具有降低的氧化的配制物
对相关申请的交叉引用
本申请要求保护2013年3月13日提交的美国临时申请61/780,852和2013年11月27日提交的美国临时申请61/909,850的权益，其每一项在本文以其全文通过提述并入。
技术领域
本发明涉及包含蛋白且进一步包含防止所述蛋白氧化的化合物的配制物、用于产生和使用所述配制物的方法及筛选在蛋白组合物中用于防止蛋白氧化的化合物的方法。
背景技术
氨基酸残基的氧化降解在蛋白药物中是常见现象。多个氨基酸残基都易于氧化，特别是甲硫氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)、组氨酸(His)、色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)(Lietal.,BiotechnologyandBioengineering48:490-500(1995))。通常，当蛋白暴露至过氧化氢、光、金属离子或在多个加工步骤中暴露至这些的组合时，观察到氧化(Lietal.,BiotechnologyandBioengineering48:490-500(1995))。具体地，暴露至光(Wei,etal.,AnalyticalChemistry79(7):2797-2805(2007))、AAPH或Fenton试剂(Jietal.,JPharmSci98(12):4485-500(2009))的蛋白已显示色氨酸残基上增加的氧化水平，而暴露至过氧化氢的蛋白通常仅显示甲硫氨酸氧化(Jietal.,JPharmSci98(12):4485-500(2009))。光暴露可通过包括单线态氧、过氧化氢和超氧化物在内的活性氧(ROS,reactiveoxygenspecies)的形成导致蛋白氧化(Lietal.,BiotechnologyandBioengineering48:490-500(1995)；Wei,etal.,AnalyticalChemistry79(7):2797-2805(2007)；Jietal.,JPharmSci98(12):4485-500(2009)；Frokjaeretal.,NatRevDrugDiscov4(4):298-306(2005))，而在Fenton介导的反应中蛋白氧化通常经由羟基自由基发生(Prouseketal.,PureandAppliedChemistry79(12):2325-2338(2007))且在AAPH介导的反应中经由烷氧基过氧 化物发生(Werberetal.,JPharmSci100(8):3307-15(2011))。色氨酸的氧化导致包括羟色氨酸、犬尿氨酸和N-甲酰基犬尿氨酸在内的多种氧化产物且具有影响安全性和效力的潜在可能(Lietal.,BiotechnologyandBioengineering48:490-500(1995)；Jietal.,JPharmSci98(12):4485-500(2009)；Frokjaeretal.,NatRevDrugDiscov4(4):298-306(2005))。已报道单克隆抗体重链互补决定区(CDR)中特定色氨酸残基的氧化与生物功能的丧失相关(Wei,etal.,AnalyticalChemistry79(7):2797-2805(2007))。最近已报道对于Fab分子，Trp氧化由配位有组氨酸的金属离子介导(Lametal.,PharmRes28(10):2543-55(2011))。Fab配制物中聚山梨酯20的自氧化导致多种过氧化物的生成，这也已在相同报道中提到。自氧化诱导的这些过氧化物的生成在药品的长期保存中还可导致蛋白中甲硫氨酸氧化，这是因为已提出蛋白中的Met残基可作为内在抗氧化剂(Levineetal.,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica93(26):15036-15040(1996))且可通过过氧化物轻易氧化。氨基酸残基的氧化具有影响蛋白生物活性的潜力。对于单克隆抗体(mAb)尤其如此。IgG1mAb中Met254和Met430处的甲硫氨酸氧化潜在影响转基因小鼠中的血清半衰期(Wangetal.,MolecularImmunology48(6-7):860-866(2011))且还影响人IgG1与FcRn和Fc-γ受体的结合(Bertolotti-Ciarletetal.,MolecularImmunology46(8-9)1878-82(2009))。
蛋白的稳定性特别是在液体状态中的稳定性需要在药品制造和保存的过程中进行评估。药物配制物的开发有时包括抗氧化剂的添加以防止活性成分的氧化。L-甲硫氨酸向配制物的添加已导致蛋白和肽中甲硫氨酸残基氧化的降低(Jietal.,JPharmSci98(12):4485-500(2009)；Lametal.,JournalofPharmaceuticalSciences86(11):1250-1255(1997))。类似地，已显示L-色氨酸的添加降低色氨酸残基的氧化(Jietal.,JPharmSci98(12):4485-500(2009)；Lametal.,PharmRes28(10):2543-55(2011))。然而，L-Trp在UV区(260-290nm)具有强吸收，这使得其在光氧化过程中成为首选靶标(Creed,D.,PhotochemistryandPhotobiology39(4):537-562(1984))。已推测Trp作为内源性光敏剂而增强酪氨酸(Babuetal.,IndianJBiochemBiophys29(3):296-8(1992))及其它氨基酸(Bentetal.,JournaloftheAmericanChemicalSociety97(10):2612-2619(1975))的氧依赖性光氧化。已证明L-Trp当暴露至光时可生成过氧化氢且L-Trp在UV光下经由超氧阴离子产生过氧化氢(McCormicketal.,Science 191(4226):468-9(1976)；Wentworthetal.,Science293(5536):1806-11(2001)；McCormicketal.,JournaloftheAmericanChemicalSociety100:312-313(1978))。此外，已知色氨酸当暴露至光时产生单线态氧(Davies,M.J.,BiochemBiophysResCommun305(3):761-70(2003))。与由聚山梨酯20的自氧化诱导的蛋白氧化类似，当ROS通过其它在蛋白配制物中的赋形剂(例如L-Trp)生成时，在正常操作条件下可能发生蛋白氧化。
由近期的研究显而易见的是，意在稳定蛋白的标准赋形剂如L-Trp和聚山梨酯向蛋白组合物的添加可产生非预期和不想要的后果如ROS诱导的蛋白氧化。因此，对于在蛋白组合物中使用的备选赋形剂的鉴别和这样的组合物的开发仍存在需求。
发明内容
本文提供了配制物，其包含蛋白和防止所述配制物中所述蛋白氧化的化合物、制备所述配制物的方法和筛选在蛋白配制物中防止蛋白氧化的化合物的方法。
一方面，本文提供了配制物，其包含蛋白和防止所述配制物中所述蛋白氧化的化合物，其中所述化合物具有下式：
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其中R2选自氢、羟基、-COOH和-CH2COOH；
R3选自氢、羟基、-COOH、-CH2COOH和-CH2CHR3a(NH2)；其中R3a是COOH或氢；
R4、R5、R6和R7独立选自氢和羟基；
条件是R2、R3、R4、R5、R6和R7之一是羟基；
或其药用盐。
在一些实施方案中，所述化合物是下式的化合物：
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其中R2和R3独立选自氢、羟基、-COOH和-CH2COOH；且
R4、R5、R6和R7独立选自氢和羟基；
条件是R2、R3、R4、R5、R6和R7之一是羟基；
或其药用盐。
在一些实施方案中，所述化合物是下式的化合物：
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其中R3a是COOH或氢；
R2、R4、R5、R6和R7独立选自氢和羟基；条件是R2、R4、R5、R6和R7之一是羟基；
或其药用盐。
在一些实施方案中，上述任何式中的R4、R5或R7是羟基。在一些实施方案中，所述化合物选自5-羟基色氨酸、5-羟基吲哚、7-羟基吲哚和5-羟色胺。在一些实施方案中，上述任何式中的R5是羟基。在一些实施方案中，上述化合物是5-羟基衍生物，其包括但不限于5-羟基色氨酸、5-羟基吲哚、5-羟色胺等。
在一些实施方案中，所述配制物是液体配制物。在一些实施方案中，所述配制物是适于施用至受试者的药物配制物。在一些实施方案中，所述配制物是水性的。
在一些实施方案中，所述配制物中的所述化合物为约0.3mM至约10mM或直至所述化合物可溶解在所述配制物中的最高浓度。在一些实施方案中，所述配制物中的所述化合物为约0.3mM至约9mM、约0.3mM至约8mM、约0.3mM至约7mM、约0.3mM至约6mM、约0.3mM至约5mM、约0.3mM至约4mM、约0.3mM至约3mM、约0.3mM至约2mM、约0.5mM至约2mM、约0.6mM至约1.5mM或约0.8mM至约1.25mM。在一些实施方案中，所述配制物中的所述化合物为约0.3mM至约5mM。在一些实施方案中，所述配制物中的所述化合物为约0.3mM至约1mM。在一些实施方案中，所述配制物中的所述化合物为约1mM。在一些实施方案中，所述化合物防止所述蛋白中的色氨酸、半胱氨酸、组氨酸、酪氨酸和/或甲硫氨酸的氧化。在一些实施 方案中，所述化合物防止所述蛋白通过活性氧的氧化。在一些实施方案中，所述活性氧选自单线态氧、超氧化物(O2-)、过氧化氢、羟基自由基和烷基过氧化物。
在一些实施方案中，所述蛋白易于氧化。在一些实施方案中，所述蛋白中的色氨酸氨基酸易于氧化。在一些实施方案中，所述蛋白是抗体(例如多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体或抗体片段)。在一些实施方案中，所述配制物中所述蛋白的浓度为约1mg/mL至约250mg/mL。
在一些实施方案中，所述配制物进一步包含一种或多种赋形剂，所述赋形剂选自稳定剂、缓冲剂、表面活性剂和张力剂。在一些实施方案中，所述配制物具有约4.5至约7.0的pH。
另一方面，本文提供制备蛋白配制物(如液体配制物)的方法，其包括添加防止蛋白氧化的量的化合物至所述蛋白配制物，其中所述化合物具有下式：
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其中R2选自氢、羟基、-COOH和-CH2COOH；
R3选自氢、羟基、-COOH、-CH2COOH和-CH2CHR3a(NH2)；其中R3a是COOH或氢；
R4、R5、R6和R7独立选自氢和羟基；
条件是R2、R3、R4、R5、R6和R7之一是羟基；
或其药用盐。
另一方面，本文提供在蛋白配制物(如液体配制物)中防止蛋白氧化的方法，其包括添加防止蛋白氧化的量的化合物至所述配制物，其中所述化合物具有下式：
![]()
其中R2选自氢、羟基、-COOH和-CH2COOH；
R3选自氢、羟基、-COOH、-CH2COOH和-CH2CHR3a(NH2)；其中R3a是COOH或氢；
R4、R5、R6和R7独立选自氢和羟基；
条件是R2、R3、R4、R5、R6和R7之一是羟基；
或其药用盐。
在本文描述的方法的一些实施方案中，所述化合物具有下式：
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其中R2和R3独立选自氢、羟基、-COOH和-CH2COOH；且
R4、R5、R6和R7独立选自氢和羟基；
条件是R2、R3、R4、R5、R6和R7之一是羟基；
或其药用盐。
在本文描述的方法的一些实施方案中，所述化合物具有下式：
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其中R3a是COOH或氢；
R2、R4、R5、R6和R7独立选自氢和羟基；条件是R2、R4、R5、R6和R7之一是羟基；
或其药用盐。
在一些实施方案中，上述任何式中的R4、R5或R7是羟基。在一些实施方案中，所述化合物选自5-羟基色氨酸、5-羟基吲哚、7-羟基吲哚和5-羟色胺。在一些实施方案中，上述任何式中的R5是羟基。在一些实施方案中，上述化合物是5-羟基衍生物，其包括但不限于5-羟基色氨酸、5-羟基吲哚、5-羟色胺等。
在一些实施方案中，所述配制物是液体配制物。在一些实施方案中，所述配制物是适于施用至受试者的药物配制物。在一些实施方案中，所述配制物是水性的。在一些实施方案中，所述配制物中的所述化合物为约0.3mM至约10mM或直至所述化合物可溶解在所述配制物中的最高浓度。在一些实施方案中，所述配制物中的所述化合物为约0.3mM至约9mM、约0.3mM至约8mM、约0.3mM至约7mM、约0.3mM至约6mM、约0.3mM至约5mM、约 0.3mM至约4mM、约0.3mM至约3mM、约0.3mM至约2mM、约0.5mM至约2mM、约0.6mM至约1.5mM或约0.8mM至约1.25mM。在一些实施方案中，所述配制物中的所述化合物为约0.3mM至约5mM。在一些实施方案中，所述配制物中的所述化合物为约0.3mM至约1mM。在一些实施方案中，所述配制物中的所述化合物为约1mM。
在一些实施方案中，所述化合物防止所述蛋白中的色氨酸、半胱氨酸、组氨酸、酪氨酸和/或甲硫氨酸的氧化。在一些实施方案中，所述化合物防止所述蛋白通过活性氧的氧化。在一些实施方案中，所述活性氧选自单线态氧、超氧化物(O2-)、过氧化氢、羟基自由基和烷基过氧化物。
在一些实施方案中，所述蛋白易于氧化。在一些实施方案中，所述蛋白中的色氨酸氨基酸易于氧化。在一些实施方案中，所述蛋白是抗体(例如多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体或抗体片段)。在一些实施方案中，所述配制物中所述蛋白的浓度为约1mg/mL至约250mg/mL。
在一些实施方案中，所述配制物进一步包含一种或多种赋形剂，所述赋形剂选自稳定剂、缓冲剂、表面活性剂和张力剂。在一些实施方案中，所述配制物具有约4.5至约7.0的pH。
另一方面，本文提供筛选在蛋白组合物中防止蛋白氧化的化合物的方法，其包括选择与L-色氨酸相比具有较低氧化电势和较小光敏感性的化合物，并测试所选化合物在防止所述蛋白氧化中的作用。
在一些实施方案中，所述光敏感性基于由化合物当光暴露时产生的H2O2的量来测量。在一些实施方案中，选择以下化合物，其产生少于约10％的由L-色氨酸产生的H2O2的量。在一些实施方案中，所述氧化电势通过循环伏安法来测量。在一些实施方案中，通过由2,2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)、光和/或Fenton试剂生成的活性氧对所选化合物在防止所述蛋白氧化中的作用进行测试。
应该理解的是，本文描述的各个实施方案的一个、一些或全部性质可组合形成本发明的其它实施方案。本发明的这些及其它方面对于本领域技术人员来说将是明显的。本发明的这些及其它实施方案进一步通过以下详述部分进行说明。
附图说明
图1是系列图，其显示A)mAb1中的Fab和B)mAb1中的Fc在以250W/m2光暴露8小时后的氧化。mAb1以5mg/mL存在于20mM组氨酸醋酸盐、250mM海藻糖、0.02％聚山梨酯20中。除mAb1RefMat外，全部小瓶置于灯箱中。箔对照小瓶在置于灯箱前覆盖于箔中。对于每个样品，对三个独立的实验小瓶进行平均，除“10mMMet、1mMTrp”(*)是两个实验小瓶的平均值，且mAb1RefMat是在HPLC上三次独立注射的一个实验小瓶。误差棒代表标准差。
图2是显示通过L-Trp的剂量依赖性H2O2产生的图。钻形表示单独的L-Trp；三角形表示L-Trp+SOD；圆形和方形表示L-Trp+NaN3±SOD。所有研究在20mML-HisHCl,pH5.5中实施。
图3是系列图，其显示A)当暴露至环境光线条件1、3和7天时在包含3.2mML-Trp的50mg/mLmAb1配制物中过氧化氢(H2O2)的产生和B)暴露至环境光线条件10天后包含3.2mML-Trp的mAb1配制物中的Fab氧化百分数(％)。
图4是系列图，其显示通过色氨酸衍生物和吲哚衍生物在以250W/m2光胁迫4小时的情况下的过氧化氢生成。A)在20mMHisAcpH5.5配制物中针对过氧化氢(μM)的生成来筛选色氨酸衍生物(1mM)。B)在20mMHisAcpH5.5配制物中针对过氧化氢(μM)的生成来筛选吲哚衍生物(1mM)。
图5是显示当光暴露时NaN3对通过多种Trp衍生物的H2O2产生的影响的图。数据以相对通过L-Trp生成的过氧化物的比例显示。
图6是显示在氧化电势和光诱导的过氧化物形成之间的相关性的图。框入的区域显示候选抗氧化化合物。
图7是系列图，其显示在AAPH温育后A)mAb1中的Fab的氧化和B)mAb1中的Fc的氧化。除mAb1RefMat和“无AAPH”外，全部样品都与AAPH一起温育。除mAb1RefMat外，全部样品都在40℃温育。数据以三个实验样品的平均值±1SD表示，除mAb1RefMat外，其为六次HPLC注射的平均值而无误差棒。
图8是系列图，其显示在以250W/m2光暴露16小时后A)mAb1中的Fab的氧化和B)mAb1中的Fc的氧化。除mAb1RefMat外，全部小瓶置于灯箱中。箔对照小瓶在置于灯箱前覆盖于箔中。对于每个样品对三个独立的实验小瓶进行平均，除L-色氨酸酰胺(*)是两个实验小瓶的平均值，而mAb1RefMat是在HPLC上三次独立注射的一个实验小瓶。误差棒代表标准差。
图9是系列图，其显示在使用10ppmH2O2和0.2mMFe(III)进行Fenton反应后A)3mg/mLmAb1中的Fab的氧化和B)3mg/mLmAb1中的Fc的氧化。反应在40℃温育3小时，用100mML-Met淬灭并在木瓜蛋白酶消化后使用RP-HPLC分析。所有样品都为三个独立小瓶的平均值，而mAb1对照(RefMat)是在HPLC上五次独立注射的一个小瓶。误差棒代表一个标准差。
图10是系列图，其显示A)L-Trp和B)5-羟基-L-色氨酸激发及在生成和淬灭1O2中的推测机制。k25C代表用于1O2淬灭的二级速率常数(Dadetal.,JPhotochemPhotobiolB,78(3):245-51(2005))，而Eox是分子相对于Ag/AgCl的氧化电势。
具体实施方式
I.定义
详细描述本发明前，应该理解的是，本发明不限于特定的组合物或生物系统，其当然可以发生变化。还应该理解的是，本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的而非意在进行限制。
术语“药物配制物”指一种制备物，其在这样的形式中从而允许活性成分的生物活性是有效的，且其不含有对于将被施用该制备物的受试者来说具有不可接受的毒性的额外组分。这类配制物是无菌的。
“无菌的”配制物是无菌的或不含或基本上不含所有活微生物及其孢子。
“稳定的”配制物是其中蛋白在保存时基本上保留其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性的一种配制物。优选地，所述配制物在保存时基本上保留其物理和化学稳定性及其生物活性。保存时间通常基于配制物的预期保质期来选择。本领域已有多种用于测量蛋白稳定性的分析技术且例如在PeptideandProteinDrugDelivery,247-301,VincentLeeEd.,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,Pubs.(1991)和Jones,A.Adv.DrugDeliveryRev.10:29-90(1993)中进行了综述。可在所选量的光暴露和/或温度历时所选时间段测量稳定性。稳定性可按多种不同的方式进行定性和/或定量评估，包括评估聚集体形成(例如使用尺寸排阻色谱、通过测量浊度和/或通过目视检查)；评估ROS形成(例如通过使用光胁迫测定或2,2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)胁迫测定)；蛋白的特定氨基酸残基的氧化(例如单克隆抗体的Trp残基和/或Met残基)；通过使用离子交换色谱评估电荷异质性、成像毛细管等电聚焦(icIEF)或毛细管 区带电泳；氨基末端或羧基末端序列分析；质谱分析；SDS-PAGE分析以比较还原且完整的抗体；肽图谱(例如胰蛋白酶或LYS-C)分析；评估蛋白的生物活性或靶向结合功能(例如抗体的抗原结合功能)等。不稳定性可涉及下列任何一种或多种：聚集、脱酰胺(例如Asn脱酰胺)、氧化(例如Met氧化和/或Trp氧化)、异构化(例如Asp异构化)、剪切/水解/片段化(例如铰链区片段化)、形成琥珀酰亚胺、未配对的半胱氨酸、N-末端延伸、C-末端加工、糖基化差异等。
当目视检查颜色和/或清晰度或通过UV光散射或通过尺寸排阻色谱测量时，若蛋白未显示任何征兆或显示极少的聚集、析出和/或变性，则其在药物配制物中“保持其物理稳定性”。
若在给定时间的化学稳定性使得蛋白被认为仍保持其如下文定义的生物活性，则所述蛋白在药物配制物中“保持其化学稳定性”。化学稳定性可通过检测和量化蛋白在化学上发生改变的形式进行评估。化学改变可涉及蛋白氧化，其可使用例如胰蛋白酶肽图谱、反相高效液相色谱(HPLC)和液相色谱-质谱(LC/MS)评估。其它类型的化学改变包括蛋白的电荷改变，其可例如通过离子交换色谱或icIEF评估。
若蛋白在给定时间的生物活性在制备药物配制物时展示的生物活性(例如对于单克隆抗体在抗原结合测定中确定)的约10％内(在测定误差内)，则所述蛋白在所述药物配制物中“保持其生物活性”。
如本文使用，蛋白的“生物活性”指所述蛋白结合其靶标的能力，例如单克隆抗体与抗原结合的能力。其可进一步包括可在体外或在体内测量的生物响应。这样的活性可以是拮抗或激动的。
“易于氧化”的蛋白是包含一个或多个已被发现容易氧化的残基的蛋白，所述残基如但不限于甲硫氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)、组氨酸(His)、色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)。例如，单克隆抗体的Fab部分中的色氨酸氨基酸或单克隆抗体的Fc部分中的甲硫氨酸氨基酸可易于氧化。
“等渗”意为感兴趣的配制物具有与人血液基本上相同的渗透压。等渗的配制物通常将具有约250至350mOsm的渗透压。等渗性可使用例如蒸汽压或冰冻型渗透压计测量。
如本文使用，“缓冲剂”指通过其酸-碱共轭组分的作用抵抗pH改变的缓冲溶液。本发明的缓冲剂优选具有约4.5至约8.0的pH。例如，组氨酸醋酸 盐是能将pH控制在该范围内的缓冲剂的实例。
“防腐剂”是以下化合物，其可任选地包含在配制物中以基本降低其中细菌作用，因此例如促进多用途配制物的生产。潜在的防腐剂的实例包括十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯己双铵、苯扎氯铵(烷基苄基二甲基氯化铵的混合物，其中所述烷基为长链)和苄索氯铵。其它类型的防腐剂包括芳香醇如苯酚、丁醇和苯甲醇、对羟苯甲酸烷基酯如对羟苯甲酸甲酯或丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚。在一个实施方案中，本文的防腐剂是苯甲醇。
如本文使用，“表面活性剂”指具有表面活性的试剂，其优选为非离子型表面活性剂。本文的表面活性剂的实例包括聚山梨酯(例如聚山梨酯20和聚山梨酯80)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；月桂基磺基甜菜碱、肉豆蔻基磺基甜菜碱、亚油烯基磺基甜菜碱或硬脂基磺基甜菜碱；月桂基肌氨酸、肉豆蔻基肌氨酸、亚油烯基肌氨酸或硬脂基肌氨酸；亚油烯基甜菜碱、肉豆蔻基甜菜碱或鲸蜡基甜菜碱；月桂酰胺丙基甜菜碱、椰油酰胺丙基甜菜碱、亚油烯酰胺丙基甜菜碱、肉豆蔻酰胺丙基甜菜碱、棕榈酰胺丙基甜菜碱或异硬脂酰胺丙基甜菜碱(例如月桂酰胺丙基甜菜碱)；肉豆蔻酰胺丙基二甲胺、棕榈酰胺丙基二甲胺或异硬脂酰胺丙基二甲胺；甲基椰油基牛磺酸钠或甲基油基牛磺酸二钠；MONAQUATTM系列(MonaIndustries,Inc.,Paterson,N.J.)；聚乙二醇、聚丙二醇及乙二醇和丙二醇的共聚物(例如Pluronics、PF68等)等。在一个实施方案中，本文的表面活性剂是聚山梨酯20。
如本文使用，“药用”赋形剂或载剂包括本领域已知的药用载剂、稳定剂、缓冲剂、酸、碱、糖、防腐剂、表面活性剂、张力剂等(Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,22ndEd.,PharmaceuticalPress,2012)。药用赋形剂的实例包括缓冲剂如磷酸类、枸橼酸类、醋酸类及其它有机酸类；抗氧化剂包括抗坏血酸、L-色氨酸和甲硫氨酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；金属复合物如Zn-蛋白复合物；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；形成盐的抗衡离子如钠；和/或非离子型表面活性剂如聚山梨酯、泊洛沙姆、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。 “药用”赋形剂或载剂是以下那些赋形剂或载剂，其可合理施用至受试者以提供有效剂量的所用活性成分且在所用剂量和浓度对于向其暴露的受试者是无毒的。
配制的蛋白优选是基本上纯的且按需是基本上均质的(例如无污染蛋白等)。“基本上纯的”蛋白意为以下组合物，所述组合物基于其总重量包含按重量计至少约90％且优选按重量计至少约95％的所述蛋白(例如单克隆抗体)。“基本上均质的”蛋白意为以下组合物，所述组合物基于其总重量包含按重量计至少约99％的所述蛋白(例如单克隆抗体)。
术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本文可交换使用以指代氨基酸的任何长度的多聚物。所述多聚物可以是线性或分支的，其可包含修饰的氨基酸，且其可由非氨基酸中断。所述术语还涵盖已天然修饰或通过干预修饰的氨基酸多聚物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操纵或修饰如与标记组件缀合。所述定义还包括例如包含一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)的蛋白及本领域已知的其它修饰。涵盖在本文定义内的蛋白的实例包括哺乳动物蛋白如肾素；生长激素包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；前胰岛素；促卵泡激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；瘦素；凝血因子如因子VIIIC、因子IX、组织因子和血管性血友病因子；抗凝血因子如蛋白C；心房钠尿因子；肺表面活性剂；纤溶酶原激活剂如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)；蛙皮素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子α和β；肿瘤坏死因子受体如死亡受体5和CD120；TNF相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)；B-细胞成熟抗原(BCMA)；B淋巴细胞刺激因子(BLyS)；增殖诱导配体(APRIL)；脑啡肽；RANTES(调节激活正常T细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；缪勒管激素抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；前松弛素；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)如CTLA-4；抑制素；激活素；血小板源性内皮细胞生长因子(PD-ECGF)；血管内皮生长因子家族蛋白(例如VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和P1GF)；血小板源性生长因子(PDGF)家族蛋白(例如PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D及其二聚体)；成纤维细胞生长因子(FGF)家族如aFGF、bFGF、FGF4和FGF9；表皮生长因子(EGF)； 针对激素或生长因子的受体如VEGF受体(例如VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3)、表皮生长因子(EGF)受体(例如ErbB1、ErbB2、ErbB3和ErbB4受体)、血小板源性生长因子(PDGF)受体(例如PDGFR-α和PDGFR-β)和成纤维细胞生长因子受体；TIE配体(血管生成素、ANGPT1、ANGPT2)；血管生成素受体如TIE1和TIE2；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子如骨源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神经生长因子如NGF-b；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)；去(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)；CD蛋白如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；趋化因子如CXCL12和CXCR4；干扰素如干扰素α、β和γ；集落刺激因子(CSF)例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；细胞因子如白介素(IL)例如IL-1至IL-10；中期因子；超氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原如AIDS包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整合素如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肝配蛋白；Bv8；δ样配体4(DLL4)；Del-1；BMP9；BMP10；卵泡抑素；肝细胞生长因子(HGF)/分散因子(SF)；Alk1；Robo4；ESM1；串珠蛋白聚糖；EGF样结构域多重7(EGFL7)；CTGF及其家族成员；凝血酶敏感蛋白如凝血酶敏感蛋白1和凝血酶敏感蛋白2；胶原如胶原IV和胶原XVIII；神经纤毛蛋白如NRP1和NRP2；多效生长因子(PTN)；生长因子颗粒素蛋白前体；多育曲霉素；Notch蛋白如Notch1和Notch4；脑信号蛋白如Sema3A、Sema3C和Sema3F；肿瘤相关抗原如CA125(卵巢癌抗原)；免疫粘附素；及上文列举的任何蛋白的片段和/或变体及抗体[包括与一种或多种蛋白(包括例如上文列举的任何蛋白)结合的抗体片段]。
术语“抗体”在本文以最广义使用且具体覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段(只要它们展现出所期望的生物活性)。
“分离的”蛋白(例如分离的抗体)为以下蛋白，其已被鉴定并与其天然环境的组分分离和/或回收。其天然环境的污染组分为可能影响蛋白研究、诊断或治疗用途的物质并可包括酶、激素及其它蛋白或非蛋白溶质。分离的蛋白包括在重组细胞中的原位蛋白，这是因为所述蛋白的天然环境的至少一种组分 将不存在。然而，通常将通过至少一个纯化步骤制备分离的蛋白。
“天然抗体”通常为约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，然而二硫连接基的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间是不同的。各条重链和轻链还具有有规律地间隔的链内二硫桥。各条重链在一端具有可变结构域(VH)，接着具有多个恒定结构域。各条轻链在一端具有可变结构域(VL)且在其另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一个恒定结构域对齐，而轻链的可变结构域与重链的可变结构域对齐。据信特定氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成交界。
术语“恒定结构域”指免疫球蛋白分子的一部分，其相对于所述免疫球蛋白的包含抗原结合位点的另一部分即可变结构域具有较保守的氨基酸序列。恒定结构域包含重链的CH1、CH2和CH3结构域(统称CH)及轻链的CHL(或CL)结构域。
抗体的“可变区”或“可变结构域”指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变结构域可称作“VH”。轻链的可变结构域可称作“VL”。这些结构域通常是抗体的最多变的部分并包含抗原结合位点。
术语“可变”指下述事实：可变结构域的某些部分就序列而言在不同抗体之间差异很大，且这些部分用于各个特定抗体与其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性在抗体的整个可变结构域中不是平均分布的。其在轻链和重链可变结构域这二者中集中在3个称为高变区(HVR)的区段中。可变结构域的较高度保守的部分称为框架区(FR)。天然的重链和轻链的可变区分别包含4个FR区，其大多采用β-片层构象，通过3个HVR连接，其形成环连接β-片层结构且在一些情况中形成β-片层结构的一部分。在各个链中的HVR通过FR区紧密保持在一起且与来自其它链的HVR一起作用于抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,NationalInstituteofHealth,Bethesda,Md.(1991)。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展示了多种效应子功能，例如抗体在抗体依赖性细胞毒性中的参与。
来自任何哺乳动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可基于其恒定结构域的氨基酸序列归为两种截然不同的称为κ和λ的类型之一。
如本文使用的术语IgG“同种型”或“亚型”意为由其恒定区的化学和抗原 特性定义的免疫球蛋白的任何亚型。取决于其重链恒定结构域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可归为不同的类型。有5种主要的免疫球蛋白类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且它们中的几个可进一步分为亚型(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应不同免疫球蛋白类型的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类型的免疫球蛋白的亚基结构和三维构象是熟知的并通常描述于例如Abbasetal.CellularandMol.Immunology,4thed.,W.B.Saunders,Co.,2000。抗体可为较大的融合分子的一部分，所述融合分子通过所述抗体与一种或多种其它蛋白或肽的共价或非共价连接形成。
本文中可互换使用的术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体”指呈其基本上完整的形式的抗体而非如下文定义的抗体片段。所述术语特别指具有包含Fc区的重链的抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
对抗体进行的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的称为“Fab”片段的各自具有一个抗原结合位点的抗原结合片段和残留的其名称反映了其易于结晶的“Fc”片段。胃蛋白酶处理产生F(ab’)2片段，其具有两个抗原结合位点并仍然能够交联抗原。Fab片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域且还包含轻链的恒定结构域和重链的第一个恒定结构域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的差异在于在重链CH1结构域的羧基端添加少量残基，这些残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是本文对下述Fab’的指代，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离的硫醇基团。F(ab’)2抗体片段的最初产生形式为一对彼此间具有铰链半胱氨酸的Fab’片段。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
“Fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种类由紧密非共价连接的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体构成。在单链Fv(scFv)种类中，可通过柔性肽接头将一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域共价连接以使轻链和重链可连接为与双链Fv种类中的二聚体类似的“二聚体”结构。在此构象中各个可变结构域的三个HVR相互作用以限定在VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。六个HVR共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，仅单个可变结构域(或仅包含3个特异 性针对抗原的HVR的半个Fv)就具有识别和结合抗原的能力，尽管比完整结合位点的亲和力低。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。通常，scFv多肽还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，其使scFv能够形成用于抗原结合的预期结构。scFv的综述参见例如Pluckthün,inThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,vol.113,RosenburgandMooreeds.,Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315,1994。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述片段包含与在相同多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不允许在相同链上的两个结构域之间发生配对的接头，所述结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体可为双价或双特异性的。例如在EP404,097；WO1993/01161；Hudsonetal.,Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollingeretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)中较完整地描述了双抗体。三抗体和四抗体也在Hudsonetal.,Nat.Med.9:129-134(2003)中进行了描述。
如本文使用的术语“单克隆抗体”指从基本上均质的抗体群体中得到的抗体，例如组成群体的单个抗体除了可能的突变例如可能以极低量存在的天然突变以外是相同的。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征在于不是不同抗体的混合物。在一些实施方案中，这样的单克隆抗体通常包括以下抗体，所述抗体包含靶结合多肽序列，其中靶结合多肽序列通过以下方法得到，所述方法包括从多种多肽序列中选择单个靶结合多肽序列。例如，选择方法可为从多个克隆例如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆中选择单一克隆。应当理解的是，所选择的靶结合序列可进一步被改造以例如改进对靶标的亲和力、人源化靶结合序列、改进其在细胞培养中的产生、降低其体内免疫原性、产生多特异性抗体等，且包含所改造的靶结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相比，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了其特异性以外，单克隆抗体制备物的优势在于其通常不被其它免疫球蛋白污染。
修饰语“单克隆”表示抗体的特征在于是从基本上均质的抗体群体中得到的，且不应理解为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用 的单克隆抗体可通过多种技术制备，包括例如杂交瘤方法(例如KohlerandMilstein,Nature,256:495-97(1975)；Hongoetal.,Hybridoma,14(3):253-260(1995)；Harlowetal.,Antibodies:ALaboratoryManual,(ColdSpringHarborLaboratoryPress,2nded.1988)；Hammerlingetal.,in:MonoclonalAntibodiesandT-CellHybridomas563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重组DNA方法(参见例如美国专利4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clacksonetal.,Nature,352:624-628(1991)；Marksetal.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhuetal.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Leeetal.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004)；和Leeetal.,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004))和在具有部分或全部人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中产生人或类人抗体的技术(参见例如WO1998/24893；WO1996/34096；WO1996/33735；WO1991/10741；Jakobovitsetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2551(1993)；Jakobovitsetal.,Nature362:255-258(1993)；Bruggemannetal.,YearinImmunol.7:33(1993)；美国专利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；and5,661,016；Marksetal.,Bio/Technology10:779-783(1992)；Lonbergetal.,Nature368:856-859(1994)；Morrison,Nature368:812-813(1994)；Fishwildetal.,NatureBiotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,NatureBiotechnol.14:826(1996)；和LonbergandHuszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。
本文中的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体及这些抗体的片段(只要它们展示出所预期的生物活性)，在所述“嵌合”抗体中，重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类型或亚型的抗体中的对应序列相同或同源，而链的其余部分与来源于另一种物种或属于另一种抗体类型或亚型的抗体中的对应序列相同或同源(参见例如美国专利4,816,567；和Morrisonetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。嵌合抗体包括![]()
抗体，其中抗体的抗原结合区来源于通过例如用目的抗原对猕猴进行免疫产生的抗体。
非人(例如鼠类)抗体的“人源化”形式是包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体是以下人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体HVR的残基由来自非人物种(供体抗体)例如小鼠、大 鼠、兔或非人灵长类的具有所预期的特异性、亲和力和/或能力的HVR的残基替换。在一些情况中，人免疫球蛋白的FR残基由对应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。可进行这些修饰以进一步完善抗体性能。通常，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个和通常两个可变结构域，其中高变环的全部或基本上全部对应非人免疫球蛋白的高变环，且FR的全部或基本上全部为人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)通常是人免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分。进一步的详情参见例如Jonesetal.,Nature321:522-525(1986)；Riechmannetal.,Nature332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还参见例如VaswaniandHamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions23:1035-1038(1995)；HurleandGross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；和美国专利6,982,321和7,087,409。
“人抗体”是具有对应由人产生的抗体的氨基酸序列的抗体和/或使用如本文公开的任何产生人抗体的技术产生的抗体。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可使用本领域已知的各种技术包括噬菌体展示文库产生人抗体。HoogenboomandWinter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marksetal.,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。用于制备人单克隆抗体还可使用的方法描述于Coleetal.,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,p.77(1985)；Boerneretal.,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)。还参见vanDijkandvandeWinkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。可通过对以下转基因动物施用抗原制备人抗体，所述转基因动物已改造为在响应抗原攻击下产生这些抗体，但其内源基因座已失效，例如免疫的异种鼠(xenomice)(参见例如关于XEN0M0USETM技术的美国专利6,075,181和6,150,584)。还参见例如关于通过人B细胞杂交瘤技术产生人抗体的Lietal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。
术语“高变区”、“HVR”或“HV”当在本文中使用时指抗体可变结构域的以下区域，其是序列高变的和/或形成在结构上限定的环。通常，抗体包含六个HVR，三个在VH(H1、H2、H3)中，且三个在VL(L1、L2、L3)中。在天然抗体中，H3和L3在六个HVR中展示最高的多样性，且特别地认为H3在赋予抗体以精细特异性中发挥独特的作用。参见例如Xuetal.,Immunity 13:37-45(2000)；JohnsonandWu,inMethodsinMolecularBiology248:1-25(Lo,ed.,HumanPress,Totowa,N.J.,2003)。实际上，天然存在的仅由重链构成的骆驼科动物抗体在缺乏轻链的情况下是有功能和稳定的。参见例如Hamers-Castermanetal.,Nature363:446-448(1993)；Sheriffetal.,NatureStruct.Biol.3:733-736(1996)。
正在使用的HVR描述有多种且涵盖于本文中。Kabat互补决定区(CDR)基于序列可变性且使用最广泛(Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991))。而Chothia涉及结构环的定位(ChothiaandLeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbMHVR体现了KabatHVR和Chothia结构环之间的折中且由OxfordMolecular’sAbM抗体建模软件使用。“接触”HVR基于现有的复合晶体结构的分析。下面注释了这些HVR中每一种的残基。
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HVR可包含如下“扩展的HVR”：在VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)和在VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。在这些定义中的每一个中，可变结构域残基根据上文的Kabatetal编号。
“框架”或“FR”残基为如本文定义的HVR残基以外的那些可变结构域残基。
术语“如Kabat中编号的可变结构域残基”或“如Kabat中编号的氨基酸位置”及其变化形式指在上文的Kabatetal.中用于抗体编译的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含对应可变结构域FR或HVR的缩短或插入的较少或额外的氨基酸。例如，重链可变结构域可包含在H2的52位残基后的单个氨基酸插入(根据Kabat为 52a位残基)和重链FR的82位残基后的插入残基(例如根据Kabat为82a、82b和82c位残基)。对于给定抗体，可通过抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源区比对确定残基的Kabat编号。
当涉及在可变结构域中的残基(大约是轻链的1-107位残基和重链的1-113位残基)时，通常使用Kabat编号系统(例如Kabatetal.,SequencesofImmunologicalInterest.5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991))。当涉及在免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”或“EU索引”(例如在以上Kabatetal中报道的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1EU抗体的残基编号。
表述“线性抗体”指描述于Zapataetal.(1995ProteinEng,8(10):1057-1062)中的抗体。简言之，这些抗体包含一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，其与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可为双特异性或单特异性的。
如本文使用的术语“约”指相应值的如本领域技术人员确定的可接受的误差范围，其将部分取决于所述值是如何测量或确定的即测量系统的限制。例如，“约”可意为根据本领域实践的在1之内或大于1的标准差。本文“约”某值或参数的指代包括且描述了针对该值或参数本身的实施方案。例如，关于“约X”的描述包括对“X”的描述。
如本说明书和附加的权利要求书中使用，单数形式的“一种”、“一个”和“所述”包括复数指代，除非另外清楚表明。因此，例如“一种化合物”的指代任选地包括两种或更多种这样的化合物的组合等。
可以理解的是，本文描述的本发明的各个方面和实施方案包括“包含”、“由…组成”和“基本上由…组成”的方面和实施方案。
II.蛋白配制物和制备
本发明涉及配制物，其包含蛋白和在所述配制物中防止所述蛋白氧化的化合物，所述化合物具有下式：
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其中R2选自氢、羟基、-COOH和-CH2COOH；
R3选自氢、羟基、-COOH、-CH2COOH和-CH2CHR3a(NH2)；其中R3a是COOH或氢；R4、R5、R6和R7独立选自氢和羟基；条件是R2、R3、R4、R5、R6和R7之一是羟基；或其药用盐。
在一些实施方案中，所述化合物具有下式：
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其中R2和R3独立选自氢、羟基、-COOH和-CH2COOH；且R4、R5、R6和R7独立选自氢和羟基；条件是R2、R3、R4、R5、R6和R7之一是羟基；或其药用盐。
在一些实施方案中，所述化合物具有下式：
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其中R3a是COOH或氢；R2、R4、R5、R6和R7独立选自氢和羟基；条件是R2、R4、R5、R6和R7之一是羟基；或其药用盐。
在一些实施方案中，上述任何式中的R4、R5或R7是羟基。在进一步的实施方案中，所述化合物选自5-羟基色氨酸、5-羟基吲哚、7-羟基吲哚和5-羟色胺。在一些实施方案中，上述任何式中的R5是羟基。在一些实施方案中，上述化合物是5-羟基衍生物，其包括但不限于5-羟基色氨酸、5-羟基吲哚、5-羟色胺等。在一些实施方案中，所述配制物是液体配制物。在一些实施方案中，所述配制物中的所述化合物为约0.3mM至约10mM或直至所述化合物可溶解在所述配制物中的最高浓度。在一些实施方案中，所述配制物中的所述化合物为约0.3mM至约1mM。在一些实施方案中，所述化合物防止所述蛋白中的一个或多个氨基酸的氧化，所述氨基酸选自色氨酸、半胱氨酸、组氨酸、酪氨酸和/或甲硫氨酸。在一些实施方案中，所述化合物防止所述蛋白通过活性氧(ROS)的氧化。在进一步的实施方案中，所述活性氧选自单线态氧、超氧化物(O2-)、烷氧自由基、过氧化氢自由基、过氧化氢(H2O2)、三氧化二氢(H2O3)、三氧化氢自由基(HO3·)、臭氧(O3)、羟基自由基和烷基过氧化物。在一些实施方案中，本文描述的蛋白易于氧化。在一些实施方案中，所述蛋 白中的甲硫氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸和/或酪氨酸易于氧化。在一些实施方案中，所述蛋白中的色氨酸和/或甲硫氨酸易于氧化。例如，单克隆抗体的Fab部分中的色氨酸氨基酸和/或单克隆抗体Fc部分中的甲硫氨酸氨基酸可易于氧化。在一些实施方案中，所述蛋白是治疗性蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白是抗体。在一些实施方案中，所述蛋白是多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体或抗体片段。在进一步的实施方案中，所述化合物防止抗体的Fab部分中的一个或多个氨基酸的氧化。在进一步的实施方案中，所述化合物防止抗体的Fc部分中的一个或多个氨基酸的氧化。在一些实施方案中，本文提供的配制物是适于施用至受试者的药物配制物。如本文使用的“受试者”或“个体”出于治疗或施用目的指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和牲畜和动物园、运动或宠物动物如狗、马、猫、牛等。优选地，所述哺乳动物是人。在一些实施方案中，所述配制物是水性的。在本文的一些实施方案中，所述配制物中所述蛋白(例如抗体)的浓度为约1mg/mL至约250mg/mL。在一些实施方案中，所述配制物进一步包含一种或多种赋形剂，所述赋形剂选自稳定剂、缓冲剂、表面活性剂和张力剂。例如，本发明的配制物可包含单克隆抗体、如本文提供的防止蛋白氧化的化合物(例如5-羟基吲哚)和维持所述配制物的pH至预期水平的缓冲剂。在一些实施方案中，本文提供的配制物具有约4.5至约7.0的pH。
所述配制物中的蛋白和抗体可使用本领域已知的方法制备。所述配制物中的抗体(例如全长抗体、抗体片段和多重特异性抗体)使用本领域已有技术制备，其非限制的示例方法在下列部分详细描述。本文的方法可由本领域的技术人员应用于制备包含其它蛋白如基于肽的抑制剂的配制物。用于产生治疗性蛋白的公知和常用技术和方法参见MolecularCloning:ALaboratoryManual(Sambrooketal.,4thed.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,2012)；CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.M.Ausubel,etal.eds.,2003)；ShortProtocolsinMolecularBiology(Ausubeletal.,eds.,J.WileyandSons,2002)；CurrentProtocolsinProteinScience,(Horswilletal.,2006)；Antibodies,ALaboratoryManual(HarlowandLane,eds.,1988)；CultureofAnimalCells:AManualofBasicTechniqueandSpecializedApplications(R.I.Freshney,6thed.,J.WileyandSons,2010)，其在本文全部以其全文通过提述并入。
A.抗体制备
本文提供的配制物中的抗体针对感兴趣的抗原。优选地，所述抗原是生物学上重要的多肽并将所述抗体施用至患有病症的哺乳动物可在该哺乳动物中导致治疗益处。然而，针对非多肽抗原的抗体也在考虑之中。
当抗原是多肽时，其可以是跨膜分子(例如受体)或配体如生长因子。典型的抗原包括分子如血管内皮生长因子(VEGF)；CD20；ox-LDL；ox-ApoB100；肾素；生长激素包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；前胰岛素；卵泡刺激激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；瘦素；凝血因子如因子VIIIC、因子IX、组织因子和血管性血友病因子；抗凝血因子如蛋白C；心房钠尿因子；肺表面活性剂；纤溶酶原激活剂如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)；蛙皮素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子α和β；肿瘤坏死因子受体如死亡受体5和CD120；TNF相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)；B-细胞成熟抗原(BCMA)；B淋巴细胞刺激因子(BLyS)；增殖诱导配体(APRIL)；脑啡肽；RANTES(正常T细胞表达和分泌激活的调节)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；Muellerian抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；前松弛素；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)如CTLA-4；抑制素；激活素；血小板源性内皮细胞生长因子(PD-ECGF)；血管内皮生长因子家族蛋白(例如VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和P1GF)；血小板源性生长因子(PDGF)家族蛋白(例如PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D及其二聚体)；成纤维细胞生长因子(FGF)家族如aFGF、bFGF、FGF4和FGF9；表皮生长因子(EGF)；针对激素或生长因子的受体如VEGF受体(例如VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3)、表皮生长因子(EGF)受体(例如ErbB1、ErbB2、ErbB3和ErbB4受体)、血小板源性生长因子(PDGF)受体(例如PDGFR-α和PDGFR-β)和成纤维细胞生长因子受体；TIE配体(血管生成素、ANGPT1、ANGPT2)；血管生成素受体如TIE1和TIE2；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子如骨源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神经生长因子如NGF-b；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)；去(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素样 生长因子结合蛋白(IGFBP)；CD蛋白如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；趋化因子如CXCL12和CXCR4；干扰素如干扰素α、β和γ；集落刺激因子(CSF)例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；细胞因子如白介素(IL)例如IL-1至IL-10；中期因子；超氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原如AIDS包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整合素如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肝配蛋白；Bv8；δ样配体4(DLL4)；Del-1；BMP9；BMP10；卵泡抑素；肝细胞生长因子(HGF)/分散因子(SF)；Alk1；Robo4；ESM1；串珠蛋白聚糖；EGF样结构域、，多重7(EGFL7)；CTGF及其家族成员；凝血酶敏感蛋白如凝血酶敏感蛋白1和凝血酶敏感蛋白2；胶原如胶原IV和胶原XVIII；神经纤毛蛋白NRP1和NRP2；多效生长因子(PTN)；生长因子颗粒素蛋白前体；多育曲霉素；Notch蛋白如Notch1和Notch4；脑信号蛋白如Sema3A、Sema3C和Sema3F；肿瘤相关抗原如CA125(卵巢癌抗原)；免疫粘附素；及上文列举的任何蛋白的片段和/或变体及抗体，包括与一种或多种蛋白(包括例如上文列举的任何蛋白)结合的抗体片段。
(i)抗原制备
可溶性抗原或其片段(任选偶联有其它分子的)可作为免疫原用于生成抗体。对于跨膜分子如受体，它们的片段(例如受体的胞外结构域)可用作免疫原。或者，表达跨膜分子的细胞可用作免疫原。此类细胞可衍生自天然来源(例如癌细胞系)，或者可以是经重组技术转化而表达跨膜分子的细胞。对于制备抗体有用的其它抗原及其形式对于本领域技术人员将是显而易见的。
(ii)某些基于抗体的方法
多克隆抗体优选通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂生成。使用双功能或衍生化试剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR(其中R和R1是不同的烷基基团)，将相关抗原与在待免疫物种中有免疫原性的蛋白偶联可能是有用的，例如锁孔蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。
通过将例如100μg或5μg蛋白或偶联物(分别用于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混和并将该溶液皮内注射于多个部位，将动物针对抗原、免 疫原性偶联物或衍生物进行免疫。一个月后，通过多个部位的皮下注射，用弗氏完全佐剂中初始量1/5-1/10的肽或偶联物对动物进行加强免疫。7-14天后，采集动物的血液，并测定血清的抗体滴度。对动物进行加强免疫，直到滴度达到平台(plateau)。优选的是，将动物用相同抗原但与不同蛋白和/或通过不同交联剂偶联得到的偶联物进行加强免疫。偶联物还可在重组细胞培养中作为蛋白融合物来制备。同样，适当使用凝聚剂如明矾来增强免疫应答。
感兴趣的单克隆抗体可使用杂交瘤方法来生成，其首先记载于Kohleretal.,Nature,256:495(1975)，且关于人-人杂交瘤进一步记载于例如Hongoetal.,Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlowetal.,Antibodies:ALaboratoryManual,(ColdSpringHarborLaboratoryPress,2nded.1988)；Hammerlingetal.,in:MonoclonalAntibodiesandT-CellHybridomas563-681(Elsevier,N.Y.,1981),和Ni,XiandaiMianyixue,26(4):265-268(2006)中。额外的关于从杂交瘤细胞系生成单克隆人天然IgM抗体的那些方法包括描述于例如美国专利7,189,826中的。人杂交瘤技术(三元杂交瘤(Trioma)技术)描述于VollmersandBrandlein,HistologyandHistopathology,20(3):927-937(2005)和VollmersandBrandlein,MethodsandFindingsinExperimentalandClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)中。
对于各种杂交瘤技术，参见例如US2006/258841；US2006/183887(完全人的抗体)；US2006/059575；US2005/287149；US2005/100546；US2005/026229；及美国专利7,078,492和7,153,507。使用杂交瘤方法来生成单克隆抗体的示例性方案记载如下。在一个实施方案中，免疫小鼠或其它适宜宿主动物(如仓鼠)以引发生成或能够生成将特异性结合用于免疫的蛋白的抗体的淋巴细胞。通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射本发明的多肽或其片段和佐剂如单磷脂酰脂质A(MPL)/海藻糖二棒分枝菌酸酯(TDM)(RibiImmunochem.Research,Inc.,Hamilton,Mont.)，在动物中生成抗体。本发明的多肽(例如抗原)或其片段可使用本领域公知方法来制备，如重组方法，其中一些在本文中进一步描述。对来自经免疫动物的血清测定抗抗原抗体，并任选施用加强免疫。从生成抗抗原抗体的动物分离淋巴细胞。可替换地，在体外免疫淋巴细胞。
随后使用合适的融合剂如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞。参见例如Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,pp.59-103(AcademicPress,1986)。可使用高效融合、支持选定地抗体生成细 胞稳定地高水平生成抗体、且对培养基如HAT培养基敏感的骨髓瘤细胞。示例性的骨髓瘤细胞包括但不限于鼠骨髓瘤细胞，如那些从MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤(可得自SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,Calif.USA)衍生的，及从SP-2或X63-Ag8-653细胞(可得自AmericanTypeCultureCollection,Rockville,Md.USA)衍生的的。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也描述用于生成人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeuretal.,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,pp.51-63(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987))。
将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，例如含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质的培养基。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则典型用于杂交瘤的培养基将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。优选地，使用无血清杂交瘤细胞培养方法来降低动物衍生血清的使用，如胎牛血清，如记载于例如Evenetal.,TrendsinBiotechnology,24(3),105-108(2006)。
作为提高杂交瘤细胞培养物生产力的工具的寡肽记载于Franek,TrendsinMonoclonalAntibodyResearch,111-122(2005)。具体地，标准培养基富含某些氨基酸(丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、脯氨酸)或蛋白水解产物级分，而且可通过由3-6个氨基酸残基构成的合成寡肽来显著遏制凋亡。所述肽以毫摩尔或更高浓度存在。
可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养液测定结合本发明抗原的单克隆抗体的生成。可通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Scatchard分析来测定。参见例如Munsonetal.,Anal.Biochem.,107:220(1980)。
在鉴定得到生成具有预期特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，该克隆可通过有限稀释规程进行亚克隆并通过标准方法进行培养(参见例如上文Goding)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以在动物中作为腹水瘤进行体内培养。可通过常规免疫球蛋白纯化规程，如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养液、腹水或血清适当分开。 用于从杂交瘤细胞分离蛋白的规程记载于US2005/176122和美国专利6,919,436。该方法包括在结合过程中最低限度地使用盐，如易溶盐，而且优选还在洗脱过程中使用少量的有机溶剂。
(iii)某些文库筛选方法
本文描述的抗体可以通过使用组合库筛选具有期望活性的抗体来生成。例如，本领域已知用于构建噬菌体展示库及对此类文库筛选具有预期的结合特性的抗体的多种方法。这些方法一般地记载于Hoogenboometal.inMethodsinMolecularBiology178:1-37(O’Brienetal.,ed.,HumanPress,Totowa,N.J.,2001)。例如，一种产生感兴趣抗体的方法是经由使用如Leeetal.,J.Mol.Biol.(2004),340(5):1073-93中所描述的噬菌体抗体文库。
原则上，通过筛选噬菌体文库来选择合成的抗体克隆，所述噬菌体文库含有展示融合至噬菌体外壳蛋白的各种抗体可变区(Fv)片段的噬菌体。通过针对所需抗原的亲和色谱来淘选此类噬菌体文库。表达能够结合所需抗原的Fv片段的克隆被吸附至抗原，从而与文库中不结合的克隆分开。随后将结合的克隆从抗原上洗脱，而且可以通过额外的抗原吸附/洗脱循环进一步富集。本发明的任何抗体可以如下获得，即设计合适的抗原筛选规程来选择感兴趣的噬菌体克隆，接着使用来自感兴趣的噬菌体克隆的Fv序列和Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,NIHPublication91-3242,BethesdaMd.(1991),vols.1-3中记载的合适的恒定区(Fc)序列来构建全长抗体克隆。
在一些实施方案中，抗体的抗原结合域由两个约110个氨基酸的可变(V)区形成，其分别来自轻链(VL)和重链(VH)，都呈现三个高变环(HVR)或互补决定区(CDR)。可变域可以功能性展示在噬菌体上，或是作为单链Fv(scFv)片段(其中VH和VL通过短的、柔性的接头共价相连)，或者作为Fab片段(其中它们各自与恒定域融合且非共价相互作用)，如Winteretal.,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)所述。在用于本文时，编码scFv的噬菌体克隆和编码Fab的噬菌体克隆统称为“Fv噬菌体克隆”或“Fv克隆”。
VH和VL基因的全集可以通过聚合酶链式反应(PCR)分开克隆，并在噬菌体文库中随机重组，随后可以搜索抗原结合克隆，如Winteretal.,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)所述。来自经免疫来源的文库提供对免疫原有高亲和力的抗体，无需构建杂交瘤。可替换地，可以克隆未免疫的全集，用于为 广泛的非自身的及自身的抗原提供单一人抗体来源，无需任何免疫，如Griffithsetal.,EMBOJ,12:725-734(1993)所述。最后，未免疫的文库还可以以合成方式来构建，即从干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用包含随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区及用来在体外实现重排，如HoogenboomandWinter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。
在一些实施方案中，通过与次要外壳蛋白pIII融合，使用丝状噬菌体来展示抗体片段。抗体片段可以展示为单链Fv片段，其中VH与VL结构域通过柔性多肽间隔在同一多肽链上相连，例如如Marksetal.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)所述，或者展示为Fab片段，其中一条链与pIII融合，另一条链分泌入细菌宿主细胞周质，在此装配Fab-外壳蛋白结构，其通过替换一些野生型外壳蛋白而展示在噬菌体表面上，例如如Hoogenboometal.,Nucl.AcidsRes.,19:4133-4137(1991)所述。
一般而言，从收获自人或动物的免疫细胞获得编码抗体基因片段的核酸。若希望文库偏向抗抗原克隆，那么可以给受试者免疫接种抗原以产生抗体应答，并回收脾细胞和/或循环B细胞或其它外周血淋巴细胞(PBL)用于文库构建。在一个实施方案中，如下得到了偏向抗抗原克隆的人抗体基因片段文库，即在携带功能性人免疫球蛋白基因阵列(且缺乏功能性内源抗体生成系统)的转基因小鼠中产生抗抗原抗体应答，使得抗原免疫接种产生生成针对抗原的人抗体的B细胞。生成人抗体的转基因小鼠的生成在下文中进行了描述。
可以如下获得抗抗原反应性细胞群的进一步富集，即使用合适的筛选规程来分离表达抗原特异性膜结合抗体的B细胞，例如通过使用抗原亲和色谱进行的细胞分离或者细胞对荧光染料标记的抗原的吸附及后续的荧光激活细胞分选(flow-activatedcellsorting,FACS)。
可替换地，来自未免疫供体的脾细胞和/或B细胞或其它PBL的使用提供了可能的抗体全集的更佳展现，而且还允许使用抗原在其中没有抗原性的任何动物(人或非人的)物种构建抗体文库。对于构建体外掺入抗体基因的文库，从受试者收获干细胞以提供编码未重排抗体基因区段的核酸。可以从多种动物物种如人、小鼠、大鼠、兔类、luprine、犬、猫、猪、牛、马和禽类物种等获得感兴趣的免疫细胞。
从感兴趣的细胞回收编码抗体可变基因区段(包括VH和VL区段)的核酸并扩增。就重排的VH和VL基因文库而言，可以如下获得所需DNA，即从 淋巴细胞分离基因组DNA或mRNA，接着用与重排的VH和VL基因的5’和3’末端匹配的引物进行聚合酶链式反应(PCR)，如Orlandietal.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),86:3833-3837(1989)所述，由此构建多样性V基因全集用于表达。可以从cDNA和基因组DNA扩增V基因，反向引物位于编码成熟V结构域的外显子的5’末端，正向引物基于J区段内部，如Orlandietal.(1989)andinWardetal.,Nature,341:544-546(1989)所述。然而，为了从cDNA进行扩增，反向引物还可基于前导外显子内，如Jonesetal.,Biotechnol.,9:88-89(1991)所述，正向引物基于恒定区内，如Sastryetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),86:5728-5732(1989)所述。为了使互补性最大化，引物中可以并入简并性，如Orlandietal.(1989)orSastryetal.(1989)所述。在一些实施方案中，如下将文库多样性最大化，即使用靶向每个V基因家族的PCR引物来扩增免疫细胞核酸样品中存在的所有可获得的VH和VL重排，例如如Marksetal.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)的方法中所述或如Orumetal.,NucleicAcidsRes.,21:4491-4498(1993)的方法中所述。为了将所扩增的DNA克隆入表达载体，可以在PCR引物的一端引入罕见的限制性位点作为标签，如Orlandietal.(1989)所述，或者用带标签的引物进行进一步的PCR扩增，如Clacksonetal.,Nature,352:624-628(1991)。
合成重排的V基因全集可以在体外从V基因区段衍生。大多数人VH基因区段已经克隆和测序(Tomlinsonetal.,J.Mol.Biol.,227:776-798(1992)中报道)，并定位(Matsudaetal.,NatureGenet.,3:88-94(1993)中报道)；这些克隆的区段(包括Hl和H2环的所有主要构造)可用于生成多样性VH基因全集，用到编码序列和长度多样性的H3环的PCR引物，如HoogenboomandWinter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。VH全集还可如下生成，所有序列多样性集中于单一长度的长H3环，如Barbasetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4457-4461(1992)所述。人Vκ和Vλ区段已经克隆和测序(WilliamsandWinter,Eur.J.Immunol.,23:1456-1461(1993)中报道)，而且可用于生成合成轻链全集。基于一系列VH和VL折叠结构及L3和H3长度的合成V基因全集将编码具有可观结构多样性的抗体。扩增编码V基因的DNA后，依照HoogenboomandWinter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)的方法，可以在体外重排种系V基因区段。
抗体片段全集可以如下构建，即以数种方式将VH与VL基因全集联合 在一起。可以在不同载体中创建各个全集，并在体外重组载体，例如如Hogrefeetal.,Gene,128:119-126(1993)所述，或者在体内通过组合感染来重组载体，例如Waterhouseetal.,Nucl.AcidsRes.,21:2265-2266(1993)中记载的IoxP系统。体内重组方法利用Fab片段的双链性质来克服因大肠杆菌转化效率施加的库大小限制。分开克隆未免疫的VH和VL全集，一个克隆入噬菌粒，另一个克隆入噬菌体载体。然后通过用噬菌体感染含噬菌粒的细菌使得每个细胞包含一种不同组合来联合两个文库，库大小只受细胞存在数的限制(约1012个克隆)。两种载体都包含体内重组信号，使得VH与VL基因重组到单一复制子上，并共包装成噬菌体病毒粒。这些巨型文库提供了大量的具有优良亲和力(Kd-1为约10-8M)的多样性抗体。
可替换地，可以将全集顺序克隆入同一载体，例如如Barbasetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:7978-7982(1991)所述，或者通过PCR装配到一起，然后克隆，例如如Clacksonetal.,Nature,352:624-628(1991)所述。PCR装配还可用于将VH和VLDNA与编码柔性肽间隔的DNA连接以形成单链Fv(scFv)全集。在另一种技术中，“细胞内PCR装配”用于通过PCR在淋巴细胞内联合VH与VL基因，然后克隆所连接基因的全集，如Embletonetal.,Nucl.AcidsRes.,20:3831-3837(1992)所述。
由未免疫文库(天然的或合成的)生成的抗体可具有中等亲和力(Kd-1为约106-107M-1)，但还可以如下在体外模拟亲和力成熟，即构建次生文库并再次选择，如上文Winteretal.(1994)所述。例如，在Hawkinsetal.,J.Mol.Biol.,226:889-896(1992)的方法或Grametal.,Proc.Natl.Acad.SciUSA,89:3576-3580(1992)的方法中，使用易错聚合酶在体外随机引入突变(Leungetal.,Technique1:11-15(1989)中报道)。另外，可以通过随机突变一个或多个CDR来进行亲和力成熟，例如在选定的个别Fv克隆中使用携带跨越感兴趣CDR的随机序列的引物进行PCR并筛选更高亲和力的克隆。WO9607754(公布于1996年3月14日)记载了用于在免疫球蛋白轻链的互补决定区中诱导诱变以创建轻链基因文库的方法。另一种高效方法是将通过噬菌体展示选出的VH或VL结构域与从未免疫供体获得的天然存在V结构域变体全集重组，并在数轮链改组中筛选更高亲和力，如Marksetal.,Biotechnol.,10:779-783(1992)所述。该技术允许生成亲和力约10-9或小于10-9M的抗体和抗体片段。
文库的筛选可通过本领域已知的多种技术来实现。例如，抗原可用于包 被吸附板的孔，在附着至吸附板的宿主细胞上表达，或用于细胞分选，或者偶联至生物素以用链霉亲合素包被的珠捕捉，或者用于淘选噬菌体展示库的任何其它方法。
在适于至少部分噬菌体颗粒结合吸附剂的条件下，使噬菌体文库样品接触固定化的抗原。正常情况下，选择包括pH、离子强度、温度等的条件来模拟生理学条件。结合至固相的噬菌体进行清洗，然后用酸洗脱，例如如Barbasetal.,Proc.Natl.Acad.SciUSA,88:7978-7982(1991)所述，或者用碱洗脱，例如如Marksetal.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)所述，或者通过抗原竞争洗脱，例如在与Clacksonetal.,Nature,352:624-628(1991)的抗原竞争法类似的规程中。噬菌体在单轮选择中可以富集20-1000倍。此外，富集的噬菌体可以在细菌培养物中进行培养，并进行更多轮选择。
选择的效率取决于许多因素，包括清洗过程中解离的动力学，及单个噬菌体上的多个抗体片段是否能同时结合抗原。具有较快解离动力学(和弱结合亲和力)的抗体可以通过使用短时间的清洗、多价噬菌体展示、及固相中的高抗原包被密度来保留。高密度不仅通过多价相互作用而稳定了噬菌体，而且有利于已解离的噬菌体的再结合。具有较慢解离动力学(和强结合亲和力)的抗体的选择可以通过使用长时间的清洗和单价噬菌体展示(如Bassetal.,Proteins,8:309-314(1990)和WO92/09690所述)及低抗原包被密度(如Marksetal.,Biotechnol.,10:779-783(1992)所述)来促进。
有可能在对抗原具有不同亲和力的噬菌体抗体之间进行选择，甚至是亲和力略有差异的。然而，选定抗体的随机突变(例如如有些亲和力成熟技术中所进行的)有可能产生许多突变体，多数结合抗原，少数具有更高的亲和力。通过限制抗原，罕见的高亲和力噬菌体能竞争胜出。为了保留所有较高亲和力的突变体，可以将噬菌体与过量的生物素化抗原一起温育，但是生物素化抗原的浓度以摩尔计低于抗原的目标摩尔亲和常数。然后可以用链霉亲合素包被的顺磁珠捕捉高亲和力的结合噬菌体。这种“平衡捕捉”允许依照结合亲和力来选择抗体，其灵敏性允许从大大过量的低亲和力噬菌体中分离出亲和力只有原值两倍的突变体克隆。还可以操作用于清洗结合至固相的噬菌体的条件来进行基于解离动力学的区分。
抗抗原克隆可以基于活性进行选择。在一些实施方案中，本发明提供结合天然表达抗原的活细胞或结合游离漂浮抗原或附着于其它细胞结构的抗原 的抗抗原抗体。对应于此类抗抗原抗体的Fv克隆可以如下选出：(1)如上所述从噬菌体文库分离抗抗原克隆，并任选通过在合适的细菌宿主中培养所分离的噬菌体克隆群来扩增该群体；(2)选出分别想要阻断和不阻断其活性的第二蛋白和抗原；(3)使抗抗原噬菌体克隆吸附至固定化的抗原；(4)使用过量的第二蛋白来洗脱任何不想要的、识别抗原结合决定簇(其与第二蛋白的结合决定簇交叠或共享)的克隆；并(5)洗脱在步骤(4)后仍然吸附的克隆。任选地，具有期望的阻断/不阻断特性的克隆可以通过一次或多次重复本文所述选择规程来进一步富集。
编码杂交瘤衍生单克隆抗体或噬菌体展示Fv克隆的DNA易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用设计成自杂交瘤或噬菌体DNA模板特异性扩增感兴趣的重链和轻链编码区的寡核苷酸引物)。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染入原本不生成免疫球蛋白蛋白的宿主细胞，如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得所需单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerraetal.,Curr.OpinioninImmunol.,5:256(1993)andPluckthun,Immunol.Revs,130:151(1992)。
编码本发明Fv克隆的DNA可以联合编码重链和/或轻链恒定区的已知DNA序列(例如合适的DNA序列可从上文的Kabatetal.获得)以形成编码全长或部分长度重链和/或轻链的克隆。应当理解的是任何同种型的恒定区都可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，而且此类恒定区可以从任何人或动物物种获得。衍生自一种动物(如人)物种的可变域DNA，然后与另一动物物种的恒定区DNA融合以形成“杂合的”全长重链和/或轻链的编码序列的Fv克隆包括在本文所用“嵌合”和“杂合”抗体的定义中。在一些实施方案中，衍生自人可变DNA的Fv克隆与人恒定区DNA融合以形成全长或部分长度人重链和/或轻链的编码序列。
还可以修饰编码衍生自本发明杂交瘤的抗抗原抗体的DNA，例如通过取代，即用人重链和轻链恒定域的编码序列替换衍生自杂交瘤克隆的同源鼠序列(例如如Morrisonetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)中的方法)。可以进一步修饰编码杂交瘤或Fv克隆衍生抗体或片段的DNA，通过共价连接免疫球蛋白编码序列和非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列。可以以该方式制备具有本发明的Fv克隆或杂交瘤克隆衍生抗体的结合特异 性的“嵌合”或“杂合”抗体。
(iv)人源化抗体和人抗体
本领域已知用于人源化非人抗体的多种方法。例如，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为“输入”残基，它们通常取自“输入”可变区。基本上可遵循Winter及其同事的方法进行人源化(Jonesetal.,Nature,321:522-525(1986)；Riechmannetal.,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyenetal.,Science,239:1534-1536(1988))，即用啮齿类CDR或CDR序列替代人抗体的对应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中显著少于完整的人可变区用非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是其中有些CDR残基和可能的有些FR残基用啮齿类抗体类似位点的残基替代的人抗体。
用于制备人源化抗体的人轻链和重链可变区的选择对于降低抗原性是非常重要的。依照所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体的可变区序列对已知人可变区序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(FR)(Simsetal.,J.Immunol.,151:2296(1993)；Chothiaetal.,J.Mol.Biol.,196:901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚类(subgroup)的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用于几种不同的人源化抗体(Carteretal.,Proc.Natl.AcadSci.USA,89:4285(1992)；Prestaetal.,J.Immunol.,151:2623(1993))。
更为重要的是抗体在人源化后保留对抗原的高亲和力及其它有利的生物学特性。为了达到此目的，依照该方法的一个实施方案，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。通常可获得免疫球蛋白三维模型，这是本领域技术人员所熟悉的。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。通过检查这些显示图像能分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从受体序列和输入序列中选出FR残基并组合，从而得到期望的抗体特征，如对靶抗原的亲和力升高。一般而言，高变区残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。
配制物和组合物中的人抗体可以通过如上所述联合选自人衍生噬菌体展示库的Fv克隆可变域序列与已知的人恒定域序列来构建。可替换地，可以通 过杂交瘤方法来生成本发明的人单克隆抗体。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已有记载，例如KozborJ.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeuretal.,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,pp.51-63(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987)；和Boerneretal.,J.Immunol.,147:86(1991)。
有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovitsetal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993)；Jakobovitsetal.,Nature,362:255-258(1993)；Bruggermannetal.,YearinImmuno.,7:33(1993)；和Duchosaletal.Nature355:258(1992)。
基因改组也可用于在体外从非人(例如啮齿类)抗体衍生人抗体，其中人抗体具有与起始非人抗体类似的亲和力和特异性。依照此方法，它也称为“表位印记”(epitopeimprinting)，如本文所述通过噬菌体展示技术得到的非人抗体片段的重链或轻链可变区用人V结构域基因全集替换，产生非人链-人链scFv或Fab嵌合物群。用抗原进行的选择导致非人链/人链嵌合scFv或Fab的分离，其中人链在一级噬菌体展示克隆中消除相应的非人链后恢复了抗原结合位点，即表位决定(印记，imprint)人链配偶体的选择。在重复该过程以替换剩余非人链时，得到人抗体(参见PCTWO93/06213，公开于1993年4月1日)。与传统的通过CDR移植进行的非人抗体的人源化不同，此技术提供完全人的抗体，它们不含非人起源的FR或CDR残基。
(v)抗体片段
抗体片段可以通过传统手段来生成，如酶促消化，或通过重组技术来生成。在某些情况中，使用抗体片段，而不是完整抗体有优势。片段的较小尺寸允许快速清除，而且可导致更易于到达某些组织。某些抗体片段的综述参见Hudsonetal.(2003)Nat.Med.9:129-134。
已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimotoetal.,JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107-117(1992)；和Brennanetal.,Science,229:81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab、Fv和 scFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达和由大肠杆菌分泌，如此容许容易地生成大量的这些片段。可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。可替换地，可直接从大肠杆菌回收Fab’-SH片段并化学偶联以形成F(ab’)2片段(Carteretal.,Bio/Technology10:163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab’)2片段。包含补救受体结合表位残基、具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段记载于美国专利5,869,046。用于生成抗体片段的其它技术对于熟练从业人员会是显而易见的。在一些实施方案中，抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO93/16185；美国专利5,571,894；和5,587,458。Fv和scFv是具有完整结合位点、缺少恒定区的唯一类型；因此，它们可能适于在体内使用时降低非特异性结合。可构建scFv融合蛋白以生成效应器蛋白在scFv的氨基或羧基末端的融合。参见上文AntibodyEngineering,ed.Borrebaeck。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利5,641,870中所记载的。此类线性抗体可以是单特异性的或双特异性的。
(vi)多特异性抗体
多特异性抗体具有对至少两种不同表位的结合特异性，其中所述表位通常来自不同抗原。尽管此类分子通常只结合两种不同表位(即双特异性抗体，BsAb)，但是此表述在用于本文时涵盖具有额外特异性的抗体，如三特异性抗体。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab’)2双特异性抗体)。
用于构建双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millsteinetal.,Nature,305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和色谱步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。类似的规程公开于WO93/08829和Trauneckeretal.,EMBOJ.,10:3655-3659(1991)。
依照不同的方法，将期望具有结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。优选的是，与包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域进行融合。通常在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和，在需要时，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体中，并共 转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供所期望的最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了很大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时或在该比例没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体。
在该方法的一个实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了便利的分离途径，因此发现这种不对称结构便于将期望的双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法公开于W094/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Sureshetal.,MethodsinEnzymology,121:210(1986)。
依照W096/27011中记载的另一种方法，可改造一对抗体分子间的交界，以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。一种交界包含抗体恒定域的至少部分CH3结构域。在该方法中，将第一抗体分子交界的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换，在第二抗体分子的交界上产生与大侧链相同或类似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物如同二聚体提高异二聚体产量的机制。
双特异性抗体包括交联的或“异源偶联的”抗体。例如，可以将异源偶联物中的一种抗体与亲合素偶联，而将另一种抗体与生物素偶联。此类抗体已经建议用于例如将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利4,676,980)和用于治疗HIV感染(WO91/00360、WO92/200373和EP03089)。异源偶联抗体可以使用任何方便的交联方法来制备。合适的交联剂连同许多交联技术是本领域众所周知的，而且公开于美国专利4,676,980。
文献中还记载了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennanetal.,Science,229:81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab’)2片段的规程。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。随后将Fab’-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab’-硫醇，并与等摩 尔量的另一种Fab’-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。
最新的进展便于从大肠杆菌直接回收Fab’-SH片段，这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。也可以从大肠杆菌直接回收Fab’-SH片段，而且可以将这些片段化学偶联以形成双特异性抗体。Shalabyetal.,J.Exp.Med.,175:217-225(1992)记载了完全人源化的双特异性抗体F(ab’)2分子的生成。由大肠杆菌分开分泌每种Fab’片段，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。
还记载了从重组细胞培养物直接生成和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelnyetal.,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab’部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。由Hollingeretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。相应地，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互补的VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体构建双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruberetal,J.Immunol,152:5368(1994)。
设想了具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体，Tuftetal.J.Immunol.147:60(1991)。
(vii)单域抗体
在一些实施方案中，本发明的抗体是单域抗体(single-domainantibody)。单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或者整个或部分轻链可变域的单一多肽链。在一些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,Mass.；see,e.g.,美国专利6,248,516B1)。在一个实施方案中，单域抗体由抗体的整个或部分重链可变域组成。
(viii)抗体变体
在一些实施方案中，涵盖本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可 以是通过将适宜的变化引入编码抗体的核苷酸序列或通过肽合成制备的。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基删除和/或插入和/或替代。若最终的构建物具有期望的特征，可进行任何删除、插入和替代组合以获得最终的构建物。可在制备序列时将氨基酸改变引入受试抗体的氨基酸序列。
(ix)抗体衍生物
可进一步修饰本发明的抗体以包含本领域知道的且易于获得的额外非蛋白性部分。在一些实施方案中，适于抗体衍生化的部分是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三P恶烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)、右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着于抗体的聚合物数目可以变化，而且若附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于待改进抗体的具体特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。
(x)载体、宿主细胞、和重组方法
也可以使用重组方法来生成抗体。为了重组生产抗抗原抗体，分离编码抗体的核酸，并将其插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。可使用常规规程容易的分离编码抗体的DNA并测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)。可利用许多载体。载体组件通常包括但不限于下列一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。
(a)信号序列组件
配制物和组合物中的抗体不仅可以直接重组生产，而且可以作为与异源多肽的融合多肽，所述异源多肽优选是成熟蛋白或多肽的N-末端处的信号序列或具有特异性切割位点的其它多肽。所选择的异源信号序列优选是受到宿主细胞识别并加工(例如受到信号肽酶切割)的。对于不识别和加工天然抗体信号序列的原核宿主细胞，所述信号序列用例如选自碱性磷酸酶、青霉素酶、 lpp或热稳定肠毒素II前导序列的原核信号序列取代。为了酵母分泌，天然信号序列可以用例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括糖酵母属(Saccharomyces)和克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)α因子前导序列)、酸性磷酸酶前导序列、白色假丝酵母葡萄糖淀粉酶前导序列、或WO90/13646中记载的信号取代。在哺乳动物细胞表达中，可以利用哺乳动物信号序列及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。
(b)复制起点
表达和克隆载体都包含能够使载体在一种或多种所选择的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，这种序列是能够使载体不依赖于宿主染色体DNA而复制的序列，包括复制起点或自主复制序列。多种细菌、酵母和病毒的此类序列众所周知。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般而言，哺乳动物表达载体不需要复制起点组件(SV40起点的使用通常可能只是因为它包含早期启动子)。
(c)选择基因组件
表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白：(a)赋予抗生素或其它毒素抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤、或四环素；(b)补足营养缺陷；或(c)提供不能由复合培养基获得的关键营养物，例如编码芽孢杆菌(Bacilli)D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个实例利用药物来阻滞宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白，因而幸免于选择方案。此类显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个实例是能够鉴定有能力摄取抗体编码核酸的细胞的选择标志，如DHFR、谷氨酰胺合酶(GS)、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，通过将转化子在含有甲氨蝶呤(Mtx)(DHFR的一种竞争性拮抗剂)的培养基中进行培养来鉴定经DHFR基因转化的细胞。在这些条件下，DHFR基因与任何其它共转化的核酸一起扩增。可使用内源DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如ATCCCRL-9096)。
可替换地，通过将转化子在含有L-甲硫氨酸亚砜亚胺(Msx)(L-methionine sulfoximine)(GS的一种抑制备物)的培养基中进行培养来鉴定经GS基因转化的细胞。在这些条件下，GS基因与任何其它共转化的核酸一起扩增。可以与上文描述的DHFR选择/扩增系统组合地使用GS选择/扩增系统。
可替换地，可以通过在含有针对选择标志的选择剂如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素、或G418的培养基中的细胞生长来选择经编码感兴趣抗体、野生型DHFR基因、和另一种选择标志如氨基糖苷3’-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)。参见美国专利4,965,199。
适用于酵母的选择基因为存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcombetal.,Nature,282:39(1979))。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株，例如ATCCNo.44076或PEP4-1提供了选择标志。Jones,Genetics,85:12(1977)。酵母宿主细胞基因组中存在trp1损害随后提供了用于通过在不存在色氨酸下生长来检测转化的有效环境。类似地，用携带Leu2基因的已知质粒补足Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC20,622或38,626)。
此外，衍生自1.6μm环状质粒pKDl的载体可用于转化克鲁维氏酵母属酵母。或者，报道了用于在乳酸克鲁维氏酵母中大规模生产重组小牛凝乳酶的表达系统。VandenBerg,Bio/Technology,8:135(1990)。还公开了适用于通过克鲁维氏酵母属的工业菌株分泌成熟重组人血清清蛋白的稳定多拷贝表达载体。Fleeretal.,Bio/Technology,9:968-975(1991)。
(d)启动子组件
表达和克隆载体一般包含受到宿主生物体识别的启动子，而且它与编码抗体的核酸可操作连接。适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子如tac启动子。然而，其它已知的细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子还将包含与编码抗体的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游大约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处找到的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3’端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3’端添加聚腺苷酸尾的信号。所有这些序列合适地插入真核表达载体。
适用于酵母宿主的启动子序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。
作为具有通过生长条件控制转录的额外优点的诱导型启动子的其它酵母启动子是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体和启动子进一步记载于EP73,657。酵母增强子也可以有利的与酵母启动子一起使用。
抗体在哺乳动物宿主细胞中自载体的转录可通过例如从病毒如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒幻、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒、猿病毒40(SV40)基因组，或从异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，及从热休克启动子获得的启动子来控制，假设此类启动子与宿主细胞系统相容的话。
方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIIIE限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利4,419,446中公开了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利4,601,978中记载了该系统的一种改良。关于在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人β-干扰素cDNA还可参见Reyesetal.,Nature297:598-601(1982)。可替换地，可以使用劳氏肉瘤病毒(RousSarcomaVirus)长末端重复序列作为启动子。
(e)增强子元件组件
常常通过将增强子序列插入载体来提高高等真核细胞对编码本发明抗体的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期一侧的增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期一侧的增强子、和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参见Yaniv,Nature297:17-18(1982)。可以将增强子剪接到载体中，位于抗体编码序列的5’或3’位置，但是优选位于启动子的5’位点。
(f)转录终止组件
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物体的有核细胞)的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5’端和偶尔的3’端获得。这些区域包含在编码抗体的mRNA的非翻译部分中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止组件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO94/11026及其中公开的表达载体。
(g)宿主细胞的选择和转化
适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，如埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠埃希氏菌或大肠杆菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescans)、志贺氏菌属(Shigella)、及芽孢杆菌属(Bacilli)如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD266,710中公开的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31,446)，尽管其它菌株如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC31，537)和大肠杆菌W3110(ATCC27,325)也是合适的。这些例子是示例性的，而不是限制性的。
可以在细菌中生产全长抗体、抗体融合蛋白、和抗体片段，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时，如在将治疗性抗体偶联至自身在肿瘤细胞破坏方面显示出效力的细胞毒剂(例如毒素)时。全长抗体在循环中具有较长的半衰期。大肠杆菌中的生成是较快的且更合算的。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如Charlton,MethodsinMolecularBiology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,HumanaPress,Totowa,N.J.,2003),pp.245-254，其描述了使表达和分泌优化的翻译起始区(TIR)和信号序列。还可参见Charlton，MethodsinMolecularBiology，卷248(B.K.C.Lo，编，HumanaPress,Totowa,NJ,2003)，pp.245-254，其描述了在大肠杆菌中表达抗体片段。表达后，可以在可溶性级分中自大肠杆菌细胞浆液分离抗体，并可以通过例如蛋白A或G柱(取决于同 种型)来纯化抗体。可以实施最终的纯化，其类似于用于纯化在例如CHO细胞中表达的抗体的工艺。
除原核生物以外，真核微生物(如丝状真菌或酵母)也是编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。啤酒糖酵母或酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或常用的面包酵母在最常用的低等真核宿主微生物之中。然而，通常可获得许多其它属、种和菌株且可用于本发明，如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC12，424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC16，045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC24，178)、K.waltii(ATCC56，500)、果蝇克鲁维酵母(K.marxianus)(ATCC36，906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(yarrowia)(EP402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)(EP183，070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichodermareesia)(EP244,234)；粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，如Schwanniomycesoccidentalis；和丝状真菌如脉抱菌属(Neurospora)、青霄属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、和曲霉属(Aspergillus)宿主如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。关于讨论酵母和丝状真菌用于生产治疗性蛋白的用途的综述参见例如Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)。
可选择如下的某些真菌和酵母株，其中糖基化途径已经“人源化”，导致具有部分或完全人的糖基化样式的抗体的生成。参见例如Lietal.,Nat.Biotech.24:210-215(2006)(记载了巴斯德毕赤氏酵母中糖基化途径的人源化)；核上文的Gerngrossetal.。
适于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许昆虫宿主细胞，它们来自如草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedesaegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyxmori)等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染，例如苜蓿尺蠖AutographacalifornicaNPV的L-1变体和家蚕BombyxmoriNPV的Bm-5株，而且此类病毒可依照本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞。
还可利用棉、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、浮萍(Leninaceae)、苜蓿(M.truncatula)、和烟草的植物细胞培养物作为宿主。参见例如美国专利5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
可使用脊椎动物细胞作为宿主，而且培养(组织培养)中脊椎动物细胞的繁殖已经成为常规规程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子是经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCCCRL1651)；人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Grahametal.,J.GenVirol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCCCCL10)；小鼠支持(sertoli)细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCCCCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCCCRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCCCCL2)；犬肾细胞(MDCK,ATCCCCL34)；牛鼠(buffalorat)肝细胞(BRL3A,ATCCCRL1442)；人肺细胞(W138，ATCCCCL75)；人肝细胞(HepG2,HB8065)；小鼠乳瘤(MMT060562，ATCCCCL51)；TRI细胞(Matheretal.,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系(HepG2)。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaubetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞细胞系，如NS0和Sp2/0。关于适合于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参阅例如YazakiandWu,MethodsinMolecularBiology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,HumanaPress,Totowa,N.J.,2003),pp.255-268。
用上文所述用于生产抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当更改的常规营养培养基中进行培养。
(h)培养宿主细胞
可以在多种培养基中培养用于生产本发明抗体的宿主细胞。商品化培养基如Ham’sF10(Sigma)、MinimalEssentialMedium(MEM,Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco’sModifiedEagle’s培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。此外，可以使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Hametal.,Meth.Enz.58:44(1979),Barnesetal.,Anal.Biochem.102:255(1980)、美国专利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO90/03430；WO87/00195；或U.S.Pat.Re.30,985。任何这些 培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以以适宜浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件(如温度、pH等)就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言是显而易见的。
(xi)抗体的纯化
在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成抗体，或者直接分泌到培养基中。若在细胞内生成抗体，则作为第一步，通过例如离心或超滤除去宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。Carteretal.,Bio/Technology10:163-167(1992)记载了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的规程。简单的说，在存在乙酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)时使细胞糊融化约30分钟。可通过离心除去细胞碎片。若将抗体分泌到培养基中，那么一般首先使用商品化蛋白浓缩滤器，例如Amicon或MilliporePellicon超滤单元浓缩来自此类表达系统的上清液。在任何上述步骤中，可以包括蛋白酶抑制备物如PMSF来抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素来防止外来污染物的生长。
可以使用例如羟磷灰石色谱、疏水相互作用色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱来纯化由细胞制备的抗体组合物，其中亲和色谱是优选的纯化步骤之一。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmarketal.,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Gussetal.,EMBOJ.5:15671575(1986))。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可以使用其它基质。物理稳定的基质如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能够获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含CH3结构域，则可使用BakerbondABXTMresin(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白纯化技术，如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的色谱、肝素SEPHAR0SETM上的色谱、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上的色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE、和硫酸铵沉淀。
一般而言，用于制备供研究、测试、和临床中使用的抗体的各种方法学是本领域完善建立的，与上文所述方法学一致，和/或是本领域技术人员认为适合于特定的感兴趣抗体的。
B.选择生物活性抗体
可对如上所述生成的抗体进行一种或多种“生物活性”测定法以选择从治疗观点看具有有益特性的抗体。可对抗体筛选其结合生成它时所针对的抗原的能力。例如，对于抗DR5抗体(例如drozitumab)，该抗体的抗原结合特性可在检测与死亡受体(DR5)结合的能力的测试中进行评估。
在另一个实施方案中，可通过例如饱和结合；ELISA；和/或竞争测定法(例如RIA)来测定抗体的亲和力。
另外，可对抗体进行其它生物活性测定法，例如为了评估它作为治疗剂的有效性。此类测定法是本领域已知的且依赖于抗体的靶抗原和预定用途。
为了筛选结合感兴趣抗原上的特定表位的抗体，可实施常规交叉阻断测定法，如Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,EdHarlow和DavidLane(1988)中记载的。可替换地，可实施表位作图例如如Champeetal.,J.Biol.Chem.270:1388-1394(1995)所述来测定抗体是否结合感兴趣表位。
C.配制物的制备
本文提供了制备包含蛋白和在配制物中防止所述蛋白氧化的化合物的配制物的方法。所述配制物可通过将具有预期纯度的蛋白和在所述配制物(如液体配制物)中防止所述蛋白氧化的化合物混合进行制备。在一些实施方案中，待配制的蛋白之前未经历冻干，且本文感兴趣的配制物是水性配制物。在一些实施方案中，所述蛋白是治疗性蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白是抗体。在进一步的实施方案中，所述抗体是多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体或抗体片段。在一些实施方案中，所述抗体是全长抗体。在一个实施方案中，所述配制物中的所述抗体是抗体片段，如F(ab’)2，这种情况中可能需要解决对于全长抗体不会发生的问题(如将抗体剪切成Fab)。所述配制物中存在的蛋白的治疗有效量通过例如将预期剂量体积和施用模式考虑在内进行确定。所述配制物中示例性的蛋白浓度为约1mg/mL至约250mg/mL、约10mg/mL至约250mg/mL、约15mg/mL至约225mg/mL、约20mg/mL至约200mg/mL、约25mg/mL至约175mg/mL、约25mg/mL至 约150mg/mL、约25mg/mL至约100mg/mL、约30mg/mL至约100mg/mL或约45mg/mL至约55mg/mL。在一些实施方案中，本文描述的蛋白易于氧化。在一些实施方案中，所述蛋白中的一个或多个氨基酸易于氧化，所述氨基酸选自甲硫氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸和酪氨酸。在一些实施方案中，所述蛋白中的色氨酸易于氧化。在一些实施方案中，所述蛋白中的甲硫氨酸易于氧化。在一些实施方案中，本文提供的抗体在抗体的Fab部分和/或Fc部分易于氧化。在一些实施方案中，本文提供的抗体在抗体的Fab部分的色氨酸氨基酸处易于氧化。在进一步的实施方案中，所述易于氧化的色氨酸氨基酸在抗体的CDR中。在一些实施方案中，本文提供的抗体在抗体Fc部分的甲硫氨酸氨基酸处易于氧化。
本文提供的配制物包含蛋白和在所述配制物中防止所述蛋白氧化的化合物，其中所述化合物具有下式：
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其中R2选自氢、羟基、-COOH和-CH2COOH；
R3选自氢、羟基、-COOH、-CH2COOH和-CH2CHR3a(NH2)；其中R3a是COOH或氢；R4、R5、R6和R7独立选自氢和羟基；条件是R2、R3、R4、R5、R6和R7之一是羟基；或其药用盐。
在一些实施方案中，所述化合是下式的化合物：
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其中R2和R3独立选自氢、羟基、-COOH和-CH2COOH；且R4、R5、R6和R7独立选自氢和羟基；条件是R2、R3、R4、R5、R6和R7之一是羟基；或其药用盐。
在一些实施方案中，所述化合物是下式的化合物：
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其中R3a是COOH或氢；R2、R4、R5、R6和R7独立选自氢和羟基；条件是R2、R4、R5、R6和R7之一是羟基；或其药用盐。
在一些实施方案中，上述任何式中的R4、R5或R7是羟基。在进一步的实施方案中，所述化合物选自5-羟基色氨酸、5-羟基吲哚、7-羟基吲哚和5-羟色胺。在进一步的实施方案中，所述化合物选自4-羟基吲哚、5-羟基吲哚-3-乙酸和7-羟基吲哚-2-羧酸。在一些实施方案中，上述任何式中的R5是羟基。在一些实施方案中，上述化合物为5-羟基衍生物，其包括但不限于5-羟基色氨酸、5-羟基吲哚、5-羟色胺等。在一些实施方案中，所述配制物是液体配制物。在一些实施方案中，所述配制物中的所述化合物的浓度为约0.3mM至约10mM或直至所述化合物可溶解在所述配制物中的最高浓度。在一些实施方案中，所述配制物中的所述化合物的浓度为约0.3mM至约9mM、约0.3mM至约8mM、约0.3mM至约7mM、约0.3mM至约6mM、约0.3mM至约5mM、约0.3mM至约4mM、约0.3mM至约3mM、约0.3mM至约2mM、约0.5mM至约2mM、约0.6mM至约1.5mM或约0.8mM至约1.25mM。在一些实施方案中，所述配制物中的所述化合物为约1mM。在一些实施方案中，所述化合物防止所述蛋白中的一个或多个氨基酸氧化。在一些实施方案中，所述化合物防止所述蛋白中的一个或多个氨基酸氧化，所述氨基酸选自色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、组氨酸和/或半胱氨酸。在一些实施方案中，所述化合物防止所述蛋白通过活性氧(ROS)的氧化。在进一步的实施方案中，所述活性氧选自单线态氧、超氧化物(O2-)、烷氧自由基、过氧自由基、过氧化氢(H2O2)、三氧化二氢(H2O3)、三氧化氢自由基(HO3·)、臭氧(O3)、羟基自由基和烷基过氧化物。在进一步的实施方案中，所述化合物防止抗体的Fab部分中的一个或多个氨基酸氧化。在另一个进一步的实施方案中，所述化合物防止抗体的Fc部分中的一个或多个氨基酸氧化。
在一些实施方案中，所述配制物(如液体配制物)进一步包含一种或多种选自下组的赋形剂：稳定剂、缓冲剂、表面活性剂和张力剂。在一些实施方案中，所述配制物在pH缓冲溶液中制备。本发明的缓冲液具有约4.5至约7.0的pH。在一些实施方案中，所述pH为pH4.5至6.5、pH4.5至6.0、pH4.5至5.5、pH4.5至5.0、pH5.0至7.0、pH5.5至7.0、pH5.7至6.8、pH5.8至6.5、pH5.9至6.5、pH6.0至6.5或pH6.2至6.5。在本发明的一些实施方案中，所述配制物具有6.2或约6.2的pH。在本发明的一些实施方案中，所述 配制物具有6.0或约6.0的pH。可将pH控制在该范围内的缓冲剂的实例包括有机酸和无机酸及其盐。例如，乙酸盐(例如组氨酸乙酸盐、精氨酸乙酸盐、乙酸钠)、琥珀酸盐(例如组氨酸琥珀酸盐、精氨酸琥珀酸盐、琥珀酸钠)、葡糖酸盐、磷酸盐、富马酸盐、草酸盐、乳酸盐、枸橼酸盐及其组合。缓冲剂浓度可以为约1mM至约600mM，这取决于例如缓冲剂和配制物的预期等渗性。在一些实施方案中，所述配制物包含组氨酸缓冲剂(例如约5mM至100mM的浓度)。组氨酸缓冲剂的实例包括组氨酸氯化物、组氨酸醋酸盐、组氨酸磷酸盐、组氨酸硫酸盐、组氨酸琥珀酸盐等。在一些实施方案中，所述配制物包含组氨酸和精氨酸(例如组氨酸氯化物-精氨酸氯化物、组氨酸乙酸盐-精氨酸乙酸盐、组氨酸磷酸盐-精氨酸磷酸盐、组氨酸硫酸盐-精氨酸硫酸盐、组氨酸琥珀酸盐-精氨酸琥珀酸盐等)。在一些实施方案中，所述配制物包含浓度为约5mM至100mM的组氨酸和浓度为50mM至500mM的精氨酸。在一个实施方案中，所述配制物包含组氨酸乙酸盐(例如约20mM)-精氨酸乙酸盐(例如约150mM)。在一些实施方案中，所述配制物包含组氨酸琥珀酸盐(例如约20mM)-精氨酸琥珀酸盐(例如约150mM)。在一些实施方案中，所述配制物中的组氨酸为约10mM至约35mM、约10mM至约30mM、约10mM至约25mM、约10mM至约20mM、约10mM至约15mM、约15mM至约35mM、约20mM至约35mM、约20mM至约30mM或约20mM至约25mM。在进一步的实施方案中，所述配制物中的精氨酸为约50mM至约500mM(例如约100mM、约150mM或约200mM)。
本发明的配制物(如液体配制物)可进一步包含糖，如二糖(例如海藻糖或蔗糖)。如本文使用，“糖”包括一般组分(CH2O)n及其衍生物，包括单糖、二糖、三糖、多糖、糖醇、降解糖、非降解糖等。本文糖的实例包括葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、果糖、麦芽糖、葡聚糖、甘油、赤藓醇、甘油、阿糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露三糖、水苏糖、乳果糖、麦芽糖、葡萄糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、异麦芽糖等。
表面活性剂可任选地添加至所述配制物(如液体配制物)。示例性的表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚山梨酯(例如聚山梨酯20、80等)或泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188等)。添加的表面活性剂的量是其降低配制的抗体的聚集和/或在所述配制物中最小化微粒的形成和/或降低吸附的这种量。例如，所述表面活性剂在所述配制物中以约0.001％至约0.5％、约0.005％至约0.2％、约 0.01％至约0.1％、约0.02％至约0.06％或约0.03％至约0.05％的量存在。在一些实施方案中，所述配制物中的表面活性剂以0.04％或约0.04％的量存在。在一些实施方案中，所述配制物中的表面活性剂以0.02％或约0.02％的量存在。在一个实施方案中，所述配制物不包含表面活性剂。
在一个实施方案中，所述配制物包含上文确定的物质(例如抗体、缓冲剂、糖和/或表面活性剂)且基本上不存在一种或多种防腐剂如苄醇、苯酚、间甲酚、氯丁醇和苄索氯。在另一个实施方案中，防腐剂可包括在所述配制物中，特别是当所述配制物是多剂量配制物时。所述防腐剂的浓度可以为约0.1％至约2％，优选为约0.5％至约1％。一种或多种其它药用载剂、赋形剂或稳定剂如Remington’sPharmaceuticalSciences16thedition,Osol,A.Ed.(1980)描述的那些可包括在配制物中，条件是其对所述配制物的特性无不良影响。本文示例性的药用赋形剂进一步包括间质性药物分散剂如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白如rHuPH20(![]()
BaxterInternational,Inc.)。一些示例性的包括rHuPH20在内的sHASEGP和使用方法描述于美国专利公开文本2005/0260186和2006/0104968中。一方面，HASEGP与一种或多种额外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。
所述配制物可进一步包含金属离子螯合剂。金属离子螯合剂为本领域的技术人员熟知且包括但不限于氨基多羧酸盐、EDTA(乙二胺四乙酸)、EGTA(乙二醇-双(β-氨乙基醚)-N,N,N’,N’-四乙酸)、NTA(次氮基三乙酸)、EDDS(乙二胺二琥珀酸盐)、PDTA(1,3-亚丙基膦酸)、DTPA(二亚乙基膦酸)、ADA(β-内丙氨酸二乙酸)、MGCA(甲基甘氨酸二乙酸)等。此外，本文的一些实施方案包含磷酸盐/膦酸螯合剂。
在组合物中存在张力剂以调整或保持液体的张力。当与大的带电荷的生物分子如蛋白和抗体共同使用时，因为其可与氨基酸侧链的带电基团相互作用，所以其还可作为“稳定剂”由此减少分子内和分子间相互作用的可能性。将其它成分相对的量考虑在内，张力剂按重量计可按0.1％至25％或优选按1％至5％存在。优选的张力剂包括多羟基糖醇，优选三元或更多元糖醇如甘油、赤藓醇、阿糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇。
对于所治疗的特定指征，本文的配制物根据需要还可包含多于一种的蛋白或小分子药物，优选为具有互补活性的对其它蛋白无不良作用的那些。例 如，当抗体是抗DR5(例如drozitumab)时，其可与其它物质(例如化疗剂和抗肿瘤剂)组合。
在一些实施方案中，所述配制物用于体内施用。在一些实施方案中，所述配制物是无菌的。所述配制物可通过无菌滤膜过滤赋予无菌。本文的治疗性配制物通常置于具有无菌接入端口的容器中，例如静脉注射溶液袋或具有由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶。施用途径依照已知和可接受方法，如以合适的方式通过在较长一段时间内单次或多次推注或输注例如皮下、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、病灶内或关节内途径注射或输注、局部施用、吸入或通过持续释放或缓释的方式。
本发明的配制物可保存在液体或非液体(例如冻干的)配制物中。所述冻干配制物可在施用前复溶。在一些实施方案中，蛋白、化合物和本文描述的其它赋形剂的浓度指复溶配制物中的浓度。在一些实施方案中，所述配制物可稳定保存。在一些实施方案中，所述蛋白在所述液体配制物中在约0至5℃可稳定保存至少约12个月、至少约18个月、至少约21个月或至少约24个月(或至少约52周)。在一些实施方案中，所述蛋白在所述液体配制物中在-20℃可保存至少约12个月、至少约18个月、至少约21个月或至少约24个月(或至少约52周)。在一些实施方案中，所述液体配制物中的所述蛋白在配制物制造过程中稳定。在一些实施方案中，所述液体配制物中的所述蛋白当在金属合金容器(例如不锈钢容器)中保存时稳定。在一些实施方案中，所述液体配制物中的所述蛋白当在玻璃小瓶中保存时稳定。在一些实施方案中，所述液体配制物中的所述蛋白当在塑料容器中保存时稳定。在一些实施方案中，对所述配制物中的所述蛋白的物理稳定性、化学稳定性或生物活性进行评估或测量。本领域已知的任何方法可用于评估稳定性和生物活性。在一些实施方案中，稳定性通过保存后配制物(如液体配制物)中蛋白的氧化测量。稳定性可在配制及下列保存时通过评估在配制物中抗体的物理稳定性、化学稳定性和/或生物活性测定。物理和/或化学稳定性可按多种方式定性和/或定量评估，包括聚集物形成的评估(例如使用尺寸排阻色谱，通过测量浊度和/或通过目视检查)；通过使用阳离子交换色谱或毛细管区带电泳评估电荷异质性；氨基末端或羧基末端序列分析；质谱分析；SDS-PAGE分析以比较还原且完整的抗体、肽图谱(例如胰蛋白酶或LYS-C)分析；评估抗体的生物活性或抗原结合功能等。不稳定性可导致聚集、去酰胺(例如Asn去酰胺)、氧化(例如Trp氧化)、 异构化(例如Asp异构化)、剪切/水解/片段化(例如铰链区片段化)、琥珀酰亚胺的形成、未配对半胱氨酸、N-末端延伸、C-末端加工、糖基化差异等。在一些实施方案中，蛋白中的氧化使用RP-HPLC、LC/MS或胰蛋白酶肽图谱中的一种或多种判断。在一些实施方案中，抗体中的氧化使用RP-HPLC、LC/MS或胰蛋白酶肽图谱中的一种或多种和下式以百分数确定：
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将用于体内使用的配制物应该是无菌的。这可由在配制物制备之前或之后通过无菌滤膜过滤轻松完成。
本文还提供了制备蛋白配制物或防止蛋白配制物中蛋白氧化的方法，其包括向所述蛋白配制物中添加防止蛋白氧化的量的化合物，其中所述化合物具有下式：
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其中R2选自氢、羟基、-COOH和-CH2COOH；
R3选自氢、羟基、-COOH、-CH2COOH和-CH2CHR3a(NH2)；其中R3a是COOH或氢；R4、R5、R6和R7独立选自氢和羟基；条件是R2、R3、R4、R5、R6和R7之一是羟基；或其药用盐。
在一些实施方案中，所述化合物具有下式：
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其中R2和R3独立选自氢、羟基、-COOH和-CH2COOH；且R4、R5、R6和R7独立选自氢和羟基；条件是R2、R3、R4、R5、R6和R7之一是羟基；或其药用盐。
在一些实施方案中，所述化合物是下式的化合物：
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其中R3a是COOH或氢；R2、R4、R5、R6和R7独立选自氢和羟基；条件是R2、R4、R5、R6和R7之一是羟基；或其药用盐。
在一些实施方案中，R4、R5或R7是羟基。在一些实施方案中，所述化合物选自5-羟基色氨酸、5-羟基吲哚、7-羟基吲哚和5-羟色胺。在一些实施方案中，所述配制物包含抗体。在一些实施方案中，R5是羟基。在一些实施方案中，所述化合物是5-羟基衍生物，其包括但不限于5-羟基色氨酸、5-羟基吲哚、5-羟色胺等。如本文给出的防止所述蛋白氧化的化合物的量为约0.3mM至约10mM或任何本文公开的量。
III.蛋白配制物的施用
根据已知的方法，通过静脉施用如推注或通过持续一段时间灌注、通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径将所述配制物(如液体配制物)施用至需用所述蛋白(例如抗体)治疗的哺乳动物，优选为人。在一个实施方案中，将所述液体配制物通过静脉施用施用至哺乳动物。出于这种目的，所述配制物可使用例如注射器或经由IV管线注射。在一个实施方案中，所述液体配制物通过皮下施用施用至哺乳动物。
所述蛋白的合适剂量(“治疗有效量”)将取决于例如治疗条件、病况的严重程度和病程、施用所述蛋白是出于预防还是治疗目的、之前的疗法、患者的临床史和对所述蛋白的响应、使用的蛋白类型和主治医生的自由裁量。可将所述蛋白适当地以一次施用或在治疗过程中持续施用至患者且可从诊断起在任何时间施用至患者。所述蛋白可作为单一治疗或与其它在治疗有关病况中有效的药物或疗法联合施用。如本文使用，术语“治疗”指治疗性治疗和预防性或防范性措施两者。需要治疗的那些包括已具有病症及其中病症有待防止的那些。如本文使用，“病症”是任何将从治疗获益的病况，其包括但不限于慢性和急性的病症或疾病，包括使哺乳动物易患有关病症的那些病理性病况。
在药理学意义上，本发明上下文中蛋白(例如抗体)的“治疗有效量”指在对所述抗体可有效治疗的病症进行预防或治疗中有效的量。作为一般性建议，所述蛋白的治疗有效量将为约0.1至约50mg/kg患者体重，无论通过一次施 用还是多次施用，其中使用的蛋白通常为约0.3至约20mg/kg，优选约0.3至约15mg/kg，例如每日施用。然而，其它剂量方案也可能有效。例如，蛋白可按约100或400mg每1、2、3或4周的剂量施用或按约1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、15.0或20.0mg/kg每1、2、3或4周的剂量施用。所述剂量可作为单次剂量或作为多次剂量施用(例如2或3次剂量)，如灌注。该疗法的进展可通过常规技术轻松监测。
IV.对防止蛋白氧化的化合物进行筛选的方法
本文还提供筛选防止蛋白组合物中蛋白氧化的化合物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括选择与L-色氨酸相比具有较低氧化电势和较小光敏感性的化合物，并测试所选化合物对防止所述蛋白氧化的作用。在一些实施方案中，所述光敏感性基于由化合物当光暴露时产生的H2O2的量来测量。例如，包含所述化合物的液体组合物可持续一定时间暴露至250W/m2的光并量化所形成的H2O2。当暴露至一定量的光时，与暴露至相同量的光的具有较高光敏感性的化合物相比，具有较小光敏感性的化合物产生较少H2O2。在一些实施方案中，选择产生比H2O2的所述量的约10％更少、约15％更少、约20％更少、约25％更少的化合物。H2O2可通过在蛋白中易于氧化的氨基酸的氧化产生。在一些实施方案中，氧化电势通过循环伏安法来测量。
在一些实施方案中，测试所选化合物防止通过2,2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)、光和/或Fenton试剂生成的活性氧所致的蛋白氧化的作用。在本文的任何实施方案中，实施例中描述的方法可用于筛选在蛋白组合物中防止蛋白氧化的化合物。
V.制品
在本发明的另一实施方案中，提供包括容纳本发明配制物且任选提供其使用说明的容器的制品。合适的容器包括例如瓶子、小瓶和注射器。所述容器可由多种材料形成，如玻璃、金属合金(如不锈钢)或塑料。典型的容器为300cc金属合金容器(例如用于在-20℃保存)。典型的容器为3-20cc单次使用玻璃小瓶。可替换地，对于多剂量配制物，所述容器可以是3-100cc玻璃小瓶。所述容器容纳所述配制物且所述容器上或与其组合的标签可指出使用说明。制品可进一步包括其它在商业和用户立场上需要的材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、注射器和具有使用说明的包装插页。
本说明书被认为足以使本领域的技术人员能够实践本发明。基于前文的描述，本发明的多种修饰及本文显示和描述的那些对于本领域的技术人员将是显而易见的且落入所附权利要求书的范围。本文引用的全部出版物、专利和专利申请出于所有目的在此处以其全文通过提述并入。
实施例
本发明将通过参考下列实施例进一步理解。然而，其不应当理解为是对本发明保护范围的限制。可以理解的是，本文描述的实施例和实施方案仅出于阐述目的，且可将由其教导的多种修饰和改变建议给本领域的技术人员，且其包括在本申请的主旨和范围及所附权利要求书的范围内。
实施例1：抗氧化剂L-Trp产生在蛋白配制物中氧化单克隆抗体的ROS
已显示单克隆抗体通过抗体催化水氧化途径(ACWOP)产生ROS，其中抗体潜在地在水和单线态氧间催化反应产生过氧化氢(Wentworthetal.,Science293(5536):1806-11(2001)；Wentworthetal.,ProcNatlAcadSciUSA97(20):10930-5(2000))。在ACWOP中，包括超氧阴离子、三氧化二氢、臭氧和甚至三氧化氢自由基在内的多种ROS在朝向生成过氧化氢的途径中生成(Zhuetal.,ProcNatlAcadSciUSA101(8):2247-52(2004))。已显示单克隆抗CD5抗体drozitumab(CAS号912628-39-8)(本文也称为mAb1)中表面暴露的色氨酸可作为底物(1O2和O2-)生成剂，其甚至在弱光条件下就按时间和浓度依赖的方式促进ACWOP(Sreedharaetal.,Mol.Pharmaceutics(2013))。在药物相关条件下证明mAb1在保存过程中特别易于氧化(Sreedharaetal.,Mol.Pharmaceutics(2013))。显示氧化为位点特异性且位于重链CDR(Fab)上的Trp53(W53)，如通过胰蛋白酶肽图谱评估。此外，使用反相HPLC试验经由木瓜蛋白酶消化、DTT还原和反相分离测量mAb1的HCFab和Fc区的总氧化。使用LC/MS鉴定来自RP-HPLC的峰且显示与胰蛋白酶肽图谱结果的强相关性，这表明可将RP方法用作用于检测W53(即％Fab)氧化的替代(Sreedharaetal.,Mol.Pharmaceutics(2013))。在RP木瓜蛋白酶消化方法中，Fab和Fc氧化峰在其各自的主峰前洗脱，这允许％Fab和％Fc氧化相对于其总峰面积的量化。该研究进一步显示过氧化氢可作为多种ROS包括超氧化物和单线态氧的替代。
为确定受限(即受控)的光暴露是否可用作加速胁迫模型以研究蛋白氧化，使用相同的人单克隆IgG1抗体(mAb1)以筛选和评估潜在的抗氧化剂。L-色氨 酸(L-Trp)是一种在蛋白配制物中使用的抗氧化剂，其近期已显示是光敏感的(Igarashietal.,AnalSci23(8):943-8(2007))且当光暴露时具有产生H2O2的能力。评估了在光胁迫下在添加或不添加L-甲硫氨酸(L-Met)作为潜在抗氧化剂的情况下mAb1对L-Trp的敏感性。mAb1在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达且通过一系列色谱方法包括通过蛋白A色谱的亲和纯化和离子交换色谱进行纯化。mAb1在玻璃小瓶中在20mM组氨酸乙酸盐、250mM海藻糖和0.02％聚山梨酯20的配制物中以5mg/mL制备且伴有1mML-Trp和多种浓度的L-Met(10mM至100mM)并在AtlasSunTestCPS+XenonTestInstrument(Chicago,IL)中以250W/m2光暴露8小时。对照小瓶包裹在铝箔中并类似处理。光暴露后，制备溶液用于通过反相HPLC分析。对于RP-HPLC，将来自胁迫研究的mAb1溶液在0.1MTris、4.4mMEDTA和1.1mM半胱氨酸中制备成1.1mg/mL。将150μL的0.1mg/mL木瓜蛋白酶添加至1.35mL的mAb1溶液，然后在37℃温育2小时。温育后，将900μL溶液与100μL的1M二硫苏糖醇(DTT)混合并在37℃另温育三十分钟。样品随后在配备在280nm处UV检测的与Varian,Inc.Pursuit3μm,2mmID×250mm联苯柱(PaloAlto,CA)联合的Agilent,Inc.1100/1200HPLC系统(SantaClara,CA)上运行。流动相A是在水中的0.1％TFA。流动相B是在乙腈中的0.1％TFA。流动相梯度由在0分钟的34％B线性增加至在50.0分钟的43％B，随后至在50.1分钟的95％B。梯度保持在95％B直至60.1分钟，随后在60.1和60.2分钟间由95％B线性减少至34％B。梯度保持在34％B直至在80.2分钟循环结束。柱温度为65℃，总流速为0.2mL/min，且每个样品的注射体积为6μL。随后对色谱图进行积分用于氧化的量化。
此外，发现mAb1在pH6.0的基于L-His的缓冲液中稳定。L-Trp和L-Met对mAb1Fab氧化的光暴露作用的分析显示mAb1参照材料(无光暴露)和箔对照具有约2％的Fab氧化(图1A)。由于箔对照和参照材料显示相同的Fab氧化水平，因此由单独的热引起Fab的氧化是不可能的。当将mAb1暴露至光时(“无赋形剂”样品)，Fab氧化加倍至4％。当添加1mML-Trp时，Fab氧化增加至几乎9％，这表明在可能已导致Fab上的W53氧化的光暴露下，游离的L-Trp生成ROS。进一步添加10、25、50和100mML-Met至包含1mML-Trp的配制物似乎轻微降低Fab氧化，但即使100微摩尔浓度过剩的L-Met也未降低Fab氧化至箔对照水平(图1A)。
已显示mAb1的Fc区中的氧化主要是Met残基Met254和Met430的氧化(Sreedharaetal.,Mol.Pharmaceutics(2013))。L-Trp和L-Met对mAb1Fc氧化的光暴露作用的分析显示即使在光暴露前，mAb1参照材料和箔对照具有约8％的Fc氧化(图1B)。对于配制物缓冲液中的mAb1，光暴露仅导致Fc氧化的微小增加(“无赋形剂”)。然而，由RP-HPLC试验可见，与1mML-Trp一起温育导致在Fc区中的这些Met位点处超过20％的氧化。多种浓度的L-Met(10、25、50和100mM)添加至包含1mML-Trp的配制物降低了Fc氧化的量，尽管即使100mML-Met也未降低Fc氧化至对照水平(图1B)。
之前报道了L-Trp经由超氧离子且以亚化学计量方式产生H2O2，而在类似条件下的抗体产生催化的量(Wentworthetal.,Science293(5536):1806-11(2001)；McCormicketal.,JournaloftheAmericanChemicalSociety100:312-313(1978))。为测试游离L-Trp在药物相关条件下如在ICH和环境光线两种条件下的易感性，包含0.32mM至7.5mML-Trp(L-Trp溶解在pH7.1的磷酸钠缓冲液中)的配制物以250W/m2UV光和约150k勒克司可见光暴露3小时。随后取出样品并立即经由Amplex测定进行分析以检测在这些条件下生成的H2O2的量。当光暴露时通过游离的L-Trp以浓度依赖的方式生成大量H2O2(图2)。该H2O2生成在50mM叠氮化钠(已知的单线态氧淬灭剂)存在下大幅降低(图2)。当L-Trp与50mMNaN3和150U超氧化物歧化酶(SOD)的组合一起或仅与SOD一起温育时，在不包含NaN3的样品中仍检测到明显量的H2O2。这表明除单线态氧外，光照射时也生成通过SOD转化成H2O2的超氧离子。
尽管确认了游离L-Trp在ICH光条件下的光敏感性，对实验室中通常可见的环境光线的作用进行了研究。使用DLM1数字光度计在多个实验室中的测量表明试验台(具有白色荧光)上为平均300勒克司、层流净化罩(具有白色荧光)中为平均3000勒克司且对于暴露东南阳光的窗台为约10000勒克司。在这些条件下，如使用AmplexUltraRed试验检测，包含50mg/mLmAb1的配制物缓冲液中的L-Trp产生微摩尔浓度范围的过氧化氢(图3A)。过氧化物的生成随光度(300、3000和10000勒克斯)和时间(1、3和7天)两者增加。蛋白样品进一步使用mAb1特异性RP-HPLC试验进行分析且显示随光度增加与W53中氧化对应的重链Fab氧化的增加(图3B)。同时，在这些条件下mAb1中％Fc氧化在300和10000勒克司间分别增加5％至增加40％。对于在环境 光线和温度下的药物物质处理，在填充/完成操作前和潜在地当检测药品小瓶时，这些光暴露水平和时间被确定为药物相关。这些结果支持L-Trp是光敏感的且其产生数种活性氧，包括不利于mAb产品质量的单线态氧、超氧化物和H2O2，且应该在处理和保存包含L-Trp的缓冲液时加以注意。
实施例2：候选抗氧化剂化合物的筛选
色氨酸(Trp)是电子丰富的氨基酸，其在ROS如羟基自由基和单线态氧存在下经历氧化和亲电加成反应。任何防止蛋白中Trp氧化的潜在抗氧化剂应具有类似的与这些ROS的反应性(若不是优秀的反应性)。已评估一系列基于L-Trp结构或已报道具有抗氧化特性的化合物。在本研究中对抗氧化能力进行筛选的化合物包括色氨酸的衍生物、吲哚的衍生物、芳香酸如唾液酸和邻氨基苯甲酸的衍生物和一些维生素的衍生物。所使用的多种化合物的化学结构基于(A)色氨酸衍生物、(B)犬尿氨酸、(C)吲哚衍生物和(D)芳香酸衍生物：
(A)色氨酸衍生物
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(B)犬尿氨酸
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(C)吲哚衍生物
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(D)芳香酸衍生物
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从光敏感性筛选试验获得的候选抗氧化化合物
尽管在一些条件下L-Trp可能已经是有效的抗氧化剂，但其光敏感性可能限制其在正常处理而无特别预防措施的过程中的应用。因此研究了上述分子的光敏感性且对分子与L-Trp相比的H2O2生成能力进行了分级。作为筛选工具，候选抗氧化剂以250W/m2暴露至光四小时且所导致的H2O2形成通过AmplexUltraRed试验进行量化。具体地，将抗氧化剂在pH5.5的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液中制备成1mM。将1mM抗氧化剂溶液分装入玻璃小瓶中(2mL/玻璃小瓶)并在AtlasSunTestCPS+XenonTestInstrument(Chicago,IL)中以250W/m2暴露至光四小时。在4小时时段内，总UV剂量为90瓦特-小时/平方米且总可见光剂量为0.22百万勒克司小时。对照小瓶包裹在铝箔中并类似处理。暴露至光后生成的过氧化氢的量使用![]()
UltraRedAssay(Invitrogen,Carlsbad,CA)依照制造商推荐的方法测量。通过加入辣根过氧化物酶(HRP)，染料以1:1的化学计量与H2O2反应，这导致荧光氧化产物试卤灵的产生。在该研究中，使用SpectraMaxM2微量板读数器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)以分别在560nm和590nm的激发和发射设定来获得荧光读数。最终的H2O2浓度使用范围为0μM至20μM的标准曲线确定。
当光暴露时通过色氨酸衍生物生成的过氧化氢(H2O2)的分析显示在类似的光(对应在4小时时段内的0.22百万勒克司小时)和缓冲液(20mML-His-乙酸盐,pH5.5)条件下，当与L-Trp比较时，5-羟基-L-色氨酸(5-HT)产生约十分之一的H2O2，而犬尿氨酸产生约五分之一的H2O2(图4A)。其它色氨酸衍生物产生的量为由L-Trp产生的H2O2的30％至105％。与L-Trp相比，Trolox(一种水溶性维生素E衍生物)产生多123倍的H2O2，且吡哆醇(微生物B6)产生多5倍的H2O2(表1)。基础结构与L-Trp类似的吲哚的表现与L-Trp类似，但吲哚-3-乙酸产生2倍的H2O2(图4B)。吲哚的羟基衍生物的表现与5-HT类似，其当光暴露时产生可忽略不计的量的H2O2。对L-Trp的数种生化相关衍生物即色胺、5-羟色胺和褪黑激素也进行了测试。色胺产生约L-Trp一半的H2O2(表1)。有趣的是，5-羟色胺(5-羟基色胺)的表现与吲哚和色氨酸的5-OH衍生物很类似，当光暴露时产生非常少的H2O2，而褪黑激素(N-乙酰基-5-甲氧基色胺)产生少于三分之一的由L-Trp产生的H2O2(表1)。
表1：测试化合物和L-Trp之间的过氧化氢产量比例
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为理解在光照射中形成的ROS，如上文所述在50mMNaN3(已知的单线态氧淬灭剂)存在下在光暴露下测试数种Trp衍生物。所有测试化合物在这些条件下展示出生成的过氧化氢的量的显著下降，这表明单线态氧是Trp及其衍生物在光照射时生成的主要ROS(图5)。
其它芳香族化合物如唾液酸和衍生物也基于其已报道的抗氧化特性(Baltazaretal.,CurrMedChem18(21):3252-64(2011))进行了测试。当光暴露时唾液酸产生非常少的H2O2，而其5-OH衍生物的表现与L-Trp类似(表1)。另一方面，邻氨基苯甲酸产生两倍于L-Trp的H2O2，但5-OH-邻氨基苯甲酸产生一半于L-Trp的H2O2(表1)。
从CV筛选试验获得的候选抗氧化化合物
基于来自光敏感性筛选试验的结果，具有芳香环取代基的化合物似乎影响生成的过氧化氢的量。由于目的是赋形剂而非蛋白药物的优先氧化，具有低氧化电势的赋形剂可作为有效的抗氧化剂。对化合物的氧化/还原特性进行了研究。使用循环伏安法(CV)评估了包括L-Trp和衍生物在内的数种化合物对蛋白中Trp氧化的保护作用并基于其氧化电势进行了排序(表2)。具体地，将候选抗氧化剂溶解在去离子水中，随后添加至0.2M高氯酸锂电解质溶液。溶液用EG&GPrincetonAppliedResearchModel264APolarograph/Voltammeter以Model616RDEGlassyCarbonElectrode作为工作电极进行表征。溶液以100或500mV/秒的扫描速率从-0.10V扫描至+1.50V。将分析电池用氮气净化四分钟，然后对每种抗氧化剂溶液进行扫描。输入是工作电极的电位的线性扫描，而输出是对所获得的电流的测量。当扫描电位(线性增加或减少)时，CV电池中的电化学活性物质在工作电极的表面处经历氧化和还原反应，这导致所连续测量的电流。氧化还原反应通过电流的急剧增加或减少(峰)来表征。氧化反应发生处的电位称为阳极峰电位(或氧化电势)，而还原反应发生处的电位称为阴极峰电位(或还原电位)。
在本研究中赋形剂的氧化电势相对于Ag/AgCl为0.410至1.080V(表2)。在这些条件下，L-Trp相对于Ag/AgCl具有不可逆的氧化电势0.938V。发现九种化合物与L-Trp相比具有较低的氧化电势，包括相对于Ag/AgCl具有 0.535至0.600V的氧化电势的所有5-OH化合物。在测试的全部化合物中，5-氨基-DL-色氨酸具有处于0.410V的最低氧化电势，而N-乙酰化合物(0.730-0.880V)和5-甲氧基-DL-色氨酸(0.890V)也低于L-Trp。七种化合物与L-Trp相比具有较高的氧化电势(表2)。这些是吲哚-3-乙酸、5-氟-L-色氨酸、色胺、L-色氨酸酰胺、L-犬尿氨酸、5-硝基-DL-色氨酸和唾液酸。唾液酸在本研究中具有最高的氧化电势(相对于Ag/AgCl为1.080V)。全部测试化合物显示出不可逆的CV，这表明一旦氧化，物质就不倾向于接受电子且可能不会参与进一步的电化学反应。
表2：赋形剂的氧化电势
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氧化(阳极峰)电位使用循环伏安法用玻碳工作电极在0.2M高氯酸锂中测量
对于16种具有高于或低于L-Trp的氧化电势且具有高于或低于L-Trp的H2O2产生水平的化合物确定了氧化电势和光诱导的H2O2产生间的相关性(图6)。由于吲哚和色氨酸在光暴露下在H2O2产生方面表现类似，因此所可能的是，在5元环的C3位上的取代不影响该性质。然而，在C3位具有-CH2CH2NH2取代的色胺和在C3位具有-CH2COOH取代的吲哚-3-乙酸与L-Trp相比分别产生少两倍和多两倍的H2O2。这些数据表明C3取代在光激活和过氧化物生成中发挥作用。C3取代不影响分子的氧化电势，而吲哚本身与L-Trp相比在这些实验条件下具有显著较低的氧化电势。6元芳香环的C5处的取代表现得相当可预测。一般而言，具有供电子基团如-NH2和-OH的化合物与其母体化合 物相比具有较低的氧化电势且在光激活时也显示出低水平的H2O2产生(例如5-氨基-DL-色氨酸、5-羟基吲哚-3-乙酸、5-羟基-L-色氨酸、5-羟基吲哚、5-羟色胺)。类似地，具有高氧化电势的化合物在这些条件下产生较多的H2O2(5-甲氧基-DL-色氨酸、L-Trp、吲哚-3-乙酸、5-氟-L-色氨酸)。存在对这种相关性的预期；一些化合物具有高氧化电势但不产生很多的H2O2(例如唾液酸和L-犬尿氨酸)，这表明可能存在其它机制对这些六元芳香化合物起关键作用但尚未在包含L-Trp的吲哚骨架的化合物中观察到。感兴趣的区域是包含以下化合物的象限(图6,虚线框)，所述化合物当光暴露时与L-Trp相比具有较低的氧化电势和较低的H2O2生成。具有这两种性质的化合物被认为是新的候选抗氧化剂，这是因为其能够(1)与蛋白上的Trp相比较快地氧化且(2)在长期保存过程中和/或在药品生产时的周围加工过程中产生非常少的H2O2并因此能保护蛋白在这些条件下免于进一步氧化。
实施例3：候选抗氧化化合物降低单克隆抗体配制物的氧化
选择与L-Trp相比在光处理时产生较少H2O2的化合物及与L-Trp相比具有较低氧化电势的那些化合物用于使用AAPH、光和Fenton反应作为氧化胁迫模型来评估其可能的抗氧化性质(表3)。将mAb1用作模型蛋白以通过不同氧化胁迫模型评估所选候选抗氧化剂防止Trp氧化的有效性。每种胁迫模型通过不同机制实现氧化且因此各自在生物药学稳定性的评估中都具有价值。将AAPH或2,2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐用作胁迫模型以模拟由配制物赋形剂如降解的聚山梨酯潜在生成的烷基过氧化物。AAPH的分解生成烷基、烷氧基和烷基过氧自由基，而这些自由基已显示氧化在蛋白中包括蛋氨酸、酪氨酸和色氨酸残基在内的氨基酸残基(Jietal.,JPharmSci98(12):4485-500(2009)；Chaoetal.,ProcNatlAcadSciUSA94(7):2969-74(1997))。类似地，受控的光可用作胁迫模型以模拟药物在加工和保存过程中可经历的环境光线暴露。光诱导的生物药物的氧化显示通过单线态氧(1O2)和/或超氧阴离子(O2-)机制进行(Sreedharaetal.,Mol.Pharmaceutics(2013))。Fenton反应也通常用作氧化胁迫模型。H2O2和Fe离子的这种混合物通过金属催化的羟基自由基机制实现氧化(Prouseketal.,PureandAppliedChemistry79(12):2325-2338(2007))且用于模拟来自在药物制造和保存过程中使用的不锈钢表面的金属残基。
表3：氧化胁迫模型
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先前使用RP-HPLC和LC-MS方法充分表征了mAb1上的色氨酸(W53)氧化(Sreedharaetal.,Mol.Pharmaceutics(2013))。简要地，mAb1用木瓜蛋白酶消化以生成重链(HC)Fab、HCFc和轻链片段。片段用DTT还原，随后经由液相色谱-质谱(LC-MS)分离和鉴定。发现HCFab和HCFc的氧化版本与其天然对应物相比洗脱较早。对在氧化和天然峰下积分的面积进行的比较用于量化HCFab和Fc氧化。此外，LC-MS/MS肽图谱(通过胰蛋白酶消化和通过Lys-C消化)显示HCFab的氧化主要为Trp残基W53，而HCFc的氧化主要归结于两个Met残基M254和M430的氧化。通过在本研究中使用木瓜蛋白酶消化RP-HPLC方法，可通过量化HCFab氧化来研究Trp残基氧化和通过量化HCFc氧化来研究Met残基氧化。
％Fab氧化和％Fc氧化如下计算(注意每种抗体分子具有两个Fab；因此，所获得的％Fab氧化没有反映氧化的包含Fab氧化的完整抗体的％)：
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对于mAb1光胁迫研究，在pH6.0的20mM组氨酸乙酸盐、250mM海藻糖和0.02％聚山梨酯20的配制物中制备mAb1至5mg/mL。抗氧化剂从在pH6.0的20mM组氨酸乙酸盐、250mM海藻糖和0.02％聚山梨酯20中制备的10mM储液中以1mM(终浓度)添加。例外的是L-Met，其从200mML-Met在相同缓冲液(即pH6.0的20mM组氨酸乙酸盐、250mM海藻糖和0.02％聚山梨酯20)中的储液中添加至1、10、25、50和100mM终浓度。包含这些配制物的玻璃小瓶在AtlasSunTestCPS+XenonTestInstrument(Chicago,IL)中在环境温度暴露至250W/m2光线。对照小瓶包裹在铝箔中且类似处理。光暴露后，制备溶液用于通过如上文所述的反相HPLC分析。
对于mAb1AAPH胁迫研究，在pH6.0的20mM组氨酸乙酸盐、250mM海藻糖和0.02％聚山梨酯20的配制物中制备mAb1至4mg/mL。抗氧化剂从在pH6.0的20mM组氨酸乙酸盐、250mM海藻糖和0.02％聚山梨酯20中制 备的10mM储液中以1mM(终浓度)添加。将200μL10mMAAPH添加至2mL每种mAb1溶液中，随后在40℃温育24小时。温育后，每种溶液使用PD-10柱与配制物缓冲液(pH6.0的20mM组氨酸乙酸盐、250mM海藻糖和0.02％聚山梨酯20)进行缓冲液交换，从而使mAb1终浓度为2.3mg/mL。缓冲液交换后，制备每种溶液用于通过上文所述的反相HPLC分析。
对于mAb1Fenton胁迫研究，在pH6.0的20mM组氨酸乙酸盐的配制物中制备mAb1至3mg/mL。抗氧化剂随后从在20mM组氨酸盐酸盐中制备的10mM储液中以1mM的终浓度添加。将终浓度为0.2mM的FeCl3和10ppm的H2O2添加至每种mAb1溶液，随后在40℃温育3小时。温育后，每种反应通过添加100mML-Met(从200mML-Met在20mM组氨酸盐酸盐中的储液制备)淬灭，随后制备每种溶液用于通过上文所述的反相HPLC分析。
所确定的是，在40℃将mAb1与AAPH温育24小时导致27％Fab(Trp残基)氧化(图7A)和47％Fc(Met残疾)氧化(图7B)。先前已使用光胁迫和循环伏安法筛选的七种赋形剂与mAb1在AAPH条件下温育以评估抗氧化能力。发现七种化合物中的六种显著降低AAPH诱导的Fab氧化(图7A)。这些化合物中的全部六种包含吲哚骨架。此外，测试的所有羟基衍生物(5-羟基-L-Trp、5-羟基吲哚、7-羟基吲哚和5-羟色胺)降低Fab氧化至接近对照的水平(约2％)。同时，唾液酸在AAPH胁迫下对Fab氧化几乎无影响。所述赋形剂都似乎不影响AAPH诱导的Fc氧化的水平(图7B)。
对于光胁迫研究，在测试前文所述的七种赋形剂时将mAb1以250W/m2暴露至光16小时(图8)。mAb1向光的暴露(“无赋形剂”)比对照水平(“mAb1RefMat”,图8A)增加3.5倍Fab氧化。先前已显示L-Trp可在模型蛋白甲状旁腺激素(PTH)中防止Trp氧化(Jietal.,JPharmSci98(12):4485-500(2009))。然而，该研究发现1mML-Trp向mAb1的添加使Fab氧化增加11倍，这可能是由于光暴露的L-Trp所致的ROS如单线态氧的生成(图2)。羟基化合物(5-羟基-L-Trp、5-羟基吲哚、7-羟基吲哚和5-羟色胺)的添加防止光诱导的Fab氧化，这降低Fab氧化至接近对照水平(图8A)。另一方面，唾液酸的表现与L-色氨酸酰胺类似，即与对照水平相比使Fab氧化增加8倍。在光胁迫下对于Fc氧化观察到类似的结果(图8B)。mAb1的光暴露导致与对照水平相比使Fc氧化增加40％，而L-Trp的添加使Fc氧化增加至对照水平的7倍。与对照(无赋形剂)相比，L-色氨酸酰胺和唾液酸也导致较多的Fc氧化。羟基化合物产生 与无赋形剂对照类似的Fc氧化，这可能是由于其与L-Trp相比在光暴露下产生少得多的ROS。实施例2中的光筛选和NaN3研究结果显示出由赋形剂生成的H2O2的量和mAb1的FcMet氧化之间的良好相关性。
使用H2O2和Fe离子的混合物的Fenton反应通过金属催化的羟基自由基反应来实现氧化(Prouseketal.,PureandAppliedChemistry79(12):2325-2338(2007))。该反应在mAb1中实现Fab即色氨酸氧化。该反应还在如上报道的可有效抵抗AAPH和光诱导的氧化的所选抗氧化剂存在下实施。关于抵抗Fenton介导的反应的抗氧化性质的数据使用如上所述的RP-HPLC试验分析(图9)。在测试条件下，Fenton反应在mAb1的Fab区产生比对照高约4倍的氧化。除唾液酸外，测试的大多数抗氧化剂对L-Trp显示出类似的羟基自由基淬灭性质，该性质相对于无赋形剂的情况对Fab氧化的防止程度为约25％(图9A)。对于防止Fc氧化，测试的赋形剂(除唾液酸外)的表现稍好于L-Trp(图9B)。
芳香环上的供电子取代可促进吲哚基自由基阳离子的形成且可能促进与自由基的较快反应性。与芳香环相连的羟基是电子供体，这是因为氧原子具有可参与共振结构的孤对电子，这导致较低的氧化电势且可能对电子攻击较敏感。如表2所示，羟基取代导致显著较低的氧化电势，这表明这些化合物与L-Trp和/或吲哚相比可成为较好的抗氧化剂。羟基取代的吲哚和Trp衍生物在光照射下也产生最少量的过氧化氢(表1)。这可能是由于这些分子在传递光能至分子氧中的低量子效率，这与其高淬灭常数相关，如就5-羟基-L-色氨酸所证实的那样(Dadetal.,JPhotochemPhotobiolB,78(3):245-51(2005))。如图7和图8所示，羟基取代的吲哚和色氨酸衍生物为mAb1的Fab区的W53提供对抗AAPH、光和Fenton诱导的氧化的大幅保护。然而，这些化合物在AAPH诱导的降解中都没有为mAb1的Fc区的Met提供显著的氧化保护。相反地，吲哚和色氨酸衍生物在光介导的氧化下表现得如预期的那样。在光激活时产生较高量的过氧化物的分子(例如L-Trp和Trp-酰胺)也在mAb1的Fc区产生较高的Met氧化，而-OH衍生物在光氧化条件下产生较少的H2O2且还在Fc区产生最低量的Met氧化。甲硫氨酸很容易被H2O2和烷基过氧化物通过亲核取代反应而氧化成甲硫氨酸亚砜(Lietal.,BiotechnologyandBioengineering48:490-500(1995))。甲硫氨酸至甲硫氨酸亚砜的光氧化经由单线态氧发生，尽管该反应经由不同的中间体发生(Lietal.,Biotechnologyand Bioengineering48:490-500(1995))。AAPH在热胁迫下降解，得到针对Met和Trp分别具有不同反应性的烷基过氧化物和烷氧基自由基(Werberetal.,JPharmSci100(8):3307-15(2011))。先前的研究已经显示L-Trp能够在PTH中防止由AAPH诱导的Trp氧化且在相同条件下L-Trp不能在PTH中防止Met氧化(Jietal.,JPharmSci98(12):4485-500(2009))。类似地，L-Met能够保护PTH免于AAPH诱导的氧化，但不能防止Trp氧化。这些观察符合以下反应机制，其中Met氧化主要经由亲核取代反应而Trp氧化主要经由游离自由基机制。
L-Trp导致单线态氧且最终导致H2O2的光激活及单线态氧通过5-HT的形成和淬灭的推测机制示于图10。