背景的活性水平(图6，柱3)。当细胞用表达Cas9和cr/tracrRNA的构建体转化时，观察到显著的活性，指示Cas9/crRNA复合物切割了靶标。对于从AtU6-26启动子表达的cr/tracrRNA，18.8％的细胞显荧光(图6，柱1)。当从At7SL2-2启动子表达cr/tracrRNA时，20.7％的细胞呈YFP阳性(图6，柱2)。YFP-表达型细胞的检测指示CRISPR/Cas系统在植物原生质体中的功能性。
实施例4–采用CRISPR/Cas系统在原生质体中的多重基因组工程改造
CRISPR/Cas系统在不同DNA序列产生多重DSB的能力采用植物原生质体评估。为了指导对于TT4、ADH1和染色体外YFP报告质粒(相同拟南芥原生质体中)的Cas9核酸酶活性，crRNA和tracrRNA或cr/tracrRNA杂合体质粒经修饰以表达多重crRNA靶向序列。这些序列经设计与TT4、ADH1和YFP报告质粒中存在的序列同源。在用Cas9、crRNA、tracrRNA或所述cr/tracrRNA杂合体，以及YFP报告质粒转染进入拟南芥原生质体之后，对YFP-表达型细胞定量并分离，然后提取基因组DNA。观察到YFP-表达型细胞的ADH1和TT4基因中的突变，说明CRISPR/Cas能够促进拟南芥细胞中的多重基因组工程改造。
为了证明在烟草原生质体中的多重基因组工程改造，修饰包含crRNA的质粒以编码与整合的gus:nptII报告基因、SuRA/SuRB和YFP报告质粒同源的序列。与拟南芥原生质体中所述的方法类似，烟草原生质体用Cas9、crRNA、tracrRNA或所述cr/tracrRNA杂合体以及YFP报告质粒转染。YFP-表达型细胞经定量并分离，然后提取基因组DNA。观察到YFP-表达型细胞中整合的gus:nptII报告基因和SuRA/SuRB中的突变，说明CRISPR/Cas能够促进烟草细胞中的多重基因组工程改造。
实施例5–植物中的CRISPR/Cas活性
为证明CRISPR/Cas在植物中的活性，修饰pFZ19T-DNA以编码Cas9和所述crRNA和tracrRNA或所述cr/tracrRNA杂合体序列。靶DNA序列存在于内源性ADH1或TT4基因中。通过浸花法，采用农杆菌(Agrobacterium)，将所得的 T-DNA整合进入拟南芥基因组。通过直接接触雌激素，在原生转基因植物中诱导Cas9表达。提取来自体细胞叶组织的基因组DNA，并通过PCR-消化评估其在对应的基因组基因座位置处的突变。观察到ADH1或TT4基因中的突变，证明CRISPR/Cas在植物中的活性。或者，CRISPR/Cas活性可通过对T2种子(产自诱导的T1亲本)筛选对应的基因组基因座的杂合或纯合突变来评估。此外，CRISPR/Cas实现多重基因组工程改造的能力通过用与ADH1和TT4质粒同源的序列修饰包含多重crRNA的质粒来评估。将所得的T-DNA质粒整合进入拟南芥基因组，在原生转基因植物中诱导Cas9表达，并通过评价T1和T2植物中的ADH1和TT4基因来评估CRISPR/Cas活性。在ADH1和TT4基因中均观察到突变，说明CRISPR/Cas能够促进拟南芥植物中的多重基因组工程改造。
实施例6–CRISPR/Cas组分的病毒递送
植物病毒可以是用于递送异源性核酸序列的有效载体，例如用于RNAi试剂或用于表达异源蛋白质。有用的植物病毒包括RNA病毒(例如，烟草花叶病毒、烟草响叶病毒、马铃薯X病毒，和大麦条纹花叶病毒)以及DNA病毒(例如，卷心菜卷叶病毒、菜豆黄矮病毒病毒、小麦矮病毒、番茄卷叶病毒、玉米条纹病毒、烟草卷叶病毒、番茄金花叶病毒，和蚕豆坏死黄化病毒；Rybicki等，CurrTopMicrobiolImmunol，2011；和Gleba等，CurrOpinBiotechnol2007，134-141)。所述植物病毒可被修饰以递送CRISPR/Cas9组分。概念验证实验在烟草(Nicotianatabacum)叶细胞中进行，采用DNA病毒(双生病毒复制子；Baltes等，PlantCell26:151-163，2014)。为此，修饰crRNA序列以包含对于内源性SuRA/SuRB基因座的同源性。将所得的质粒连同Cas9克隆进入pNJB121(双生病毒复制所需的具有顺式作用元件的T-DNA目的地载体(LSLT-DNA))(图4A)。农杆菌(Agrobacterium)的LSLT-DNA与编码复制酶蛋白T-DNA(Rep；REPT-DNA)的共表达导致双生病毒复制子的复制性释放(图4B)。T-DNA通过用农杆菌(Agrobacterium)注射器浸润被递送至烟草叶组织。浸润后五-七天，采用PCR-消化评估SuRA/SuRB序列的Cas9介导的突变(图4C)。抵抗消化的PCR复制子经克隆并序列。对应的靶序列存在突变，指示植物病毒是递送CRISPR/Cas组分的有效载体(图4D)。
其它实施方式
应理解虽然本发明已结合其详述进行描述，但以上描述意在说明而不是限制本发明的范围，该范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。