用人生长激素类似物治疗小儿生长激素缺乏症
发明背景
人生长激素(hGH)作为通常发生在睡眠期间、持续数分钟到数小时的间歇脉冲而从人垂体前叶自然分泌。hGH分泌的速率和程度随着年龄的增长而下降，并且在正常健康的营养良好的儿童的青春期达到最大值。hGH与hGH受体结合，从而启动涉及STAT(信号转导物和转录激活因子)、MAPK(促分裂原活化蛋白激酶)以及PI3K(磷酸肌醇-3激酶)途径的信号传导过程。hGH受体信号传导激活胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因表达，从而导致IGF-I分泌到循环中。IGF-I与胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)和酸不稳定性亚单位(ALS)形成复合物。IGFBP-3和ALS表达也均通过hGH受体活化进行调控。
在患有由于缺乏hGH表达或分泌而导致，而并非由hGH受体的缺陷所引起的生长激素缺乏症(GHD)的儿童中，通常开出含有每日注射rhGH的替代疗法的处方以促进接近正常的生长和发育。响应于hGH和IGF-I，新骨在骨骺处形成，从而引起线性生长，直到青春期后生长板融合。每日rhGH施用并不模拟在非GHD儿童中hGH的正常内源性脉冲，而是导致生长的显著增加，在治疗的第一年的典型生长速率为11cm/年。使用泵连续输注rhGH的临床研究显示了与通过每日rhGH注射实现的生长速度和IGF-I水平相当的生长速度和IGF-I水平(![]()
等，J.ClinEndocrinolMetab.70(6),1616-23(1990)；Laursen,T.等，JClinEndocrinolMetab.80(8),2410-8(1995)；Tauber,M.等，JClinEndocrinolMetab.76(5),1135-9(1993))。因此，rhGH的连续的以及脉冲式施用是有效的。
已在GHD儿童和成人两者中对每日rhGH疗法的安全性进行了研究。在一些超重或肥胖患者中，已观察到有朝向空腹和餐后胰岛素水平增加的趋势。尽管通常耐受性良好，但每日rhGH疗法可能导致轻度至中度的头痛、关节痛、恶心、呕吐以及注射反应。
其他人已报道了各种不同的持续释放GH制剂(CookDM等，2002.JClinEndocrinolMetab87(10):4508-4514；BillerBM等，2011.JClinEndocrinolMetab96(6):1718-1726；PeterF.等，2012.JClinEndocrinolMetab97(2):400-407；FaresF.等，2010.Endocrinology151(9):4410-4417；SondergaardE等，2011.JClinEndocrinolMetab96(3):681-688；deSchepperJ等，2011.EuropeanJournalofEndocrinology165(3):401-409；BidlingmaierM等，2006.JClinEndocrinolMetab91(8):2926-2930)。然而，仍然需要可替代的GH疗法、剂量以及治疗方案。
VRS-317是一种开发中的用于患有GHD的成人和患有小儿GHD的儿童的长期替代疗法的试验性长效rhGH。设计VRS-317以达到每月一次给药，预期施用频率的降低(少至每年12次相对于高达365次注射)将增加治疗依从性，并且因此改进整体治疗结果。VRS-317是一种rhGH融合蛋白，其被设计成通过受体结合的降低来最小化由受体介导的清除，这种受体结合的降低是通过在遗传学上将延伸重组多肽(XTEN)氨基酸序列融合至天然hGH序列的N-端和C-端而非对rhGH进行突变来实现(Cleland等，2012,JournalofPharmaceuticalSciences.101(8):2744-2754，电子版，2012年6月7日)。
发明概述
本发明涉及一种用于儿童的小儿生长激素缺乏症(“PGHD”)疗法的改进的治疗方案。具体而言，本发明涉及用于以推注剂量(bolusdose)施用融合蛋白的组合物的方法，该融合蛋白包含与一个或多个延伸重组多肽(XTEN)融合的人生长激素(该融合蛋白在下文称为“hGH-XTEN”)。因此，在一方面，本发明涉及一种用hGH-XTEN融合蛋白治疗患有人PGHD的儿科患者的方法。
在一方面，本发明提供了一种通过向患有PGHD的患者施用一个剂量人生长激素-XTEN(hGH-XTEN)融合蛋白来治疗儿科患者的人小儿生长激素缺乏症(PGHD)的方法。在另一个实施方案中，hGH-XTEN融合蛋白包含与SEQIDNO:1具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。在一个其它实施方案中，所述剂量是推注剂量。在一个实施方案中，所述hGH-XTEN推注剂量是治疗有效的根据体重调整的推注剂量。在另一个实施方案中，所述hGH-XTEN推 注剂量是在约0.80mg/kg与约6.3mg/kg之间。在另一个实施方案中，所述hGH-XTEN推注剂量是在约0.80mg/kg与约7.0mg/kg之间。
在其它实施方案中，所述推注剂量的hGH-XTEN是每周、每两周、每半个月(即，一个月两次)、每三周或每月施用。在另一个实施方案中，推注剂量的hGH-XTEN施用每月进行。在一个优选的实施方案中，推注剂量的hGH-XTEN的施用每周进行。在一个优选的实施方案中，推注剂量的hGH-XTEN施用每半个月进行。在另一个优选的实施方案中，推注剂量的hGH-XTEN的施用每三周进行。在另外的实施方案中，皮下施用推注剂量的hGH-XTEN。
在另外的实施方案中，人类儿科患者在施用推注剂量的hGH-XTEN之后具有约-2.0与约2.0之间的血清IGF-I标准差得分(SDS)。在另一个实施方案中，人类儿科患者在推注剂量的hGH-XTEN的第一或第二或第三或第四推注剂量施用之后具有约-2.0与约2.0之间的血清IGF-I标准差得分(SDS)。在其它实施方案中，儿科患者在施用所述推注剂量之后表现出所述血清IGF-ISDS，其中所述IGF-ISDS选自由以下各项组成的组：大于约-2.0、大于约-1.5、大于约-1.0、大于约-0.5、大于约0、大于约0.5、大于约1.0以及大于约1.5。在其它实施方案中，儿科患者在施用所述推注剂量之后表现出所述血清IGF-ISDS，其中所述IGF-ISDS选自由以下各项组成的组：大于约-1.5至约2.0、大于约-1.0至约2.0、大于约-0.5至约2.0、大于约0至约2.0、大于约0.5至约2.0、大于约1.0至约2.0以及大于约1.5至约2.0。在其它实施方案中，儿科患者在施用所述推注剂量之后表现出所述血清IGF-ISDS，其中所述IGF-ISDS选自由以下各项组成的组：大于约-1.0至约2.0、大于约0至约2.0以及大于约1.0至约2.0。在另一个实施方案中，儿科患者在施用所述推注剂量之后表现出所述血清IGF-ISDS，其中所述施用是每周、每两周、每三周或每月进行的。在另一个实施方案中，所述施用是每周、每两周、每半个月、每三周或每月进行的。在另外的实施方案中，所述施用是每半个月或每月进行的。在其它实施方案中，所述推注剂量在施用之后可有效将儿科患者的血清IGF-ISDS维持在约-2.0与约2.0之间，持续至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、 至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天、至少约25天、至少约26天、至少约27天、至少约28天、至少约29天、至少约30天或至少约1个月。在其它实施方案中，所述推注剂量在施用之后可有效将儿科患者的血清IGF-ISDS维持在约-2.0与约2.0之间，持续至少约14天、至少约21天或至少约30天。在另一个实施方案中，所述推注剂量在施用之后可有效将儿科患者的血清IGF-ISDS维持在约-2.0与约2.0之间，持续至少约14天，或至少约30天。在另一个实施方案中，人类儿科患者在hGH-XTEN的第一或第二或第三或第四推注剂量施用后所述各天之后具有约-2.0与约2.0之间的血清IGF-I标准差得分(SDS)。
在其它实施方案中，所述推注剂量在施用之后可有效将儿科患者的血清IGF-ISDS基线血清IGF-I标准差得分(SDS)维持在至少1.0，持续至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天、至少约25天、至少约26天、至少约27天、至少约28天、至少约29天、至少约30天或至少约1个月。在另一个实施方案中，所述推注剂量在施用之后可有效将儿科患者的血清IGF-ISDS基线血清IGF-I标准差得分(SDS)维持在至少1.0，持续至少约14天、至少约21天或至少约30天。在另外的实施方案中，所述推注剂量在施用之后可有效将儿科患者的血清IGF-ISDS基线血清IGF-I标准差得分(SDS)维持在至少1.0，持续至少约14天或至少约30天。在其它实施方案中，所述推注剂量在hGH-XTEN的第一或第二或第三或第四推注剂量施用后所述各天之后可有效将儿科患者的血清IGF-ISDS基线血清IGF-I标准差得分(SDS)维持在至少1.0。
在另一个实施方案中，儿科患者在施用至少一个第二或第三或第四推注剂量之后表现出所述血清IGF-I标准差得分(SDS)。
在其它实施方案中，本发明提供了一种通过向患者施用hGH-XTEN融合蛋白来治疗儿科患者的人小儿生长激素缺乏症(PGHD)的方法，其中所述hGH-XTEN在儿科患者中可有效实现等于至少约6cm/年或至少约7cm/年或 至少约8cm/年或至少约9cm/年或至少约10cm/年或至少约11cm/年或至少约12cm/年的身高增长速度(heightvelocity)。在另一个实施方案中，推注剂量的hGH-XTEN可有效实现等于在约7cm/年至约12cm/年之间的身高增长速度。在其它实施方案中，推注剂量的hGH-XTEN在儿科患者体内可有效实现等于在约8cm/年至11cm/年之间的身高增长速度。在本段落的前述实施方案中，所述身高增长速度是在所述儿科患者中给药至少3个月后、至少6个月后、至少9个月后或至少12个月后实现。在其它实施方案中，所实现的身高增长速度是第一年身高增长速度。
在其它实施方案中，本发明提供了一种通过向患者施用hGH-XTEN融合蛋白来治疗儿科患者的人小儿生长激素缺乏症(PGHD)的方法，其中所述方法在儿科患者中实现的身高增长速度不亚于同一时期使用未连接至XTEN的hGH的每日注射所实现的身高增长速度。在一个实施方案中，所施用的hGH-XTEN融合蛋白以摩尔计与未连接至XTEN且施用给儿科患者的等量hGH相当。在一个实施方案中，所述等量选自至少约25、至少约30、至少约33、至少约35、至少约37或至少约或至少约40μghGH/kg/天的hGH剂量。
在其它实施方案中，本发明提供了一种通过向患者施用hGH-XTEN融合蛋白来治疗儿科患者的人小儿生长激素缺乏症(PGHD)的方法，其中所述方法可有效将儿科患者的身高增长速度维持在与在相当的剂量时期内在儿科患者体内每日注射等量(以摩尔计)的未连接至XTEN的hGH来施用实现的身高增长速度相比的身高增长速度的至少约10％、至少约20％或至少约30％内。在一个实施方案中，所述等量选自至少约25、至少约30、至少约33、至少约35、至少约37或至少约或至少约40μghGH/kg/天的hGH剂量。
在一个实施方案中，推注剂量的hGH-XTEN选自由以下各项组成的组：约0.8mg/kg、约1.0mg/kg、约1.2mg/kg、约1.4mg/kg、约1.6mg/kg、约1.8mg/kg、约2.0mg/kg、约2.2mg/kg、约2.4mg/kg、约2.6mg/kg、约2.7mg/kg、约2.8mg/kg、约3mg/kg、约3.2mg/kg、约3.4mg/kg、约3.6mg/kg、约3.8mg/kg、约4.0mg/kg、约4.2mg/kg、约4.4mg/kg、约4.6mg/kg、约4.8mg/kg、约5.0mg/kg、约5.2mg/kg、约5.4mg/kg、约5.6mg/kg、约5.8mg/kg、约6.0mg/kg以及约6.3mg/kg。在另一个实施方案中，所述推注剂量是约0.8 mg/kg至约2.0mg/kg。在另一个实施方案中，所述推注剂量是约2.0mg/kg至约4.0mg/kg。在另一个实施方案中，所述推注剂量是约4.0mg/kg至约6.0mg/kg。在另一个实施方案中，所述推注剂量是约6.0mg/kg至约7.0mg/kg。在另一个实施方案中，所述推注剂量是约0.8mg/kg至约1.5mg/kg。在另一个实施方案中，所述推注剂量是约1.8mg/kg至约3.2mg/kg。在另一个实施方案中，所述推注剂量是约3.5mg/kg至约6.3mg/kg。
在另一个实施方案中，所述hGH-XTEN融合蛋白包含SEQIDNO:1的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述hGH-XTEN融合蛋白与SEQIDNO:1具有至少约91％或至少约92％或至少约93％或至少约94％或至少约95％或至少约96％或至少约97％或至少约98％或至少约99％的序列同一性。
在另一方面，本发明提供了一种通过向患有PGHD的患者施用一个剂量的人生长激素-XTEN(hGH-XTEN)融合蛋白来治疗人类儿科患者的人小儿生长激素缺乏症(PGHD)的方法，所述剂量可有效将患者的血清IGF-I标准差得分(SDS)维持在某一水平上。在一个实施方案中，所述方法包括施用具有与SEQIDNO:1具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的hGH-XTEN融合蛋白。在另一个实施方案中，所述剂量是治疗有效的根据体重调整的推注剂量。在一个其它实施方案中，所述推注剂量可有效将患者的血清IGF-I标准差得分(SDS)维持在约-2.0与约2.0之间。在另外的实施方案中，所述推注剂量在施用所述推注剂量之后可有效将IGF-ISDS维持在约-2.0与约2.0之间，持续至少7天。在其它实施方案中，推注剂量的hGH-XTEN是在约0.8mg/kg与约6.3mg/kg之间。在一个实施方案中，推注剂量的hGH-XTEN在施用之后可有效将患者的血清IGF-ISDS维持在约-2.0与约2.0之间，持续至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天、至少约25天、至少约26天、至少约27天、至少约28天、至少约29天、至少约30天或至少约1个月。在另一个实施方案中，所述推注剂量在施用之后可有效将儿科患者的血清IGF-ISDS维持在约-2.0与约2.0之间，持续至少约14天、至少约21天或至少约30天。在另一个实施方案中， 所述推注剂量在施用之后可有效将儿科患者的血清IGF-ISDS维持在约-2.0与约2.0之间，持续至少约14天，或至少约30天。
在一个另外的方面，本发明提供了一个儿科推注剂量的hGH-XTEN融合蛋白的。在一个实施方案中，所述hGH-XTEN融合蛋白包含与SEQIDNO:1具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述推注剂量是治疗有效的根据体重调整的推注剂量。在一个其它实施方案中，推注剂量的hGH-XTEN包含在约0.8mg/kg与约6.3mg/kg之间的hGH-XTEN融合蛋白。在其它实施方案中，所述推注剂量用于治疗有需要的儿科患者的人小儿生长激素缺乏症(PGHD)。在另一个实施方案中，所述hGH-XTEN融合蛋白包含SEQIDNO:1的氨基酸序列。在一个实施方案中，推注剂量的hGH-XTEN配制用于皮下施用。
在另一方面，本发明提供了一种hGH-XTEN融合蛋白，其(i)用于治疗人类儿科患者的人小儿生长激素缺乏症(PGHD)的方法中；或(ii)用于用以治疗儿科患者的PGHD的药剂的制备中。在一个实施方案中，所述hGH-XTEN融合蛋白包含与SEQIDNO:1具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。在另外的实施方案中，所述方法包括施用推注剂量的hGH-XTEN融合蛋白的。在另一个实施方案中，所述药剂包含推注剂量的hGH-XTEN融合蛋白。在一个其它实施方案中，所述推注剂量是所述hGH-XTEN融合蛋白的治疗有效的根据体重调整的推注剂量。在一个实施方案中，所述推注剂量是在约0.8mg/kg与约6.3mg/kg之间。在另一个实施方案中，所述推注剂量是每周、每两周、每半个月、每三周或每月施用的。在另一个实施方案中，所述推注剂量是每半个月或每月施用的。在一个另外的实施方案中，所述hGH-XTEN融合蛋白包含SEQIDNO:1的氨基酸序列。在另一个实施方案中，皮下施用所述推注剂量。在另一个实施方案中，所述药剂配制用于皮下施用。在其它实施方案中，人类儿科患者在施用所述hGH-XTEN推注剂量之后具有约-2.0与约2.0之间的血清IGF-I标准差得分(SDS)。在一个另外的实施方案中，儿科患者在施用所述推注剂量之后表现出所述血清IGF-ISDS，其中所述IGF-ISDS选自由以下各项组成的组：大于约-2.0、大于约-1.5、大于约-1.0、大于约-0.5、大于约0、大于约0.5、大于约1.0以及大于约1.5。在一个实施方案中，所述推注剂 量是每周、每两周、每三周、每半个月或每月施用。在另一个实施方案中，所述推注剂量是每半个月或每月施用。在另一个实施方案中，所述IGF-ISDS选自由以下各项组成的组：大于约-1.5、大于约-1.0、大于约-0.5、大于约0、大于约0.5、大于约1.0以及大于约1.5。在另一个实施方案中，所述IGF-ISDS选自由以下各项组成的组：大于约-1.0、大于约0以及大于约1.0。
在另一个实施方案中，hGH-XTEN融合蛋白施用是每周、每两周、每半个月、每三周或每月进行的。在另一个实施方案中，hGH-XTEN融合蛋白施用是每半个月或每月进行的。
在一个其它方面，本发明提供了一种用于治疗小儿生长激素缺乏症(PGHD)的试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒包括容器，所述容器容纳包含人生长激素-XTEN(hGH-XTEN)融合蛋白的药物组合物。在另一个实施方案中，所述hGH-XTEN融合蛋白包含与SEQIDNO:1具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。在一个其它实施方案中，所述试剂盒还包括与所述容器相关联的包装插页。在一个另外的实施方案中，所述包装插页指示所述组合物用于通过施用一个初始剂量的hGH-XTEN融合蛋白来治疗儿科患者的小儿生长激素缺乏症(PGHD)。在另一个实施方案中，所述包装插页进一步指示施用多个后续剂量的hGH-XTEN融合蛋白。在一个其它实施方案中，所述初始剂量是在约0.8mg/kg与约6.3mg/kg之间。在另外的实施方案中，所述多个后续剂量的hGH-XTEN融合蛋白是在约0.8mg/kg与约6.3mg/kg之间。在一个实施方案中，所述剂量的hGH-XTEN融合蛋白是每周、每两周、每半个月、每三周或每月施用的。在另一个实施方案中，所述剂量的hGH-XTEN融合蛋白是每半个月或每月施用的。
在另一方面，本发明提供了一种在用于治疗儿科患者的小儿生长激素缺乏症(PGHD)的医药治疗方案中使用的人生长激素-XTEN(hGH-XTEN)融合蛋白。在一个实施方案中，所述hGH-XTEN融合蛋白包含与SEQIDNO:1具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述医药方案包括施用推注剂量的hGH-XTEN融合蛋白以治疗儿科患者。在一个其它实施方案中，所述推注剂量是治疗有效的根据体重调整的推注剂量的所述hGH-XTEN融合蛋白的。在一个实施方案中，所述推注剂量是在约0.8mg/kg 与约6.3mg/kg之间。在一个其它实施方案中，所述医药方案还包括确定在儿科患者中实现在约-2.0与约2.0之间的IGF-I标准差得分(SDS)所需的hGH-XTEN融合蛋白的量的步骤。在一个实施方案中，用于治疗儿科患者的所述医药方案包括施用约0.8mg/kg与约6.3mg/kg之间的初始推注剂量的hGH-XTEN融合蛋白，以及约0.8mg/kg与约6.3mg/kg之间的多个后续推注剂量的hGH-XTEN融合蛋白。在另一个实施方案中，所述推注剂量是每周、每两周、每半个月、每三周或每月施用的。在另一个实施方案中，所述推注剂量是每半个月或每月施用的。
以引用的方式并入
本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请都以引用的方式并入本文，所述引用的程度就如同已特定地和个别地指示将各个别公布、专利或专利申请以引用的方式并入一般。
附图简述
图1提供了hGH-XTEN融合蛋白的氨基酸序列(hGH序列以下划线和粗体示出)(SEQIDNO:1)。
图2概述了儿科患者中人生长激素-XTEN(hGH-XTEN)融合蛋白的1b/2a期研究的设计。
图3示出了hGH-XTEN融合蛋白血浆浓度(ng/mL)平均值。
图4示出了hGH-XTEN融合蛋白Cmax(ng/mL)以及hGH-XTEN融合蛋白AUC(hr-ng/mL)。
图5展示了IGF-I(平均值)的持续变化(始于基线)。
图6展示了IGF-I响应与hGH-XTEN融合蛋白的剂量线性相关。
图7概述了儿科患者中人生长激素-XTEN(hGH-XTEN)融合蛋白的1b/2a期研究的设计。hGH-XTEN融合蛋白剂量等同于5-37μg/kd/天，服用30天的 重组hGH(rhGH)质量。
图8提供了示出完成给药组的临床特征的表；数值是平均值(SD)。
图9提供了示出被认为与剂量水平组1-6中的研究药物可能、很可能或明确相关的相关不利事件的表。所有相关AE是轻度的(CTCAE等级1)且短暂的。无SAE，无出乎意料的AE，无患者撤出，无脂肪萎缩，无结节。
图10示出了hGH-XTEN融合蛋白血浆浓度(ng/mL)平均值(1b期的初步PK)。
图11示出了hGH-XTEN融合蛋白Cmax(ng/mL)以及hGH-XTEN融合蛋白AUC(hr-ng/mL)(剂量比例性)。
图12A-12B示出了对单剂量融合蛋白的IGF-ISDS响应。
图13A-13B示出了每月平均IGF-ISDS(单剂量)始于基线的增加。平均IGF-ISDS的增加随着剂量的增加而增加(p<0.00001)。实现了所需每月IGF-I特征。
图14示出了与年龄匹配的历史对照和VRS-317治疗患者的平均年度身高增长速度。
发明描述
在描述本发明的实施方案之前，应理解所述实施方案是仅通过举例方式提供，且本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案可以用于实践本发明。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现将会想到众多变化、改变和替代。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与由本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管在实践或测试本发明时可以使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料，但以下描述了合适的方法和材料。在起冲突的情况下，以包括定义的专利说明书为 准。此外，材料、方法和实例仅是说明性的而非意图具有限制性。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现将会想到众多变化、改变和替代。
定义
如本文所用，除非另外指明，否则以下术语具有赋予其的含义。
除非上下文另外明确规定，否则如在说明书和权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数个提及物。例如，术语“一个细胞”包括复数个细胞，包括其混合物。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换用于指代任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是直链或支链，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸打断。所述术语还涵盖已例如通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作(如与标记性组分缀合)加以修饰的氨基酸聚合物。
如本文所用，术语“氨基酸”指代天然和/或非天然或合成氨基酸，包括但不限于甘氨酸和D或L两种光学异构体、以及氨基酸类似物和肽模拟物。标准单字母代码或三字母代码用于指定氨基酸。
术语“天然L-氨基酸”意指甘氨酸(G)、脯氨酸(P)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、丝氨酸(S)以及苏氨酸(T)的L光学异构体形式。
如应用于序列以及如本文所用的术语“非天然存在”意指不具有哺乳动物中存在的野生型或天然存在的序列的对应物、不互补于哺乳动物中存在的野生型或天然存在的序列或不与哺乳动物中存在的野生型或天然存在的序列具有高度同源性的多肽或多核苷酸序列。例如，当适合地比对时，非天然存在的多肽或片段相较于天然序列可以共有不超过99％、98％、95％、90％、80％、70％、60％、50％或甚至更小氨基酸序列同一性。
术语“亲水性”和“疏水性”指代物质与水具有的亲和程度。亲水性物质对水具有强烈亲和力，倾向于溶解于水中，与水混合，或由水湿润，而疏水性物质大致上对水缺乏亲和力，倾向于排斥而非吸收水且倾向于不溶解于水中或与水混合或由水湿润。氨基酸可以基于它们的疏水性加以表征。已开发许多尺度。一个实例是由Levitt,M等,JMolBiol(1976)104:59开发的尺度，其列于Hopp,TP等,ProcNatlAcadSciUSA(1981)78:3824中。“亲水性氨基酸”的实例是精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬酰胺以及谷氨酰胺。特别感兴趣的是亲水性氨基酸天冬氨酸、谷氨酸和丝氨酸以及甘氨酸。“疏水性氨基酸”的实例是色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸以及缬氨酸。
“片段”是保留至少一部分治疗活性和/或生物活性的天然生物活性蛋白质的截短形式。“变体”是与天然生物活性蛋白质具有序列同源性的蛋白质，其保留了生物活性蛋白质的至少一部分治疗活性和/或生物活性。例如，比参考生物活性蛋白质相比较，变体蛋白质可以共有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性。如本文所用，术语“生物活性蛋白质部分”包括有意修饰(如例如通过定点诱变、插入)的蛋白质或通过突变而意外修饰的蛋白质。
“宿主细胞”包括可以为或已为主题载体的接受者的个别细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单一宿主细胞的子代。由于天然、偶然或故意突变，子代可以不必与原始亲本细胞完全相同(在形态方面或在总DNA互补体的基因组方面)。宿主细胞包括用本发明的载体体内转染的细胞。
“分离的”在用于描述本文公开的各种多肽时意指已被鉴别且与它的天然环境的组分分离和/或自所述天然环境的组分回收的多肽。它的天然环境的污染物组分是通常将干扰多肽的诊断用途或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素以及其它蛋白质或非蛋白质溶质。如为本领域技术人员显而易知，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要“分离”以将它与它的天然存在的对应物区分。此外，“浓缩的”、“分离的”或“稀释的”多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段可与它的天然存在的对应物区分，因为每体积分子的浓度或数目通常大于它的天然存在的对应物的浓度或数目。 一般而言，通过重组手段制备且在宿主细胞中表达的多肽被视为是“分离的”。
“分离的”多核苷酸或多肽编码核酸或其它多肽编码核酸是被鉴别且从在多肽编码核酸的天然来源中它通常与之缔合的至少一种污染物核酸分子分离的核酸分子。分离的多肽编码核酸分子不同于它在自然界中所存在的形式或配置。因此，分离的多肽编码核酸分子不同于当它存在于天然细胞中时的特定多肽编码核酸分子。然而，分离的多肽编码核酸分子包括通常表达多肽的细胞中含有的多肽编码核酸分子，在所述细胞中，例如核酸分子是在不同于天然细胞的位置的染色体或染色体外位置中。
“嵌合”蛋白含有在序列中不同于在自然界中存在的位置的位置中包含多个区的至少一种融合多肽。所述区可以通常以单独蛋白质形式存在，并且在融合多肽中集合在一起；或它们可以通常以相同蛋白质形式存在，但以新型排列放置在融合多肽中。可以例如通过化学合成，或通过产生并翻译其中以所需关系编码肽区域的多核苷酸来产生嵌合蛋白。
“缀合的”、“连接的”、“融合的”和“融合”在本文中可互换使用。这些术语指代通过无论什么手段(包括化学缀合或重组手段)将两种或更多种化学元素或组分连接在一起。例如，如果启动子或增强子影响序列的转录，那么使所述启动子或增强子可操作地连接至编码序列。一般而言，“可操作地连接”意指所连接的DNA序列是连续的，且在阅读相中或框内。“框内融合”指代以维持原始ORF的正确阅读框的方式连接两个或更多个开放阅读框(ORF)以形成连续更长ORF。因此，所得重组融合蛋白是含有两个或更多个对应于由原始ORF编码的多肽的区段的单一蛋白质(所述区段在自然界中通常不这样连接)。
在多肽的情形下，“直链序列”或“序列”是多肽中呈氨基末端至羧基末端方向的一定顺序的氨基酸，其中在序列中彼此相邻的残基在多肽的一级结构中是连续的。“部分序列”是多肽的一部分的已知在一个或两个方向上包含其它残基的直链序列。
“异源”意指源于某一实体，所述实体就基因型而言不同于它与之比较的 实体的其余部分。例如，自它的天然编码序列移除且可操作地连接至除天然序列以外的编码序列的富含甘氨酸的序列是异源富含甘氨酸的序列。如应用于多核苷酸、多肽的术语“异源”意指多核苷酸或多肽源于某一实体，所述实体就基因型而言不同于它与之比较的实体的其余部分的基因型。
术语“多核苷酸”、“核酸”、“核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用。它们指代任何长度的核苷酸的聚合形式，所述核苷酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析确定的基因座(loci)(基因座(locus))、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针以及引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，那么可在聚合物装配之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以由非核苷酸组分打断。可以在聚合之后，如通过与标记组分缀合来进一步修饰多核苷酸。
术语“多核苷酸的互补体”表示与参考序列相比较，具有互补碱基序列和逆向取向，以致它可以完全保真度与参考序列杂交的多核苷酸分子。
如应用于多核苷酸的“重组”意指多核苷酸是体外克隆、限制和/或连接步骤、以及产生可以潜在地于宿主细胞中表达的构建体的其它程序的各种组合的产物。
术语“基因”和“基因片段”在本文中可互换使用。它们指代含有能够在转录和翻译之后，编码特定蛋白质的至少一个开放阅读框的多核苷酸。基因或基因片段可以是基因组的或cDNA，只要多核苷酸含有可以涵盖整个编码区或其区段的至少一个开放阅读框即可。“融合基因”是由至少两种连接在一起的异源多核苷酸组成的基因。
“同源性”或“同源”指代两个或更多个多核苷酸序列之间或两个或更多个多肽序列之间的序列相似性或可互换性。当使用如BestFit的程序来确定两个 不同氨基酸序列之间的序列同一性、相似性或同源性时，可以使用缺省设置，或可以选择适当计分矩阵如blosum45或blosum80来使同一性、相似性或同源性计分最优化。优选地，同源的多核苷酸是在如本文定义的严格条件下杂交且与那些序列相比较具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％、更优选地95％、更优选地97％、更优选地98％、以及甚至更优选地99％序列同一性的那些多核苷酸。
“连接”指代在两个核酸片段或基因之间形成、将它们连接在一起的磷酸二酯键的过程。为将DNA片段或基因连接在一起，DNA的末端必须可彼此相容。在一些情况下，在核酸内切酶消化之后，末端将直接可相容。然而，可能必要的是首先使通常在核酸内切酶消化之后产生的交错末端转化成钝末端以使得它们对于连接可相容。
术语“严格的条件”或“严格的杂交条件”包括指代多核苷酸将在比与其它序列更大的可检测程度上(例如，超过背景至少2倍)与它的靶标序列杂交所处的条件。通常，部分地关于进行洗涤步骤所处的温度和盐浓度来表述杂交的严格性。通常，严格条件将为以下条件：其中在pH7.0至8.3下，盐浓度小于约1.5MNa离子，通常约0.01至1.0MNa离子浓度(或其它盐)并且温度是至少约30℃(对于短多核苷酸(例如10至50个核苷酸)而言)和至少约60℃(对于长多核苷酸(例如大于50个核苷酸)而言)—举例来说，“严格条件”可以包括在37℃下在50％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中杂交，以及在60℃至65℃下在0.1×SSC/1％SDS中洗涤3次，各次15分钟。或者，可以使用约65℃、60℃、55℃或42℃的温度。SSC浓度可以自约0.1变化至2×SSC，其中SDS是以约0.1％存在。所述洗涤温度通常选择为低于特定序列在确定离子强度和pH下的热熔点的约5℃至20℃。Tm是50％靶标序列与完全匹配探针杂交时所处的温度(在确定离子强度和pH下)。用于计算Tm的方程式和核酸杂交条件是熟知的并且可以参见Sambrook,J.等，(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，第1至3卷，ColdSpringHarborPress,PlainviewN.Y.；具体参见第2卷和第9章。通常，阻断试剂用于阻断非特异性杂交。所述阻断试剂包括例如约100-200μg/ml的剪切和变性的鲑鱼精子DNA。有机溶剂(如在约35-50％v/v浓度下的甲酰胺)也可以在特定情况(如RNA:DNA杂交)下使 用。关于这些洗涤条件的有用变化将易于为本领域普通技术人员显而易知。
如应用于多核苷酸序列的术语“同一性百分比”和“同一性％”指代使用归一化算法比对的至少两个多核苷酸序列之间的残基匹配的百分比。所述算法可以归一化和可复现方式插入在所比较的序列中的间隙中，以便于使两个序列之间的比对最优化，并且因此实现两条序列的更有意义的比较。同一性百分比可以在整个确定多核苷酸序列的长度上加以测量，或可以在较短长度，例如在取自较大确定多核苷酸序列的片段(例如至少45、至少60、至少90、至少120、至少150、至少210或至少450个连续残基的片段)的长度上加以测量。所述长度仅是示例性的，并且应理解，由本文在表、图或序列表中所示的序列支持的任何片段长度都可以用于描述在其上可以测量同一性百分比的长度。
关于本文鉴别的多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列且必要时引入间隙以实现最大序列同一性百分比，且不将任何保守性取代考虑为序列同一性的一部分之后，查询序列中与第二参考多肽序列或其部分的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于测定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以在本领域技能的范围内的多种方式实现，所述方式例如使用可公开获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定适于测量比对的参数，包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。同一性百分比可以在整个确定的多肽序列的长度上加以测量，或可在较短长度，例如在取自较大确定的多肽序列的片段(例如至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少70或至少150个连续残基的片段)的长度上加以测量。所述长度仅是示例性的，并且应理解，由本文在表、图或序列表中所示的序列支持的任何片段长度都可以用于描述在其上可以测量同一性百分比的长度。
如本文在多肽的情形下所用的术语“非重复性”指代在肽或多肽序列中缺乏内部同源性程度或内部同源性程度有限。术语“大致上非重复”可以意指例如几乎不存在或不存在以下情况：在序列中四个连续氨基酸是相同氨基酸类型；或多肽具有10或更小的子序列计分(下文定义)或以自N末端至C末端的顺序不存在构成多肽序列的序列基序的样式。如本文在多肽的情形下所用的 术语“重复性”指代在肽或多肽序列中的内部同源性的程度。相反，“重复”序列可以含有短氨基酸序列的多个相同拷贝。例如，目标多肽序列可以分成n-mer序列，并且可以对相同序列的数目进行计数。高度重复序列含有大部分相同序列，而非重复序列几乎不含有相同序列。在多肽的情形下，序列可以含有具有确定或可变长度的较短序列或基序的多个拷贝，其中所述基序自身具有非重复序列，从而致使全长多肽大致上是非重复的。测量非重复性所处的多肽的长度可以自3个氨基酸至约200个氨基酸、约自6个氨基酸至约50个氨基酸或自约9个氨基酸至约14个氨基酸变化。在多核苷酸序列的情形下使用的“重复性”指代序列中的内部同源性程度，诸如例如像给定长度的相同核苷酸序列的频率。重复性可以例如通过分析相同序列的频率来测量。
“载体”是将插入的核酸分子转移至宿主细胞中和/或在宿主细胞之间转移插入的核酸分子的核酸分子，优选在适当宿主中自我复制。所述术语包括主要起将DNA或RNA插入细胞中的作用的载体、主要起复制DNA或RNA的作用的载体复制、以及起转录和/或翻译DNA或RNA的作用的表达载体。还包括提供多于一种上述功能的载体。“表达载体”是在引入到适当宿主细胞中时可以转录且翻译成多肽的多核苷酸。“表达系统”通常暗示包含可以起产生所需表达产物的作用的表达载体的适合的宿主细胞。
如应用于多肽的“血清降解抗性”指代多肽能够抵抗在血液或其组分中的降解的能力，所述降解通常涉及血清或血浆中的蛋白酶。血清降解抗性可以通过通常在约37℃下合并蛋白质与人(或视情况小鼠、大鼠、猴)血清或血浆，通常持续一定范围的天数(例如0.25、0.5、1、2、4、8、16天)来测量。这些时间点的样本可以进行蛋白质印迹测定并且用抗体检测蛋白质。抗体可以针对蛋白质中的标签。如果蛋白质在蛋白质印迹上显示单一条带(其中蛋白质的尺寸与注射的蛋白质的尺寸相同)，那么未发生降解。在这个示例性方法中，如通过蛋白质印迹或等效技术判断的50％蛋白质降解所处的时间点是蛋白质的血清降解半衰期或“血清半衰期”。
如本文所用的术语“t1/2”意指计算为ln(2)/Kel的终末半衰期。Kel是通过对数浓度对比时间曲线的终末线性部分的线性回归计算的终末消除速率常数。半衰期通常指代为沉积在活生物体中的一半数量的施用物质由正常生物过程 代谢或消除所需的时间。术语“t1/2”、“终末半衰期”、“消除半衰期”和“循环半衰期”在本文中可互换使用。
“表观分子量因子”或“表观分子量”是关于由特定氨基酸序列展现的表观分子量相对增加或减少的量度的相关术语。表观分子量是使用尺寸排阻色谱(SEC)和类似方法，通过与球状蛋白质标准物进行比较来测定，并且用“表观kD”单位度量。表观分子量因子是表观分子量与实际分子量之比；后者通过基于氨基酸组成在所述组合物中添加计算分子量的每种类型的氨基酸来预测。
“流体动力学半径”或“斯托克斯半径(Stokesradius)”是溶液中分子的有效半径(Rh，以nm计)，其是通过假定穿过溶液移动且受溶液的粘性所抵抗的主体来测量。在本发明的实施方案中，XTEN融合蛋白的流体动力学半径测量结果与作为一种更直观量度的‘表观分子量因子’相关。蛋白质的“流体动力学半径”影响它在水溶液中的扩散速率以及它在大分子的凝胶中迁移的能力。蛋白质的流体动力学半径是通过它的分子量以及通过它的结构(包括形状和紧密性)来测定。用于测定流体动力学半径的方法在本领域中是熟知的，如通过使用如美国专利No.6,406,632和7,294,513中所述的尺寸排阻色谱(SEC)。大多数蛋白质具有球状结构，其是蛋白质具有最小流体动力学半径所具有的最紧密三维结构。一些蛋白质采用随机和开放的非结构化或‘直链’构象，并且因此与具有类似分子量的典型球状蛋白质相比较具有大得多的流体动力学半径。
“生理条件”指代活宿主中的一组条件以及体外条件，包括模拟活受试者的那些条件的温度、盐浓度、pH。已建立用于体外测定的具有生理相关条件的宿主。一般而言，生理缓冲液含有生理浓度的盐并且调节至在约6.5至约7.8、且优选地约7.0至约7.5的范围内的中性pH。多种生理缓冲液列于Sambrook等(1989)中。生理相关温度在约25℃至约38℃、且优选地在约35℃至约37℃的范围内。
“反应性基团”是可以偶联于第二反应性基团的化学结构。反应性基团的实例是氨基、羧基、硫氢基、羟基、醛基、叠氮基。一些反应性基团可以被活化来促进与第二反应性基团偶联。用于活化的非限制性实例是羧基与碳二 亚胺反应、羧基转化成活化的酯或羧基转化成叠氮化物官能团。
“控制释放剂”、“缓慢释放剂”、“贮库制剂(depotformulation)”和“持续释放剂”可互换用于指代相对于在不存在试剂下施用多肽时的释放持续时间，能够延长本发明多肽的释放持续时间的试剂。本发明的不同实施方案可以具有不同的释放速率，从而产生不同的治疗量。
术语“抗原”、“靶标抗原”或“免疫原”在本文中可互换用于指代抗体片段或基于抗体片段的治疗剂与其结合或针对其具有特异性的结构或结合决定簇。
如本文所用的术语“有效负载”指代具有生物或治疗活性的蛋白质或肽序列；即小分子的药效团的对应物。有效负载的实例包括但不限于细胞因子、酶、激素、以及血液和生长因子。有效负载还可以包括遗传融合或化学缀合的部分，如化疗剂、抗病毒化合物、毒素或造影剂。这些缀合部分可以经由接头连接至多肽的其余部分，所述接头可以是可裂解的或不可裂解的。
如本文所用的术语“拮抗剂”包括部分或完全阻断、抑制或中和本文公开的天然多肽的生物活性的任何分子。用于鉴别多肽的拮抗剂的方法可以包括使天然多肽与候选拮抗剂分子接触，并且测量一种或多种通常与天然多肽相关联的生物活性的可检测变化。在本发明的情形下，拮抗剂可以包括蛋白质、核酸、碳水化合物、抗体或降低生物活性蛋白质的作用的任何其它分子。
术语“激动剂”是以广义使用，并且包括模拟本文公开的天然多肽的生物活性的任何分子。合适的激动剂分子具体包括激动剂抗体或抗体片段、天然多肽的片段或氨基酸序列变体、肽、有机小分子等。用于鉴别天然多肽的激动剂的方法可以包括使天然多肽与候选激动剂分子接触，并且测量通常与天然多肽相关联的一种或多种生物活性的可检测变化。
用于本文中目的的“活性”指代融合蛋白的组分的作用或效应，其与对应的天然生物活性蛋白质的作用或效应一致，其中“生物活性”指代体外或体内生物功能或效应，包括但不限于受体结合、拮抗剂活性、激动剂活性或细胞响应或生理学响应。
如本文所用，“治疗”或“减轻”或“改善”在本文中可互换使用。这些术语指代用于获得有益或希望的结果(包括但不限于治疗益处和/或预防益处)的途径。所谓治疗益处意指所治疗的基本病症的根除或改善。此外，治疗益处是通过与基本病症相关联的一种或多种生理症状的根除或改善以使得在所述儿科受试者中观察到改善而实现，尽管所述受试者仍可能被所述基本病症困扰。对于预防益处，可以对有发展成特定疾病风险的儿科受试者或对报告疾病的一种或多种生理症状的儿科受试者(即使可能还未作出该疾病的诊断)施用所述组合物。
如本文所用的“治疗作用”指代生理作用，其包括但不限于治愈、减轻、改善或预防人或其它动物的疾病，或另外增强人或动物的身体或精神良好状态，所述生理作用是由本发明的融合多肽而非诱导产生针对生物活性蛋白质具有的抗原表位的抗体的能力引起的。确定治疗有效量完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其鉴于本文提供的详细公开内容。
如本文所用的术语“治疗有效量”和“治疗有效剂量”指代当以一次或重复剂量向儿科受试者施用时，单独或作为融合蛋白组合物的一部分的生物活性蛋白质能够对疾病病况或病状的任何症状、方面、测量参数或特征产生任何可检测的有益作用的量。所述作用无需是绝对有益的。
“药学上可接受的载体”指代药物组合物中除活性成分以外的成分，它对儿科受试者是无毒的。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文所用的术语“治疗有效剂量方案”指代用于单独或作为融合蛋白组合物的一部分连续施用多次剂量的生物活性蛋白质的时间表，其中所述剂量是以治疗有效量给予以对疾病病况或病状的任何症状、方面、测量参数或特征产生持续的有益作用。
如本文所用的术语“儿科患者”、“儿科受试者”指代非成人的个体。儿科患者包括婴幼儿、儿童以及青少年。在一个实施方案中，儿童是青春前期或青春期前的个体。在另一个实施方案中，所述儿科患者是人患者。
I).一般技术
除非另外指示，否则本发明的实践采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学以及重组DNA的常规技术，所述技术属于本领域的技能。参见Sambrook,J.等，“MolecularCloning:ALaboratoryManual,”第3版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001；“Currentprotocolsinmolecularbiology”,F.M.Ausubel等编著，1987；“MethodsinEnzymology”系列，AcademicPress,SanDiego,CA.；“PCR2:apracticalapproach”,M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编著，OxfordUniversityPress,1995；“Antibodies,alaboratorymanual”Harlow,E.和Lane,D.编著，ColdSpringHarborLaboratory,1988；“Goodman&Gilman’sThePharmacologicalBasisofTherapeutics”，第11版，McGraw-Hill,2005；以及Freshney,R.I.,“CultureofAnimalCells:AManualofBasicTechnique”，第4版，JohnWiley&Sons,Somerset,NJ,2000，这些参考文献的内容以引用的方式整体并入。
II).生长激素
本发明涉及一种用于治疗小儿生长激素缺乏症(PGHD)患者的改进的治疗方案。具体而言，本发明涉及用于以推注剂量向患有PGHD的儿科患者施用hGH-XTEN融合蛋白的方法。因此，在一方面，本发明涉及一种用hGH-XTEN融合蛋白治疗儿科患者的人小儿生长激素缺乏症(PGHD)的方法。
(a)生长激素蛋白质
“生长激素”或“GH”意指生长激素蛋白质及其种类和序列变体，并且包括但不限于人GH的191个单链氨基酸序列。GH可以是天然的全长蛋白质，或可以是保留天然蛋白质的至少一部分生物活性的截短片段或序列变体。有两种已知类型的源自脑垂体的人GH(下文称“hGH”)：一种具有约22,129道尔顿的分子量(22kDhGH)，而另一种具有约20,000道尔顿的分子量(20kDhGH)。20kDHGH具有对应于由191个氨基酸组成的22kDhGH的氨基酸序列，除了22kDhGH的第32位至第46位的15个氨基酸残基缺失以外。一些报道已显示，已经发现20kDhGH表现出比22kDhGH更低的风险和更高的活性。 本发明考虑使用22kD、20kDhGH以及其种类和序列变体和截短片段，因为其适合作为本文公开的XTEN的融合配偶体用于hGH-XTEN组合物。hGH的克隆基因已经在大肠杆菌中以分泌形式表达(美国专利No.4,898,830；Chang,C.N.等，Gene55:189[1987])，并且已经报道了其DNA和氨基酸序列(Goeddel等，Nature,281:544[1979])；Gray等，Gene39:247[1985])。
本发明考虑在hGH-ΧΤΕΝ组合物中包含与GH序列具有同源性的序列，为天然的序列片段(如来自人)，以及保留了GH的至少一部分生物活性或生物学功能和/或可用于预防、治疗、介导或改善GH相关疾病、缺乏症、病症或病状的非天然序列变体。此外，与人GH同源的天然序列可以通过标准同源性搜索技术如NCBIBLAST来发现。
GH对身体组织的影响一般可以被描述为合成代谢的。与大多数其它蛋白质激素类似，天然GH通过与被称为生长激素受体的特异性血浆膜受体相互作用而发挥作用。GH作用于肝和其它组织以刺激IGF-I的产生，所述IGF-I负责GH的生长促进作用并且还反映产生的量。IGF-I继而对成骨细胞和软骨细胞活性具有刺激效应以促进骨生长。在一个实施方案中，本发明提供了一种表现出本文以上描述的天然GH的至少一种性质的hGH-XTEN。
在一个实施方案中，掺入主题组合物中的GH是序列对应于自然界中所见的蛋白质的重组多肽。在另一个实施方案中，所述GH是天然序列的保留对应的天然GH的至少一部分生物活性的序列变体、片段、同源物或模拟物。在一个其它实施方案中，所述GH是包含以下氨基酸序列的人GH：FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF(SEQIDNO:41)。通过在家族之间改组个体突变而构建的、保留了天然GH的至少一部分生物活性的任何人GH序列或同源衍生物可以用于本发明的融合蛋白。可以掺入hGH-ΧΤΕΝ融合蛋白中的GH可以包括表现出与SEQIDNO:41具有至少约80％序列同一性或可替代地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列 同一性的蛋白质。
III).用于治疗PGHD的人生长激素-XTEN融合蛋白组合物
本发明涉及一种用于儿科患者的小儿生长激素缺乏症(PGHD)疗法的改进的治疗方案。具体而言，本发明涉及用于以推注剂量向患有PGHD的儿科患者施用hGH-XTEN融合蛋白的方法。在一方面，适合于本发明使用的hGH融合蛋白包含人生长激素多肽和如本文所述的以及如Schellenberger等，WO10/144502A2和WO10/091122所公开的一个或多个XTEN序列，所述文献以引用的方式整体并入本文。
在一个其它方面，所述hGH-ΧΤΕΝ融合蛋白是GH的经分离的单体融合蛋白，其包含与一个或多个延伸重组多肽(“XTEN”或“XTEN”)共价连接的GH的全长序列或序列变体。在一个实施方案中，所述hGH-ΧΤΕΝ融合蛋白包含图1中所示的氨基酸序列(SEQIDNO:1)或其药理学活性变体。在另一个实施方案中，所述hGH-XTEN融合蛋白包含选自表1的氨基酸序列。
例如，所述hGH-XTEN融合蛋白VRS-317由重组人生长激素(rhGH)和两个被称为XTEN的重组多肽构成，如Schellenberger等，(2009).NatBiotechnol27,1186-90、Schellenberger等，WO10/144502A2和WO10/091122所述，所述文献各自以引用的方式整体并入本文。XTEN结构域，氨基酸的两个非结构化的亲水链，提供了rhGH的半衰期延长。VRS-317的分子量是118.9kDa，其中rhGH贡献了22.1kDa，而其余的质量由XTEN构建体贡献。因此，rhGH与VRS-317的质量比是1:5.37。
表1-示例性hGH-XTEN融合蛋白
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在表1中提供的示例性hGH-XTEN融合蛋白的进一步表征可以见于Schellenberger等，WO10/144502A2的实施例中(例如，实施例27-35)，其以引用的方式整体并入本文。
本发明考虑使用包含图1、表1所示的或如Schellenberger等，WO10/144502A2(其以引用的方式整体并入本文)所述的一种氨基酸序列的hGH-XTEN融合蛋白。另外，还考虑在此描述及提及的任一种hGH-XTEN融合蛋白的药理学活性变体。
如下文更全面描述，所述融合蛋白任选地包括间隔子序列，所述间隔子序列还包含裂解序列以在受蛋白酶作用时从融合蛋白上释放GH，从而使GH从XTEN序列上释放。
在一方面，本发明提供了一种分离的融合蛋白，其包含与一个或多个延伸重组多肽(“XTEN”)共价连接的至少第一生物活性生长激素蛋白质，从而得到生长激素-XTEN融合蛋白组合物(下文称“hGH-XTEN”)。在一个实施方案中，所述生长激素是人生长激素或hGH的序列变体。如下文更全面描述，所述融合蛋白任选地包括间隔子序列，所述间隔子序列还包含裂解序列以在受蛋白酶作用时从融合蛋白上释放GH。
如本文所用的术语“hGH-XTEN”意指涵盖包含有效负载区和至少一个其它区的融合多肽，所述有效负载区包含介导与生长激素相关联的一种或多种生物活性或治疗活性的生物活性GH；所述至少一个其它区包含用作载体的至少第一XTEN多肽。在一个实施方案中，本发明提供了一种包含表1中阐述的序列的hGH-XTEN融合蛋白。
主题组合物的GH以及其对应的核酸和氨基酸序列是本领域熟知的，并且其描述和序列可获自公共数据库如ChemicalAbstractsServicesDatabases(例如，CAS登记)、GenBank、TheUniversalProteinResource(UniProt)以及订购得到的数据库如GenSeq(例如，Derwent)。多核苷酸序列可以是编码给定GH的野生型多核苷酸序列(例如，全长的或成熟的)，或在一些情况下，所述序列可以是野生型多核苷酸序列的变体(例如，编码野生型生物活性蛋白质的 多核苷酸，其中所述多核苷酸的DNA序列已例如针对在特定物种中的表达加以优化；或编码野生型蛋白质的变体(如定点突变体或等位基因变体)的多核苷酸)。完全属于熟练技术人员的能力的是使用本领域已知的方法和/或结合本文提供的以及在Schellenberger等，WO10/144502A2(其以引用的方式整体并入本文)的实施例中更全面描述的指导和方法使用GH的野生型或共有cDNA序列或密码子优化变体来产生本发明所考虑的融合蛋白构建体。
用于包括在本发明hGH-XTEN中的GH包括具有生物学、治疗、预防或诊断意义或功能或者在施用给儿科受试者时可用于介导或预防或改善与生长、生长激素缺乏症或缺陷相关联的疾病、病症或病状的任何生长激素或序列变体。特别感兴趣的是寻求以下这样的hGH-XTEN融合蛋白组合物：与天然GH相比较，其药代动力学参数增加、溶解度增加、稳定性增加或一些其它医药或药效学性质增强，或增加其终末半衰期将改进功效、安全性，或导致给药频率降低和/或改进儿科患者依从性。因此，出于各种目的的考虑而制备所述hGH-XTEN融合蛋白组合物，这些目的包括通过以下方式提高生物活性GH的治疗效力：例如，与未连接至XTEN的GH相比，在施用给儿科受试者时，增加hGH-XTEN保留在治疗窗内的体内暴露或时长。
在一个实施方案中，掺入主题组合物中的GH可以是序列对应于自然界中所见的蛋白质(如人生长激素)的重组多肽。在一个实施方案中，所述GH是包含以下氨基酸序列的人GH：FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF(SEQIDNO:41)。
在另一个实施方案中，所述GH是天然序列的保留天然GH的至少一部分生物活性的序列变体、片段、同源物或模拟物。在非限制性实例中，GH是表现出与SEQIDNO:41的蛋白质序列具有至少约80％序列同一性或可替代地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％或100％序列同一性的序列。在一个实施方案中，所述hGH-XTEN融合蛋白包含与XTEN连接的单个GH 分子(如下文更全面描述)。在另一个实施方案中，所述hGH-XTEN融合蛋白包含与第一XTEN和第二XTEN连接的单个GH分子，具有XTEN-GH-XTEN的N-端至C-端构型，其中所述GH是表现出与人生长激素蛋白质序列(SEQIDNO:41)具有至少约80％序列同一性或可替代地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％或100％序列同一性的序列，并且所述第一XTEN和/或所述第二XTEN是表现出与选自表2的序列具有至少约80％序列同一性或可替代地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％或100％序列同一性的序列。
一般而言，当体内使用或当用于体外测定时，所述hGH-XTEN的GH融合配偶体组分表现出对给定靶标的结合特异性或另一所需的生物学特征。例如，所述hGH-XTEN是一种激动剂，具有结合生长激素的跨膜受体的能力。在一个实施方案中，与天然生长激素相比较，hGH-XTEN与生长受体的结合导致受体二聚体化并导致细胞间信号转导途径的至少一部分活化。在一个实施方案中，与未连接至XTEN的天然生长激素相比较，与生长激素的跨膜受体结合的所述hGH-XTEN将表现出细胞间信号转导途径的至少约1％或约5％或约10％或约15％或约20％或约25％或约30％或约40％或约50％或约60％或约70％或约80％或约90％或至少约95％的活化。
本发明的主题hGH-XTEN表现出一个或多个药代动力学或药效学参数的增强，其任选地通过间隔子序列的裂解导致从融合蛋白上释放GH而得到增强。具有增强的药代动力学参数的所述hGH-XTEN允许较低频率的给药或增强的药理学效应，例如但不限于使生物活性hGH-XTEN维持在最低有效剂量或血液浓度(Cmin)与最大耐受剂量或血液浓度(Cmax)之间的治疗窗内。此外，具有增强的药效学参数的所述hGH-XTEN允许较低的和/或较不频繁的给药或增强的药效学效应，例如但不限于持续的或归一化的IGF-I标准差得分(IGF-ISDS)。在这类情况下，所述GH与包含选定XTEN序列的融合蛋白的连接可以带来这些性质的改善，从而使得它们与未连接至XTEN的GH相比较更可用作治疗剂或预防剂。
IV).XTENDED重组多肽
本发明涉及一种用于PGHD疗法的改进的治疗方案。具体而言，本发明涉及用于以推注剂量向患有PGHD的儿科患者施用人生长激素-XTEN(hGH-XTEN)融合蛋白的方法。因此，在一方面，本发明涉及一种用hGH-XTEN重组多肽或融合蛋白治疗人小儿生长激素缺乏症(PGHD)的方法。
在另一方面，本发明提供了可用作其上连接GH的融合蛋白配偶体的XTEN多肽组合物，从而得到hGH-XTEN融合蛋白。XTEN一般是长度延伸的多肽，具有主要由小的亲水性氨基酸构成的非天然存在的、基本上非重复的序列，其中所述序列在生理条件下具有低程度的二级或三级结构或者不具有二级或三级结构。
XTEN具有作为融合蛋白配偶体的效用，因为它们用作“载体”，当连接至GH蛋白质产生融合蛋白时赋予某些期望的药代动力学、物理化学以及药学性质。这类期望的性质包括但不限于组合物的增强的药代动力学参数和溶解度特征以及本文描述的其它性质。如本文所述，这类融合蛋白组合物可用于治疗某些生长激素相关的疾病、病症或病状。如本文所用的“XTEN”明确排除抗体或抗体片段，如单链抗体，或轻链或重链的Fc片段。
在一些实施方案中，当作为载体使用时或在单个融合蛋白中累积地使用超过一个XTEN单元时，XTEN是具有超过约100至约3000个氨基酸残基、优选地超过400至约3000个残基的长多肽。在其它实施方案中，当用作融合蛋白组分之间的接头时，或在不需要增加融合蛋白的半衰期但希望增加GH融合配偶体组分的溶解度或其它物理/化学性质时，将短于100个氨基酸残基如约96或约84或约72或约60或约48或约36个氨基酸残基的XTEN序列掺入到具有GH的融合蛋白组合物中以实现所述性质。
对于将要连接至用于产生本发明融合蛋白组合物的生物活性蛋白质的XTEN的选择标准通常涉及XTEN的物理/化学性质和构象结构的属性，所述构象结构继而用于赋予融合蛋白增强的药学和药代动力学性质。本发明的XTEN表现出以下有利性质中的一种或多种：构象柔性、增强的水溶解度、 高度的蛋白酶抗性、低免疫原性、与哺乳动物受体的低结合以及增加的流体动力学(或Stokes)半径；使它们特别可用作融合蛋白配偶体的性质。包含GH的融合蛋白被XTEN增强的性质的非限制性实例包括总溶解度和/或代谢稳定性的增加、降低的对蛋白质水解的敏感性、降低的免疫原性、皮下或肌肉内施用时降低的吸收速率、和增强的药代动力学性质如较长的终末半衰期和增加的曲线下面积(AUC)、皮下或肌肉内注射后较慢的吸收(与未连接至XTEN并通过类似途径施用的GH相比较)，以使得Cmax较低，这继而导致GH的副作用降低，这共同导致施用给儿科患者的hGH-XTEN组合物的融合蛋白保持治疗活性的时段增加。
1.非重复序列
在一些实施方案中，所述组合物的XTEN序列是基本上非重复的。一般而言，重复的氨基酸序列具有聚集或形成更高阶结构的倾向，如天然重复序列(如胶原蛋白和亮氨酸拉链)所示例的，或形成接触而导致结晶或假结晶结构。相反，非重复序列的聚集倾向较低使得能够设计带电荷氨基酸的频率相对较低的长序列XTEN，如果序列反而是重复的，那么所述长序列XTEN将可能聚集。通常，所述hGH-XTEN融合蛋白包含大于约100至约3000个氨基酸残基、优选地大于400至约3000个累积残基的XTEN序列，其中所述序列是基本上非重复的。在一个实施方案中，XTEN序列具有大于约100至约3000个氨基酸残基，优选地大于400至约3000个氨基酸残基，其中所述序列中没有三个连续氨基酸是相同的氨基酸类型，除非所述氨基酸是丝氨酸，在这种情况下，不超过三个连续氨基酸是丝氨酸残基。在前述实施方案中，XTEN序列将是基本上非重复的。
多肽或基因的重复性程度通过计算机程序或算法或通过本领域已知的其它手段来测量，包括子序列评分(参见Schellenberger等，WO10/144502A2；Cleland等，U.S.13/829,369；以及Cleland等，WO13/184216的实施例44，所述文献各自以引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，本发明提供分别包含一个或多个XTEN的hGH-XTEN，其中所述XTEN的子序列评分小于12、更优选地小于10、更优选地小于9、更优选地小于8、更优选地小于7、更优选地小于6、且最优选地小于5。在所述段落中以上描述的实施方案 中，子序列评分小于约10(即，9、8、7等)的XTEN是“基本上非重复的”。
与具有重复序列的多肽相比较，XTEN的非重复特征赋予具有GH的融合蛋白更大程度的溶解度和更小的聚集倾向。这些性质有利于配制包含XTEN的药物制剂，所述制剂含有极高的药物浓度，在某些情况下超过100mg/ml。
2.示例性序列基序
本发明涵盖包含多个单元的较短序列或基序的XTEN，其中所述基序的氨基酸序列是非重复的。在设计XTEN序列的过程中发现，尽管使用了利用多聚体化的序列基序文库的“结构单元(buildingblock)”方法来产生XTEN序列，但仍可以满足非重复标准。因此，尽管XTEN序列可以由少至四种不同类型的序列基序的多个单元组成，但因为所述基序自身通常由非重复氨基酸序列组成，所以使得整体XTEN序列是基本上非重复的(参见Schellenberger等，WO10/144502A2；Cleland等，U.S.13/829,369；以及Cleland等，WO13/184216，所述文献各自以引用的方式整体并入本文)。
3.序列的长度
在本发明的另一方面，本发明涵盖hGH-XTEN组合物，其包含具有长度延伸的序列的XTEN多肽的载体。(参见Schellenberger等，WO10/144502A2；Cleland等，U.S.13/829,369；以及Cleland等，PCT/US2013/031673，所述文献各自以引用的方式整体并入本文)。表2中呈现了考虑包括在本发明的hGH-XTEN中XTEN的非限制性实例。在一个实施方案中，本发明提供了hGH-XTEN组合物，其中所述融合蛋白的XTEN序列长度大于约100至约3000个氨基酸残基，并且在一些情况下大于400至约3000个氨基酸残基，其中所述XTEN赋予hGH-XTEN比未连接至XTEN的GH增强的药代动力学性质。在一些实施方案中，本发明的hGH-XTEN组合物的XTEN序列可以是约100或约144或约288或约401或约500或约600或约700或约800或约900或约1000或约1500或约2000或约2500或多达约3000个氨基酸残基的长度。在其它情况下，XTEN序列长度可以是约100至150、约150至250、 约250至400、401至约500、约500至900、约900至1500、约1500至2000或约2000至约3000个氨基酸残基。在一个实施方案中，所述hGH-XTEN可以包含XTEN序列，其中所述序列表现出与选自表2的XTEN具有至少约80％的序列同一性，或可替代地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，通过在编码融合蛋白的基因的XTEN部分中包括优化的N-端前导序列(NTS)的编码核苷酸，所述XTEN序列为了优化的表达而被设计为hGH-XTEN的N-端组分。在另一个实施方案中，表达的hGH-XTEN的N-端XTEN序列与选自表2的任何序列具有至少90％的序列同一性。在一个实施方案中，表达的hGH-XTEN的N-端XTEN序列与AE48或AM48、AE624、AE911、AE912或AM923的序列具有至少90％的序列同一性。
在其它实施方案中，所述hGH-XTEN融合蛋白包含第一XTEN和第二XTEN序列，其中XTEN序列中的残基的累积总数大于约400至约3000个氨基酸残基。在前述实施方案中，所述hGH-XTEN融合蛋白包含第一XTEN和第二XTEN序列，其中所述序列各自表现出与选自表2的至少第一XTEN或另外第二XTEN具有至少约80％的序列同一性，或可替代地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。其中在hGH-XTEN组合物中使用超过一个XTEN的实例包括但不限于具有连接至至少一个GH的N-端以及C-端的XTEN的构建体。
如下文更全面描述，本发明提供了其中通过选择XTEN的长度而将hGH-XTEN设计成赋予向儿科受试者施用的融合蛋白以目标半衰期的方法。一般而言，与较短累积长度相比较，例如短于约280个残基，累积长度长于约400个残基的XTEN掺入hGH-XTEN组合物中导致半衰期变长。然而，在另一个实施方案中，将hGH-XTEN融合蛋白设计成包含具有更长序列长度的XTEN，所述序列长度被选择来另外赋予在皮下或肌肉内施用给儿科受试者之后较慢的全身吸收速率。在此类实施方案中，与相当剂量的未连接至XTEN的GH相比较，Cmax降低，从而有助于将hGH-XTEN保持在组合物的治疗 窗内的能力。因此，除了本文描述的其它物理/化学性质以外，XTEN还赋予施用的hGH-XTEN以贮库(depot)性质。
表2：XTEN多肽
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在hGH-XTEN融合蛋白的XTEN组分的小于100％的氨基酸由4、5或6种类型的选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)以及脯氨酸(P)的氨基酸组成，或小于100％序列由来自表2的XTEN序列组成的那些实施方案中，XTEN的其它氨基酸残基选自任何其它14种天然L-氨基酸，但优先选自亲水性氨基酸以使得XTEN序列含有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％亲水性氨基酸。不是甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)以及脯氨酸(P)的XTEN氨基酸分散在整个XTEN序列中，位于序列基序内或之间，或集中在XTEN序列的一个或多个短列段(shortstretches)中例如以在XTEN组分与hGH组分之间产生接头。在hGH-XTEN的XTEN组分包含除甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)以及脯氨酸(P)以外的氨基酸的所述情况下，优选的是小于约2％或小于约1％氨基酸是疏水性残基，以使所得序列通常缺乏二级结构，例如不具有超过2％α螺旋或2％β折叠，如通过本文公开的方法所确定。在构建XTEN时有利性较小的疏水性残基包括色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸以及甲硫氨酸。另外，人们可以设计XTEN序列以含有小于5％或小于4％或小于3％或小于2％或小于1％或不含有以下氨基酸：半胱氨酸(以避免形成二硫化物和氧化)、甲硫氨酸(以避免氧化)、天冬酰胺和谷氨酰胺(以避免脱酰胺)。因此，在一些实施方案中，hGH-XTEN融合蛋白的除甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)以及脯氨酸(P)之外也包含其它氨基酸的XTEN组分具有促成α螺旋和β折叠的残基小于5％(如通过Chou-Fasman算法所测量)的序列，并且具有至少90％或至 少约95％或更大的无规卷曲形成率(如通过GOR算法所测量)。
4.XTEN区段
在一个实施方案中，本发明提供了一种分离的hGH-XTEN融合蛋白，其中XTEN组分的累积长度大于约100至约3000个氨基酸残基，含有选自表2(和Schellenberger等，WO10/144502A2的表8、9、10、11和12，其以引用的方式整体并入本文)的至少一个多肽序列区段，并且其中XTEN序列其余部分的至少约90％，或至少约91％，或至少约92％，或至少约93％，或至少约94％，或至少约95％，或至少约96％，或至少约97％，或至少约98％或更多总的来说含有亲水性氨基酸，并且XTEN的其余部分的小于约2％由疏水性或芳香族氨基酸或半胱氨酸组成。在一些实施方案中，XTEN含有多个区段，其中所述区段是相同或不同的(参见Schellenberger等，WO10/144502A2；Cleland等，U.S.13/829,369；以及Cleland等，WO13/184216，所述文献各自以引用的方式整体并入本文)。
5.N-端XTEN表达增强序列
在一些实施方案中，本发明提供了一种作为hGH-XTEN融合蛋白的N-端部分而掺入的短长度XTEN序列。在用合适的表达载体转化的宿主细胞中融合蛋白的表达得到增强，所述表达载体包含掺入到编码结合融合蛋白的多核苷酸中的优化的N-端前导多核苷酸序列(其编码N-端XTEN)。已发现，如Schellenberger等，WO10/144502A2(其以引用的方式整体并入本文)的实施例14-17所述，用这种在结合融合蛋白基因中包含优化的N-端前导序列(NTS)的表达载体转化的宿主细胞导致与从不包含NTS的多核苷酸表达对应的融合蛋白相比较大大增强的融合蛋白表达，并且不需要掺入用于增强表达的非XTEN前导序列(参见Schellenberger等，WO10/144502A2；Cleland等，U.S.13/829,369；以及Cleland等，WO13/184216，所述文献各自以引用的方式整体并入本文)。
在一个实施方案中，所述hGH-XTEN的N-端XTEN多肽包含表现出与AE48、AE48.1、AM48或AM48.1的氨基酸序列具有至少约80％、更优选地 至少约90％、更优选地至少约91％、更优选地至少约92％、更优选地至少约93％、更优选地至少约94％、更优选地至少约95％、更优选地至少约96％、更优选地至少约97％、更优选地至少约98％、更优选地至少99％或表现出100％序列同一性的序列，AE48、AE48.1、AM48或AM48.1各自的氨基酸序列如下：
AE48：MAEPAGSPTSTEEGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGASPGTSSTGS(SEQIDNO：13)
AE48.1：AEPAGSPTSTEEGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGASPGTSSTGS(SEQIDNO：36)
AM48：MAEPAGSPTSTEEGASPGTSSTGSPGSSTPSGATGSPGSSTPSGATGS(SEQIDNO：14)
AM48.1：AEPAGSPTSTEEGASPGTSSTGSPGSSTPSGATGSPGSSTPSGATGS(SEQIDNO：37)
在另一个实施方案中，所述hGH-XTEN的N-端XTEN多肽包含表现出与AE48、AM48或AE912具有如本文所述的至少90％同一性的序列，其中不存在N-端M残基(例如，AE48.1-SEQIDNO:36；AM48.1-SEQIDNO:37；以及AE912.1-SEQIDNO:38)。在另外的实施方案中，所述hGH-XTEN的C-端XTEN多肽包含表现出与AE146具有如本文所述的至少90％同一性的序列(例如，AE146-SEQIDNO:35；或AE146.1-SEQIDNO:40)。
在另一个实施方案中，短长度的N-端XTEN连接至较长长度的XTEN以形成hGH-XTEN融合蛋白的N-端区，其中编码所述短长度N-端XTEN的多核苷酸序列赋予在宿主细胞中表达增强的性质，并且其中表达的XTEN的长的长度促进XTEN载体在融合蛋白中增强的性质，如上所述。在一些实施方案中，具有长的长度的N-端XTEN多肽表现出与选自由序列AE624、AE911、AE912和AM923组成的组的氨基酸序列的具有至少约80％或至少约90％或至少约91％或至少约92％或至少约93％或至少约94％或至少约95％或至少约96％或至少约97％或至少约98％或至少99％或表现出100％的序列同一性。
6.净电荷
在其它实施方案中，XTEN多肽具有通过掺入具有净电荷的氨基酸残基 和/或降低XTEN序列中疏水性氨基酸的比例而赋予的非结构化特征。总的净电荷和净电荷密度通过修改XTEN序列中带电氨基酸的含量来控制。在一些实施方案中，组合物的XTEN的净电荷密度可以高于+0.1或低于-0.1电荷/残基。在其它实施方案中，XTEN的净电荷可以是约0％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％或约20％或更多(参见Schellenberger等，WO10/144502A2；Cleland等，U.S.13/829,369；以及Cleland等，PCT/US2013/031673，所述文献各自以引用的方式整体并入本文)。
7.低免疫原性
在另一方面，本发明提供了其中XTEN序列具有低程度的免疫原性或基本上无免疫原性的组合物。若干因素可以促成XTEN的低免疫原性，例如，非重复序列、非结构化构象、高度溶解性、低程度自聚集或缺乏自聚集、序列内低程度蛋白水解位点或缺乏蛋白水解位点、以及XTEN序列中低程度表位或缺乏表位(参见Schellenberger等，WO10/144502A2；Cleland等，U.S.13/829,369；以及Cleland等，PCT/US2013/031673，所述文献各自以引用的方式整体并入本文)。
8.增加的流体动力学半径
在另一方面，本发明提供了XTEN，其中所述XTEN多肽具有高流体动力学半径，这使得掺入XTEN的hGH-XTEN融合蛋白具有对应的增加的表观分子量。如Schellenberger等，WO10/144502A2的实施例37中所详述，XTEN与GH序列的连接产生了hGH-XTEN组合物，与未连接至XTEN的GH相比较，所述组合物可以具有增加的流体动力学半径、增加的表观分子量以及增加的表观分子量因子(参见Schellenberger等，WO10/144502A2；Cleland等，U.S.13/829,369以及Cleland等，WO13/184216，所述文献各自以引用的方式整体并入本文)。
V).hGH-XTEN结构构型和性质
主题组合物的人生长激素(GH)不限于天然的全长多肽，还包括其重组型式以及生物和/或药理学活性的变体或片段。例如，将理解，可以在GH中进行各种氨基酸缺失、插入和取代以产生变体，而在GH的生物活性或药理学性质方面不脱离本发明的精神。表3中示出了多肽序列中的氨基酸的保守性取代的实例。然而，在与本文公开的特定序列相比较，GH的序列同一性小于100％的hGH-XTEN的实施方案中，本发明涵盖用其它19种天然L-氨基酸的任一者取代给定GH的可以处在GH序列内任何位置处的给定氨基酸残基，包括邻近氨基酸残基。如果任何一个取代导致不期望的生物活性的变化，则可以采用一种可替代的氨基酸，并且通过本文描述的方法或使用例如美国专利No.5,364,934(其内容以引用的方式整体并入)中阐述的关于保守和非保守突变的任何技术和指导或使用本领域公知的方法来评价构建体。此外，变体可以包括例如以下这样的多肽：在GH的全长天然氨基酸序列的N-端或C-端添加或缺失一个或多个氨基酸残基，所述GH保留天然肽的一些(如果不是全部)生物活性。
表3：示例性保守性氨基酸取代
原始残基示例性取代
Ala(A)val；leu；ile
Arg(R)lys；gin；asn
Asn(N)gin；his；Iys；arg
Asp(D)glu
Cys(C)ser
Gln(Q)asn
Glu(E)asp
Gly(G)pro
His(H)asn:gin:Iys:arg
xIle(I)leu；val；met；ala；phe:正亮氨酸
Leu(L)正亮氨酸:ile:val；met；ala:phe
Lys(K)arg:gin:asn
Met(M)leu；phe；ile
Phe(F)leu:val:ile；ala
Pro(P)gly
Ser(S)thr
Thr(T)ser
Trp(W)tyr
Tyr(Y)trp:phe:thr:ser
Val(V)ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸
(a)融合蛋白构型
本发明提供了具有以特定的N-端至C-端构型连接的GH和XTEN组分的融合蛋白组合物。在一些实施方案中，在使用或不使用间隔子的情况下，一个或多个GH在N-端或C-端连接至一个或多个XTEN，以形成嵌段共聚物，并且融合蛋白中GH和XTEN的顺序排列与嵌段共聚物化学中已知的构型相同。当存在超过一个GH、XTEN或间隔子时，GH、XTEN或间隔子中的每一个具有相同或不同的序列，并且GH和/或XTEN连续或交替地(规则或不规则)连接。因此，在本文提供的所有式中，当存在超过一个GH、XTEN或间隔子时，GH、XTEN和间隔子中的每一个相同或不同。在一些实施方案中，所述融合蛋白是具有与一个XTEN多肽连接的GH的单体融合蛋白。在其它实施方案中，所述融合蛋白是具有与两个或更多个XTEN多肽连接的GH的单体融合蛋白。在其它实施方案中，所述融合蛋白是具有与一个XTEN多肽连接的两个或更多个GH的单体融合蛋白。在其它实施方案中，所述融合蛋白是具有与两个或更多个XTEN多肽连接的两个或更多个GH的单体融合蛋白。表4提供了本发明所涵盖的构型的非限制性实例；许多其它变化对于普通技术人员而言是明显的，包括本文公开或本领域已知的间隔子和裂解序列的掺入。
表4：hGH-XTEN构型
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*对于1个组分表示为单个，或者对于2个或更多个所述组分表示为多个**反映生长因子和XTEN组分的N-端至C-端构型
本发明考虑处于表4中所示的构型并且保留未连接至XTEN的对应GH 的至少一部分生物活性的融合蛋白组合物。在其它实施方案中，如下文更全面描述，所述GH组分在其通过掺入hGH-XTEN的间隔子序列内的任选裂解序列的裂解而从XTEN上释放时变得具有生物活性或活性增加。
在hGH-XTEN组合物的一个实施方案中，本发明提供了一种式I的融合蛋白：
(XTEN)x-GH-(XTEN)yI
其中每次出现时独立地，GH是人生长激素；x是0或1，且y是0或1，其中x+y>1；并且XTEN是延伸重组多肽。
在hGH-XTEN组合物的另一个实施方案中，本发明提供了一种式II的融合蛋白：
(XTEN)x-(GH)-(S)y-(XTEN)yII
其中每次出现时独立地，GH是人生长激素；S是具有1至约50个氨基酸残基的间隔子序列，其可以任选地包括裂解序列；x是0或1，且y是0或1，其中x+y>1；并且XTEN是延伸重组多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有式III：
(GH)-(S)x-(XTEN)-(S)y-(GH)-(S)z-(XTEN)zIII
其中每次出现时独立地，GH是人生长激素；S是具有1至约50个氨基酸残基的间隔子序列，其可以任选地包括裂解序列；x是0或1；y是0或1；z是0或1；并且XTEN是延伸重组多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有式IV：
(XTEN)x-(S)y-(GH)-(S)z-(XTEN)-(GH)IV
其中每次出现时独立地，GH是人生长激素；S是具有1至约50个氨基 酸残基的间隔子序列，其可以任选地包括裂解序列；x是0或1；y是0或1；z是0或1；并且XTEN是延伸重组多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有式V：
(GH)x-(S)x-(GH)-(S)y-(XTEN)V
其中每次出现时独立地，GH是生长激素；S是具有1至约50个氨基酸残基的间隔子序列，其可以任选地包括裂解序列；x是0或1；y是0或1；并且XTEN是延伸重组多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有式VI：
(XTEN)-(S)x-(GH)-(S)y-(GH)VI
其中每次出现时独立地，GH是生长激素；S是具有1至约50个氨基酸残基的间隔子序列，其可以任选地包括裂解序列；x是0或1；y是0或1；并且XTEN是延伸重组多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有式VII：
(XTEN)-(S)x-(GH)-(S)y-(GH)-(XTEN)VII
其中每次出现时独立地，GH是生长激素；S是具有1至约50个氨基酸残基的间隔子序列，其可以任选地包括裂解序列；x是0或1；y是0或1；并且XTEN是延伸重组多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有式VIII：
((S)m-(GH)x-(S)n-(XYEN)y-(S)o)tVIII
其中t是大于0的整数(1、2、3等)；m、n、o、x和y各自独立地是整数(0、1、2、3等)，GH是生长激素；S是间隔子，任选地包含裂解位点；并且XTEN是延伸重组多肽，条件是：(1)x+y>l，(2)当t＝1时，x>0且y>0，(3)当存在超过一个GH、S或XTEN时，每个GH、XTEN或S是相同的或独立地是不同的；并且(4)当t>l时，每个亚单位中的每个m、n、o、x或y是相同的或独立地是不同的。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有式IX：
(XTEN)x-(S)x-(GH)-(S)y-(XTEN)yIX
其中每次出现时独立地，GH是人生长激素；S是具有1至约50个氨基酸残基的间隔子序列，其可以任选地包括裂解序列；x是0或1，且y是0或1，其中x+y>1；并且XTEN是延伸重组多肽。
任何间隔子序列基团在本发明涵盖的融合蛋白中都是任选的。提供间隔子是为了增强融合蛋白从宿主细胞的表达或降低空间位阻，以使得GH组分可以采取其所需的三级结构和/或适当地与其靶受体相互作用。关于间隔子和鉴别所需间隔子的方法，参见，例如George等，(2003)ProteinEngineering15:871–879，所述文献明确地以引用的方式并入本文。在一个实施方案中，间隔子包含一种或多种长度在1–50个氨基酸残基或约1–25个残基或长度约1-10个残基之间的肽序列。除去裂解位点，间隔子序列可以包含20种天然L氨基酸的任何一种，并且将优选地包含无空间位阻的亲水性氨基酸，所述亲水性氨基酸可以包括但不限于甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)以及脯氨酸(P)。在一些情况下，所述间隔子可以是多聚甘氨酸或多聚丙氨酸，或者主要是甘氨酸和丙氨酸残基的组合的混合物。除去裂解序列，间隔子多肽大部分基本上缺乏二级结构；例如，通过Chou-Fasman和/或GOR算法测定，为小于约10％或小于约5％。在一个实施方案中，hGH-XTEN融合蛋白组合物中的一个或两个间隔子序列各自还含有相同或不同的裂解序列，其中所述裂解序列可以受蛋白酶作用而从融合蛋白上释放GH。
在一个实施方案中，掺入hGH-XTEN融合蛋白中的GH具有以下序列：所述序列表现出与SEQIDNO:41所示的序列具有至少约80％的序列同一性，可替代地与SEQIDNO:41的序列相比较具有至少约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％、或约100％的序列同一性。前述实施方案的GH可以使用如本文所述的测定或测量的或测定的参数来评价活性，并且与对应的天然GH序列相比较保留至少约40％、或约50％、或约55％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％或约95％或更多活性的那些序列将被认为适合于包括在主题hGH-XTEN中。发现保留适当水平的活性的GH可以连接至上文描述的一个或多个XTEN多肽。在一个实施方案中，发现保留适当水平的活性的GH可以连接至与表3序列具有至少约80％序列同一性，可替代地与表3序列相比较具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％序列同一性的一个或多个XTEN多肽，从而得到嵌合的融合蛋白。
含有与单个XTEN连接的单个GH的融合蛋白的序列的非限制性实例呈现于Schellenberger等，WO10/144502A2(其以引用的方式整体并入本文)的表35中。在一个实施方案中，hGH-XTEN组合物将包含以下这样的融合蛋白：所述融合蛋白与Schellenberger，WO10/144502A2(其以引用的方式整体并入本文)的表35中的hGH-XTEN具有至少约80％的序列同一性，可替代地与Schellenberger等，WO10/144502A2(其以引用的方式整体并入本文)的表35中的hGH-XTEN相比较具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％的序列同一性。含有与一个或多个GH连接的两个XTEN分子的融合蛋白的序列的非限制性实例呈现于Schellenberger等，WO10/144502A2(其以引用的方式整体并入本文)的表36中，但是本发明还考虑用连接至一个或两个XTEN的、表现出与SEQIDNO:41的序列具有至少约90％序列同一性的序列取代其它GH，所述XTEN可以是相同的或不同的，表现出与选自表2的序列具有至少约90％的序列同一性。包含GH、XTEN以及间隔子氨基酸的 hGH-XTEN的非限制性实例呈现于Schellenberger等，WO10/144502A2(其以引用的方式整体并入本文)的表37中。(还参见Schellenberger等，WO10/144502A2；Cleland等，U.S.13/829,369；以及Cleland等，WO13/184216，所述文献各自以引用的方式整体并入本文)。
VI).本发明组合物的用途
身体生长中涉及的大多数过程受多种肽和激素的调节，并且此类肽和激素及其类似物已经用于治疗生长激素相关的疾病、病症以及病状。然而，可商购的生长激素在治疗儿科患者中的使用在控制罹患此类疾病、病症以及病状的儿科患者中未达到最佳成功。特别是，剂量优化和给药频率对于在治疗儿科患者的生长激素相关疾病和病症中使用的肽和激素生物制剂而言是重要的。生长激素具有短半衰期(例如，当皮下给药时通常短于4小时)这一事实需要频繁(例如每日)给药以实现临床益处，这导致在此类儿科患者的管理中的困难。不依从每日生长激素(GH)注射会导致治疗效果的丧失。
当与重组hGH(rhGH)的当前治疗方案相比较时，hGH-XTEN融合蛋白对儿科PGHD患者的益处可以包括注射数目和频率的显著降低。例如，在临床试验的2a期阶段(参见实施例2)，儿科PGHD患者将接受与rhGH的180次总注射(这些患者按每日rhGH疗法在6个月内将接受的)相比较，比经受每日rhGH疗法的儿科患者在相同时间段内将接受的注射显著减少的hGH-XTEN融合蛋白的总注射(例如，共6次注射，每月一次，持续6个月)。在当前临床实践中用rhGH进行频繁注射常常会导致缺乏依从性。为了实现正常生长的全部潜力，每日疗法的依从性是相当重要的(Rosenfeld,R.G.&Bakker,B.(2008).EndocrPract14,143-54；Desrosiers,P.等，(2005).PediatrEndocrinolRev2增刊3,327-31)。hGH-XTEN融合蛋白有望向患有PGHD的儿童提供非每日(例如，每半周(bi-weekly)、每周、每两周、每三周或每月)施用的优点，并且提供当前每日注射的安全的替代方案。施用频率低于每日rhGH疗法的hGH产品可以提供更大的依从性，以及因此向PGHD儿童提供更佳的长期的治疗效果。
在一方面，本发明提供了一种用于在人类儿科类患者中对GH介导的疾 病、病症或病状(包括但不限于生长激素缺乏症)实现有益效果的方法。在另一方面，本发明提供了一种用于在儿科患者中对GH介导的疾病、病症或病状(包括但不限于生长激素缺乏症)实现有益效果的方法。有益效果包括但不限于治疗、介导或改善GH-相关的疾病、缺乏症、病症或病状。本发明解决了GH具有相对较短的终末半衰期和/或窄治疗窗的缺点和/或限制。
1.小儿生长激素缺乏症(PGHD)
如本文所用的“小儿生长激素缺乏症”或“PGHD”指代将会受益于生长激素治疗的人小儿患者的疾病、缺乏症、病症或病状。PGHD包括基于GH缺乏的来源而分类的病症(例如，垂体PGHD、下丘脑PGHD、功能性PGHD以及特发性PGHD)。垂体或“典型的”PGHD是垂体不能产生生长激素。“下丘脑PGHD”是下丘脑无法产生和/或传输神经内分泌信息传递激素(neuroendocrinemessaginghormone)、生长激素释放激素(GHRH)，所述激素引导功能正常的垂体产生GH；“功能性PGHD”是其它激素的失效以及与垂体无法产生、吸收和/或利用GH有关的代谢功能的失效。PGHD还包括但不限于特发性身材矮小症、特纳综合征(Turner'ssyndrome)、普拉德-威利综合征(Prader-Willisyndrome)、小于胎龄儿(SGA)、含身材矮小症同源盒的基因的缺乏导致的生长障碍(SHOX缺乏症)；以及慢性肾病(CKD)。PGHD可以是先天的或后天的。
PGHD发病的原因还可能是子宫内生长迟缓、先天垂体功能减退或后天垂体功能减退(包括由肿瘤例如颅咽管瘤引起的垂体功能减退)；小于胎龄儿、脑垂体之内或附近的发育缺陷；关于GH的产生的遗传问题；普拉德-威利综合征；特纳综合征；特发性身材矮小症；子宫内生长迟缓；面部中线缺陷(midlinefacialdefect)；以及由于肿瘤、感染、放射治疗或严重头部伤害而对脑垂体或周围区域造成的损伤。
PGHD可以基于GH缺乏症变得明显的生命阶段来分类。例如，青少年可能患有为童年期发病PGHD(包括童年发病PGHD和童年发病特发性PGHD)的延续的PGHD，所述童年期发病PGHD起始于婴幼儿或青春期前儿童。上文提供了童年期发病PGHD的病因。作为青春期前儿童幸存于脑肿瘤 的青少年可能处在因手术、头颅放疗或化疗的影响而发展成PGHD的风险中。可以在青少年时发展成PGHD，即，童年期发病PGHD，所述青少年作为青春期前儿童并未被诊断为是GH-缺乏。PGHD可能是脑垂体的损伤或创伤引起的。所述损伤通常由肿瘤引起(例如，脑垂体之中和/或周围的肿瘤；或下丘脑中的肿瘤)。垂体肿瘤会压迫腺体，或当通过神经外科移除肿瘤时可能发生损伤。感染、血管疾病、严重头部伤害或用于治疗头颈部肿瘤的头颅放疗或化疗也会对垂体造成损伤。PGHD可由以下原因引起：发生在儿童或青少年中，在其出生或出生后不久发生的创伤；中枢神经系统感染；下丘脑或脑垂体的肿瘤；浸润性或肉芽肿性疾病；颅脑照射；手术；或特发性原因。
2.hGH-XTEN推注剂量和给药方案
在一方面，本发明提供了一种通过向患者施用人生长激素-XTEN(hGH-XTEN)融合蛋白来治疗人小儿患者的人小儿生长激素缺乏症(PGHD)的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向儿科患者施用作为推注剂量的hGH-XTEN融合蛋白。在另一个实施方案中，所述推注剂量是治疗有效的根据体重调整的推注剂量。在一个其它实施方案中，所述推注剂量是在约0.8mg/kg与约6.3mg/kg之间。在一个实施方案中，所述融合蛋白包含与SEQIDNO:1具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述融合蛋白包含与SEQIDNO:1具有至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述融合蛋白包含具有SEQIDNO:1的序列的氨基酸序列。
在一方面，所述推注剂量可以在一个剂量范围上施用。应注意，在提及施用约第一mg/kg与约第二mg/kg之间的推注剂量的情况下，“第一mg/kg”术语可以包括第一mg/kg值，并且“第二mg/kg”术语可以包括第二mg/kg值。
在一个实施方案中，所述hGH-XTEN融合蛋白包含(i)与SEQIDNO:1具有至少约90％的序列同一性的氨基酸序列；(ii)SEQIDNO:1的氨基酸序列；(iii)与SEQIDNO:4具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列(AE912-hGH)；(iv)SEQIDNO:4的氨基酸序列(AE912-hGH)；(v)与SEQIDNO:38具有至少 约90％序列同一性的氨基酸序列；或(vi)SEQIDNO:38的氨基酸序列。
在一个其它方面，在合适的一段时间内定期向人类儿科患者施用所述hGH-XTEN融合蛋白的推注剂量，所述段时间可以是有限的或无限的。在一个实施方案中，所述推注剂量是每周、每两周、每三周或每月施用。在其它实施方案中，所述推注剂量是每月一次、每月两次、每月三次或每月四次施用。在另一个实施方案中，所述推注剂量是约每7天、约每10天、约每14天、约每21天、约每28天或约每30天施用。在一个实施方案中，所述推注剂量并非每日施用，或者是非每日的推注剂量。
在另外的方面，所述hGH-XTEN融合蛋白的所述推注剂量是以以下剂量向人类儿科患者施用：(i)约1.0mg/kg与约6.3mg/kg之间；(ii)约1.0mg/kg与约1.5mg/kg之间；(iii)约2.0mg/kg与约3mg/kg之间，或(iv)约4.5mg/kg与约5.5mg/kg之间，其中所述剂量每月、每半个月或每周施用。在一个实施方案中，所述融合蛋白是以以下剂量施用：约1.0mg/kg、约1.05mg/kg、约1.10mg/kg、约1.15mg/kg、约1.20mg/kg、约1.25mg/kg、约1.30mg/kg、约1.35mg/kg、约1.40mg/kg、约1.45mg/kg以及约1.50mg/kg，其中所述剂量每月、每半个月或每周施用。在另一个实施方案中，所述融合蛋白是以以下剂量施用：约2.0mg/kg、约2.10mg/kg、约2.20mg/kg、约2.30mg/kg、约2.40mg/kg、约2.50mg/kg、约2.60mg/kg、约2.70mg/kg、约2.80mg/kg、约2.90mg/kg以及约3.0mg/kg，其中所述剂量每月、每半个月或每周施用。在一个其它实施方案中，所述融合蛋白是以以下剂量施用：约4.50mg/kg、约4.60mg/kg、约4.70mg/kg、约4.80mg/kg、约4.90mg/kg、约5.0mg/kg、约5.10mg/kg、约5.20mg/kg、约5.30mg/kg、约5.40mg/kg、约5.50mg/kg、约6.0mg/kg以及约6.3mg/kg，其中所述剂量每月、每半个月或每周施用。在优选的实施方案中，所述融合蛋白(i)以约1.15mg/kg的剂量每周施用；(ii)以约2.5mg/kg的剂量每月施用；和/或(iii)以约5.0mg/kg的剂量每月施用。
在另一个实施方案中，所述融合蛋白是以以下剂量施用：约0.8mg/kg、约0.9mg/kg、1.60mg/kg、约1.70mg/kg、约1.80mg/kg、约1.90mg/kg、约3.10mg/kg、约3.20mg/kg、约3.30mg/kg、约3.40mg/kg、约3.50mg/kg、约3.60mg/kg、约3.70mg/kg、约3.80mg/kg、约3.9mg/kg、约4.0mg/kg、 约4.10mg/kg、约4.20mg/kg、约4.30mg/kg、约4.40mg/kg、约5.60mg/kg、约5.70mg/kg、约5.80mg/kg以及约5.90mg/kg，其中所述剂量每月、每半个月或每周施用。
在另一方面，用于人类儿科患者的所述hGH-XTEN融合蛋白的另外的推注剂量和推注剂量的范围是合适的。在一个实施方案中，所述hGH-XTEN推注剂量是
(i)约0.8mg/kg与约1.2mg/kg、约1.2mg/kg与约1.8mg/kg、约1.8mg/kg与约2.7mg/kg、约2.7mg/kg与约4mg/kg、约4mg/kg与约6mg/kg、约0.8mg/kg与约1.8mg/kg、约0.8mg/kg与约2.7mg/kg或约0.8mg/kg与约4mg/kg之间；
(ii)约1.2mg/kg与约1.8mg/kg、约1.2mg/kg与约2.7mg/kg、约1.2mg/kg与约4mg/kg或约1.2mg/kg与约6.3mg/kg之间；
(iii)约1.8mg/kg与约2.7mg/kg、约1.8mg/kg与约4mg/kg或约1.8mg/kg与约6mg/kg之间；
(iv)约2.7mg/kg与约4mg/kg、约2.7mg/kg与约6mg/kg之间；或
(v)约4mg/kg与约6mg/kg之间。
在另一个实施方案中，所述hGH-XTEN推注剂量选自由以下各项组成的组：约0.8mg/kg、约1.0mg/kg、约1.2mg/kg、约1.4mg/kg、约1.6mg/kg、约1.8mg/kg、约2.0mg/kg、约2.2mg/kg、约2.4mg/kg、约2.6mg/kg、约2.7mg/kg、约2.8mg/kg、约3mg/kg、约3.2mg/kg、约3.4mg/kg、约3.6mg/kg、约3.8mg/kg、约4mg/kg、约4.2mg/kg、约4.4mg/kg、约4.6mg/kg、约4.8mg/kg、约5mg/kg、约5.2mg/kg、约5.4mg/kg、约5.6mg/kg、约5.8mg/kg、约6mg/kg以及约6.3mg/kg。
在一个实施方案中，所述方法包括向患有PGHD的人类儿科患者施用至少两个推注剂量的人生长激素hGH-XTEN融合蛋白，其中所述施用间隔开：至少约7天、至少约10天、至少约14天、至少约21天、至少约28天或至 少约30天。在一个其它实施方案中，所述推注剂量是治疗有效的根据体重调整的推注剂量(如本文所述)。在一个其它实施方案中，所述施用步骤包括施用包含有效量的hGH-XTEN融合蛋白的药物组合物，所述hGH-XTEN融合蛋白包含图1中阐述的氨基酸序列(SEQIDNO:1)。在另一个实施方案中，本文所述的方法包括使用与如图1中阐述的序列(SEQIDNO:1)具有至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％序列同一性的融合蛋白。
在另一个实施方案中，推注剂量的施用间隔开：至少约1个月、至少约31天、至少约30天、至少约29天、至少约28天、至少约27天、至少约26天、至少约25天、至少约24天、至少约23天、至少约22天、至少约21天、至少约20天、至少约19天、至少约18天、至少约17天、至少约16天、至少约15天、至少约14天、至少约13天、至少约12天、至少约11天、至少约10天、至少约9天、至少约8天、至少约7天、至少约6天、至少约5天、至少约4天、至少约3天或至少约2天。
在另一个实施方案中，向人类儿科患者皮下施用治疗有效的根据体重调整的hGH-XTEN融合蛋白的推注剂量。
一般而言，“推注剂量”是一个短时间段内施用的剂量。在另一个实施方案中，所述推注剂量是在约1至约30分钟、约1至约20分钟、约1至约15分钟、约1至约10分钟或约1至约5分钟内施用。在一个实施方案中，所述推注剂量是在约1至约5分钟内施用。在一个其它实施方案中，所述推注剂量是皮下推注剂量。
本发明提供了用于确定本发明用于人类儿科患者的hGH-XTEN药物组合物的剂量方案的方法。所述方法包括使用剂量之间的可变时间段施用连续多剂治疗有效量的hGH-XTEN组合物，以确定足以实现和/或维持所需参数、血液水平或临床作用的给药间隔；在有效间隔下的所述连续多剂治疗有效量确定hGH-XTEN用于PGHD病状的治疗有效剂量方案。因此，在一方面，本发明提供了一种对人生长激素缺乏症(PGHD)治疗有效的治疗方案中使用的hGH-XTEN组合物。
在另一方面，本发明提供了一种在用于人小儿生长激素缺乏症(PGHD)的治疗方案中使用的hGH-XTEN融合蛋白，所述方案包括向人小儿患者施用hGH-XTEN融合蛋白。在一个实施方案中，所述治疗方案包括在某些时间间隔(如本文所述)向人类儿科患者施用hGH-XTEN融合蛋白的推注剂量(如本文所述)。在一个另外的实施方案中，所述治疗方案包括皮下施用所述hGH-XTEN推注剂量。在一个实施方案中，所述方案包括间隔开适当的时间间隔(如本文所述)向人类儿科患者施用hGH-XTEN融合蛋白的至少两个推注剂量(如本文所述)。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种连续给药方案，其中所述hGH-XTEN的每个推注剂量每周(everyweek)(或每周(weekly))、每两周、每三周、每四周或每月施用。
在治疗方案中使用的hGH-XTEN组合物的一个实施方案中，所述hGH-XTEN融合蛋白包含如图1中阐述示出的氨基酸序列(SEQIDNO:1)。在一个实施方案中，所述治疗有效剂量治疗方案包括向儿科受试者施用至少两个治疗有效的根据体重调整的推注剂量，其中皮下施用所述剂量。
3.hGH-XTEN与rhGH等效
在另一方面，本发明提供了用治疗有效量的作为推注剂量的hGH-XTEN融合蛋白治疗儿科患者的人生长激素缺乏症(PGHD)的方法，所述治疗有效量的hGH-XTEN融合蛋白等同于或等同于小于每日施用的对应的hGH(未连接至XTEN)的有效量。在一个实施方案中，所述融合蛋白的所述推注剂量等于以下量：小于约4.8μghGH/kg/天与约37μghGH/kg/天之间的量；或小于或等于约4.8μghGH/kg/天、约7.4μghGH/kg/天、约11.1μghGH/kg/天、约16.7μghGH/kg/天、约24.7μghGH/kg/天或约37μghGH/kg/天的量。适宜的平均儿科rhGH每日剂量是40μghGH/kg/天至43μghGH/kg/天。在另一个实施方案中，所述推注剂量是治疗有效的根据体重调整的所述hGH-XTEN融合蛋白的推注剂量。
在一个另外的方面，本发明提供了治疗人小儿生长激素缺乏症(PGHD) 的方法，其包括向患有PGHD的人小儿患者施用剂量低于或小于重组hGH的等效每日剂量(例如，rhGH的推荐的每日剂量)的hGH-ΧΤΕΝ融合蛋白。
在另一个实施方案中，所述推注剂量的施用间隔开至少约7天、至少约10天、至少约14天、至少约21天、至少约28天、至少约30天或至少约1个月。
在一个实施方案中，所述hGH-XTEN推注剂量等同于小于约43μghGH/kg/天的hGH/kg/天剂量。在另一个实施方案中，所述hGH-XTEN推注剂量等同于小于约40μghGH/kg/天的hGH/kg/天剂量。在另一个实施方案中，所述hGH-XTEN的剂量等同于小于约39μghGH/kg/天、约38μghGH/kg/天、约36μghGH/kg/天、约34μghGH/kg/天、约32μghGH/kg/天、约30μghGH/kg/天、约28μghGH/kg/天、约26μghGH/kg/天、约25μghGH/kg/天、约24μghGH/kg/天、约22μghGH/kg/天、约20μghGH/kg/天、约18μghGH/kg/天、约17μghGH/kg/天、约16μghGH/kg/天、约14μghGH/kg/天、约12μghGH/kg/天、约11μghGH/kg/天、约8μghGH/kg/天、约7μghGH/kg/天、约6μghGH/kg/天、约5μghGH/kg/天、约4μghGH/kg/天或约2μghGH/kg/天。
在一个其它实施方案中，所述hGH-XTEN推注剂量等于或小于约7天、约14天、约21天、约28天或约30天内施用的累计等效的hGH/kg/天剂量。
在另一个实施方案中，所述hGH-XTEN融合蛋白包含如图1中阐述示出的氨基酸序列(SEQIDNO:1)。在其它实施方案中，所述施用是皮下施用。
在一方面，可以在等同于小于hGH/kg/天剂量的剂量范围上施用所述hGH-XTEN推注剂量。应注意，在提到等同于小于第一μghGH/kg/天与约第二μghGH/kg/天之间的hGH/kg/天剂量的推注剂量时，术语“第一μghGH/kg/天”可以包括第一μghGH/kg/天的值，而术语“第二μghGH/kg/天”可以包括第二μghGH/kg/天的值。
4.hGH-XTEN和IGF-I水平
本发明的方法相对于用hGH-XTEN融合蛋白治疗之后人小儿患者体内所 得IGF-I水平而言是有利的。高水平的血液IGF-I是不希望的，因为高IGF-I被认为是癌症的危险因素(Svensson等，JClinEndocrinMetab.电子出版，2012年9月26日，doi:10.1210/jc.2012-2329)。人体内的IGF-I产生主要归因于GH信号传导，并且IGF-I是GH疗法期间观察到的合成代谢作用的重要介导物(LeRoith等，(2001).EndocrRev22,53-74)。因此，IGF-I是hGH-XTEN融合蛋白生物活性的重要的药效学标记物。在实践中，在年龄和性别特异性标准数据方面解释了对GH(例如，每日rhGH疗法)的IGF-I响应(Vance等，(1999).NEnglJMed341,1206-16；Molitch等，(2011).JClinEndocrinolMetab96,1587-609)。在使用IGF-I标准差得分(IGF-ISDS)的情况下最容易进行解释。另外，患有GH缺乏症的儿科患者以及健康个体具有基线IGF-I值的范围。因此，在0时刻时根据基线校准的IGF-ISDS可以用于检查潜在的hGH-XTEN融合蛋白剂量对IGF-I响应的影响。
在一方面，本发明提供了治疗PGHD的方法，其中在施用hGH-XTEN融合蛋白之后人类儿科患者维持正常范围内的IGF-I响应(例如，如通过平均IGF-ISDS所测量)。对于IGF-ISDS，正常范围通常是在约-1.5与约1.5之间，但也可以是在约-2.0与约2.0之间。
应注意，在提至约第一值(例如，-2.0)与约第二值(例如，2.0)之间的IGF-ISDS时，“第一值”可以包括第一值，而“第二值”可以包括第二值。
在一个实施方案中，本发明提供了一种通过向患者施用hGH-XTEN融合蛋白来治疗人类儿科患者的小儿生长激素缺乏症(PGHD)的方法，其中在施用之后，人患者的血清IGF-I标准差得分(SDS)是在约-2.0与约2.0之间。在一个实施方案中，所述方法包括向儿科患者施用作为推注剂量(如本文所述)的hGH-XTEN融合蛋白。在另一个实施方案中，所述推注剂量是治疗有效的根据体重调整的推注剂量。在其它实施方案中，在施用所述hGH-XTEN之后，所述儿科患者的血清IGF-ISDS是大于约-2.0、大于约-1.5、大于约-1.0、大于约-0.5或大于约0、大于约0.5、大于约1.0、大于约1.5、大于约1.6、大于约1.7、大于约1.8或大于约1.9。
在另一个实施方案中，所述hGH-XTEN推注剂量在施用所述推注剂量之 后可有效将儿科患者的血清IGF-I标准差得分(SDS)维持在(a)约-2.0与约2.0之间，或(b)约0与约2.0之间，持续至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天、至少约25天、至少约26天、至少约27天、至少约28天、至少约29天或至少约30天。
在另一个实施方案中，在施用多个推注剂量之间施用多个连续hGH-XTEN推注剂量可有效将儿科患者的血清IGF-I标准差得分(SDS)维持在(a)约-2.0与约2.0之间，或(b)约0与约2.0之间，持续至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天、至少约25天、至少约26天、至少约27天、至少约28天、至少约29天或至少约30天。在前述实施方案中，所述推注剂量是每周、每两周、每三周或每月施用。
在另一个实施方案中，在施用多个推注剂量之间施用多个连续hGH-XTEN推注剂量可有效将儿科患者的平均血清IGF-I标准差得分(SDS)维持在(a)约-2.0与约2.0之间，或(b)约-1.0与约2.0之间，持续至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天、至少约25天、至少约26天、至少约27天、至少约28天、至少约29天或至少约30天。在前述实施方案中，所述推注剂量是每周、每两周、每三周或每月施用。
在另一个实施方案中，在施用多个推注剂量之间施用多个连续hGH-XTEN推注剂量可有效将儿科患者的血清IGF-I标准差得分(SDS)维持在(a)约-2.0之上，或(b)约0之上，或(c)约1.0之上，或(d)约1.5之上，持续至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约 12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天、至少约25天、至少约26天、至少约27天、至少约28天、至少约29天或至少约30天。在前述实施方案中，所述推注剂量是每周、每两周、每三周或每月施用。
在另一个实施方案中，在施用多个推注剂量之间施用多个连续hGH-XTEN推注剂量可有效将儿科患者的血清IGF-I标准差得分(SDS)维持在(a)约1.5之下，或(b)约2.0之下，持续至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天、至少约25天、至少约26天、至少约27天、至少约28天、至少约29天或至少约30天。在前述实施方案中，所述推注剂量是每周、每两周、每三周或每月施用。
在另一个实施方案中，在施用多个推注剂量之间施用多个连续hGH-XTEN推注剂量可有效将儿科患者的平均最大血清IGF-I标准差得分(SDS)与基线SDS相比较的变化维持在(a)约0.5与3.0之间，或(b)约1.0与2.5之间，持续至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天、至少约25天、至少约26天、至少约27天、至少约28天、至少约29天或至少约30天。在前述实施方案中，所述推注剂量是每周、每两周、每三周或每月施用。
在另一个实施方案中，所述施用步骤包括施用包含有效量的hGH-XTEN融合蛋白的药物组合物，所述hGH-XTEN融合蛋白包含图1中阐述的氨基酸序列(SEQIDNO:1)。
在一个其它方面，本发明提供了通过施用hGH-XTEN融合蛋白以在儿科患者体内提供正常的血清IGF-I水平来治疗儿科患者的方法。在一个实施方 案中，所述hGH-XTEN融合蛋白作为推注剂量(如本文所述)进行施用。在另一个实施方案中，间隔开一个时间间隔(如本文所述)施用至少两个推注剂量。在一个其它实施方案中，所述推注剂量是治疗有效的根据体重调整的所述融合蛋白的推注剂量。在一个另外的其它实施方案中，hGH-XTEN的所述推注剂量的施用在施用推注剂量之后导致儿科受试者体内的血清IGF-I水平的归一化，持续至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天、至少约25天、至少约26天、至少约27天、至少约28天、至少约29天、至少约30天或至少约1个月。在一个其它实施方案中，正常的血清IGF-I水平通过高于约-2.0；高于约-1.5；高于约-1.0；高于约0；高于约0.5；高于约1.0；高于约1.5的血清IGF-I标准差(SD)来表征。在另一个实施方案中，正常的血清IGF-I水平通过在约-1.5与约1.5之间；约-1.5与约1.0之间；约-1.5与约0.5之间；约-1.5与约0之间；约-1.5与约-0.5之间；约-1.5与约-1.0之间的血清IGF-I标准差(SD)来表征。
在另外的实施方案中，IGF-I血清水平的归一化程度取决于hGH融合蛋白的治疗有效的根据体重调整的推注剂量的剂量。在一个其它实施方案中，IGF-I归一化持续时间随着hGH融合蛋白的治疗有效的根据体重调整的推注剂量增加。
本发明的方法提供了特别的优点，因为hGH-XTEN融合蛋白的施用在人类儿科患者中提供了可观察到的且延长的IGF-I响应(例如，如通过IGF-ISDS所测量)，所述IGF-I响应不伴随或不以过度暴露于高水平的IGF-I(这是不期望的)为代价。换言之，IGF-I响应维持在升高的水平上，所述水平根据当前标准仍被认为是可接受的，例如，如由1.5或更小的IGF-ISDS或者2.0或更小的IGF-ISDS指示。
5.hGH-XTEN融合蛋白的血浆浓度
在另一方面，本发明提供了一种通过向患者施用hGH-XTEN融合蛋白来治疗人类儿科患者的人小儿生长激素缺乏症(PGHD)的方法，其中所述患者在 施用之后具有至少约10ng/mL的所述融合蛋白的血浆浓度。在一个实施方案中，所述方法包括向儿科患者施用作为推注剂量(如本文所述)的hGH-XTEN融合蛋白。在另一个实施方案中，所述hGH-XTEN推注剂量是治疗有效的根据体重调整的推注剂量(如本文所述)。在一个实施方案中，所述推注剂量选自由以下各项组成的组：约0.8mg/kg、约1.0mg/kg、约1.2mg/kg、约1.4mg/kg、约1.6mg/kg、约1.8mg/kg、约2.0mg/kg、约2.2mg/kg、约2.4mg/kg、约2.6mg/kg、约2.7mg/kg、约2.8mg/kg、约3mg/kg、约3.2mg/kg、约3.4mg/kg、约3.6mg/kg、约3.8mg/kg、约4.0mg/kg、约4.2mg/kg、约4.4mg/kg、约4.6mg/kg、约4.8mg/kg、约5.0mg/kg、约5.2mg/kg、约5.4mg/kg、约5.6mg/kg、约5.8mg/kg、约6.0mg/kg以及约6.3mg/kg。在另一个实施方案中，所述hGH-XTEN推注剂量可有效将融合蛋白的血浆浓度维持在至少约10ng/mL：持续至少约5天、至少约7天、至少约10天、至少约14天、至少约20天、至少约25天、至少约30天或至少约1个月。在另一个实施方案中，所述推注剂量可有效将融合蛋白的血浆浓度维持在至少约100ng/mL：持续至少约5天、至少约7天、至少约10天、至少约14天或至少约20天。在一个其它实施方案中，所述施用步骤包括施用包含有效量的hGH-XTEN融合蛋白的药物组合物，所述hGH-XTEN融合蛋白包含图1中阐述的氨基酸序列(SEQIDNO:1)。
6.无副作用
在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗人类儿科患者的人小儿生长激素缺乏症(PGHD)的方法，其包括向患者施用hGH-XTEN融合蛋白而不存在一种或多种副作用。在一个其它实施方案中，不存在一种或多种副作用是不存在临床上显著水平的一种或多种副作用。在另一个实施方案中，不存在的所述一种或多种副作用选自由以下各项组成的组：施用融合蛋白之后出现的头痛、关节痛、肌痛、水肿、恶心以及肌肉疲劳。如本文所用，“临床上显著水平的副作用”意指所述副作用不是意料之外的或者不是严重的不良事件。轻度且短暂的副作用，即使是头痛、关节痛、肌痛、水肿、恶心以及肌肉疲劳中的一种或其它已知与生长激素施用相关联的那些副作用，将不会被认为是临床上显著的水平。在一个实施方案中，所述方法包括向儿科患者施用作 为推注剂量(如本文所述)的hGH-XTEN融合蛋白。在另一个实施方案中，所述hGH-XTEN融合蛋白的推注剂量是治疗有效的根据体重调整的推注剂量(如本文所述)。在一个其它实施方案中，皮下施用所述推注剂量。在一个其它实施方案中，所述施用步骤包括施用包含有效量的hGH-XTEN融合蛋白的药物组合物，所述hGH-XTEN融合蛋白包含图1中阐述的氨基酸序列(SEQIDNO:1)。
7.施用后参数
在一个实施方案中，本发明提供了一种在患有生长激素缺乏症的人类儿科患者体内实现有益效果的方法，其包括向儿科患者施用治疗有效量的hGH-XTEN融合蛋白的步骤，其中所述施用带来与生长激素相关疾病、病症或病状(包括PGHD(如本文所述))相关联的一个或多个生化或生理参数或临床终点的改进。所述有效量在帮助治疗(例如，治愈或降低严重程度)生长激素相关疾病、病症或病状的有害作用方面产生有益效果。在一些情况下，用于实现有益效果的方法包括施用治疗有效量的hGH-XTEN融合蛋白组合物以治疗患有生长激素相关疾病、病症或病状(包括PGHD(如本文所述))的儿科患者。
本发明的方法包括向人类儿科患者施用治疗有效量的hGH-XTEN的相继或连续剂量，持续足以实现和/或维持所需参数或临床效果的一段时间，并且治疗有效量的此类连续剂量建立了hGH-XTEN的治疗有效剂量方案；即融合蛋白组合物的连续施用剂量的时间表，其中以治疗有效量给予所述剂量，以对代谢疾病状态或病状(包括但不限于本文所述的那些)的任何临床指征或症状、方面、测量的参数或特征产生持续的有益效果。在所述方法的一个实施方案中，所述参数包括但不限于平均(SD)身高标准差得分(HT-SDS)、身高增长速度变化、IGF-I浓度、IGF-I/IGFBP-3比、IGFBP3浓度、体重变化、瘦体重、身体质量指数变化、总体脂肪(脂细胞脂肪/组织)、躯干脂肪、对胰岛素挑战的响应、软骨细胞的分裂速率(divisionrate)、软骨细胞数、骨密度、骨龄、骨生长、骨转换、骨骺板宽度的增加、胆固醇的减少、甘油三酯的减少以及LDL的减少。在所述方法的另一个实施方案中，向人类儿科患者施用治疗有效量hGH-XTEN的相继或连续剂量对两个或更多个参数产生有益效果，所述 参数包括但不限于平均(SD)身高标准差得分(HT-SDS)、身高增长速度变化、IGF-I浓度、IGF-I/IGFBP-3比、IGFBP3浓度、体重变化、瘦体重、身体质量指数变化、总体脂肪(脂细胞脂肪/组织)、躯干脂肪、对胰岛素挑战的响应、软骨细胞的分裂速率、软骨细胞数、骨密度、骨龄、骨生长、骨转换、骨骺板宽度的增加、胆固醇的减少、甘油三酯的减少以及LDL的减少。
用重组人生长激素(rhGH)治疗的儿科患者的身高增长速度数据已被编到各种数据库中。国家合作生长研究(NCGS)数据库含有有关接受rhGH疗法的儿童的220,000名患者年生长数据。1985年12月启动NCGS数据库以收集用rhGH治疗的儿童的数据，以用于评价安全性和功效。美国的临床研究人员键入了匿名数据，包括出生日期、性别、身高、体重、身材矮小症的病因、对刺激测试的峰值血清GH响应、Tanner青春期分期、父母身高以及用Genentech的rhGH产品治疗的患者的GH剂量(Shulman,DI等，IntJPediatrEndocrinol.2013；2013(1):2)。已显示，在小于胎龄儿(SGA)儿童中，利用GH进行治疗的第一年期间观察到的身高增长速度是第二青春期前年对GH生长响应的主要决定因素(RankeMB等，JClinEndocrinolMetab.2003；88:125–131)。第一年身高增长速度可以在儿科患者体内在3个月、4个月、6个月的时段内或其它高达12个月的时段内测量以确定年度第一年身高增长速度，表达为“cm/年”。
在用于在患有生长激素缺乏症的人类儿科患者体内实现有益效果的方法的其它实施方案中，所述方法包括向儿科患者施用治疗有效量的hGH-XTEN融合蛋白的步骤，其中所述施用带来儿科患者的身高增长速度的改进。在所述方法的一个实施方案中，所述方法可在儿科患者体内有效实现等于7cm/年至12cm/年的身高增长速度。在所述方法的另一个实施方案中，所述方法可在儿科患者体内有效实现等于8cm/年至11cm/年的身高增长速度。在一个实施方案中，所述身高增长速度是在儿科患者体内给药至少3个月或至少6个月或至少12个月之后实现(或测定)。在另一个实施方案中，所实现的身高增长速度是第一年身高增长速度。在另一个实施方案中，所述方法不亚于同一时期使用未连接至XTEN的且以摩尔计使用相当等效剂量进行施用的hGH的每日注射所实现的身高增长速度。在另一个实施方案中，所述方法可在给药至少3个月之后将儿科患者的年度身高增长速度维持在与同一时期内利用 等量(以摩尔计)未连接至XTEN的hGH的每日注射实现的身高增长速度相比的10％、20％或30％内。在前述一个实施方案中，施用了未连接至XTEN的hGH的每日注射的儿科患者接受以下剂量：至少约25、至少约30、至少约33、至少约35μgrhGH/kg/天、至少约37μgrhGH/kg/天或至少约43μgrhGH/kg/天。在本段落的前述实施方案中，所述hGH-XTEN融合蛋白的所述推注剂量是治疗有效的根据体重调整的推注剂量，其包含约0.8mg/kg与约6.3mg/kg之间的hGH-XTEN融合蛋白。在另一个实施方案中，所述hGH-XTEN融合蛋白的所述推注剂量是治疗有效的根据体重调整的推注剂量，其包含约0.8mg/kg与约7.0mg/kg之间的hGH-XTEN融合蛋白。在另一个实施方案中，所述推注剂量是每周、每两周、每三周、每半个月或每月施用。在另一个实施方案中，所述儿科患者每周施用约1.15mg/kghGH-XTEN融合蛋白的推注剂量，或每两周施用约2.5mg/kghGH-XTEN融合蛋白的推注剂量，或每月施用约5.0mg/kghGH-XTEN融合蛋白的推注剂量。在另一个实施方案中，所述儿科患者施用选自以下的推注剂量：约0.8mg/kg至约1.5mg/kg、约1.8mg/kg至约3.2mg/kg或约3.5mg/kg至约6.3mg/kg。在优选的实施方案中，所述儿科患者每月施用至少约5.0mg/kghGH-XTEN融合蛋白的推注剂量。
在方案的另一个实施方案中，人类儿科患者在两个或更多个推注剂量之后实现选自骨密度、骨生长以及骨骺板宽度的增加的至少一个参数的改进。在一个其它实施方案中，前述改进是与未接受人生长激素的人类儿科患者相比的至少约10％、或至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％或至少约90％。在另一个实施方案中，前述百分比改进类似于或不次于通过未连接至XTEN且每日施用的hGH，使用每日剂量等量hGH实现的改进。
8.hGH-XTEN药剂
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用作药剂或用于治疗儿科患者的PGHD的hGH-XTEN融合蛋白。在另一个实施方案中，本发明提供了hGH-XTEN融合蛋白在制备用于治疗患有PGHD的人类儿科患者的PGHD的药物中的用途。在一个其它实施方案中，本发明提供了具有图1中阐述的序 列(SEQIDNO:1)的融合蛋白在制备用于治疗儿科患者的PGHD的药物中的用途。在其它实施方案中，所述hGH-XTEN融合蛋白被提供为推注剂量(如本文所述)。在另一个实施方案中，所述推注剂量是治疗有效的根据体重调整的剂量。在另一个实施方案中，所述药剂配制用于皮下施用。在一个其它实施方案中，所述hGH-XTEN融合蛋白包含如图1中阐述示出的氨基酸序列(SEQIDNO:1)。
9.小儿GH相关病状的指标的治疗
在另一方面，本发明提供用于治疗小儿患者体内与小儿生长激素缺乏症(PGHD)相关的疾病或病状的基于hGH-XTEN融合蛋白的治疗剂。为了预防、治疗或降低给定疾病或病状的严重程度，本发明的治疗剂的适当剂量将取决于待治疗的疾病或病状的类型(如上文定义)、疾病或病状的严重程度和病程、所述治疗剂是否为了治疗目的而施用、先前的疗法、儿科患者的临床病史和对所述治疗剂的响应，以及主治医生的裁量。
在另一方面，本发明提供了一种用于延迟或减缓儿科患者体内与PGHD相关的疾病或病状的进展的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向被诊断为患有疾病、病状或病症的儿科受试者施用有效量的hGH-XTEN融合蛋白。在另一方面，本发明提供了一种用于治疗或改善与PGHD相关的疾病或病状的指标的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向处于疾病或病状危险中的儿科受试者施用有效量的hGH-XTEN融合蛋白，其中所述hGH-XTEN融合蛋白可有效对抗所述疾病或病状的指标的发展。
在一个另外的方面，所述hGH-XTEN融合蛋白提供了对抗人类儿科患者与PGHD相关的疾病或病状的发展或进展、临床和/或组织学和/或生物化学和/或病理学指标(包括症状和体征两者)的改善效果。在一个实施方案中，所述疾病或病状是PGHD。在一个实施方案中，儿科患者的所述指标包括身材矮小、升高的体脂肪水平(特别是向心性或躯干型肥胖，即腰部)、所有身体部位减缓的生长速度、趋平于或脱离已确立的身高生长曲线、骨龄落后、降低的IGF-ISDS以及低于平均身高SDS。在另一个实施方案中，所述儿科受试者处于与PGHD相关的疾病或病状的危险中。一般而言，处于危险中的儿科 受试者先前会遭受针对脑垂体和/或下丘脑的一定的损害。在一个实施方案中，处于危险中的儿科受试者先前被诊断为患有与脑垂体相关联的肿瘤，和/或进行过用于治疗肿瘤的外科手术、化疗或放疗。在另一个实施方案中，处于危险中的儿科受试者先前曾经或目前具有减少的对脑垂体的血液供应。在一个其它实施方案中，处于危险中的儿科受试者先前进行过颅脑消融，或者具有头部创伤史。在一些实施方案中，处于危险中的儿科受试者先前或目前患有下丘脑-垂体疾病或病症。
对本文所述的疾病和病状(包括PGHD)的治疗功效可以通过在评价儿科患者的PGHD中常用的各种评定来测量。例如，分泌激素的腺体的健康可以通过(但不限于)以下手段来评价：例如，IGF-I标准差得分(SDS)、平均(SD)身高标准差得分(HT-SDS)、生长激素刺激测试(GHST)、生长激素释放激素(GHRH)、刺激试验、内源性hGH脉冲的监测或测量、IGF-I水平、IGF-I结合蛋白质水平、其它血液或生物化学试验(例如，总胆固醇、低密度脂蛋白(LDL)胆固醇、高密度脂蛋白(HDL)胆固醇、甘油三酯以及脂质)。
在一个另外的方面，本发明提供了提高人生长激素(hGH)疗法在人类儿科患者中的功效的方法。在另一方面，本发明提供了当用hGH-XTEN融合蛋白治疗患有PGHD的人类儿科患者时，确定在后续剂量期施用的hGH-XTEN融合蛋白的后续剂量的方法。“剂量期”意指在推注剂量的施用(例如，初始剂量)与推注剂量的下一次连续施用(例如，后续剂量)之间的时间。剂量期可以随一个或多个进一步的连续剂量而变化，或者可以保持恒定。
在一个实施方案中，前述提高功效的方法包括在施用初始剂量的人生长激素-XTEN(hGH-XTEN)融合蛋白的初始剂量期期间监测从儿科患者获得的血浆或血清样品的IGF-I标准差得分(SDS)的步骤。在一个实施方案中，所述hGH-XTEN融合蛋白包含与SEQIDNO:1具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述方法还包括基于在初始剂量期期间观察到的IGF-ISDS确定在后续剂量期内施用的hGH-XTEN融合蛋白的后续剂量的步骤。在一个另外的实施方案中，所述方法还包括在后续剂量期内施用后续剂量。在一个其它实施方案中，后续剂量改进了所述治疗在后续剂量期内的功效。在另一个实施方案中，所述后续剂量高于、低于或等于初始剂量。 初始剂量或后续剂量可以是本文描述的任何推注剂量。在一个另外的实施方案中，所述后续剂量期长于、短于或等于初始剂量期。初始剂量期或后续剂量期可以是本文描述的任何时段(例如，每周、每两周，每半个月、每三周、每月等或每7天、每10天、每14天、每21天、每30天等)。
VII).剂型和药物组合物
在另一方面，本发明提供了包含本文所述的hGH-XTEN融合蛋白的推注剂量或剂型。
在一个实施方案中，hGH-XTEN融合蛋白的推注剂量或剂型包含对于人类儿科患者而言治疗有效的根据体重来调剂的推注剂量。在一个其它实施方案中，所述推注剂量或剂型包含约0.8mg/kg与约6.3mg/kg之间的hGH-XTEN融合蛋白。本文描述了其它推注剂量。
在其它实施方案中，所述推注剂量或剂型(i)用于治疗有需要的儿科受试者的人PGHD；和/或(ii)配制用于皮下施用。在一个其它实施方案中，所述hGH-XTEN融合蛋白包含如图1中阐述示出的氨基酸序列(SEQIDNO:1)。在一个实施方案中，所述推注剂量或剂型是包含具有如图1中阐述的序列(SEQIDNO:1)的融合蛋白以及药学上可接受的载体的药物组合物。
在另一个实施方案中，本发明提供试剂盒，其包括包装材料和至少一个第一容器，所述至少一个第一容器包括前述实施方案的药物组合物，和标示出所述药物组合物及储存和处理条件的标签，以及用于制备和/或向儿科受试者施用所述药物组合物的说明书页。
在一个另外的方面，本发明提供了hGH-XTEN融合蛋白的组合物、药物组合物以及剂量。在一个其它实施方案中，所述药物组合物或剂量包含具有如图1阐述的序列(SEQIDNO:1)或与SEQIDNO:1的序列具有至少约90％、至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％序列同一性的序列的融合蛋白。在另一个实施方案中，所述剂量是基于患者的体重用于人类儿科患者。人类儿科患者的体重可以是约10kg至约50kg的范围。在一个另 外的实施方案中，所述hGH-XTEN融合蛋白以药物组合物、组合物或作为一定量的剂量提供。在一个其它实施方案中，所述药物组合物或剂量还包含药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，所述药物组合物以治疗有效剂量施用。在另一个实施方案中，使用多个连续剂量、使用治疗有效剂量方案(如本文定义)施用所述药物组合物，持续剂量期的时间长度。
hGH-XTEN的治疗有效量根据如个体的疾病状况、年龄、性别和体重、以及融合蛋白在个体中引发所需反应的能力的因素而变化。治疗有效量也是其中治疗上有益的效果超过hGH-XTEN的任何毒性或有害影响的量。
应注意，在提到包含其量介于约第一mg与约第二mg之间的hGH-XTEN融合蛋白的组合物、药物组合物或剂量时，术语“第一mg”可以包括第一mg值，而术语“第二mg”可以包括第二mg值。
在另一方面，本发明提供了在用于治疗PGHD的医药方案或治疗有效剂量方案中使用的hGH-XTEN融合蛋白。在一个实施方案中，在包含用于治疗儿科患者的融合蛋白的推注剂量的方案中使用所述hGH-XTEN融合蛋白。在另外的实施方案中，所述方案包括确定在儿科患者体内实现在约-2.0与约2.0之间的IGF-I标准差得分(SDS)所需的hGH-XTEN融合蛋白的量的步骤。
在一个其它实施方案中，所述方案包括治疗有效的根据体重调整的推注剂量。在另一个实施方案中，所述方案包括在约0.8mg/kg与约6.3mg/kg之间的融合蛋白的推注剂量。在一个其它实施方案中，所述方案包括施用融合蛋白的连续推注剂量。在一个实施方案中，连续推注剂量的所述施用是约每周、约每两周、约每三周或约每月进行的。在一个另外的实施方案中，所述融合蛋白包含与SEQIDNO:1具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述方案包括皮下施用融合蛋白的推注剂量。在另一个实施方案中，所述方案可有效治疗儿科患者的PGHD。
VIII).制品
在一方面，本发明还提供了含有可用于治疗、预防和/或诊断儿科患者的疾病(例如，PGHD)的材料的试剂盒和制品。在另一个实施方案中，本发明提供了试剂盒，其包括包装材料和至少一个第一容器，所述至少一个第一容器包括前述实施方案的剂型或药物组合物，和标示出所述剂型或药物组合物及储存和处理条件的标签，以及用于重建和/或向儿科受试者施用所述剂型或药物组合物的说明书页。在一个其它实施方案中，所述试剂盒包括容器和标签，所述标签可以位于所述容器上或者与所述容器相关联。所述容器可以是瓶子、小瓶、注射器、筒体(包括自动注射器筒体)或任何其它合适的容器，并且可以由各种材料如玻璃或塑料形成。所述容器容纳具有如本文所述的hGH-XTEN融合蛋白的组合物，并且可以具有无菌进入孔。容器的实例包括带有塞子的小瓶，所述塞子可以被皮下注射针刺穿。试剂盒可以具有另外的容器，所述容器容纳各种试剂，例如，稀释剂、防腐剂以及缓冲液。所述标签可以提供关于组合物的描述以及关于儿科患者中预期用途的说明。
在一个其它方面，所述容器是预填充注射器。在一个实施方案中，所述注射器预填充有组合物，所述组合物具有如本文所述的hGH-XTEN融合蛋白。在一个另外的方面，本发明提供具有如本文所述的hGH-XTEN融合蛋白的组合物的容器，其中所述容器适合于所述组合物的自动注射。在一个实施方案中，所述容器是筒体。在另一个实施方案中，所述容器是自动注射笔中的筒体。本领域普通技术人员将了解，其它合适的自动注射装置也可以用于本发明。在一些实施方案中，所述自动注射装置包括圆筒形外壳内的弹簧支承式注射器，所述圆筒形外壳在注射前保护针尖。在一个实施方案中，儿科患者按压所述装置上的按钮，并且注射器针自动插入以递送内容物。
在另一个实施方案中，所述装置是气体喷射式自动注射装置。在其它实施方案中，气体喷射式装置包括具有加压气体的圆筒，但不包括针。一旦激活，所述装置就驱使液体的微细射流穿过皮肤，而无需使用针。在一个其它实施方案中，所述装置是离子渗透装置或电动给药(EMDA)装置(例如，使用小电荷来穿过皮肤递送试剂，而不使用针)。
所述试剂盒具有至少一个容器，所述至少一个容器包括包含本文所述的hGH-XTEN融合蛋白的作为活性剂的组合物。所述容器可以包括hGH-XTEN融合蛋白剂型或药物组合物。可以提供标签，所述标签指示所述剂型或组合物可以用于治疗儿科患者的疾病。所述标签还可以提供用于向需要治疗的儿科受试者施用的说明。所述试剂盒还可以含有另外的容器，所述容器具有药学上可接受的缓冲液如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液以及右旋糖溶液。最后，所述试剂盒还可以含有任何其它合适的材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针以及注射器。
在一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括容纳用于向人类儿科患者施用的药物组合物的容器，所述药物组合物包含人生长激素-XTEN(hGH-XTEN)融合蛋白。在一个实施方案中，所述hGH-XTEN融合蛋白包含与图1中阐述的序列(SEQIDNO:1)具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述试剂盒还包括与所述容器相关联的包装插页。在一个其它实施方案中，所述包装插页指示所述组合物用于通过施用超过一剂所述组合物来治疗生长激素缺乏症。在一个实施方案中，所述施用是施用约0.8mg/kg与约6.3mg/kg之间的hGH-XTEN的初始剂量以及其量为约0.8mg/kg与约6.3mg/kg之间的hGH-XTEN的多个后续剂量。在另一个实施方案中，所述剂量在时间上彼此间隔至少约7天。所述包装插页可以进一步指示如本文所述的不同的剂量、剂量范围以及剂量之间的时间。
以下是本发明的方法、治疗方案以及组合物的实施例。应理解，鉴于上文提供的一般性描述，可以实践各种其它实施方案。
实施例
实施例1A–单剂量结果
已进行关于单剂量人生长激素类似物(图1示出为SEQIDNO:1的人生长激素-XTEN(hGH-XTEN)融合蛋白)在患有生长激素缺乏症的儿科患者中皮下(SC)施用时的安全性、药代动力学(PK)以及药效学(PD)的1b/2a期试验。基于GHD成人中的安全性特征(Yuen,K.C.等，TheJournalofClinical EndocrinologyandMetabolism98,2595-2603(2013))以及实现每月一次给药的可能性，关于GHD儿童的1b/2a期研究确定(i)安全性、耐受性、PK和GHD儿童对单剂量hGH-XTEN融合蛋白的IGF-I响应(1b期)；以及(ii)使用使IGF-I归一化的融合蛋白给药方案进行的6个月身高增长速度(2a期)。
所述研究被设计成招募72名首次接受治疗的青春期前儿童。关键纳入标准是青春期前状态、身材矮小(HT-SDS≤-2.00)、通过成对GH刺激测试诊断为GHD(GHmax≤10ng/mL)、IGF-I标准差得分(IGF-ISDS)≤-1以及不存在可能损害数据解析的其它疾患或用药。在1b期中，在单次皮下给药多达6个递增剂量水平的hGH-XTEN融合蛋白(SAD设计)之后确定30天时段内的PK和PD(IGF-I和IGFBP-3)响应。在每次剂量提高之前复查包括针对方案指定停止标准而收集的数据的安全性。2a期的hGH-XTEN融合蛋白剂量选择基于安全性和IGF-I响应。在剂量选择之后，针对最大三组不同剂量和/或剂量方案随机选择受试者以用于确定重复给药之后的6个月身高增长速度。hGH-XTEN融合蛋白给药起始于GHD成人中的安全且耐受良好的剂量0.80mg/kg，增加至1.20mg/kg、1.80mg/kg、2.70mg/kg、4.00mg/kg以及多达6.00mg/kg。
图2概述了1b/2a期研究的设计。表1.1提供了1b期剂量水平。hGH-XTEN融合蛋白剂量水平低于30天内施用的40μg/kg/天的平均小儿GHD每日重组人生长激素(rhGH)剂量。基于在30天时段内使IGF-1暴露归一化的可能性来选择2a期的剂量。
表1.1-1b期剂量水平
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表1.2示出了完成给药组的临床特征；数值是平均值(SD)。
表1.2
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针对0.80、1.20、1.80和2.70mg/kghGH-XTEN融合蛋白组的1b期给药和数据收集是完整的。范围从0.80至2.7mg/kg(等同于每天服用4.8至16.7μgrhGH/kg，持续30天)的剂量的数据是完整的。
所述数据支持hGH-XTEN融合蛋白是安全的且耐受良好的。表1.3示出了被认为与剂量水平组1-4中的研究药物可能、很可能或明确相关的不利事件(AE)。所有相关AE是CTCAE等级1(轻度的)。招募的任何儿童中无SAE，无出乎意料的AE，无患者撤出以及无脂肪萎缩。所述事件被认定为是在首次接受治疗的患有GHD的儿童中开始rhGH治疗时观察到的那些典型所有的事件。
表1.3
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hGH-XTEN融合蛋白血浆水平在单剂量之后持续保持长达30天。图3示出了hGH-XTEN融合蛋白血浆浓度(ng/mL)平均值。
图4示出了hGH-XTEN融合蛋白Cmax(ng/mL)以及hGH-XTEN融合蛋白AUC(hr-ng/mL)数据的线性回归。这些结果支持在融合蛋白中的暴露与剂量成线性比例。
在2.70mg/kg的单次皮下剂量的hGH-XTEN融合蛋白之后，在8名受试者的6名当中，到第30天，IGF-ISDS都被维持在基线以上，而在其余2名受试者中维持到第22天。IGF-ISDS的延长的响应并不以过度暴露于IGF-I为代价。在一个时间点，仅在一名患者中观察到IGF-ISDS>2.0(2.12)。
图5展示了所有剂量(0.8mg/kg(●)；1.2mg/kg(■)；1.8mg/kg(▲)；以及2.7mg/kg(◆))的IGF-I(平均值)的(自基线的)持续变化。hGH-XTEN融合蛋白的IGF-I响应在单次皮下剂量之后持续长达30天。
图6示出了四个剂量组的最大IGF-SDS数据的线性回归，并且证实了IGF-I响应与hGH-XTEN融合蛋白的剂量线性相关。
来自完成剂量水平的数据支持在2a期使用每周或每半个月hGH-XTEN融合蛋白剂量方案。剂量提高继续支持2a期的每月一次hGH-XTEN融合蛋白剂量方案。
实施例1B–单剂量结果
当前批准的生长激素药物要求每日注射，并且因此对患有GHD的患者提出了相当大的挑战。相比之下，人生长激素类似物((图1)示出为SEQIDNO:1 的人生长激素-XTEN(hGH-XTEN)融合蛋白)被开发来提供多达每月一次给药、有助于提高患者依从其疗法方案的能力以及改进其总体治疗结果。
数据收集自关于患有生长激素缺乏症(GHD)的青春期前儿童的新型长效人生长激素(hGH-XTEN融合蛋白)的1b/2a期研究。1b期研究的目的是评价单剂量安全性、hGH-XTEN融合蛋白在儿科GHD患者中的耐受性；并且确定30天内的PK(hGH-XTEN融合蛋白浓度)和PD(IGF-I、IGFBP-3)特征。
临床试验招募了多达72名首次接受治疗的患有GHD的青春期前儿童，其通过生长学标准和两个GH刺激测试记录。hGH-XTEN融合蛋白的临床试验具有两个阶段：单一递增剂量阶段(1b期)用于确定融合蛋白剂量的安全性、PK以及PD，并且使得能够选择重复剂量阶段(2a期)中使用的剂量方案以获得6个月身高增长速度结果。可获得来自研究中最近完成的1b期剂量提高阶段的结果。
来自1b期的数据证实单剂量hGH-XTEN融合蛋白在患有GHD的儿童中的耐受性非常好，并且证实有可可在使用降低的给药频率时使IGF-I安全地升高至与良好的追赶性生长相关联的水平。所述数据为下一试验阶段中每月多达一次给药的继续研究提供了强有力的支持，这将进一步确定GHD患者的3个月和6个月身高增长速度。
在1b期中，在6个递增剂量水平下进行单次皮下剂量的hGH-XTEN融合蛋白之后确定30天时段内的PK和PD(IGF-I)响应。融合蛋白的给药起始于在先前完成的试验中显示在GHD成人中是安全的且耐受良好的剂量0.80mg/kg，之后剂量增加至1.20mg/kg、1.80mg/kg、2.70mg/kg、4.00mg/kg以及6.00mg/kg(等同于每天服用4.8、7.4、11.1、16.7、24.7以及37.0mcgrhGH/kg，持续30天)。因此，这个试验中研究的hGH-XTEN融合蛋白的剂量都低于针对这些患者典型开出的每日rhGH的量。2a期的融合蛋白剂量选择是基于来自1b期的安全性和IGF-I响应。在2a期剂量选择之后，按三个剂量组中的每一个向受试者给药，以用于确定3个月和6个月身高增长速度。
在试验的1b期部分中，分6个剂量组(每组8名)研究平均(SD)年龄为7.2 (2.2)岁的48名受试者(27名男性，21名女性)。在筛选时，平均(SD)HT-SDS是-2.7(0.6)，体重是18.0(4.6)kg并且IGF-ISDS是-1.8(0.7)。平均在给药后3天时达到最大值的hGH-XTEN融合蛋白血浆浓度与剂量成比例并且在所测试的所有受试者中从单剂量之后的多达30天内都保持是可检测的。IGF-ISDS的最大变化发生在第1天单剂量之后的2至14天内。IGF-1响应的幅度和持续时间随着融合蛋白剂量的增加而增加。30天内平均IGF-ISDS的增加还与剂量成比例，并且足以支持hGH-XTEN融合蛋白的每月多达一次给药。重要的是，延长的IGF-I响应并不以过度暴露于高IGF-I水平为代价，其中两名患者各自的IGF-ISDS的仅一个值超过+2。已报道的所有相关不利事件是轻度的且暂时的，并未报道严重或出乎意料的不利事件。
总而言之，0.8至6.0mg/kg的单剂量的hGH-XTEN融合蛋白在施用给48名患有GHD的青春期前儿童时是安全的且耐受良好的。此外，观察到了hGH-XTEN融合蛋白水平和IGF-I响应与剂量成比例的增加，从而表明了选择每月多达一次给药的剂量和剂量方案的灵活性。因此，hGH-XTEN融合蛋白是长效rhGH，在患有GHD的儿童当中具有多达每月一次的给药间隔的潜力。
图7概述了儿科患者中人生长激素-XTEN(hGH-XTEN)融合蛋白的1b/2a期研究的设计。hGH-XTEN融合蛋白剂量以重组hGH(rhGH)质量计相当于5-37μg/kd/天，持续服用30天。
图8提供了示出完成给药组的临床特征的表；数值是平均值(SD)。
图9提供了示出被认为与剂量水平组1-6中的研究药物可能、很可能或明确相关的相关不利事件的表。所有相关AE是轻度的(CTCAE等级1)且暂时的。无SAE，无出乎意料的AE，无患者撤出，无脂肪萎缩，无结节。
图10示出了hGH-XTEN融合蛋白血浆浓度(ng/mL)平均值(1b期的初步PK)。
图11示出了hGH-XTEN融合蛋白Cmax(ng/mL)以及hGH-XTEN融合蛋白AUC(hr-ng/mL)(剂量比例性)。
图12A-12B示出了对单剂量融合蛋白的IGF-ISDS响应。
图13A-13B示出了每月平均IGF-ISDS(单剂量)始于基线的增加。平均IGF-ISDS的增加随着剂量的增加而增加(p<0.00001)。实现了所需每月IGF-I特征。
0.80至6.0mg/kg的单剂量的hGH-XTEN融合蛋白在患有GHD的青春期前儿童体内是安全的且耐受良好的。注射部位反应是轻度的且暂时的，无结节且无脂肪萎缩。hGH-XTEN的剂量等同于4.8-37μgrhGH/kg/天，持续服用30天。药物暴露参数(Cmax，AUC)与剂量成比例。30天内平均IGF-ISDS的增加与剂量成比例。每月平均IGF-I的增加不与升高的IGF-ISDS(两个瞬时值>2)关联。hGH-XTEN融合蛋白是具有多达按月给药的PK/PD属性的长效rhGH。
实施例2–重复给药结果
VRS-317是一种由rhGH与N端和C端附接的氨基酸序列(XTEN)(图1的SEQIDNO:1)组成的新型融合蛋白(M.W.119kDa)。在GHD成人和儿童的1期研究中，VRS-317浓度、IGF-I和IGFBP-3响应与剂量成比例，并且IGF-I和IGFBP-3的药物浓度和增加在单次皮下注射之后仍持续呈现30天。单剂量VRS-317施用是安全的且耐受良好的，注射部位存在轻微不适；与每日rhGH产品已经呈现出来的信号相比不存在新的安全信号。
进行重复给药研究以确定6个月VRS-317治疗之后的安全性、耐受性、身高增长速度、IGF-I以及IGFBP-3响应。主要终点是平均6个月身高增长速度。受试者都是青春期前的并且是首次接受rhGH治疗。GHD通过以下各项诊断：身材矮小(HT-SDS<-2)、骨龄延迟、成对GH刺激测试(GHmax≤10ng/mL)、低IGF-I(IGF-ISDS<-1)以及引起生长缓慢的其它条件的缺乏。最初，48名受试者(8名/剂量组)接受六个VRS-317剂量水平(0.8至6.0mg/kg；等同于4.9至37μgrhGH/kg/天，持续服用30天)中的一个的单剂量。基于观察到的PK/PD结果，将64名受试者随机分成三个给药小组，以评价5.0mg/kg/月、2.5mg/kg/半月或1.15mg/kg/周(总共6个月的累计剂量是30mg/kg)。在 重复给药开始时，受试者(37男/27女)具有7.8(2.4)岁的平均(SD)年龄、-2.5(0.5)的HT-SDS以及-1.7(0.8)的IGF-ISDS。
迄今为止施用了多于465次注射，注射部位不适是轻度的(1级)、暂时的(通常<30分钟)并且仅在22％的受试者中进行报道。已注意到注射部位未形成结节或不存在脂肪萎缩。不存在相关的严重不利事件(SAE)或出乎意料的AE。其它相关AE是轻度的且暂时的，并且是在首次接受rhGH治疗的儿童中启用rhGH时预料到的类型(例如，5名受试者出现肌骨骼疼痛，1名受试者出现头痛)。峰值IGF-ISDS水平在每月给药的情况下是最大的但不>3，并且仅在2种情况下暂时超过2(2.01和2.12)。在所有给药组中，在第30天，平均谷底IGF-ISDS水平保持在基线以上。在2个月给药之后，峰值IGF-I水平通常高于第一剂量之后的水平，从而表明重复VRS-317给药可以加强IGF-I响应。
总之，在等同于约30μgrhGH/kg/天的按rhGH质量计的剂量下，发现利用VRS-317重复给药在青春期前GHD儿童中是安全的且耐受良好的，并且在以每周、每半个月或每月间隔给予时将平均IGF-I增加维持在基线以上而不需IGF-I过度暴露。重复VRS-317给药可以加强初始给药情况下可见的IGF-I响应。
实施例3–三个月结果
在等同于约30μgrhGH/kg/天的每日rhGH的VRS-317剂量下，迄今为止已发现2a期中的VRS-317的重复给药在青春期前GHD儿童中是安全的且耐受良好的，并且在以每周、每半个月和每月间隔给予时将平均IGF-I增加维持在基线以上以及治疗范围之内而不需IGF-I过度暴露。不存在相关的严重不利事件或出乎意料的不利事件。其它相关不利事件大部分是轻度且暂时的，并且是在首次接受rhGH治疗的儿童中启用rhGH时预料到的类型。在迄今为止施用了多于1000次注射的情况下，注射部位不适出现在少数患者中并且是轻度的且暂时的。注射部位处并未观察到结节形成或脂肪萎缩。峰值IGF-ISDS水平在每月给药的情况下是最大的但不超过3，并且仅在3种情况下暂时超过2。在所有给药组中，在第30天，平均谷底IGF-ISDS水平保持在基 线以上。在2个月给药之后，峰值IGF-I水平通常高于第一剂量之后的水平，从而表明重复VRS-317给药可以加强IGF-I响应。2a期中GHD儿童的平均年度3个月身高增长速度(又称为生长速度)与施用了相当剂量的每日rhGH(33μgrhGH/kg/天)的年龄匹配的历史对照是相当的。总之，GHD儿童2a期临床试验中迄今为止的结果表明VRS-317具有与以相当剂量施用的每日rhGH的历史研究相当的安全性和功效特征。
图14示出了与年龄匹配的历史对照和VRS-317治疗患者的平均年度身高增长速度。