以植物和真菌类为原料提取的多糖粗品或作为保健品的多糖,常因含有
酚型化合物,使之有较深的色泽,用碱提取获得的多糖则颜色更深。这些色
素的存在,不但影响多糖作为保健品或药物时的外观,而且给多糖的进一步
分离、纯化和结构鉴定带来极大的困难。目前,主要采用以下三种方法除去
多糖粗品(包括保健品多糖)中所含有的色素,然而这三种方法均存在一定
的局限性。
1.活性炭吸附脱色。活性炭对多糖具有较强的吸附作用,多糖的损失
较大,而且采用这种方法脱色后,过滤起来也相当困难,可以说这种方法对
多糖脱色是不合理的。
2.弱碱性树脂脱色,如Duolite A-7,DEAE-纤维素等吸附多糖中的色素。
这种方法主要应用于除去多糖粗品中游离的色素,如果色素与多糖结合,多
糖也被树脂同时吸附,用水难以洗脱下来。另外,对酸性多糖不宜采用该方
法脱色。
3.双氧水氧化脱色。采用这种方法对除去与多糖结合色素具有一定的
效果,然而,在脱色过程中,虽然严格控制脱色的条件,如温度、时间、PH
值等,但还会引起多糖的部分降解。
以上三种方法应用于医药工业中多糖粗品的脱色均存在很多缺陷。
本发明目的是在于多糖具有多方面的功能,如多糖作为广谱免疫促进剂
用以治疗与机体免疫系统有关疾病;多糖的糖链分子医学中具有凝性作用;
它在医药上又是一种良好的佐剂。而多糖中的色素存在直接影响多糖作为药
物或保健品的外观,寻找一种应用新的脱色方法去除多糖粗品中的色素并减
少对多糖、保健品本身的影响具有重要的实用意义。
本发明另一目的是目前采用的脱多糖中的色素常对多糖的分离、纯化和
结构鉴定工作产生干扰,寻找一种新的脱色素方法,它既可脱去多糖中的色
素而且不破坏多糖的结构。
本发明的技术方案是这样实施的:一种多糖、保健品去色素的方法,其
特征在于由反胶束溶液与多糖或保健品粗品预处理液在1∶1~1∶8(V/V)的比
例下剧烈混合3分钟,静置分层,下层液为脱色后的多糖或保健品样品液;
反胶束溶液由CTAB浓度10-250mM、正己醇5%-35%(V/V)、异辛烷
65%-95%(V/V)组成;
多糖或保健品的预处理为原料经95%乙醇脱脂,残渣用沸水提取,提取
液浓缩后经乙醇沉淀得多糖粗提物,粗提物按比例溶于水中,沸水浴加热30
分钟,振荡溶解,3000rpm离心3分钟,上清液加入一定量NaCl,得多糖、
保健品预处理液;
1.反胶束溶液,多糖或保健品粗品预处理液的比例为1∶1~1∶8(V/V)。
首先制备反胶束溶液,它由十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、正己醇、
异辛烷组成。
它们的浓度和含量如下:
CTAB的浓度为10-250mM
正己醇的含量为5%-35%(V/V)
异辛烷的含量为65%-95%(V/V)
上述按比例组成备用。
2.对多糖粗品预处理液的制备:
植物和真菌类原料,经95%乙醇脱脂,残渣用沸水提取,提取液浓缩后
经乙醇沉淀得多糖粗提物。称取2mg-6mg多糖粗提物于1mL水中,沸水浴
加热30分钟,震荡溶解,3000rpm离心3分钟,根据不同性质的多糖上清
液加入氯化钠50mM-500mM,即为多糖粗品预处理液。
3.多糖的脱色过程
取上述反胶束溶液与多糖粗品预处理液,以1∶1~1∶8(V/V)比例,剧烈
混合3分钟,静置分层后,下层水液即为脱色后的多糖样品液。该多糖样品
液继续进行分离、纯化,最终获得颜色浅淡的脱色后多糖产品。
多糖回收率的计算
糖含量的测定
硫酸-苯酚法,100μl待测定的样品液加入0.4mL及2mL硫酸(98%),
振动后显色,测定λ=490nm时的吸光度A。
标准曲线的制作
准确称取2mg葡萄糖并溶于5mL相应盐浓度(与多糖预处理液相同)
的水溶液中,分别取0.2mL,0.4mL,0.6mL,0.8mL,1.0mL,稀释至1.0mL,
测定λ=490nm时的吸光度A,以吸光度对相应的葡萄糖的浓度作图,得一
元线性回归方程Y=2.887X,吸光度A小于1.2,均能保持较好的线性关系。
为消除萃取得到的下层多糖溶液中少量的CTAB及正己醇,对糖含量测
定所可能造成的影响,以相应盐浓度的水溶液与1~8体积的反胶束溶液混
合,静置分层,以下层水溶液配制标准的葡萄糖液,采用上述方法作标准曲
线,所得结果在硫酸苯酚比色测定法的误差范围内(<5%)。
多糖的回收率的计算:
C1/C2×V1/V2×100%==(A11-A12)/(A21-A22)×V1/V2×100%
C1-脱色后的下层多糖水溶液的糖浓度
C2-多糖粗品预处理液的糖浓度
V1-脱色后的下层多糖水溶液的体积
V2-多糖粗品预处理液的体积
A11-脱色后的下层多糖水溶液,稀释5倍,加硫酸-苯酚显色后的吸光
度
A12-脱色后的下层多糖水溶液,稀释5倍,加硫酸及0.2mL盐水,测
定的吸光度
A21-多糖粗品预处理液,稀释5倍,加硫酸-苯酚显色后的吸光度
A22-多糖粗品预处理液,稀释5倍,加硫酸及0.2mL盐水,测定的吸
光度
本发明具有如下优点:
1.采用本法脱色效果较好,对色泽愈深的多糖粗品,脱色效果更佳,
而且对未经脱蛋白质处理的多糖粗品具有同样的脱色效果。
2.采用本法多糖的回收率较高,在90%以上,对酸性多糖含量较高的
粗品回收率也超过80%。
3.采用本法可以一次性除去多糖中的绝大部分色素,无需多次脱色。
下面结合实施例对本发明做详细说明。
实施例:
首先制备反胶束溶液,它由十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、正己醇、
异辛烷组成。
它们的浓度和含量如下:
CTAB的浓度为10-250mM
正己醇的含量为5%-35%(V/V)
异辛烷的含量为65%-95%(V/V)
上述按比例组成备用。
实施例一 积雪草(中性)多糖粗提物的脱色
准确称取32mg积雪草多糖粗提物,加入8mL水,沸水浴30分钟,搅
拌溶解,3000rpm离心3分钟,上清液中加入氯化钠(300mM),得积雪草
多糖预处理液,取4mL与1mL反胶束溶液混合3分钟,静置30分钟分层,
萃取分离得下层多糖溶液,按照前述方法,测得的结果为:
A11=0.570 A12=0.011
A21=0.647 A22=0.013
积雪草多糖的回收率为:(0.570-0.011)/(0.647-0.013)×4.4/4×
100%=97.4%
实施例二 螺旋藻(肽)多糖粗提物的脱色
准确称取32.2mg螺旋藻多糖粗提物(未经脱蛋白质处理),加入8mL
水,沸水浴30分钟,搅拌溶解,3000rpm离心3分钟,上清液中加入氯化
钠(100mM),得螺旋藻多糖预处理液,取8mL与1mL反胶束溶液混合3
分钟,静置30分钟分层,萃取分离得下层多糖溶液,按照前述方法,测得
的结果为:
A11=0.447 A12=0.000
A21=0.543 A22=0.000
螺旋藻多糖的回收率为:(0.570-0.000)/(0.647-0.000)×4.4/4×
100%=90.6%
实施例三 灵芝(中性)多糖粗提物的脱色
准确称取17.3mg灵芝多糖粗提物(未经脱蛋白质处理),加入5mL水,
沸水浴30分钟,搅拌溶解,3000rpm离心3分钟,上清液中加入氯化钠
(100mM),得灵芝多糖预处理液,取5mL与1mL反胶束溶液混合3分钟,
静置30分钟分层,萃取分离得下层多糖溶液,按照前述方法,测得的结果
为:
A11=0.236 A12=0.000
A21=0.264 A22=0.000
灵芝多糖的回收率为:(0.236-0.000)/(0.264-0.000)×4.4/4×
100%=98.3%
实施例四 石见穿(酸性)多糖粗提物的脱色
准确称取24.6mg石见穿多糖粗提物,加入6mL水,沸水浴30分钟,
搅拌溶解,3000rpm离心3分钟,上清液中加入氯化钠(500mM),得石见
穿多糖预处理液,取1mL与1mL反胶束溶液混合3分钟,静置30分钟分
层,萃取分离得下层多糖溶液,按照前述方法,测得的结果为:
A11=0.236 A12=0.000
A21=0.348 A22=0.000
石见穿多糖的回收率为:(0.236-0.000)/(0.348-0.000)×4.4/4×
100%=80.87%