二价重组人乳头瘤病毒疫苗.pdf

本发明提供了二价重组人乳头瘤病毒疫苗，它包括活性成分以及佐剂、可药用的赋型剂等辅料，其中活性成分包括重组HPV的L1蛋白五聚体，所述HPV型为HPV6和HPV11。该疫苗能够预防95％的尖锐湿疣。本发明所述的疫苗与目前已有的疫苗相比，质量稳定、成本低廉，适应症明确，疗效显著。

1、  二价重组人乳头瘤病毒疫苗，它包括活性成分以及佐剂、可药用的赋型剂、稳定剂等辅料，其特征在于所述的活性成分包括重组HPV的L1蛋白五聚体，所述HPV型为HPV6和HPV11。

2、  根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于所述辅料中的佐剂包括铝盐、3D-MPL、脂质A衍生物。

3、  根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于所述辅料中的稳定剂包括基于磷酸盐的生理缓冲液。

4、  根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于所述重组HPV6 L1、HPV11L1蛋白五聚体的含量均为20-50μg/支疫苗。

5、  一种生产如权利要求1-4之任一所述疫苗的方法，它包括如下步骤：
(1)表达、分离、纯化重组HPV6和HPV11的L1蛋白五聚体；
(2)将所得L1蛋白五聚体与辅料混合制剂，得到二价重组人乳头瘤病毒疫苗。

6、  根据权利要求1所述的疫苗在制备用于预防和/或治疗由HPV6、HPV11引起的感染和疾病的药物中的应用。

7、  根据权利要求1所述的疫苗在制备用于预防和/或治疗由于抗体交叉反应而由HPV6、HPV11以外的其它一种或多种HPV型引起的感染和疾病的药物中的应用。

8、  根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于所述的感染和疾病包括子宫颈癌、尖锐湿疣、乳腺癌、支气管肺癌、直肠癌、食道癌、咽癌、口腔癌、皮肤癌及其它与HPV密切相关的疾病。

9、  根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述的感染和疾病是尖锐湿疣。

二价重组人乳头瘤病毒疫苗
技术领域
本发明涉及人乳头瘤病毒感染的预防和治疗领域。具体地，本发明涉及二价(HPV6和HPV11)重组人乳头瘤病毒疫苗及其应用。
背景技术
子宫颈癌(Cervical Cancer)每年直接造成约超过30万成年女性死亡(国际卫生组织资料)，成为世界范围内仅次于乳腺癌的威胁妇女生命健康的第二号杀手。科学研究证实，导致宫颈癌的罪魁祸首是一种名为人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，简称HPV)的DNA致癌病毒。该病毒主要通过两性接触传染，专性侵染人体上皮细胞特别是生殖器官，部分病毒携带者在反复感染后表现出多种临床症状。女性受高危险型(HPV16、HPV18等)病毒感染后，小部分患者由最初的宫颈细胞学异常，发展成I-III的宫颈内皮细胞瘤样变(CINI-III)和浸润性宫颈癌变(ICC)，最终发展成致命的子宫颈癌。部分低危险型(HPV6、HPV11)病毒感染可导致男女两性生殖器官部位的尖锐湿疣。
最新研究表明HPV除了直接导致宫颈癌，还与支气管肺癌、直肠癌、口腔癌和皮肤癌有重大关系。根据国际卫生组织WHO的有关资料，除了导致宫颈癌，HPV感染还可能解释60％的皮肤癌，60％的食管癌，50％的肺癌、50％的乳腺癌、25％的口腔癌等人类重大癌症。
HPV病毒在长期的进化中形成了上百种变异类型，其中HPV16、HPV18等13种高危险型确认能够导致宫颈癌症。HPV6、HPV11等低危险型是造成男女生殖部位尖锐湿疣的关键病原体，本发明正是针对由HPV6、HPV11引起的感染所设计的尖锐湿疣疫苗。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明的目的之一是提供二价(HPV6和HPV11)重组人乳头瘤病毒疫苗；本发明的另一目的是提供该重组人乳头瘤病毒疫苗在制备药物中的应用。
(二)技术方案
本发明所述的二价重组人乳头瘤病毒疫苗，它包括活性成分以及佐剂、可药用的赋型剂、稳定剂等辅料，其特征在于所述的活性成分包括重组HPV的L1蛋白五聚体，所述HPV型为HPV6和HPV11。
所述辅料中的佐剂包括铝盐、3-O-去酰化单磷酸类脂(3D-MPL)、脂质A衍生物。
所述辅料中的赋型剂包括生理盐水及其它药物上可接受的赋型剂。
所述辅料中的稳定剂包括基于磷酸盐的生理缓冲液。
所述重组HPV6 L1、HPV11 L1蛋白五聚体的含量均为20-50μg/支疫苗。
本发明所述的疫苗还可包括HPV6和HPV11的L2蛋白、其它能与HPV6和HPV11 L1蛋白五聚体结合的蛋白，例如HPV6和HPV11的E6/E7蛋白。
一种生产所述疫苗的方法，它包括如下步骤：
(1)表达、分离、纯化重组HPV6和HPV11的L1蛋白五聚体；
(2)将所得L1蛋白五聚体与辅料混合制剂，得到二价重组人乳头瘤病毒疫苗。
其中，表达、分离、纯化重组HPV6、HPV11 L1蛋白五聚体的具体方法参见专利PCT/CN2008/000314、CN200810055700.5，得到纯度为95％以上的L1蛋白五聚体。
本发明公开了所述疫苗在制备用于预防和/或治疗由HPV6、HPV11引起的感染和疾病的药物中的应用。
本发明还公开了所述疫苗在制备用于预防和/或治疗由于抗体交叉反应而由HPV6、HPV11以外的其它一种或多种HPV型引起的感染和疾病的药物中的应用。
前述的感染和疾病包括子宫颈癌、尖锐湿疣、乳腺癌、支气管肺癌、直肠癌、食道癌、咽癌、口腔癌、皮肤癌及其它与HPV密切相关的疾病。
优选地，所述的感染和疾病是尖锐湿疣。
本发明所述的疫苗可采用多种方法作用于人体，包括肌肉和皮下注射。该疫苗在能引发对L1蛋白免疫反应的有效剂量范围内使用。用于增强免疫反应的复合物的特定剂量依照L1复合物不同而变化。一般而言，L1五聚体的用量在1-5μg/Kg体重之间。上述剂量范围并不排除更高或更低剂量的可能。例如，具体的剂量会根据是否伴随有其他药物剂量而定，或取决于个人的药代动力学、药物积累和代谢速率。
(三)有益效果
本发明所述的该疫苗能够预防95％的尖锐湿疣。该疫苗的活性成分为HPV6和HPV11 L1蛋白的五聚体，该五聚体与HPV L1蛋白的VLP(类病毒颗粒，为HPV L1蛋白的七十二聚体)具有相同的免疫原性和抗原性，且相对于VLP而言具有结构更稳定、工业成本大幅降低的优点。本发明所述的疫苗与目前已有的疫苗相比，质量稳定、成本低廉，适应症明确，疗效显著。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1  二价重组人乳头瘤病毒疫苗的制备
以下步骤中涉及的基因克隆、修饰等的操作参见PCT/CN2008/000314、CN200810055700.5。
一、HPV6 L1五聚体的制备
1、克隆HPV6L1衣壳蛋白基因，克隆到T-Easy vector质粒(购自美国Promega生物试剂公司)上。
2、修饰HPV6 L1衣壳蛋白基因，并在大肠杆菌中表达：将含有碱基替代突变的载有HPV6 L1基因插入片段的表达质粒pGEX-6-1通过热激法导入大肠杆菌BL21细胞之后，使用LB培养基(配方见《分子克隆》第三版，科学出版社，2002年8月出版)进行摄氏37度培养，菌种接入后生长12小时开始用表达诱导剂IPTG(购自美国Promega公司)诱导，9小时后收获细胞，细胞用Ni roSoavi NS2006型高压匀质机在800bar下重复破碎细胞2次，显微镜检查细胞破碎率达到90％以上。
3、HPV6 L1蛋白五聚体的分离、纯化：上清溶液中的L1蛋白经亲和色谱纯化蛋白：预装谷胱甘肽-琼脂糖树脂(Amersham公司生产的GlutathioneSepharose 4B)色谱柱，取浓度为50％的Glutathione Sepharose 4B匀浆放入色谱柱中(每200ml蛋白清液需要5-10ml匀浆)。用5-10倍的柱床体积的缓冲液A(组分为：50mmol/L Tric-HCl，200mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，pH8.0)洗涤树脂，将蛋白清液加入色谱柱中，与树脂混合均匀并在室温下作用20分钟后放出滤过液，用10倍柱床体积的缓冲液A洗涤树脂柱。用电镜观察纯化产物，得到HPV6 L1的五聚体。
二、HPV11 L1五聚体的制备：方法同HPV6 L1五聚体的制备，得到HPV11L1的五聚体。
三、活性成分与辅料混合：将纯化的HPV16 L1的五聚体与含有100mM NaCl的标准磷酸缓冲液(见《分子克隆实验指南》第三版，)通过缓冲液置换(bufferexchange，见《分子克隆实验指南》第三版)方式混合，使得L1五聚体保存在pH值为7.2的磷酸缓冲液中，通过调整使得重组HPV6 L1蛋白五聚体的含量为40μg/支疫苗，重组HPV11 L1蛋白五聚体的含量为40μg/支疫苗，制剂成为二价重组人乳头瘤病毒疫苗，在4℃保存。
实施例2  二价重组人乳头瘤病毒疫苗的制备
以下步骤中涉及的基因克隆、修饰等的操作参见PCT/CN2008/000314、CN200810055700.5。
一、HPV6 L1五聚体的制备
1、克隆HPV6 L1衣壳蛋白基因，克隆到T-Easy vector质粒(购自美国Promega生物试剂公司)上。
2、修饰HPV6 L1衣壳蛋白基因，并在大肠杆菌中表达：将含有碱基替代突变的载有HPV6 L1基因插入片段的表达质粒pGEX-6-1通过热激法导入大肠杆菌BL21细胞之后，使用LB培养基(配方见《分子克隆》第三版，科学出版社，2002年8月出版)进行摄氏37度培养，菌种接入后生长12小时开始用表达诱导剂IPTG(购自美国Promega公司)诱导，9小时后收获细胞，细胞用NiroSoavi NS2006型高压匀质机在800bar下重复破碎细胞2次，显微镜检查细胞破碎率达到90％以上。
3、HPV6L1蛋白五聚体的分离、纯化：上清溶液中的L1蛋白经亲和色谱纯化蛋白：预装谷胱甘肽-琼脂糖树脂(Amersham公司生产的GlutathioneSepharose4B)色谱柱，取浓度为50％的Glutathione Sepharose4B匀浆放入色谱柱中(每200ml蛋白清液需要5-10ml匀浆)。用5-10倍的柱床体积的缓冲液A(组分为：50mmol/L Tric-HCl，200mmol/LNaCl，1mmol/L EDTA，pH8.0)洗涤树脂，将蛋白清液加入色谱柱中，与树脂混合均匀并在室温下作用20分钟后放出滤过液，用10倍柱床体积的缓冲液A洗涤树脂柱。用电镜观察纯化产物，得到HPV6 L1的五聚体。
二、HPV11 L1五聚体的制备：方法同HPV6 L1五聚体的制备，得到HPV11L1的五聚体。
三、活性成分与辅料混合：将纯化的HPV16 L1的五聚体与含有100mM NaCl的标准磷酸缓冲液(见《分子克隆实验指南》第三版，)通过缓冲液置换(bufferexchange，见《分子克隆实验指南》第三版)方式混合，使得L1五聚体保存在pH值为7.2的磷酸缓冲液中，同时加入氢氧化铝150μg，通过调整使得重组HPV6L1蛋白五聚体的含量为25μg/支疫苗，重组HPV11L1蛋白五聚体的含量为45μg/支疫苗，在4℃保存。
实施例3  二价重组人乳头瘤病毒疫苗的制备
以下步骤中涉及的基因克隆、修饰等的操作参见PCT/CN2008/000314、CN200810055700.5。
一、HPV6 L1五聚体的制备
1、克隆HPV6 L1衣壳蛋白基因，克隆到T-Easy vector质粒(购自美国Promega生物试剂公司)上。
2、修饰HPV6 L1衣壳蛋白基因，并在大肠杆菌中表达：将含有碱基替代突变的载有HPV6 L1基因插入片段的表达质粒pGEX-6-1通过热激法导入大肠杆菌BL21细胞之后，使用LB培养基(配方见《分子克隆》第三版，科学出版社，2002年8月出版)进行摄氏37度培养，菌种接入后生长12小时开始用表达诱导剂IPTG(购自美国Promega公司)诱导，9小时后收获细胞，细胞用NiroSoavi NS2006型高压匀质机在800bar下重复破碎细胞2次，显微镜检查细胞破碎率达到90％以上。
3、HPV6 L1蛋白五聚体的分离、纯化：上清溶液中的L1蛋白经亲和色谱纯化蛋白：预装谷胱甘肽-琼脂糖树脂(Amersham公司生产的GlutathioneSepharose 4B)色谱柱，取浓度为50％的Glutathione Sepharose 4B匀浆放入色谱柱中(每200ml蛋白清液需要5-10ml匀浆)。用5-10倍的柱床体积的缓冲液A(组分为：50mmol/L Tric-HCl，200mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，pH8.0)洗涤树脂，将蛋白清液加入色谱柱中，与树脂混合均匀并在室温下作用20分钟后放出滤过液，用10倍柱床体积的缓冲液A洗涤树脂柱。用电镜观察纯化产物，得到HPV6 L1的五聚体。
二、HPV11 L1五聚体的制备：方法同HPV6 L1五聚体的制备，得到HPV11L1的五聚体。
三、活性成分与辅料混合：将纯化的HPV16 L1的五聚体与含有100mMNaCl的标准磷酸缓冲液(见《分子克隆实验指南》第三版，)通过缓冲液置换(buffer exchange，见《分子克隆实验指南》第三版)方式混合，使得L1五聚体保存在pH值为7.2的磷酸缓冲液中，通过调整使得重组HPV6L1蛋白五聚体的含量为35μg/支疫苗，重组HPV11 L1蛋白五聚体的含量为50μg/支疫苗，制剂成为二价重组人乳头瘤病毒疫苗，在4℃保存。