敏诺西迪供用于抑制与雄性素受体有关的功能的用途
本件申请案主张于2013年4月30提申的美国申请案序号61/817,830号的优势，它的全部公开内容被并入此处以作为参考数据。
技术领域
本发明是有关于敏诺西迪(minoxidil)供用于抑制与雄性素受体(androgenreceptor,AR)有关的功能以及治疗与雄性素受体有关的疾病的用途。
背景技术
雄性素受体(AR)是一引导对雄性素(androgen)[包括睪固酮(testosterone)以及它的衍生物二氢睪固酮(dihydrotestosterone,DHT)]反应的基因调控的核受体(nuclearreceptor)。雄性素结合至该AR的配位子-结合领域(ligand-bindingdomains,LBD)。没有雄性素时，AR存在于细胞溶质(cytosol)中且被结合至热休克蛋白(heatshockproteins)的一复合体。循环的雄性素自由地扩散至细胞溶质中，并且它们对于AR的结合触发一系列导致核转位(nucleartranslocation)、基因转录(genetranscription)以及蛋白质转译(proteintranslation)的构形与结构的改变。AR在雄性的生殖器(genitalia)的生长、分化以及作用、雄性与雌性的生育力(fertility)以及生殖上显著地扮演了重要的角色。在AR基因上的改变与其它与生育力以及生殖无关的疾病有关联。
虽然在过去50年内在与AR有关的疾病的诊断与治疗上已取得进展，医界仍然面对治疗许多种类的与AR有关的疾病的挑战。因此，针对更有效且安全的对于与AR有关的疾病的治疗仍然存在有一需要。本发明满足了此需要。
发明内容
发明概要
本发明是针对用于治疗一在一个体中的与雄性素受体(AR)有关的疾病的方法，其借由对该个体投药以一有效量的敏诺西迪、它的一药学上可接受的盐类(pharmaceuticallyacceptablesalt)或它的一前驱药(prodrug)以治疗与AR有关的疾病。
亦所提供的是用于抑制在一细胞、一组织或一个体中的与AR有关的功能的方法，其借由对该细胞、该组织或该个体投药以一有效量的敏诺西迪、它的一药学上可接受的盐类或它的一前驱药以抑制该与AR有关的功能。
亦所提供的是用于治疗或预防性治疗在一个体中的痤疮的方法，该方法包含有对该个体投药以一有效量的敏诺西迪、它的一药学上可接受的盐类、它的一前驱药或此处所述的一药学组成物以治疗或预防性治疗痤疮。
本发明在参照随文检附的图式和以下的详细说明后，将变得更加明显。
发明的详细说明
定义
除非另有指明，如同以下以及遍及该揭示内容所采用的，下列术语应被理解为具有下列意义。
除非上下文另外清楚地指明，如此处所使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”以及“该(the)”包括复数指涉。
如此处所使用的，一“有效量(effectiveamount)”包括敏诺西迪或此处所述的一药学组成物的一足以抑制该雄性素受体的功能或治疗一与AR有关的疾病的剂量。
如此处所使用的术语“治疗(treating)”、“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”包括预防的(preventative)[例如预防性(prophylactic)]、舒缓的(palliative)以及治疗的(curative)用途或结果，其中该目 的是去预防或减缓与AR有关的疾病。
术语“抑制(suppressing)”或“抑制(suppress)”包括减缓或减低一雄性素受体的功能、活性或反应，诸如细胞内的蛋白质表现或交互作用。
术语“前驱药(prodrug)”是一无药理活性的化合物，其可借由代谢转化(metabolictransformation)而被转换为一药理活性剂(pharmacologicallyactiveagent)。
本发明的化合物的药学上可接受的盐类包括由一适当的碱[诸如一碱金属(alkalimetal)(例如，钠、钾)、一碱土金属(alkalineearthmetal)(例如，钙、镁)、铵以及NX4+(其中X为C1-C4烷基)]所衍生的盐类。一胺基基团的药学上可接受的盐类包括下列酸的盐类：有机羧酸(organiccarboxylicacids)或有机磺酸(organicsulfonicacids)[诸如酒石(tartaric)、脂族(aliphatic)、环脂族(cycloaliphatic)、芳族(aromatic)、杂环(heterocyclic)、羧基(carboxylic)以及磺基(sulfonic)的类型的有机酸]，诸如，例如，甲酸、葡糖醛酸、苹果酸、马来酸、延胡索酸、丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸、邻胺苯甲酸、甲磺酸、水杨酸、烃苯甲酸、苯乙酸、扁桃酸、扑酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、泛酸、甲苯磺酸、2-羟乙磺酸、对胺苯磺酸、硬酯酸、海藻酸、羟丁酸、环己胺磺酸、半乳糖二酸与半乳糖醛酸以及类似物、乳糖酸以及琥珀酸；以及无机酸(inorganicacids)，诸如氢氯酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、碳酸、硫酸与胺磺酸以及磷酸以及类似物。一具有一羟基基团的化合物的药学上可接受的盐类由该化合物的阴离子与一适当的阳离子[诸如Na+、NH4+或NX4+(其中X为，例如，一C1-C4烷基基团)、Ca++、Li+、Mg++或K+与锌]所共同构成，或者由一级、二级与三级胺、环胺、N,N’-二苯基伸乙二胺(N,N’-dibenzylethylenediamine)、氯普罗卡因(chloroprocaine)、胆碱(choline)、二乙醇胺(diethanolamine)、乙二胺(ethylenediamine)、美洛明 (meglumine)[甲基还原葡糖胺(N-methylglucamine)]与普罗卡因(procaine)以及类似物所制成的有机盐类。所有的这些盐类可借由传统的方式从对应的化合物而被制备，例如，借由将适当的酸或碱与呈自由形式的该化合物相反应。
如此处所使用的术语“与雄性素受体有关的疾病”广泛地意指与雄性素受体结构和/或功能中的一或多个方面有关联的病况。与雄性素受体有关的疾病的特征可在于雄性素受体结构和/或功能中的一或多个方面上自在一群体中存在的正常或基准位准偏离。这些偏离可证实它们在雄性素受体的结构或雄性素受体的活化(包括经改变的雄性素受体的交互作用)上的异常。该多个偏离亦可证实它们在雄性素受体的细胞与组织分布上的异常、在雄性素受体的作用上的偏离(包括正常功能的丧失、获得毒性功能或毒性)，或者在与雄性素受体有关的蛋白质调控与细胞途径上的偏离。目前被认为与雄性素受体有关的病况的例子为AR阳性癌(ARpositivecancer)[诸如前列腺癌(prostatecancer)、肝癌(livercancer)以及乳癌(breastcancer)]、痤疮(acne)、良性前列腺增生(benignprostatehyperplasia)、多囊性卵巢症候群(polycysticovariansyndrome)、心血管疾病(cardiovasculardisease)、脑血管疾病(cerebrovasculardisease)、高血压(hypertension)以及动脉粥样硬化(atherosclerosis)。要被理解的是，与雄性素受体有关的疾病不限于上述病况。
如此处所使用的术语“个体(subject)”通常意指被进行此处所述的方法的一人类或一动物。要被理解的是，一个体可为一带有已知的或被怀疑的与雄性素受体有关的疾病的病患，但不带有已知的或被怀疑的与雄性素受体有关的疾病的个体(诸如研究个体)亦被包括于该术语“个体”的范畴内。
术语“功能”以及类似的术语，可用来论及一雄性素受体的活性或反应。该功能可关于在一带有雄性素受体的细 胞、组织或生物中的结构、分布、反应、过程以及级联(cascades)的改变。当透过不同的参数或方法而被评估时，与该雄性素受体的交互作用可减低或改变该雄性素受体的功能，或导致一经增加或经减少的反应或者一经增加与一经减少这两者的反应。
此处的所有数目为近似值并且可由“大约”所修饰。
治疗与雄性素受体有关的疾病的方法
敏诺西迪[6-吡啶-1-基嘧啶-2,4-二胺3-氧化物(6-piperidin-1-ylpyrimidine-2,4-diamine3-oxide)]在1970年代被引入作为一抗-高血压药剂，而过量的头发生长被注意到为一副作用。它针对在男人中接而在女人中的雄性秃(androgenicalopecia)的局部治疗(topicaltreatment)随后由FDA所批准。该局部治疗配方是可获得的，例如，可商业上得自于Pfizer的商品名![]()
敏诺西迪如何造成过量的头发生长的机制不清楚，但下列机制已被假定：血管扩张(vasodilatation)、血管生成(angiogenesis)、经增强的细胞增生以及钾通道(potassiumchannel)的打开。先前研究已一致地推论：敏诺西迪没有直接透过雄性素效用来作用(NuckAGetal.,TopicalMinoxidldoesnotactasanantiandrogenintheflankorganofthegoldSyrianhamster.Archivesofdermatology.1987；123(1):59-61。MessengerAGetal.,Minoxidil:Mechanismsofactiononhairgrowth.TheBritishJournalofDermatology.2004；150(2):186-194。)
由发明人所发现的是：敏诺西迪结合至AR并且导致与AR有关的功能(诸如转录以及蛋白质表现)的抑制。
此处所提供的是治疗一与AR有关的疾病的方法，其借由投药一有效量的敏诺西迪、它的一药学上可接受的盐类或它的一前驱药以治疗与AR有关的疾病。不被任何特定的理论所限制，被认为的是：敏诺西迪的疗效是借由在该细胞中抑制AR所调控的转录以及转译。
没有限制的与AR有关的疾病的例子为：雄性素受体(AR)阳性癌、皮肤疾病(dermatologicaldisorder)或良性前列腺增生(BPH)、心血管疾病、脑血管疾病、高血压以及动脉粥样硬化。
在一具体例中，该AR阳性癌是选自于：乳癌、前列腺癌以及肝癌。在另一具体例中，该个体实质上没有中枢神经是癌(centralnervoussystemcancer)，诸如脑肿瘤(braintumor)。在另一具体例中，该皮肤疾病是痤疮。
针对依据此处所提供的方法来投药，敏诺西迪可被单独地投药或与一或多种抗-癌剂来组合投药。该抗-癌剂包括传统的化学治疗剂(chemotherapeuticagent)、标靶癌症治疗(targetcancertherapy)或放射线治疗(radiationtherapy)。
该传统的化学治疗剂包括蒽环霉素类(anthracycline)抗生素、DNA合成抑制剂、烷基化试剂(alkylatingagent)、抗叶酸剂(antifolateagent)、代谢抑制剂(metabolicinhibitor)，或者它们的组合。该标靶癌症治疗是借由干扰癌症形成(carcinogenesis)以及癌症生长所需的专一性标靶分子来抑制癌细胞的生长的药剂，而非借由简单地干扰快速分裂的细胞(例如，以传统的化学治疗剂)。该标靶癌症治疗包含激酶抑制剂、表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)抑制剂、HER2/neu受体，或者它们的组合。
敏诺西迪与抗-癌剂的剂量可依据要被治疗的个体的年龄、体重与合并症(comorbidity)而变化。在一具体例中，敏诺西迪的有效量为大约每天5mg至大约100mg。
抑制与雄性素受体有关的功能的方法
此处所提供的是抑制在一细胞、一组织或一个体中的与AR有关的功能的方法，其借由投药一有效量的敏诺西迪、它的一药学上可接受的盐类或它的一前驱药以抑制在该细胞、该组织或该个体中的与雄性素受体有关的功能。
不被任何特定的理论所限制，敏诺西迪借由下列机制中的一或多者来抑制与AR有关的功能：抑制AR转录活化(transactivation)、抑制AR基因转录、抑制AR共活化剂(coactivator)(例如ARA54C)或FxxLF肽与AP交互作用、减低AR的NH2-端与COOH-端(N-C)交互作用以及减低AR安定性。
在此处所提供的方法的各种不同的具体例中，在一细胞、一组织或一个体中，敏诺西迪被投药来抑制AR所调控的转录或转译功能，其可具有在一个体中的有益效用，诸如，但不限于，抑制癌细胞生长或抑制人类毛发真皮乳突细胞(humanhairdermalpapillacell)。使用敏诺西迪来抑制与AR有关的功能可导致减少与AR有关的疾病的症状(symptoms)与征兆(signs)、减缓与AR有关的疾病的进展以及增加具有与AR有关的疾病的个体的寿命。
此处所提供的方法包含在一个体中的治疗性方法以及用途(包括治疗或减缓与AR有关的疾病的方法)以及预防性方法(包括预防或减低与AR有关的疾病的可能性)。此处所提供的方法亦包含研究的方法与用途，其包括抑制在该细胞、该组织或该个体中的与AR有关的功能的活体外(invitro)、离体(exvivo)或活体内(invivo)方法。
带有AR的病理细胞(诸如高度增生的细胞)或组织可借由将该细胞或组织与一有效量的敏诺西迪或本发明的药学组成物相接触而被治疗。带有AR的细胞(诸如前列腺癌细胞)可为原发癌细胞(primarycancercells)，或可为可得自于组织库(tissuebanks)[诸如美国类型培养物收集中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC)]的经培养的细胞。该多个细胞可来自于一脊椎动物，较佳地一哺乳动物，更佳地一人类。美国专利公开序号2004/0087651。Balassianoetal.(2002)Intern.J.Mol.Med.10:785-788。Thorne,etal.(2004)Neuroscience127:481-496。Fernandes,etal.(2005)OncologyReports 13:943-947。DaFonseca,etal.(2008)SurgicalNeurology70:259267。DaFonseca,etal.(2008)Arch.Immunol.Ther.Exp.56:267-276。Hashizume,etal.(2008)Neuroncology10:112-120。
敏诺西迪或此处所描述的药学组成物的活体外功效可使用在此技艺中所熟知的方法而被测定。例如，敏诺西迪的细胞毒性可借由MTT{3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四唑溴化物[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide]}细胞毒性分析(cytotoxicityassay)而被研究。MTT分析是以由代谢活性的细胞摄入MTT(一四唑盐类)的原理为基础，其中它被代谢为一可被分光光度计辨认的蓝色的甲臜(formazon)产物。J.ofImmunologicalMethods65:5563,1983。敏诺西迪的细胞毒性可借由菌落形成分析(colonyformationassay)而被研究。针对结合的敏诺西迪的功能性分析可透过ELISA而被进行。由敏诺西迪所阻碍的细胞周期可借由标准碘化丙锭(propidiumiodide,PI)染色以及流动式细胞测量术(flowcytometry)而被研究。侵入抑制(invasioninhibition)可借由博登腔室(Boydenchambers)而被研究。在此分析中，一层重组基底膜(reconstitutedbasementmembrane)(Matrigel)被涂布至趋化性滤网(chemotaxisfilters)上并且作用为一对于在博登腔室中的细胞迁移的阻隔物。只有带有侵入能力的细胞可跨越该Matrigel阻隔物。其它分析包括，但不限于，细胞可活性分析(cellviabilityassays)、细胞凋亡分析(apoptosisassays)以及形态学分析(morphologicalassays)。分析亦可使用一鼠类模型而于活体内被完成。参见，例如，Teicher,B.,TumorModelsforEfficacyDetermination.MolCancerTher2006；5:2435-2443。
用于治疗或预防性治疗痤疮的方法
此处所提供的是用于治疗或预防性治疗痤疮的方法，其借由投药一有效量的敏诺西迪、它的一药学上可接受的盐 类、它的一前驱药或此处所述的一药学组成物以治疗痤疮。
在一具体例中，敏诺西迪、它的一药学上可接受的盐类、它的一前趋药或此处所述的药学组成物是被局部地投药至被感染的区域大约一天一次至大约一天三次。
药学组成物
此处所提供的是用于治疗或预防性治疗痤疮的药学组成物。针对治疗或预防性治疗痤疮，此处所提供的药学组成物是有用的，较佳地借由该多个组合的有益协同效用(synergisticeffects)。
在一具体例中，该药学组成物包括敏诺西迪、它的一药学上可接受的盐类或它的一前趋药，以及一抗-痤疮药剂。没有限制的抗-痤疮药剂的例子包括维生素A(vitaminA)、一或多种抗生素(antibiotics)、口服避孕药(oralcontraceptives)以及类视色素(retinoids)。
在一具体例中，该类视色素是异维生素A酸(isotretinoin)。在另一具体例中，该抗生素是四环素(tetracycline)或它的一衍生物。在另一具体例中，该抗生素是美诺四环素(minocycline)或它的一衍生物。在又另一具体例中，该抗生素是脱氧羟四环素(doxycycline)或它的一衍生物。
要依据此处所提供的一些具体例的方法而被投药的药学组成物可被配方以、制备以或投药以一药学上可接受的载剂。该多个制剂可借由各种不同的技术而被制备。该多个技术包括令该药学组成物的活性成分(诸如敏诺西迪以及抗生素)与一适当的载剂结合。在一具体例中，药学组成物可借由令该药学组成物的活性成分与液态载剂、与固态载剂或与这两者均匀地且充分地结合而被制备。液态载剂包括，但不限于，水性配方、非-水性配方，或者这两者。固态载剂包括，但不限于，生物载剂、化学载剂，或者这两者。
该药学组成物可呈一水性悬浮液、一油乳剂(oilemulsion)、水包油乳剂(waterinoilemulsion)以及油包 水乳剂(water-in-oil-in-wateremulsion)且于载剂[包括，但不限于，乳霜(creams)、凝胶(gels)、泡沫(foams)、脂质体(liposomes)(中性的、阴离子的或阳离子的)、液态纳米球(lipidnanospheres)或微球体(microspheres)、中性的、阴离子的或阳离子的聚合纳米粒子或微粒子、位置-特异性乳剂(site-specificemulsions)、常驻乳剂(long-residenceemulsions)、粘性-乳剂、微-乳剂、纳米-乳剂]与小型泵(minipumps)中，并连同允许该药学组成物的持续释放(sustainedrelease)的各种不同的天然或合成的聚合物[包括阴离子的、中性的或阳离子的多糖(polysaccharides)以及阴离子的、中性的或阳离子的聚合物或共聚物]而被投药，该小型泵或聚合物可被植入需要组成物递送处的附近。再者，此处所提供的该药学组成物的活性成分与该多个载剂中的任一者或任何的组合是有用的。这些者包括，但不限于，抗-氧化剂、缓冲液以及静菌剂(bacteriostaticagents)，并且可选择性地包括悬浮剂(suspendingagents)以及增稠剂(thickeningagents)。
为了于一非-水性载剂中投药，此处所提供的药学组成物的活性成分可以一矿物油(mineraloil)或以一中性油(neutraloil)[诸如，但不限于，一二酸甘油酯(diglyceride)、一三酸甘油酯(triglyceride)、一磷脂质(phospholipid)、一脂质、一油，以及它们的混合物]而被乳化，其中该油含有多不饱和与饱和的脂肪酸的一适当混合。例子包括，但不限于，大豆油(soybeanoil)、芥花油(canolaoil)、棕榈油(palmoil)、橄榄油(oliveoil)以及myglyol，其中脂肪酸碳的数目是介于12与22之间，并且其中该多个脂肪酸可为饱和或不饱和的。选择性地，带电的脂质或磷脂质是被悬浮于该中性油中。一适当的磷脂质为，但不限于，标靶于巨噬细胞(macrophages)上的受体的磷脂酰丝胺酸(phosphatidylserine)。此处所提供的药学组成物可选择性地使用已知的技术而被配方于一水性介质中 或被配方为乳剂。
此处所提供的药学组成物可包括此处所述的敏诺西迪以及选择性地包括其它治疗性和/或预防性成分。该载剂或其它治疗性成分必须在与该组成物的其它成分兼容并且不会有害于它的接受者(recipient)的效用上是可接受的。
该药学组成物是以一有效量而被投药以治疗或预防性治疗痤疮。该药学组成物所投药的剂量会端视要被治疗的痤疮的严重性与位置、特定的配方以及其它临床因子，诸如接受者的体重与病况以及投药的途径。在一具体例中，该药学组成物所投药的剂量对应于大约1％至10％的敏诺西迪。在另一具体例中，该药学组成物所投药的剂量对应于大约2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％的敏诺西迪或其间以0.1％增量的任何％。在一进一步的具体例中，该药学组成物所投药的剂量对应于大约5％的敏诺西迪。
依据此处所提供的方法，该药学组成物可借由各种不同的途径而被递送，包括，但不限于，注射[例如，皮下的(subcutaneous)、肌肉内的(intramuscular)、静脉内的(intravenous)、动脉内的(intra-arterial)、腹膜内的(intraperitoneal)]；连续静脉内注入(continuousintravenousinfusion)；局部的(topical)[皮肤地(cutaneously)、真皮地(dermally)、穿皮地(transdermally)；口服地(orally)[例如，锭剂(tablet)、丸剂(pill)、液态药物(liquidmedicine)、可食性薄膜带(ediblefilmstrip)]；植入式渗透泵(implantedosmoticpumps)；栓剂(suppository)；气溶胶喷雾(aerosolspray)、插入皮肤的印模(impressionintoskin)以及电穿孔(electroporation)。在一具体例中，该药学组成物被局部地施用以治疗或预防性治疗痤疮。
在一预定的时程上，或者历时适合于要被治疗的疾病、接受者的病况以及投药的途径的一段时间，一药学组成物可以单一剂量治疗或以多重剂量治疗而被投药。所欲的剂量可 便利地被呈现于单一剂量中或被呈现为于适当的间隔下而被投药的经分割的剂量，例如，每天二、三、四或多个次-剂量(sub-doses)。该次-剂量本身可进一步被分割，例如，被分割为许多不连续的零散间隔的投药。
本发明的具体例是借由下列实施例而被例示说明，在任何情况下该多个实施例不被解释为构成在本发明的范畴上的限制。相反地，可被清楚理解的是：在阅读此处的说明之后可将它们暗示于熟习此技艺者而没有背离本发明的精神的各种不同的其它具体例、修饰以及它们的等效物可作为凭借。除非另外有所指明，在下列实施例中所述的研究的期间内，传统的操作程序被遵循。为了例示说明的目的，一些操作程序被描述于下面。
附图说明
本发明例示说明的具体例是参照下列图式而被详细地说明于下面：
图1是一说明敏诺西迪在MMTV-Luv报导子分析(reporterassay)中抑制AR转录活化的图集。(a)区是一说明pSG5-AR、二氢睪固酮(DHT)以及各种不同浓度的敏诺西迪在前列腺癌细胞(PC-3)中的效用的长条图。(b)区是一说明DHT以及敏诺西迪在前列腺癌细胞(LNCaP)中的效用的长条图。
图2是一说明敏诺西迪在AR基因转录与蛋白质表现上的抑制效用的图集。(a)区是一说明pSG5-AR、二氢睪固酮(DHT)以及各种不同浓度的敏诺西迪在前列腺癌细胞(PC-3)中的AR转录上的效用的长条图。(b)区是一显示各种不同浓度的敏诺西迪在前列腺癌细胞(LNCaP)中的AR蛋白质与前列腺特异性抗原(prostatespecificantigen,PSA)表现上的效用的西方墨点分析(Westernblottinganalysis)的照片。(C)区是一说明500ng的pSG5-AR、各种不同浓度的敏诺西迪以及激素(hormone)地塞松(dexamethasone)(Dexan,1uM) 在PC-3细胞中的效用的长条图。
图3是一说明敏诺西迪在前列腺癌细胞(PC-3)中的肽-AR与辅因子-AR交互作用上的抑制效用的图集。(a)区是一说明DHT以及各种不同浓度的敏诺西迪在AR-FxxLF肽交互作用上的效用的长条图。(b)区是一显示DHT以及各种不同浓度的敏诺西迪在AR-辅因子-AR(ARA54C)交互作用上的效用的长条图。
图4含有一说明各种不同浓度的敏诺西迪在前列腺癌细胞(PC-3)中抑制AR的NH2-端与COOH-端(N-C)交互作用的长条图。
图5A含有一说明敏诺西迪在前列腺癌细胞(LNCaP)中以一剂量依赖性(dosedependent)的方式减低AR安定性的西方墨点分析照片的图集。图5B是一关于敏诺西迪脉冲-追踪(pulse-chase)时程研究的的西方墨点分析照片的图集。
图6A-6F是一说明敏诺西迪抑制在皮肤细胞中的AR转录活化的图集。
图7是一说明5％局部的敏诺西迪在痤疮上的效用的照片。图7A是在5％局部的敏诺西迪治疗开始之前所拍摄的，以及图7B是在5％局部的敏诺西迪的7-天疗程之后所拍摄。该多个照片显示在敏诺西迪治疗之后的较快的疗愈时间以及较少的痤疮爆发。
图8是一显示5％局部的敏诺西迪在治疗痤疮历时48小时期间上是有效的之照片集。
具体实施方式
较佳实施例的详细说明
在实施例中所使用的材料与方法的说明
下列材料与方法被用于下面所述的实施例中。
细胞培养：前列腺癌细胞株(PC-3与LNCaP)以及人类毛发真皮乳突细胞被使用遍及实验性研究。人类前列腺癌细胞株(PC-3与LNCaP)被培养于补充有10％胎牛血清(fetal bovineserum)的杜贝可氏最低基本培养基(Dulbecco’sminimumessentialmedium)中。人类毛发真皮乳突细胞(HHDPC)被维持于具有10％胎牛血清(fetalcalfserum)的RPMI培养基中。前列腺癌细胞(1x105)被接种于24-井培养盘(24-wellplate)的各井中并且于一具有5％CO2的37℃培养箱中被培养过夜。
细胞转录分析(CellTranscriptionAssay)：在实施例1、3、4以及6中，小鼠乳腺肿瘤病毒-荧光酶(mousemammarytumorvirus-luciferase,MMTV-Luc)报导子分析(Promega,Madison,WI)被用来测量荧光酶活性。荧光酶通常被用来作为一报导子以评估在细胞中AR所调控的转录活性。
在实施例2中，前列腺特异性抗原-荧光酶(prostatespecificantigen-luciferase,PSA-Luc)报导子分析(Promega,Madison,WI)被用来测量荧光酶活性。
统计学分析(StatisticalAnalysis)：统计学显著性(statisticalsignificance)是借由变异数分析(analysisofvariance)[t-试验(t-test)]而被计算。若p值＜0.05，组别之间的差异被认为是显著的。
实施例
实施例1.敏诺西迪抑制在前列腺癌细胞中的AR转录活性
敏诺西迪在前列腺癌细胞AR转录活化上的活体外效用评估被进行。前列腺癌细胞是如先前所述而被培养。PC-3细胞是依据制造商的操作指南来使用Superfect套组(购自于QiagenScience,MD,USA)而被转染以300ng的pSG5-AR以及700ng的MMTV-LUC报导子质体(被描述于K.Nishimuraetal.,(2003)“Modulationofandrogenreceptortransactivationbygelsolin:anewlyidentifiedandrogenreceptorcoregulator.”CancerRes63(16):4888-4894以及S.Yehetal.,(1996)“Cloningandcharacterizationofaspecificcoactivator,ARA70,fortheandrogenreceptorinhumanprostatecells.”Proc NatlAcadSciUSA93(11):5517-5521中)，而LNCaP细胞是使用Superfect套组而被转染以1000ng的MMTV-LUC报导子质体(描述于K.Nishimuraetal.2003以及S.Yehetal.1996中)。
该多个经转染的前列腺癌细胞被培养历时16h，接着在具有或没有10-3至10-6M的敏诺西迪下被处理以乙醇和/或1nMDHT历时另一16h。
该多个前列腺癌细胞被收取以及荧光酶活性是使用MMTV-Luc报导子分析而被测量。图1A与1B显示DHT增强荧光酶活性以及在前列腺癌细胞中的AR所调控的转录，而敏诺西迪以一剂量依赖性(dose-dependent)的方式减低在DHT存在下的AR所调控的荧光酶活性。
实施例2.敏诺西迪抑制在前列腺癌细胞中的AR所调控的转录以及转译
敏诺西迪在AR转录上的活体外效用评估被进行。前列腺癌细胞是如前面所述而被培养。
PC-3细胞是使用Superfect套组而被转染以300ngpSG5-AR以及700ngPSA-Luc(1.5kb)质体(被描述于K.Nishimuraetal.2003以及S.Yehetal.1996中)以及被培养历时16h。该多个经转染的前列腺癌细胞在具有或没有10-3至10-6M的敏诺西迪下被处理以乙醇、pSG5-AR和/或1nMDHT历时另一16h，以及为了荧光酶活性而被收取。图2A显示增强荧光酶活性以及在前列腺癌细胞中的AR所调控的转录，而敏诺西迪在以一剂量依赖性的方式减低在DHT存在下的荧光酶活性以及AR所调控的荧光酶活性上是有效的。
前列腺癌细胞(LNCaP)被处理以DMSO或10-3至10-5M的敏诺西迪历时24h。该多个细胞被制备而用于在SDS/PAGE凝胶上的电泳(electrophoresis)，接而被转印至硝化纤维素(nitrocellulose)(Minipore,Billerica,USA)上。
AR、PSA以及β-肌动蛋白(beta-actin)蛋白质是分别使 用抗-AR(来自于SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,USA的N-20)、抗-PSA(来自于SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,USA的C-19)或抗-微管蛋白(来自于Millipore,Billerica,USA的MAB1501)而被鉴别。影像是使用碱性磷酸酶受体彩色套组(alkalinephosphatasesubstratecolorkit)(Bio-Rad,Hercules,USA)而被显示。
图2B显示敏诺西迪在以一剂量依赖性的方式来抑制在DHT存在下的AR所调控的PSA蛋白质表现上是有效的。
为了评估敏诺西迪在高浓度下可能的非专一性作用，一控制研究被进行而在糖皮质素受体(glucocorticoidreceptor,GR)转录活性上测试不同浓度的敏诺西迪(1-100μM)。如图2C所示，在报导子分析中最高浓度的敏诺西迪(100μM)有影响在PC-3细胞中的GR转录活性，而较低的浓度(1-10μM)则没有。该多个数据暗示：当于高浓度下使用时，敏诺西迪(一小疏水性分子)可在细胞中具有多重标的。
实施例3.敏诺西迪抑制在前列腺癌细胞中的AR辅因子(cofactor)交互作用
许多AR共活化剂透过似FxxLF要素(FxxLF-likemotif)结合至AR的配位子-结合领域以增强AR转录活化。ARA54C是一已被显示具有对于AR的高配位子所诱导的亲和性的AR共活化剂。在ARA54C与AR之间的交互作用是借由在该AR配位子-结合领域中的FxxLF要素所媒介。
敏诺西迪在AR辅因子交互作用上的活体外评估是于前列腺癌细胞中所进行。前列腺癌细胞(PC-3)是如前面所述而被培养。PC-3细胞是使用Superfect套组而被转染以300ng的pG5-LUC报导子基因质体(被描述于K.Nishimuraetal.2003以及S.Yehetal.1996中)、350ng的在pCMX-GAL4载体中的AR共活化剂(ARA54C)或肽(FxxLF)以及350ng的VP16-AR，并且被培养历时16h。
该多个经转染的前列腺癌细胞在具有或没有10-3至10-5 M的敏诺西迪下被处理以乙醇以及1nMDHT历时16h。AR-FxxLF肽与AR-ARA54C的交互作用是使用哺乳动物二-杂和分析(Mammaliantwo-hybridassay)而被检测，而荧光酶活性是使用MMTV-Luc报导子分析而被测量。
图3A显示敏诺西迪抑制在DHT存在下的含FxxLF的肽与AR的交互作用，因此以一剂量依赖性的方式减少荧光酶活性。图3B显示敏诺西迪抑制在DHT存在下的ARA54C共活化剂与AR的交互作用，因此以一剂量依赖性的方式减少荧光酶活性。
实施例4.敏诺西迪抑制AR的NH2-端与COOH-端(N-C)交互作用
对于由该AR的N-端FxxLF要素所媒介的整个与AR有关的功能，AR的NH2-端与COOH-端(N-C)交互作用是重要的。敏诺西迪在AR的N-C交互作用上的活体外评估在前列腺癌(PC-3)细胞中被进行。
PC-3细胞是如前面所述而被培养并且是使用Superfect套组而被转染以300ng的pG5-LUC报导子基因质体、350ng的质体pCMX-GAL4-AR-C(a.a.663～919)(被描述于K.Nishimuraetal.2003以及S.Yehetal.1996中)以及350ng的VP16-AR-N(a.a1～506)，并且被培养历时16h。
该多个经转染的前列腺癌细胞在具有或没有10-3至10-6M的敏诺西迪下被处理以乙醇以及1nMDHT历时另一16h。该N-C交互作用是使用哺乳动物二-杂和分析而被检测，而荧光酶活性是使用MMTV-Luc报导子分析而被测量。
图4显示呈一范围落在10至100μM的浓度的敏诺西迪抑制在DHT存在下的该N-C交互作用，因此减少在前列腺癌细胞中的荧光酶活性。这暗示：敏诺西迪亦破坏AR的N-端与C-端交互作用，对于敏诺西迪的与AR有关的功能的抑制提供了一额外的机制。
实施例5.敏诺西迪减低在前列腺癌细胞中的AR安定性
敏诺西迪在AR安定性上的活体外评估在前列腺癌细胞 (LNCaP)中被进行。
LNCaP细胞是如前面所述而被培养并且被处理以DMSO或10-3至10-5M的敏诺西迪历时24h。该多个细胞被制备而用于在SDS/PAGE凝胶上的电泳，接而被转印至硝化纤维素上。
AR以及β-肌动蛋白蛋白质是分别使用抗-AR或抗-微管蛋白而被鉴别。影像是使用碱性磷酸酶受体彩色套组而被显示。
图5A说明敏诺西迪以一剂量依赖性的方式减低在DHT存在下的AR安定性。
如图5B所示，敏诺西迪诱导在AR蛋白质上的减少，其在处理后的8小时最为明显，在该时间点上AR蛋白质位准为36％的预处理数值。该多个观察暗示：敏诺西迪的作用机制可能包括在AR安定性上的减低。
实施例6.敏诺西迪抑制在人类毛发真皮乳突细胞中的AR转录活化
敏诺西迪在真皮乳突细胞的AR转录活化上的活体外效用评估被进行。人类毛发真皮乳突细胞是如前面所述而被培养，并且是使用Superfect套组而被转染以300ng的pSG5-AR以及700ng的MMTV-LUC报导子质体(被描述于K.Nishimuraetal.2003以及S.Yehetal.1996中)。
该多个经转染的人类毛发真皮乳突细胞(HHDPCs)被培养历时16h，接而被处理以1nMDHT以及下列中的一者历时另一16h：比卡鲁胺(bicalutamide)(一非-类固醇的抗-雄性素药剂)或10-3至10-5M的敏诺西迪。
HHDPCs细胞被收取以及荧光酶活性是使用MMTV-Luc报导子分析而被测量。图6A与6B显示在HHDPCs中分别呈mRNA与蛋白质位准的AR表现。如图6C所示，敏诺西迪以一浓度依赖性的方法抑制AR转录活性[将径(lane)4以及5与径2相比较]。使用10-3以及10-4M的敏诺西迪在真皮乳突细胞中的AR转录活化的抑制是统计学显著性的。敏诺西迪在 HHDPCs中的AR蛋白质安定性上的效用被说明于图6D中，其显示敏诺西迪诱导在AR蛋白质安定性上的浓度依赖性的减少。该多个数据提供敏诺西迪在治疗AGA上的功效可能涉及与AR有关的功能的抑制的进一步的证据。
在AGA治疗的情况下敏诺西迪被认为如同一钾通道开启者来作用，作用主要是与在毛囊(hairfollicles)中的SUR2B/Kir6.1钾通道亚型(subtype)有关联(ShorterK,etal.,HumanhairfolliclescontaintwoformsofATP-sensitivepotassiumchannels,onlyoneofwhichissensitivetominoxidil.FASEBjournal:officialpublicationoftheFederationofAmericanSocietiesforExperimentalBiology.2008；22(6):1725-1736)。如图6C(将径6与径2相比较)所示，在报导子分析中甲苯磺丁尿素(Tolbutamide)(一已被报导拮抗敏诺西迪在头发生长上的效用的钾通道阻断剂)抑制于HHDPCs中的AR转录活性。HHDPCs与各种不同的癌细胞株的测试进一步显示：HHDPCs表现与在缺乏内生性的(endogenous)AR之前列腺癌细胞株PC-3中所发现者相同的钾通道亚型(图6E)。特别地，敏诺西迪抑制在PC-3细胞中的AR转录活性，然而此效用不会由甲苯磺丁尿素所阻断(图6F)，暗示：敏诺西迪在AR转录活性上的抑制效用不是一与钾通道有关的作用。
实施例7.使用局部的敏诺西迪来治疗以及预防性治疗痤疮
局部的敏诺西迪在痤疮上的活体内评估是于一女性病患中而被进行。图7A是在局部的敏诺西迪处理开始之前所拍摄，其显示一带有多样的丘疹于她的前额上的病患。5％的敏诺西迪溶液被局部地施用至左侧前额(红色圆圈)上，每天一次历时7天，而右侧前额为控制侧。图7B是在7-天疗程的敏诺西迪治疗之后所拍摄，其显示在该左侧(经治疗的)前额上的丘疹消失。此外，与该右侧(未经治疗的)前额相较的下，于该左侧(经治疗的)前额上有较少的新丘疹形成。
这个结果暗示：局部的敏诺西迪在治疗以及预防性治疗痤疮上是有效的。
实施例8.使用敏诺西迪来治疗痤疮
5％的敏诺西迪被局部地施用至一于一病患脸上的痤疮。图8A显示一在治疗开始之前所拍摄的照片，图8B显示一在一次5％的敏诺西迪的施用之后所拍摄的照片，以及图8C显示一在二次5％的敏诺西迪的施用之后所拍摄的照片，其显示在痤疮附近的红斑(erythema)与肿胀(swelling)上的显著减少。该多个照片显示：5％的敏诺西迪在治疗痤疮上是有效的。
实施例9.局部的敏诺西迪投药在一临床试验(clinicaltrial)中减少痤疮的症状以及征兆
一双盲(double-blind)的临床试验被进行，其中局部的敏诺西迪以及安慰剂(placebo)被投药给带有痤疮的病患。与安慰剂组相较之下，接受局部的敏诺西迪的病患显示在痤疮的症状以及征兆上的一统计显著性的减少。
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