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本发明公开了一种硫化氢在提高抗肿瘤药物抑瘤率中的应用以及在制备抗肿瘤药物增效剂中的应用。本发明还公开了一种提高抗肿瘤药物抑瘤率的方法，该方法包括在抗肿瘤药物处理前或者处理的同时，向癌细胞施用抗肿瘤药物增效剂。本发明中的增效剂采用硫化氢、可溶性硫氢盐类或可溶性硫化物作为有效成分，该增效剂作用于机体肿瘤细胞后，可显著提高抗肿瘤药物的抑瘤效果，对机体正常细胞的副作用非常小，可以忽略不计，大大减轻了对正常细胞造成的副作用。

1.  硫化氢在提高抗肿瘤药物抑瘤率中的应用。

2.  硫化氢在制备抗肿瘤药物增效剂中的应用。

3.  如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物包括过氧化氢、阿霉素、丝裂霉素、5-氟尿嘧啶和平阳霉素。

4.  如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤包括肝癌、肺癌、胃癌、皮肤癌和食道癌。

5.  如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物增效剂的有效成分为硫化氢、可溶性硫氢盐类、可溶性硫化物中的至少一种。

6.  如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物增效剂的有效成分的浓度为0.01～5mmol/L。

7.  如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的可溶性硫氢盐类为NaHS或KHS。

8.  如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的可溶性硫化物为Na₂S或K₂S。

9.  一种提高抗肿瘤药物抑瘤率的方法，其特征在于，包括以下步骤：在抗肿瘤药物处理前或者处理的同时，向癌细胞施用抗肿瘤药物增效剂；
所述抗肿瘤药物增效剂的有效成分为硫化氢、可溶性硫氢盐类、可溶性硫化物中的至少一种。

10.  如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述抗肿瘤药物增效剂的有效成分的浓度为0.01～5mmol/L。

硫化氢在提高抗肿瘤药物抑瘤率中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及硫化氢在提高抗肿瘤药物抑瘤率中的应用以及一种提高抗肿瘤药物抑瘤率的方法。
背景技术
对肿瘤/癌症患者来说，治疗的手段不外乎3种：手术、放疗和化疗。而手术的应用范围较窄，一般只适用于良性肿瘤患者，且只能切除非必需器官；放疗和化疗是大多数肿瘤/癌症患者的优先选择。
放疗是利用放射线(如X射线、γ射线，电子射线)的辐射能来杀灭癌细胞的一种方法。高剂量的射线可直接作用于DNA，引起DNA分子断裂或交联；低剂量的射线可引起组织液电离，产生自由基，自由基进而破坏生物大分子，引起细胞死亡。放射治疗时所用的辐射剂量一般为低剂量，主要以间接作用的方式来杀灭癌细胞。
化疗是用化学药物来杀灭癌细胞的一种方法。化疗药物种类较多，大部分化疗药物，如阿霉素、丝裂霉素、5-氟尿嘧啶等施加到特定部位后，也会在体内形成自由基，并通过自由基的作用来杀灭癌细胞(FreeRadicalBiol.Med.1990,8:567)。
自由基包括多种组分，其中反应活性最高的是羟自由基(HO·)，它主要来自于Fenton反应：
Fe²⁺+H₂O₂+H⁺→HO·+H₂O+Fe³⁺
由于细胞内有许多含铁蛋白，在受到辐射或化疗药物攻击后会释放Fe²⁺，继而与H₂O₂反应生成HO·。虽然，HO·寿命很短，但其化学反应活性极高，可以和细胞内几乎所有大分子物质(如蛋白质、DNA、RNA和脂质)进行反应，将这些生物大分子氧化。如HO·可与氨基酸残基反应引起分子的羰基化。羰基化是一个不可逆的过程，不仅可造成蛋白断裂形成小肽段，而且可进一步衍生形成毒蛋白。HO·也会氧化脂质，使不饱和脂质转变成极性的过氧化脂质，从而使膜流动性升高，造成细胞内含物的流失和膜蛋白的失活。胞内H₂O₂引起的DNA损伤也与Fenton反应有关，由于二价铁很容易和DNA上带负电的磷酸骨架结合，当细胞内有H₂O₂时，就会和DNA上结合的Fe²⁺发生Fenton反应产生HO·，从而破坏DNA的结构，严重时甚至使DNA断裂。
为了对抗外界施加的或者自身代谢产生的过氧化氢及自由基，细胞进化出了多种应答途径。其中最重要的途径是产生超强/超量的过氧化氢酶。如结肠癌细胞的过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性就比周围的黏膜细胞高2-3倍(Mekhailetal,CancerRes.1989,49:4866)。为此，许多药物研发机构一直致力于开发抗癌药物增效剂。
公布号为CN101583366A的发明专利申请文献公开了一种过氧化氢和透明质酸的混合制剂，可用来增强抗癌药物的疗效，其原理是利用过氧化氢与抗癌药的氧化协同来杀死癌细胞。这类协同处理虽然能提高抗癌药物的疗效，但其副作用也会有所增强，因此需要添加透明质 酸来加强对正常细胞的保护。
因此，有必要探究一种新的抗癌药物增效剂来解决上述抗癌药物副作用大的问题。
发明内容
本发明发现硫化氢对过氧化氢酶具有较强的抑制作用，用含有硫化氢或能够释放硫化氢气体的试剂处理癌细胞后施加抗癌药物，或在处理的同时施加抗癌药物，可大大提高癌细胞的死亡率。
基于以上发现，本发明提供了硫化氢在提高抗肿瘤药物抑瘤率中的应用。
研究发现，硫化氢在常温下为气态物质，能自由穿过细胞膜进入细胞，使胞内的过氧化氢酶失活；而且硫化氢是人体正常的气态信号分子组分，人体血液中约含60μM硫化氢，肠道组织中甚至高达1mM，只要对肿瘤组织有选择性地定向施加硫化氢或硫化氢释放试剂，对机体正常细胞的副作用几乎可以忽略不计。
本发明所述的硫化氢释放试剂即指能够释放硫化氢气体的抗肿瘤药物增效剂；所述的抗癌药物或者抗肿瘤药物都是抗肿瘤/癌症的泛称。
本发明还提供了硫化氢在制备抗肿瘤药物增效剂中的应用。
具体地，所述的抗肿瘤药物包括过氧化氢、阿霉素、丝裂霉素、5-氟尿嘧啶和平阳霉素。
具体地，所述的肿瘤为肝癌、肺癌、胃癌、皮肤癌和食道癌中的一种。
作为优选，所述抗肿瘤药物增效剂的有效成分为硫化氢、可溶性硫氢盐类、可溶性硫化物中的至少一种。
优选地，所述抗肿瘤药物增效剂的有效成分的浓度为0.01～5mmol/L。
优选地，所述的可溶性硫氢盐类为NaHS或KHS。
优选地，所述的可溶性硫化物为Na₂S或K₂S。
本发明还提供了一种提高抗肿瘤药物抑瘤率的方法，包括以下步骤：在抗肿瘤药物处理前或者处理的同时，向癌细胞施用抗肿瘤药物的增效剂；
所述增效剂的有效成分为硫化氢、可溶性硫氢盐类、可溶性硫化物中的至少一种。作为优选，所述抗肿瘤药物增效剂的有效成分的浓度为0.01～5mmol/L。更优选，浓度为0.05～1.00mmol/L。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明对于已知化合物硫化氢发掘了新的提高抗肿瘤药物抑瘤率的用途，开拓了一个新的应用领域。
(2)本发明增效剂采用硫化氢、可溶性硫氢盐类或可溶性硫化物作为有效成分作用于机体肿瘤细胞，显著提高了抗肿瘤药物的抑瘤效果，对机体正常细胞的副作用非常小，可以忽略不计，大大减轻了对正常细胞造成的副作用。
(3)本发明提供的增效剂可以工业化生产，利用该试剂可以进行抗肿瘤辅助药物的制备，可减少传统化疗或放疗剂量，降低患者机体正常细胞的损伤。
附图说明
图1为硫氢化钾与过氧化氢对人肺癌细胞株A549生长的协同抑制作用(相对抑制率，％)；
A:0.01mMKHS；B:0.2mMKHS；C:5mMKHS；D:0.2mMH₂O₂；E:1mMH₂O₂；F:5mMH₂O₂；G:0.01mMKHS+0.2mMH₂O₂；H:0.01mMKHS+1mMH₂O₂；I:0.2mMKHS+0.2mMH₂O₂；J:0.2mMKHS+1mMH₂O₂。
图2为硫化钠与阿霉素对人胃癌细胞株SGC7901生长的协同抑制作用(相对抑制率，％)；
A：0.05mMNa₂S；B:0.2mMNa₂S；C:1mMNa₂S；D:0.2mg/mL阿霉素；E:1mg/mL阿霉素；F:5mg/mL阿霉素；G:0.05mMNa₂S+0.2mg/mL阿霉素；H:0.05mMNa₂S+1mg/mL阿霉素；I:0.2mMNa₂S+0.2mg/mL阿霉素；J:0.2mMNa₂S+1mg/mL阿霉素。
图3为硫氢化钠对人胃癌细胞株SGC7901过氧化氢酶活力的影响。
图4为硫氢化钾对小鼠肝癌细胞株H22过氧化氢酶活力的影响。
图5为硫氢化钠和平阳霉素协同处理后对小鼠肉瘤细胞的抑瘤率。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施案例对本发明做进一步的说明。
实施例1～4按下述方法处理(甲基偶氮四唑盐(MTT)分析法)：
甲基偶氮四唑溶液：250mg甲基偶氮四唑盐溶于50mL磷酸缓冲液(PBS，0.01mol/L，pH7.4)中，过滤除菌后，4℃冰箱保存。
其他材料：含l0％胎牛血清的DMEM培养液，0.25％胰蛋白酶等。
甲基偶氮四唑盐(MTT)分析法：0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞后，用含10％胎牛血清的DMEM培养液制备成单细胞悬液，计数并稀释成10000个细胞/mL。在96孔培养板中，每孔加单细胞悬液100μL，移入CO₂培养箱中，37℃、5％CO₂及饱和湿度下培养72h。然后，小心吸去培养液，加入100μLH₂S释放试剂，室温处理10min后，小心吸去溶液，蒸馏水洗涤后，加入100μL过氧化氢或抗癌药液，培养5h，培养细胞经蒸馏水洗涤后测定细胞活力。每个试验3个重复。
细胞活力的测定：每孔加入甲基偶氮四唑溶液20μL，37℃反应4h后，吸走溶液，再在孔中加入150μL二甲亚砜(DMSO)，振荡10min，使细胞裂解。在酶标仪上570nm波长下测定各孔的吸光度，计算相对抑制率。
相对抑制率＝(对照组A₅₇₀–实验组A₅₇₀)/对照组A₅₇₀
实施例1硫氢化钾与过氧化氢对人肺癌细胞株A549生长的协同抑制
用甲基偶氮四唑盐(MTT)分析法，对人肺癌细胞株A549的体外生长特性进行试验。发现硫氢化钾单独处理对癌细胞的生长没有抑制作用，过氧化氢单独处理对癌细胞有抑制作用，这种抑制作用具有剂量相关性；而用硫氢化钾处理后加过氧化氢，可显著增强对癌细胞的抑制作用，两者的协同抑制效应明显(如图1所示)。
实施例2硫化钠与阿霉素对人胃癌细胞株SGC7901生长的协同抑制
用甲基偶氮四唑盐(MTT)分析法，对人胃癌细胞株SGC7901的体外生长特性进行了试验。发现硫化钠单独处理对癌细胞的生长没有抑制作用，阿霉素单独处理对癌细胞有抑制作用，这种抑制作用具有剂量相关性；而用硫化钠处理后加阿霉素，可显著增强对癌细胞的抑制作用，两者的协同抑制效应明显(如图2所示)。
实施例3硫氢化钠与丝裂霉素对小鼠黑色素皮肤癌细胞株B16生长的协同抑制
用甲基偶氮四唑盐(MTT)分析法，对小鼠黑色素皮肤癌细胞株B16的体外生长特性进行了试验。发现硫氢化钠单独处理对癌细胞的生长没有抑制作用，丝裂霉素单独处理对癌细胞有抑制作用，这种抑制作用具有剂量相关性；而用硫氢化钠处理后加丝裂霉素，可显著增强对癌细胞的抑制作用，两者的协同抑制效应明显(见表1)。
表1.硫氢化钠与丝裂霉素对小鼠黑色素皮肤癌细胞株B16生长的协同抑制(相对抑制率，％)